一種免疫增強劑及製備的製作方法

2023-12-10 07:21:12 1

專利名稱：一種免疫增強劑及製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種免疫增強劑肽及其製備方法，尤其涉及ー種人工設計的通用T輔助細胞表位肽作為免疫增強劑的應用及其製備方法。
背景技術：
表位(epitope)又稱抗原決定簇,是指免疫應答中被特異的效應分子或T、B淋巴細胞識別的抗原分子上的特定結構位點。T細胞表位是指在特異性免疫應答中，抗原經抗原遞呈細胞處理後，由MHC分子向T細胞表面抗原受體(TCR)遞呈的線性肽段，是人為規定的存在於抗原分子上的被T細胞所識別的抗原決定簇。T淋巴細胞識別抗原遞呈細胞遞呈的抗原肽分子後，開始活化増殖，產生免疫應答。T淋巴細胞表位在特異性免疫應答的啟動和調節中發揮重要的作用。 T淋巴細胞表位又分為與⑶8T細胞識別的CTL (與MHCI類分子結合)表位和OT4T細胞識別的Th (與MHCII類分子結合)表位。由於抗原所加工的部位以及MHC分子本質的不同，使得CD4T和CD8T細胞的抗原識別存在著差異。外源性蛋白抗原由抗原遞呈細胞酶解後多與MHC II類分子結合，遞呈給CD4T細胞；而內源性抗原多以靶細胞作為抗原遞呈細胞，於細胞內酶解後，與MHCI類分子結合，遞呈給CD8T細胞。CTL抗原表位來自細胞內寄生的病毒、細菌、原蟲以及腫瘤等抗原，這些抗原在細胞內核糖體上合成後，運送到巨大多功能蛋白酶體(LMP)分解成小肽後，被轉運到內質網膜，並進行一定的修剪，最終形成T細胞表位，進入MHC I類分子的凹槽，運送到細胞膜上，再與CD8CTL細胞上TCR結合，介導T細胞毒性免疫應答。而Th抗原表位多來自於細胞外的抗原，細胞外源性抗原首先要被APC捕獲，送到溶酶體中，將其裂解成一定片段後，在DM分子幫助下，消除由Ii鏈引導進入溶酶體的MHCII類分子上的CLIP，使得片段中的T細胞表位結合到MHCII類分子凹槽中，然後再運送到膜上，由MHC II類分子提呈蛤OT4Th細胞，激活Th細胞以輔助B細胞產生抗體。活化的Th細胞還產生ー些細胞因子，介導NK細胞等免疫細胞產生細胞免疫應答。由於Th細胞表位在特異性免疫應答的啟動和調節中發揮重要的作用，所以在新型疫苗研製中Th表位選取至關重要。目前，基因工程亞單位疫苗和合成肽疫苗的弱免疫原性與MHCII類分子的限制性有夫。免疫學研究表明，大多數的疫苗抗原為T細胞依賴性抗原，這類抗原刺激機體產生抗體需要T輔助細胞的參與。首先，抗原被抗原提呈細胞攝取後在細胞吞噬小體內被消化處理，產生的T輔助細胞表位與MHCII類抗原結合轉移至細胞表面，然後提呈給T輔助細胞，刺激T輔助細胞產生IL-2等細胞因子，促進漿細胞產生抗體。因此，T輔助細胞表位在抗體的產生中起著重要的作用，只有當T輔助細胞表位與機體MHCII相適應時抗原才能刺激機體產生抗體。進ー步的研究發現，外源性通用T輔助細胞表位與ー些免疫原性較弱的抗原結合後，可使其免疫原性明顯增強，與ー些無免疫反應的抗原結合後可使其產生免疫反應，表明通用T輔助細胞表位能克服機體MHC-II分子的限制性。研究Th細胞表位通常的策略是，根據抗原蛋白的胺基酸序列隨機合成或連續合成一個或幾個重疊胺基酸的一系列肽段，是通過淋巴細胞功能實驗確定可以被T細胞識別的肽段。這種方法的優點是，鑑定的Th細胞表位較可靠，且能發現ー些不符合多肽結合基序(motif)的MHC結合抗原肽。缺點是盲目性大，浪費人力和物力。此外，由於MHC分子高度的多態性也可能造成漏檢，因此，在合成肽段之前，如果對其與MHC分子結合的可能性進行預測，先篩選出最有可能的ー些抗原片段，這樣不僅可減少工作量、節省花費，而且還能提高實驗的成功率。在經費有限的情況下，它成為確定Th細胞表位的首選方法。隨著分子生物和分子免疫學技術的發展，尤其是計算機科學在生物醫學中的廣泛應用，Th細胞表位研究方法也在不斷更新。藉助於計算機編制預測T細胞表位的軟體，能較精確地預測與MHC分子結合的肽，然後再經過實驗驗證。這已成為目前研究Th細胞表位的常用方法並得到廣泛應用，取得了重要進展。

發明內容
