甘蔗根特異表達啟動子及其用途的製作方法

2023-12-10 04:32:01 1

專利名稱：甘蔗根特異表達啟動子及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物分子生物學和植物基因工程領域。具體地講，本發明涉及一種甘 蔗根特異表達的啟動子序列，含有該啟動子的重組核酸序列，構建體和表達系統，及其驅動 功能基因在甘蔗根內特異性表達和優先表達的用途。
背景技術：
在利用基因工程技術對農作物進行遺傳改良的過程中，人們常常期望插入的外源 基因能夠限制在受體特定的組織中表達。這有兩個重要的原因首先，相對於整體和持續性 表達而言，限制性表達(restricted expression)可減少植株體內營養資源新陳代謝的浪 費，降低對植株自身原有新陳代謝的影響，降低對植株生長的影響；其次，當外源表達蛋白 與植株上人或動物的食用部位沒有關係時，外源基因最好直接表達在這些食用部位以外的 其他部位中，特別是在人或動物攝取外源表達蛋白的後果還不十分清楚的時候。而當外源 表達蛋白是對人體或動物有益的營養物質時，則應儘量使外源蛋白在人或動物的使用部位 高效表達。高等植物根的結構簡單、組成穩定，是研究器官發生和發育的良好模式系統，有效 的根特異表達啟動子是利用抗病蟲基因、抗逆性基因、促進礦物質吸收的基因以及促進特 定次生物質代謝的基因等有益目的基因導入農作物並在植物根中驅動表達的必要前提。甘蔗是禾本科(Graminaceae)甘蔗屬(SaccharumL.)植物，原產於熱帶、亞熱帶地 區。甘蔗是一種高光效的C4植物，其光飽和點高、二氧化碳補償點低、光呼吸率低、光合強 度大、因而生物產量很高，它不僅是一種重要的糖料作物，也是一種重要的能源植物。由於 甘蔗是一種宿根植物，主要種植於旱坡地，逆境(特別是乾旱和低溫)和各種病蟲害對其生 長影響很大，提高甘蔗對逆境和病蟲的抗性一直是甘蔗育種的主要目標之一。研發甘蔗根 特異表達啟動子，對甘蔗抗病蟲、抗逆性等的遺傳改良具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一個在甘蔗根特異表達的啟動子及其植物表達載體。本發明 的技術方案為一種甘蔗根特異高效表達啟動子，具有序列表1中的序列。上述啟動子是包括從甘蔗總DNA中克隆的甘蔗己糖轉運蛋白基因(PST2a)的啟 動子，經測序其長度為1968bp，通過啟動子預測(Promoter predictions)等軟體進行基 礎啟動子的分析，結果表明該啟動子在540-590bp、908-958bp、1575_1625bp、1652-1702bp、 1894-1944bp存在五處基礎啟動子區。利用該啟動子序列與植物表達載體pCAMBIA1301構 建成一個含有甘蔗己糖轉運蛋白基因(PST2a)基因啟動子和GUS基因的新的植物表達載體 PCAMBIA1900。通過農桿菌介導法遺傳轉化甘蔗愈傷組織，獲取轉基因甘蔗植株，⑶S組織化 學染色結果顯示甘蔗己糖轉運蛋白基因(PST2a)基因啟動子是一個根特異性表達的啟動子。以下我們分為兩部分詳細介紹我們的發明內容。一、PST2a基因啟動子的克隆及植物表達載體的構建
1. PST2a基因啟動子的分離及序列分析甘蔗基因組DNA提取採用經改良的CTAB法小量提取甘蔗基因組DNA。根據基因 庫中已登錄的甘蔗己糖轉運蛋白基因(PST2a)基因的序列(登錄號為AY165599. 1)，按照染 色體步移試劑盒(Universal Genomeffalker Kit)的要求設計兩條引物Sl :5，-GCAACAAGAGCAGCTCCCGACATGTTTTC-3，；S2 5，-GCTCAACGATCCCTGCAACAGCGAGTTAA-3，。再依據試劑盒提供的引物、方法及反應條件進行PCR擴增。PCR擴增得到一條長 約2000bp的產物，擴增片段回收後與PMD-18T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細 胞，挑取陽性克隆，交上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序。測序結果表明 其為長1968bp，序列如序列表中1。通過啟動子預測(Promoterpredictions)等軟 件進行基礎啟動子的分析，結果表明在540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、 1894-1944bp存在五處基礎啟動子區。該啟動子具有高等植物啟動子應具有的調控元件，如 TATA盒、CAAT盒、轉錄起始位點及其他調控元件(表1)。表1 :PST2a基因啟動子元件分析
