利用哺乳類β肌動蛋白啟動子的表達體系的製作方法

2023-12-10 04:21:56

專利名稱：利用哺乳類β肌動蛋白啟動子的表達體系的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白質的生產中更強力的啟動子，以及對攜帶該啟動子的載體的開發。
背景技術：
近年，許多生物製品上市。這些藥物中大多是將基因導入動物細胞而生產出的重組蛋白質。在動物細胞內有效生產這些重組蛋白質的技術降低了生物製劑的耗費，保證了對患者的穩定供應。
通常將EF1α(elongation factor 1)啟動子和SRα啟動子等用於上述表達載體(專利文獻1，非專利文獻1、2)。最近，為進一步提高表達效率，人們構建了CAG啟動子(人CMV增強子中組合了雞的β肌動蛋白啟動子)和CEF啟動子(人CMV增強子中組合了人EF1α啟動子)等強力啟動子，用於上述用途(非專利文獻3～5)。
但是，開發攜帶更強啟動子的載體的必要性仍然存在。期望這樣的啟動子對進一步降低生物製劑的耗費和穩定供給作出巨大貢獻。
專利文獻1WO92/19759非專利文獻1Mol.Cell.Biol.，Vol.8(1)，p.466-472，1988非專利文獻2Gene，Vol.87(2)，p.291-294，1990非專利文獻3Gene，Vol.272，p.149-156，2001非專利文獻4Analytical Biochemistry，Vol.247，p.179-181，1997非專利文獻5Gene，Vol.108，p.193-200，1991發明公開發明預解決的問題本發明是鑑於上述狀況而實施的，其目的是提供比目前存在的動物細胞表達啟動子更強的啟動子，和利用該啟動子的載體。另外，本發明的另一目的是利用該載體開發製備所需蛋白質的方法，以及開發表達所需DNA的方法。
解決課題的手段為了解決上述課題，本發明者們應用不同基因啟動子和增強子的組合比較、檢驗了啟動子的活性。
首先，根據NCBI和Jackson laboratory公開的小鼠基因組信息，獲得了小鼠β-肌動蛋白的序列信息，應用PCR擴增了小鼠β-肌動蛋白的5』區域。將擴增的PCR產物克隆到pGEM-T-Easy載體中，通過測序證實了鹼基序列。其後，通過PCR僅擴增了小鼠β-肌動蛋白的啟動子區域，重組到pGL3-Basic的Bgl II-Hind III位點。再向該載體中插入新黴素抗性基因，作為pmAct-Luc-neo。
通過PCR擴增土撥鼠肝炎病毒基因組序列的轉錄後調控區域(WPRE)，將反應產物克隆到pGEM-T-Easy載體中，測定鹼基序列。再用XbαI消化pGEM-T/WPRE，將所得WPRE片段插入到pmAct-Luc-neo的XbαI部位，製成pmAct-WPRE-Luc-neo。
然後，向pGL3-Basic載體的多克隆位點MCS(multi cloning site序列第5～53位)插入CMV增強子區域，構建表達載體pmAct-Luc-neo，或者插入人CMV增強子區域-小鼠β-肌動蛋白啟動子區域構建表達載體phCMV-mAct-Luc-neo(