因此本發明的目的是提供ー種免疫增強劑肽，具體是ー種可以提高半抗原或者抗原免疫原性的人工通用T輔助細胞表位肽。同時，本發明提供了上述免疫增強劑肽的製備方法。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案。本發明在上述T細胞表位研究的基礎上，結合計算機輔助預測設計了大量候選的T輔助細胞表位，進而通過大量T細胞表位功能試驗進行篩選，得到了兩條以小反芻獸疫病毒為來源的T輔助細胞表位肽。再進ー步結合多肽的親疏水性、ニ級結構和帶電荷等情況對序列進行了重新設計，得到了兩條人工設計的T輔助細胞表位肽。本發明提供ー種免疫增強劑，其特徵在於該免疫增強劑為人工設計的通用T輔助細胞表位肽，具有如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列。本發明提供了上述免疫增強劑肽在提高半抗原或者弱抗原免疫效果中的用途。本發明提供了上述免疫增強劑肽的製備方法，主要包括以下步驟(I)免疫增強劑肽的化學合成；(2)免疫增強劑肽的的裂解、沉澱；(3)高壓液相色譜分離純化免疫增強劑肽；上述免疫增強劑肽的製備方法，免疫增強劑肽的化學合成其特徵在幹，是以氨基樹脂和9芴甲氧羰基(Fmoc)胺基酸為原料，逐步接上胺基酸，每步接肽反應後用こ醯咪唑封閉未反應的活性氨基端，主要包括如下步驟(a)FMOC基團脫除用含15% -35%六氫吡啶的ニ甲基甲醯氨(DMF)溶液在20-26°C條件反應20-40分鐘脫除氨基上保護的FMOC基團，氮氣吹乾，ニ甲基甲醯氨(DMF)洗滌樹脂；(b)接肽反應加入I-羥基苯丙三氮唑(HOBT)、苯並三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、ニ異丙基こ胺(DIEA)與FMOC保護的胺基酸在20_28°C條件反應
0.5-2. 5小時，氮氣吹乾，ニ甲基甲醯氨(DMF)洗滌樹脂；(c)封閉反應使用I. 5% -3. 5%的こ醯咪唑在20-26°C條件反應15-30分鐘。上述免疫增強劑肽的製備方法，其中所述多肽抗原裂解所用試劑為三氟こ酸(TFA)/ 苯酚(Phenol)/H20 = 90/8/2，裂解時間為 1-3 小時。
本發明利用生物信息學和免疫學技術手段，篩選得到兩條以小反芻獸疫病毒和分歧桿菌為來源的人工T輔助細胞表位。該表位肽可以作為免疫增強劑，顯著提高半抗原或者抗原的免疫效果。同時，該免疫增強劑肽質量穩定、安全、經濟，具有良好的應用前景。下面結合具體實施例對本發明做進ー步的說明。實施例I.免疫增強劑肽固相化學合成本發明免疫增強劑肽的製備可使用全自動多肽合成儀運用經典固相化學合成法，採用的是FMOC保護胺基酸，固相載體採用的是氨基樹脂。生產過程通常分為免疫增強劑肽的固相合成、免疫增強劑肽的裂解、免疫增強劑肽純化與除菌保存。具體步驟如下I. I免疫增強劑肽固相合成 I. I. I合成原料的準備合成肽序列如SEQID NO :1、SEQ ID NO 2 所示。依據上述免疫增強劑肽的序列以及合成規模準備合適的保護胺基酸，加入到相應的胺基酸瓶中。同樣按要求稱量氨基樹脂，放入反應腔，將上下蓋子擰紫，貼標籤，記錄所合成肽的名稱，反應腔的皮重及所稱樹脂的重量。將反應腔裝入合成儀。配製合成試劑包括DMF、AIM(己醯咪唑)、PIP (哌啶)、甲醇等放置到相對應的試劑瓶中。1.1.2合成儀狀態的檢測檢查合成儀器是否正常運行，開機後，運行自檢程序，儀器自檢各項指標是否正常。另外檢查氮氣是否充足，系統表壓是否正常。合成前應對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進行測定。發送測試程序到合成儀，進行測量或觀察，若流量不合適，則調節上下閥門壓力，直至達到要求。
瓶號測試程序測試標準範圍Piperidine III. 0-1. 2ml
AIM5E1.0-1.2ml■
MeOH9D3. 5-4. Oml■
DIC8S0.45-0. 55g ■
DMF10 A2.6-2.8ml■I. I. 3免疫增強劑肽的合成開始在合成儀的程序中將要合成的胺基酸序列與合成方法發送到合成儀上。編輯合成肽的序列，保存。檢查合成方法是否正確，序列是否為所存名字，設定合成循環；確定後保存，然後運行程序。I. I. 4免疫增強劑肽的合成如上述的免疫增強劑肽序列，合成的時候是從C端開始至N端，依照設定的程序，依次不斷地重複如下合成步驟(I)脫除FMOC保護基團使用含25%六氫吡啶的DMF溶液在25°C條件反應30分鐘脫除氨基上保護的FMOC基團；