名稱個數代表序列序列中位點功能G-box2CACGTA378光反應順式調控元件ACIII element1GTTAGGTTC999維管束特異表達相關元件RY-repeat1CATGCA632核蛋白的結合位點GATA-box7GATA185,488,615, 752,1071,1658 1904特異性表達啟動子 的必需元件ABRE元件1TACGTG49脫落酸應答元件ARE元件1TGGTTT112厭氧應答所必需的元件HD-Zip3GTAAT736,772蛋白結合位點LTR元件1CCGAAA1543低溫應答元件MBS元件1CAACTG588乾旱誘導應答相關 的MYB結合位點Skn-Imotif2GTCAT535,1913植物胚乳形成有關TGACG-motif4TGACG436,954 1135,1316茉莉酸應答元件Circadian2CAANNNNATC253,298節律控制應答元件
2.根特異植物表達載體PCAMBIA1900的構建根據已測序的甘蔗己糖轉運蛋白基因(PST2a)基因啟動子序列，設計在5』端加上 BamH I 酶切位點的上遊引物 Pl (5，-GGATCCGGCATCTCGGCTTTCTACG-3，)和在 3，端加上 NcoI 酶切位點的下遊引物P2 (5，-CCATGGCGACCAAGAGCCAACTGAAG-3』 )。通過PCR反應擴增啟動 子目的片段，回收PCR產物，經測序無誤後再用BamH I和NcoI雙酶切該產物和植物表達載 體PCAMBIA1301，並將酶切獲得的含有兩個酶切位點的啟動子片段和pCAMBIA1301載體大 片段連接獲得含有PST2a基因啟動子的植物表達載體PCAMBIA1900。(圖1)二、PST2a基因啟動子的功能鑑定將pCAMBIA1900轉入農桿菌菌株EHA105中，轉化甘蔗愈傷組織，通過分化篩選培 養，獲得轉基因植株。待轉基因甘蔗植株長至成熟期，取其根、莖，葉組織，進行組織化學染 色和顯微觀察，證明該啟動子具有甘蔗根特異表達的特性。本發明提供一種甘蔗根特異高效表達啟動子序列及其植物表達載體，該啟動子以 其取代植物表達載體PCAMBIA1301上的組成型CaMV35S啟動子，構建一個新的植物表達載 體，利用該載體對甘蔗進行遺傳轉化，該啟動子具有組織特異表達功能，該啟動子的獲得， 對甘蔗抗病蟲、抗逆境等遺傳改良的研究具有重要意義。


圖1為含有PST2a基因啟動子的植物表達載體pCAMBIA1900示意圖。
圖2為轉基因甘蔗根的GUS染色圖。
圖3為轉基因甘蔗根的GUS染色圖。
圖4為轉基因甘蔗根的GUS染色圖。
圖5為轉基因甘蔗莖的⑶S染色圖。
圖6為轉基因甘蔗葉的GUS染色圖。
圖7為非轉基因甘蔗根的GUS染色圖。
圖8為非轉基因甘蔗莖的⑶S染色圖。
圖9為非轉基因甘蔗葉的GUS染色圖。
具體實施例方式下面用實施例對本發明做進一步說明。1.甘蔗葉片基因組DNA的提取取甘蔗葉片約lg，用液氮研磨成粉末狀，加入2ml已預熱的2% CTAB提取緩衝液 中，65°C溫浴1小時；4°C、10000r/min離心2_3分鐘，將上清轉至另一離心管中，加入等體 積氯仿異戊醇(24 l)，10000r/min離心10分鐘；取上清液加入等體積的異丙醇沉澱， 室溫放置30min ； 12000r/min離心lOmin，以70%的酒精洗滌2次，晾乾，溶於加有RNAse的 TE緩衝液中，37°C溫浴30min;加入等體積酚氯仿異戊醇(25 24 1)，輕輕顛倒、混 勻，12000r/min離心IOmin ；取上清液加酚氯仿異戊醇重複抽提1次；在上清中加入等 體積的異丙醇，混勻，室溫放置半小時，12000r/min離心10分鐘，去上清，沉澱用70%的酒 精洗滌2次，晾乾，溶於50 μ ITE緩衝液中。2.基因組DNA步行和擴增
