海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子及其應用的製作方法

2023-12-10 04:28:41

專利名稱：海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、基因工程領域，具體的說是一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子及其應用。
背景技術：
近年來，我國淺海貝養殖有了長足發展，但隨著氣候變暖，夏季高溫成為制約水產養殖業發展的主要環境因素。生物體受到熱激脅迫(高於正常生長溫度5°C以上的溫度)時，能迅速誘導熱休克蛋白的合成，它最早是Ritossa於1962年在果蠅中首先發現的。而且除溫度外，許多損傷因素、應激刺激(如缺氧、重金屬離子、病毒感染、自由基等)都可以誘導熱激反應，合成的熱休克蛋白(HSPs)在細胞穩態的重建中起重要作用。熱休克蛋白70(HSP70)家族是熱休克蛋白超家族的重要成員，除了具有分子伴侶的功能以外，在消除重金屬汙染對機體造成的損傷，調節受體數量，調理細胞凋亡，促進抗原提呈，參與機體的免疫反應等方面都具有重要的作用。真核啟動子作為在真核細胞中啟動基因轉錄的必需元件，是真核表達載體中一個關鍵組成部分，決定了目標基因的表達效果，不同類型啟動子活性不同。啟動子按其作用方式和功能可分為三類組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異型啟動子。其中，誘導型啟動子可根據需要在生物體特定的發育階段、組織器官或生長環境下，快速誘導基因轉錄，如熱誘導表達基因啟動子(HSP啟動子)等。目前已有許多熱誘導型啟動子被成功應用於植物基因工程領域，例如將大豆熱激蛋白GmHSP17. 3B啟動子與gus融合，轉入苔蘚。通過控制熱激溫度來調節GUS的表達量；將向日葵的HaHSP17. 7G4基因的啟動子與gus連接，轉化菸草，發現其對高溫(42°C)、脫落酸都有應答，在胚胎形成過程中也有積累。在水生動物中，目前還沒有熱誘導型啟動子的相關研究。

發明內容
本發明目的在於提供一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子及其應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示。海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列具有> 75%同源性，且能夠控制下遊基因轉錄的DNA分子。海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下遊基因轉錄的DNA分子。海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的應用，所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子在調控海灣扇貝基因表達中的應用。所述基因為下遊基因。本發明所述含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的重組載體，包含有本發明所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子，以及由該啟動子控制的目標蛋白基因。
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本發明所述含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子重組載體的宿主細胞，是通過在宿主細胞中轉染含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的重組載體獲得的，重組的宿主細胞中含有本發明所述的含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的重組載體，並能夠表達由海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子控制的目標蛋白基因。本發明所述宿主細胞包括且不僅限於Hela細胞。本發明的突出優點如下本發明克隆的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子是典型的熱誘導型啟動子，具有強啟動子活性。實驗結果表明，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子可以在Hela細胞系中高效啟動下遊基因表達，可以廣泛用於基因工程重組載體的構建。


圖1為本發明實施例提供的RT-PCR檢測熱脅迫后海灣扇貝熱休克蛋白70表達情況柱狀圖(其中柱狀圖上方星號標記表示與b 1 ank組顯著差異(**:P<0.01，N = 5))。圖2為本發明實施例提供的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子活性分析圖(其中將包含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的重組載體轉染到Hela細胞系中，檢測熱激前後由海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子驅動的螢光素酶活性變化。pGL 3-control為陽性對照，pGL 3-basic為陰性對照。)。