(2)洗滌樹脂氮氣吹乾樹脂，用DMF洗滌樹脂5次；(3)接肽反應加入HOBT, HBTU, DIEA與FMOC保護的胺基酸在25°C條件反應I. 5小時，氮氣吹乾樹脂，然後DMF洗滌樹脂；(4)洗滌樹脂氮氣吹乾樹脂，使用DMF洗滌樹脂5次；(5)封閉反應使用2. 5%的こ醯咪唑在25°C條件反應30分鐘，將未反應活性氨基封閉；(6)免疫增強劑肽合成後處理合成結束後從多肽合成儀上取下反應器，再用甲醇洗滌肽樹脂5次，後在通風廚內吹乾，然後將多肽樹脂轉移至棕色瓶內，放入_20°C冰箱內，封ロ膜密封備用。I. 2、免疫增強劑肽的裂解及鑑定I. 2. I、免疫增強劑肽的裂解按照比例(TFA/Phenol/H20 = 90/8/2)配製裂解液，然後從冰箱內取出合成好多肽樹脂，放入圓底燒瓶內，在通風廚內向燒瓶內加入配製好的裂解液和磁攪拌子，然後穩定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續攪拌2小時到反應完全。反應結束後，使用帶冷阱的旋轉蒸發儀持續蒸發80分鐘除去粗產品中的TFA。然後用ニ甲基甲醯氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最後將混合在一起的樹脂用砂心漏鬥過濾出來，既得到多肽抗原。I. 2. 2、免疫增強劑肽的鑑定免疫增強劑肽合成完畢後用基質輔助雷射解吸飛試時間質譜法(MALDL-T0F)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進行定性定量分析。I. 3、免疫增強劑肽的分離純化免疫增強劑肽的分離純化採用高壓液相色譜法，色譜條件是色譜柱ODS C18 (柱規 19mmX250mmX5ii , 300A,Hypersil);流動相 A(0. 5% TFA/H20)，流動相 B (0. 5% TFA/ 乙腈)；梯度洗脫條件為30min內從10% B變化到50% B ;檢測波長216nm ;流速為I. OmL/min ;進樣量:20ul。實施例II免疫增強劑肽的安全性試驗按照上述實施例合成如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示胺基酸序列免疫增強劑肽，按照肽含量為30ug/ml。每種肽用體重350 450g的豚鼠10隻，每隻皮下注射2ml ;用體重18 22g的小鼠10隻，每隻皮下注射0.5ml。連續觀察7日，判定是否出現因注射免疫增強劑肽引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身反應。觀察結果見表2。表2 :免疫增強劑肽對豚鼠與小鼠的安全性試驗結果
權利要求
1.一種免疫增強劑，其特徵在於該免疫增強劑為人工設計的通用T輔助細胞表位肽，具有如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列。
2.權利要求I所述的免疫增強劑在提高半抗原或者弱抗原免疫效果中的用途。
3.一種根據權利要求I中所述的免疫增強劑的製備方法，主要包括以下步驟 (1)免疫增強劑肽的化學合成； (2)免疫增強劑肽的的裂解、沉澱； (3)高壓液相色譜分離純化免疫增強劑肽。
4.根據權利要求3所述免疫增強劑肽的製備方法，免疫增強劑肽的化學合成其特徵在於，是以氨基樹脂和9芴甲氧羰基(Fmoc)胺基酸為原料，逐步接上胺基酸，每步接肽反應後用乙醯咪唑封閉未反應的活性氨基端，主要包括如下步驟 (a)FMOC基團脫除用含15% -30%六氫吡啶的二甲基甲醯氨(DMF)溶液在20-26°C條件反應20-40分鐘脫除氨基上保護的FMOC基團，氮氣吹乾，二甲基甲醯氨(DMF)洗滌樹脂； (b)接肽反應加入I-羥基苯丙三氮唑(HOBT)、苯並三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、二異丙基乙胺(DIEA)與FMOC保護的胺基酸在20-28 °C條件反應·0.5-2. 5小時，氮氣吹乾，二甲基甲醯氨(DMF)洗滌樹脂； (c)封閉反應使用I.5% -3. 3%的乙醯咪唑在20-26°C條件反應15-30分鐘。
5.根據權利要求3所述免疫增強劑肽的製備方法，其中所述多肽抗原裂解所用試劑為三氟乙酸(TFA)/苯酚(Phenol)/H20 = 90/8/2，裂解時間為1-3小時。
全文摘要
本發明公開了一種免疫增強劑及其製備方法，該免疫增強劑為人工設計的通用T輔助細胞表位肽。具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，可以通過化學合成的方法製備。該免疫增強劑安全性好、質量穩定、成本低廉，可以顯著提高半抗原或者弱抗原的免疫效果。
文檔編號A61P37/04GK102659931SQ20121011396
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者邵國虎, 陶鈺 申請人:邵國虎, 陶鈺