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用幾種限制性內切酶Hindlll、EcoRI, PstI, XbaI分別對甘蔗基因組DNA進行 酶切消化。50μ1反應體系含IX反應緩衝液，5ygDNA和20u的限制性內切酶，37°C保 溫12小時；加入等體積的氯仿，顛倒混勻，室溫、12，000r/min離心5min ；取上清，加入2 倍體積的無水乙醇，1/10體積的3mol/L醋酸鈉NaAc (pH5. 2)，混勻，-20 °C靜置30min， 15，000r/min離心15min;沉澱用70 %乙醇洗滌兩次，晾乾，10 μ 1滅菌蒸餾水溶解；取 5μ1用於連接，連接體系為基因組酶切產物5 μ 1，盒式(Cassette)接頭2.5 μ 1，連接 酶 I (LigationSolution I ) 15 μ 1，連接酶 II (Ligation Solution ΙΙ)7·5μ1，總體積 30 μ 1，混勻後16°C連接過夜，反應完成後，用乙醇沉澱回收DNA，連接後的產物溶於10 μ 1 滅菌蒸餾水，該加接頭的甘蔗基因組酶切產物作為以下PCR擴增的模板。進行初級PCR 50 μ 1反應體系包含2 μ 1 DNA連接產物，1 X反應緩衝液，0. 5 μ 1 LA Tap 酶(5υ/μ 1)，8μ 1 dNTPs (各 2. 5mM)，1 μ 1 引物 Sl，ly 1 引物 Cl。反應程序為1 個 循環，94°C 5min ；30 個循環，94°C lmin,55°C 2min,72°C 4min ； 1 個循環，72°C 7min。將初級 PCR產物稀釋50倍。進行次級PCR。50 μ 1反應體系包含1μ 1稀釋的初級PCR產物，1 X反應緩衝 液，0. 5 μ 1 DNA 聚合酶(LA Tap) (5U/ μ 1)，8 μ 1 核苷酸混合物 dNTPs (各 2. 5mM)，1 μ 1 引 物S2，lyl引物C2。反應程序為1個循環，94°C 5min ;30個循環，94°C lmin，56°C 2min， 72°C 4min ；1個循環，72°C 7min。所擴增的PCR產物用1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測， 結果由HindIII產生的DNA庫中擴增出約2000bp的片段，從凝膠中純化回收目的產物。將 純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，挑取陽性克隆，交 上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。3.序列分析通過啟動子預測(Promoter predictions)等軟體進行基礎啟動子的分析，結果表 明在 540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、1894-1944bp 存在五處基礎啟動 子區。該啟動子具有高等植物啟動子應具有的調控元件，如TATA盒、CAAT盒、轉錄起始位 點及其他調控元件(表1)。4.根特異植物表達載體pCAMBIA1900的構建根據已測序的甘蔗己糖轉運蛋白基因PST2a基因啟動子序列，設計在5』端加上 BamH I酶切位點的上遊引物Pl (5』 -GGATCCGGCATCTCGGCTTTCTACG-3』 )和在3』端加上酶 NcoI切位點的下遊引物P2 (5，-CCATGGCGACCAAGAGCCAACTGAAG-3』)。通過PCR反應擴增啟 動子目的片段，50 μ 1反應體系包含1 μ IDNA稀釋的初級PCR產物，IX反應緩衝液，0.5μ 1 DNA聚合酶LATap (5U/ μ 1)，8 μ 1核苷酸混合物dNTPs (各2. 5mM)，1 μ 1引物P2，1 μ 1引物 Ρ2。反應程序為1 個循環，94°C 5min ；30 個循環，94°C lmin，56°C 2min，72°C 4min ；1 個循 環，72°C 7min。回收PCR產物，經測序無誤後再用BamH I和NcoI雙酶切該產物和植物表 達載體pCAMBIA1301，50y 1反應體系包含回收PCR產物或pCAMBIA1301質粒DNAlOul， 緩衝液Buffer E 5ul，BamHI 5ul，NcoI 5ul，BSA(IOO)O. 5ul，用無菌水將反應體系補充至 50yL。