具體實施例方式本發明所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子，是具有下述任一特徵的DNA分子1、由SEQ ID NO. 1鹼基對1-1540定義的DNA分子；2、由SEQ ID NO. 1鹼基對1-1540定義的序列具有> 75%同源性，且能夠控制下遊基因轉錄的DNA分子；3、是SEQ ID NO. 1的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下遊基因轉錄的DNA分子。本發明所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的克隆方法，包括以下步驟一、海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子5』調控序列分離1、米用 Clontech 公司(www.Clontech.com)的 GenomeffalkerUniversalKit (Catalog No. 638904)的限制性內切酶(Dra IjEcoR V,Pv μ II & St μ I)構建四個DNA內切酶庫。2、採用兩輪兩步PCR方法克隆出5』 -端序列，具體步驟如下(1)第一輪PCR總體系為50 μ 1，包括40 μ 1無菌雙蒸餾水，5 μ 110XPCR buffer,1μ 1 dNTP (10πιΜ)，1μ 1 接頭引物(ΑΡ1，10μΜ)，1μ 1 基因特異性引物(SEQ ID NO. 2,10μΜ))，1μ 1 rTaq 聚合酶(TaKaRa)，1 μ 1 酶切文庫 DNA。PCR 程序為7 個循環94°C 25s,72°C 3min ；32 個循環94°C 25s，67°C 3min ；1 個循環67°C 7min。(2)第二輪兩步PCR以第一輪的PCR產物為模板，利用巢式引物(AP2和SEQ IDN0. 3)，按照跟第一輪一樣的體系進行擴增，PCR程序為5個循環94°C 25s，72°C 3min ；20個循環94°C 25s，67°C 3min ；1 個循環67°C 7min。
所述SEQ ID NO. 2 序列為5』 -GGTTGTCCTGTTTCCTTGGTCATTGGCG-3'所述SEQ ID NO. 3 序列為5』 -CGCCAGTTATTTCAATGTTCCTGTCTCA-3'二、擴增出來的PCR產物連接到pMD18-T Simple vector (TaKaRa)，轉化大腸桿菌。篩選陽性克隆進行測序，獲得帶有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子序列SEQ ID N0.1的大腸桿菌質粒。實施例IRT-PCR檢測熱脅迫后海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達情況從青島水產市場購買實驗用海灣扇貝，於(17士 1)°C海水中暫養一周後進行持續高溫刺激實驗。取5隻扇貝作為空白組，同時將另外25隻扇貝放入海水中進行熱激作為處理組。在刺激後的第lh、2h、4h、8h和12h，分別取扇貝的鰓凍存在_80°C，用於RNA提取。利用引物oligo dT(liS和反轉錄酶M-MLV在42°C反轉lh。以扇貝的管家基因β-actin作為內參，利用RT-PCR方法檢測AiHSP70基因的mRNA表達情況(參見圖1)。結果如圖1所示熱激1小時後，海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達量迅速上升並達到最大值，為空白組的7. 61倍；之後表達量下降，到4小時時基本回復到初始水平；然後在處理8小時時又開始上升，為空白組的3. 63倍；在處理12小時後，處理組的海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達量為空白組的6. 94倍。f-test和t_test分析顯示海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達量在處理1小時、8小時和12小時後顯著高於空白組(** =P <0.01),這表明海灣扇貝熱休克70啟動子屬於典型的熱誘導型啟動子。實施例2海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的克隆1.米用 Clontech 公司(www. Clontech. com)的 GenomeffalkerUniversa 1Kit (Catalog No. 638904)的限制性內切酶(Dra IjEcoR V,Pv μ II & St μ I)構建四個DNA內切酶庫。2.採用兩輪兩步PCR方法克隆出5』 -端序列，具體步驟如下(1)第一輪PCR總體系為50μ 1，包括38. 5μ 1無菌雙蒸餾水，5 μ 110XPCRbuffer, 3 μ 1 dNTP (IOmM)，1 μ 1 接頭引物(API :5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC_3，，10 μ Μ)，1 μ 1 基因特異性引物(SEQ IDN0. 2，10 μ Μ))，0. 5 μ 1 rTaq 聚合酶(TaKaRa)和 1 μ 1 步驟 1所述構建的酶切文庫DNA為模板。PCR程序為7個循環94°C 25s, 72°C 3min ；32個循環940C 25s，67°C 3min ；1 個循環67°C 7min。(2)第二輪兩步PCR以第一輪的PCR產物為模板，利用巢式引物(AP2 5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，和SEQ ID N0. 3)，按照跟第一輪一樣的體系進行擴增，PCR程序為5 個循環94°C 25s，72°C 3min ；20 個循環94°C 25s，67°C 3min ； 1 個循環67°C 7min。所述SEQ ID NO. 2 序列為5』 -GGTTGTCCTGTTTCCTTGGTCATTGGCG-3'所述SEQ ID NO. 3 序列為5』 -CGCCAGTTATTTCAATGTTCCTGTCTCA-3'二、擴增出來的PCR產物連接到pMD18_T Simpl evector (TaKaRa)，轉化大腸桿菌。利用載體引物 RV-M(5』 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，)和 M13_47(5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3』)進行PCR篩選陽性克隆進行測序，獲得帶有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子序列SEQ ID NO. 1的大腸桿菌質粒。所述 SEQ ID NO. 1 為:
cgacggcccgggctggtaaatatgacatatctttattcaaatagagatat50
ctttatttaaattagagatatctttaattaaatagagatatcttcatttt100
aaatagagatatcttttattaaatagagatatctatatttcaataggtaa150
clclclC CcltclclCggcttgccatactaacctacacttttaaagatatatagtt200
tgaaacagaattttccctaatactacatataaacagatgtctccattttt250
catttcatggtttatttacatgttagcaatgcatacacataaggagcttt300
gaaacatgcctgatccagccctatatttatcagtattatttacgtactat350
agttattataagttataaacacgtgacttgttttagtcatcttgtgggat400
gttccagatttgacgtcatatccttaagtgcgcataaatactcgtcgcat450
agcgccgggaaccaagaacaaaccggaacgaggagttttagctgagacaa500
gaacattgaaataactggctcttatattcaagaaaaaacaC 3.3.3.3.3.3. C 3.3.550
caggtaactttgtggaacgatatcggaagaaaatcgattcgattctgatt600
gatggttttgttgggattcgtgtaaattttgtcaagaataattttcaggg650
aggagccctcgagcagatgacagttttcactgggctttcaccgttgtatc700
aaaaagttaaatgaaaatcgtaacattttatatttctcgtgttaataata750
cattagttttagttactaaattccctcaaaatgatgtttcgttagatttg800
aagtagggctaccgaaagctttgttcattcacgttaccaatcgtcaacac850
cacatgcacgtagccggctaaatcgaccccattatataacCggttttgtt900
tagttactcagtctttgccttaagttgcgt 3.3.3. 3. 3.3.attgtaaaca950
ctgtggatga3. 3.3. C 3. 3.3.3.ttttagtttcgttatcgatttgactttgga1000
cgcgttaccttgctttagcaagttctattc attatcttcc ggaatcggtc1050
atgtgagttcCgtctggcgtggtagagctg tctctaaaag gagacaccca1100
aacaatgaagtgttaaaagtatggtatata aatagagtga acggaattcc1150
aagaataagttaccccttggtaacagaaca aatagtctgg tatttgttac1200
aactctggtgtcatgttggttaacgagtga acggaaaaag aatgtctgct1250
￡1￡1￡1￡10 ￡1￡1￡1agttttatgtgtttatgtgt attactttca caatatttaa1300
tgtgaatggtgaaatagacctagctatgat tataaacatt tgatcacaat1350
gatcacttatcattactatttattagtaat caattaatta tttttcatga1400
catacctaaaaggtgctagggaatggggta cactgtagat tgaaataggc1450
agagatgaaataaaatttgctgtaagaaaa aaattgtgaa tatttattaa1500
aaacctgctttagttttatttcgtttttgt ttttagcaaa1540
(a)序列特徵
參長度IMObp
參類型鹼基序列
參鏈型雙鏈
參拓撲結構線性
(b)分子類型DNA
(C)假設否(d)反義否(e)最初來源海灣扇貝(f)特異性名稱pAi HSP7O實施例3海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子(pAiHSP70)活性檢測1、pGL-3-Basic-pAiHSP70重組載體的構建1)合成分別帶有限制性內切酶位點Kpn I 和 Bgl I I 的引物 SEQ ID NO. 4(5' -GGTACCATAACGGCTTGCCATACTAAC—3『)禾口 SEQID NO. 5 (5，-AGATCTTTGCTAAAAACAAAAACGAAAT-3，)，用 Takara 高保真 Taq 酶進行 PCR 擴增。在總體積為50μ 1的反應體系中包含有38. 5μ 1無菌雙蒸餾水，5μ 1 10XPCR buffer,3 μ 1 dNTP (IOmM)，1 μ 1 引物 SEQ ID NO. 4 (10 μ Μ)，1 μ 1 SEQ ID NO. 5 (10 μ Μ))，0· 5 μ 1 高保真Taq聚合酶(TaKaRa)和1 μ 1全基因組DNA為模板(50ng/ul)。