37°C水浴反應3小時後，用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回啟動 子片段和PCAMBIA1301雙酶切載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測回收結果。將酶切獲 得的含有兩個酶切位點的啟動子片段和PCAMBIA1301載體大片段連接獲得含有PST2a基 因啟動子的植物表達載體。反應體系如下7ul啟動子目的片段DNA，Iul pCAMBIA1301雙酶切載體，2ul連接酶緩衝液lOXligase buffer, Iul T4DNA連接酶。16°C連接過夜後，將 連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用BamH I和NcoI雙酶切鑑定重組子，命名為 PCAMBIA1900。5.凍融法轉化植物表達載體pCAMBIA1900至ΕΗΑ105中「凍融法」將植物表達載體pCBI1900導入農桿菌(ΕΗΑ105)中，具體操作為向農 桿菌(ΕΗΑ105)感受態細胞中加入1 μ g純化的Ti質粒DNA，混勻，冰上放置5min，置於液氮 速凍5min，立即用37°C水浴熱激5min，加入800 μ L YEP液體培養基。在28°C緩慢振蕩培 養(< 200r/min) 2_3h。IOOOOrpm離心50s,吸去部分上清，剩餘200 μ L菌液重懸菌體，把 菌液分別塗布於含鏈黴素(Str) 50ug/ml，利福平(Rif) 50ug/ml，卡那黴素(Km) 50ug/ml的 YEP固體培養基上，28°C倒置培養約48h，可見抗性菌落長出。挑取抗性菌落於相應抗生素 的YEP培養基中，搖菌24-48h，小量提取質粒進行酶切鑑定。PST2a基因啟動子的功能鑑 定1.農桿菌介導法轉化甘蔗1. 1外植體的處理以田間材料為轉化體，選取生長健壯植株的尾稍部分，逐層剝去外層老葉，再取其 距頂端生長點約IOcm左右的幼葉組織作為外植體。外植體先用75%的乙醇浸泡30sec後， 再用0. 1 %的升汞處理12min，後用無菌水洗3_4次，放在無菌的濾紙上吸乾水珠，再小心剝 去最外一層葉片組織，然後將其橫切成0. 2 0. 5mm厚的薄片並接種於Ml固體培養基上， 25°C黑暗培養。20天左右長出胚性愈傷組織，可直接用於轉化。1. 2農桿菌菌液的準備將經PCR鑑定的農桿菌在相應抗生素的YEP平板上劃線，挑取單菌落接種到 5mLYEP (含有 Kan 50 μ g/mL, Str50 μ g/mL, Rif 50 μ g/mL)的液體培養基中，於 28 °C， 200rpm振蕩培養至對數生長期(約24h)，於150mL三角瓶中擴大培養到IOOmL含有相同抗 生素的YEP培養基中，培養至OD為0. 6左右(IOh)，將菌液轉移到離心管中，4°C，5000rpm 離心5min，棄上清，吸乾殘液，用等體積(IOOmL)的MR液體培養基(含150 μ mol/LAS)重懸 菌體，最後置於28°C，200rpm激活2h，誘導細菌Vir基因的表達，作為轉化材料的浸染液。1. 3農桿菌菌液浸染愈傷組織及共培養將甘蔗胚性愈傷組織置於準備好的農桿菌工作菌液中浸泡約30-40min，期間用 無菌鑷子輕輕攪動愈傷組織。浸染30min後，用無菌漏勺濾去菌液，然後將胚性愈傷組織 轉移到濾紙上，在超淨工作檯中晾乾，直至材料表面乾爽、無水膜，並把材料組織塊切成 0. 3-0. 5cm的小塊，然後轉到含100 μ mol/L的AS的MS固體培養基上，22°C左右黑暗共培養 3-4d。共培養後用含CarfOOmg/L的無菌水洗滌胚性愈傷組織一次，再用無菌水洗2_3次， 最後再用MS液體培養基洗一次，置於無菌濾紙上在超淨工作檯中吹晾到材料乾爽後，將胚 性愈傷組織轉移到含有CarfOOmg/L的M2培養基上，28°C光下培養。1. 4農桿菌浸染後的愈傷組織分化成苗28°C，M2培養基上光下培養浸染過的胚性愈傷組織45天左右便能分化出小苗，期 間需要經常更換新鮮M2培養基，約15天左右更換一次，可降低農桿菌汙染機率，同時還要 剔除褐化和被農桿菌嚴重汙染的組織塊。1. 5甘蔗小植株的篩選培養及定植
挑選0. 5-3cm高的小苗，轉移到含有PPT2. 5-3. 5mg/L的M3培養基上篩選培養50 天左右，期間經常更換新鮮M3 (加PPT)培養基，約20天左右更換一次，並逐步進行分株。將 最後剩餘的抗性小苗按編號獨立培養於M3 (不加PPT)培養基上，當抗性小植株長到4-7cm 後，按編號剪取小苗葉片，約3-4cm、20mg左右，微量提取DNA，進行Bar和⑶S基因雙重PCR 檢測。雙重PCR陽性抗性苗經壯苗培養後，移植於沙床上。各培養基配方①Ml :MS+2,4-D lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 8g/L，pH 5. 8 ；②M2 :MS+6-BA lmg/L+KT 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 8g/L, pH 5. 8 ；③M3 :MS+IBA5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 8g/L，pH 5. 8 ；④MR 1/5MS 大量元素 +MS 其他成分 +2. 4Dlmg/L+IOmmol/L 果糖 +10mmol/L 葡萄 糖+30g/L蔗糖(固體培養基應加入卡拉膠8g/L)，pH 5. 3。2.⑶S組織化學染色取成熟轉基因及非轉基因甘蔗植株的根、莖(切片)、葉，放入IOml大離心管中， 加入 GUS 染色液[2. Ommol/L K3 [Fe (CN) 6], 2. Ommol/L K4 [Fe (CN) 6]，10mmol/L EDTA_Na2， 0. 辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)，0. 5mg/ml 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷 (X-Gluc)，氯黴素100 μ g/m，以50mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7. 0)配製]，材料全部浸泡在染 液中，蓋好蓋子防止揮發。37°C培養箱中溫育2h至過夜(時間可延長至1-2天)。取出材 料轉入70%酒精中脫色2-3次，直至陰性對照材料呈白色為止。取出材料放在載玻片上，置 於載物臺上，用光學顯微鏡觀察。在白色背景下的藍色斑點即為GUS表達位點，並照相。染 色材料可浸入標準固定液(70%酒精90ml，福馬林5ml，冰醋酸5ml)中保存。在組織化學染色試驗中，轉基因植株的根(附圖2-4)被染成藍色，莖(附圖5)、葉 (附圖6)均未被染成藍色，非轉基因植株的根(附圖7)、莖(附圖8)、葉(附圖9)均未被 染成藍色。說明用含有甘蔗己糖轉運蛋白基因PST2a啟動子區的表達載體pCAMBIA1900轉 化甘蔗材料，GUS基因只在根中表達。說明該啟動子是一個根特異性啟動子。
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權利要求
一種分離的甘蔗根特異表達啟動子，其特徵在於具有序列表1中的序列。
2.一種甘蔗根特異高效表達載體，其特徵在於利用了權利要求1所述的甘蔗根特異表 達啟運子驅動目的基因表達的植物表達載體。
3.根據權利要求2所述的甘蔗根特異高效表達載體，其特徵在於用權利要求1所述的 甘蔗根特異高效表達啟動子置換植物表達載體PCAMBIA1301上的CaMV35S啟動子，構建成 在啟動子下遊含有GUS基因的甘蔗根特異高效表達載體。
全文摘要
本發明涉及甘蔗根特異高效表達啟動子序列及其植物表達載體，該啟動子長1968bp，以其取代植物表達載體pCAMBIA1301上的組成型CaMV35S啟動子，構建一個新的植物表達載體，命名為pCAMBIA1900。利用該載體對甘蔗進行遺傳轉化，對轉基因植株的不同組織進行GUS組織化學染色顯示，該啟動子具有組織特異表達功能，即只在根中表達。該啟動子的獲得，對甘蔗抗病蟲、抗逆境等遺傳改良的研究具有重要意義。
文檔編號C12N15/113GK101948833SQ20101018483
公開日2011年1月19日 申請日期2010年5月13日 優先權日2010年5月13日
發明者張樹珍, 楊本鵬, 王文治, 蔡文偉, 馬滋蔓 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所