PCR程序為1個循環940C 5min ；32 個循環94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s ；1 個循環72°C IOmin0 用膠回收試劑盒(TaKaRa)純化PCR產物。2)回收後的PCR產物和無啟動子的空載體pGL-3-Basic (Promega)進行雙酶切(Kpnl和Bgl II)，37°C孵育4h。膠回收純化酶切產物。幻將上述酶切產物在16°C連接過夜。ΙΟμΙ連接體系中包含3μ1 (濃度15ng/μ 1)雙酶切後的空載pGL-3-Basi C(Promega)，5 μ 1 (濃度lOng/μ 1)雙酶切後的PCR產物片段，1 μ 1 10ΧΤ4 連接酶 buffer 和 1 μ 1 T4DNA 連接酶(TaKaRa)。4)將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，37 °C過夜培養。5)利用載體引物 RVprimer 3 (5，-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3，)和 GLprimer2 (5，-CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3』)進行PCR篩選陽性克隆，挑取陽性單克隆進行過夜培養，用小量質粒試劑盒(!Iomega)提取質粒，並雙酶切鑑定和測序。2.細胞轉染和螢光素酶活性分析1)細胞鋪板500 μ 1 Hela細胞(2 X IO5個/ml)接種於M孔細胞培養板(Costar)上，於生化培養箱並通入5% CO2, 37°C條件下培養24h使融合度達到90% -95%。2)瞬時轉染將0. 72 μ g上述構建好的質粒pGL3-Basic_pAiHSP70和0. 08 μ g內對照質粒 pRL-TK (Promega)，在脂質體(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介導下共轉染進入Hela細胞，同時轉染pGL-3-control作為陽性對照，轉染pGL-3-Basic作為陰性對照。3)熱激處理在轉染24h後，一個板在45°C條件下熱激lh，然後繼續在5% CO2,37°C條件下培養Mh，對照組生長條件一直不變。4)轉染4 後收集細胞，參考雙螢光素酶活性檢測試劑盒(!Iomega)方法分析海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子活性(參見圖2)。結果如圖2所示，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子可以在Hela細胞中啟動下遊報告基因Luciferase酶的表達，具有啟動子活性。熱激後，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子活性顯著上升(** =P < 0. 01)，屬於熱誘導型啟動子。
權利要求
1.一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子，其特徵在於海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.按權利要求1所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子，其特徵在於海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列具有>75%同源性，且能夠控制下遊基因轉錄的DNA分子。
3.按權利要求1所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子，其特徵在於海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下遊基因轉錄的DNA分子。
4.一種權利要求1所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的應用，其特徵在於所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子在調控海灣扇貝基因表達中的應用。
5.按權利要求4所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的應用，其特徵在於所述基因為下遊基因。
全文摘要
本發明屬於分子生物學、基因工程技術領域，涉及一種熱誘導型啟動子海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子序列及其克隆方法，以及包含有此啟動子的重組載體的構建，可用於在宿主細胞中表達外源基因。提供一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子及其克隆方法，以及含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動子的重組載體和重組的宿主細胞。本發明利用分子生物學方法分析該片段控制下的海灣扇貝熱休克蛋白70基因mRNA和報告基因Luciferase酶的表達模式，結果表明該啟動子受熱脅迫誘導調控，能夠啟動外源基因在Hela細胞中的高效表達。
文檔編號C12N15/113GK102559683SQ20121004014
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者宋林生, 張峘, 楊傳燕, 王玲玲, 邱麗梅 申請人:中國科學院海洋研究所