圖1)。
將來自DHFR-DE-RVh-PM1-f(參考文獻WO92/19759)的人EF1α啟動子與CMV增強子一起插入pGLN載體的MCS製備pCEF-Luc-neo作為對照載體。
分別將這些載體導入CHO細胞，CO2培養箱內培養2天，應用螢光素酶分析系統測定螢光素酶活性。測定結果表明，製備的pmAct-Luc-neo的活性顯著高於其它載體(圖2)。以上結果顯示，本發明的小鼠β-肌動蛋白啟動子比已知的CEF啟動子更強。此外，還表明通過附加WPRE增強子或附加CMV增強子，小鼠β-肌動蛋白的啟動子活性明顯增強。
隨後，還檢測了同時表達反式激活蛋白的效果。進行了小鼠c-H-ras基因、小鼠活化型c-H-ras和人活化型K-ras的克隆，插入到pCXN載體中，分別叫做pCXN-H-Ras(小鼠c-H-ras)、pCXN-A-H-Ras(小鼠活化型c-H-ras)、pCXN-A-K-Ras(人活化型K-ras)。將兩種或3種類型的載體以不同的比例導入到CHO細胞，測定螢光素酶活性。結果表明，因pCXN-H-Ras(小鼠c-H-ras)、pCXN-A-H-Ras(小鼠活化型c-H-ras)、pCXN-A-K-Ras(人活化型c-K-Ras)的存在，增強了pmAct-Luc-neo的啟動子活性(圖4)。以上結果顯示，癌基因產物Ras(無論活化型還是野生型、H-Ras、K-Ras)賦予本發明的小鼠β-肌動蛋白啟動子更強的活性。
也就是說，本發明者們發現CMV增強子和哺乳類β-肌動蛋白啟動子的組合、或者土撥鼠肝炎病毒基因組序列的轉錄後調控區域(WPRE)和哺乳類β-肌動蛋白啟動子的組合能作為強力的啟動子。本發明者們還發現，通過與反式激活蛋白癌基因產物Ras共表達，帶有這些啟動子的表達體系的表達活性還可進一步提高。由此完成了本發明。
更具體而言，本發明涉及以下[1]～[37]。
一種DNA構建物，其中哺乳類β-肌動蛋白啟動子與增強子功能性連接。
[1]的DNA構建物，其中增強子為巨細胞病毒(CMV)。
[1]的DNA構建物，其中增強子為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
[1]～[3]任一項的DNA構建物，其中哺乳類β-肌動蛋白啟動子為嚙齒類β-肌動蛋白啟動子。
[2]的DNA構建物，其中CMV增強子包含序列號4所示的鹼基序列，哺乳類β-肌動蛋白啟動子包含序列號2所示的鹼基序列。
[3]的DNA構建物，其中土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)由序列號3所示的鹼基序列構成，哺乳類β-肌動蛋白啟動子由序列號2所示的鹼基序列構成。
一種載體，它包含[1]～[6]任一項中的DNA構建物。
[7]的載體，包含功能性結合到哺乳類β-肌動蛋白啟動子下遊的所需DNA的DNA。
[7]或[8]的載體，帶有可表達地編碼反式激活蛋白的DNA。
[9]的載體，其中反式激活蛋白為癌基因產物。
[10]的載體，其中癌基因產物為Ras。
[8]～[11]任一項的載體，其中所需DNA為編碼所需蛋白質的DNA。
一種帶有[8]～[12]任一項中載體的細胞。
一種帶有[8]～[12]任一項中載體、癌基因活化的細胞。
[14]的細胞，其中癌基因活化的細胞是導入了包含編碼反式激活蛋白基因的載體的細胞。
[14]的細胞，其中癌基因活化的細胞是癌化了的細胞。
[13]～[16]任一項的細胞是哺乳動物細胞。
[17]的細胞，是嚙齒類細胞。
[13]～[18]任一項的細胞，其特徵在於，它與β-肌動蛋白啟動子來源於相同的動物目。
[19]的細胞，其特徵在於，它與β-肌動蛋白啟動子來源於相同的動物種。
一種非人轉基因動物，其中導入了[8]～[12]任一項的載體。
一種全能性細胞，其中導入了[8]～[12]任一項的載體。
一種製備所需蛋白質的方法，它包括培養帶有[12]中載體的細胞，從培養的細胞或培養基中回收表達的蛋白質。
[23]中的方法，其中包括向培養基中添加反式激活蛋白。
一種在宿主細胞內表達所需DNA的方法，包括將[8]～[12]任一項的載體導入與載體上的β-肌動蛋白啟動子來源於相同動物目的宿主細胞。
一種在宿主細胞內表達所需DNA的方法，包括將[8]～[12]任一項的載體導入與載體上的β-肌動蛋白啟動子來源於相同動物種的宿主細胞。
一種在宿主細胞內表達所需DNA的方法，包括將[8]中的載體及帶有可表達地編碼反式激活蛋白的DNA導入與[8]中載體上的β-肌動蛋白啟動子同種來源宿主細胞。
[25]～[27]任一項的方法，其中宿主細胞為哺乳動物細胞。
[25]～[27]任一項的方法，其中宿主細胞為嚙齒類細胞。
一種增加所需DNA表達量的方法，其特徵在於，將來源於與宿主細胞相同動物目的β-肌動蛋白啟動子插入到所需DNA的上遊。
一種增加所需DNA表達量的方法，其特徵在於，將來源於與宿主細胞相同動物種的β-肌動蛋白啟動子插入到所需DNA的上遊。
[30]或[31]的方法，其特徵在於還插入了增強子。
[32]的方法，其中增強子為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
[32]的方法，其中增強子為CMV增強子。
[30]～[34]任一項的方法，其特徵在於插入了編碼反式激活蛋白的基因。
[30]～[35]任一項的方法，其中宿主細胞為哺乳動物細胞。
[30]～[35]任一項的方法，其中宿主細胞為嚙齒類細胞。
附圖簡述[圖1]表示實驗中所使用的載體。
現有啟動子CEF啟動子與小鼠β-肌動蛋白啟動子的比較圖。
表示WPRE、CMV增強子對小鼠β-肌動蛋白啟動子的效果。
表示小鼠的Ras蛋白對小鼠β-肌動蛋白啟動子的效果。
本發明的最佳實施方式本發明提供與增強子功能性連接的哺乳類β-肌動蛋白啟動子的DNA構建物、以及包含該構建物的載體。本發明的DNA構建物和載體可用於所需DNA的表達(例如，編碼所需蛋白質的DNA的表達、反義DNA的表達、編碼dsRNA的DNA的表達等)。
本發明中所謂哺乳類β-肌動蛋白啟動子與增強子「功能性連接」是指，具有本發明的啟動子活性的哺乳類β-肌動蛋白啟動子與增強子連接以增強啟動子活性。因此，哺乳類β-肌動蛋白啟動子與增強子之間既可相分離，也可插入其它的基因，只要能提高哺乳類β-肌動蛋白啟動子的啟動子活性均包含在上述「功能性連接」的範疇內。增強子可存在於哺乳類β-肌動蛋白啟動子的上遊或下遊。
此外，哺乳類β-肌動蛋白啟動子與所需DNA的「功能性連接」是指，哺乳類β-肌動蛋白啟動子與所需DNA結合，從而通過哺乳類β-肌動蛋白啟動子的活化誘導所需DNA的表達。該DNA與哺乳類β-肌動蛋白啟動子之間可以有任意的DNA序列，只要可誘導該DNA的表達即可。本發明中「DNA的表達」包含轉錄和翻譯兩方面。另外，所需DNA可編碼所需蛋白質。
本發明中對增強子無特殊限制，只要它能增加通過轉錄而生成的信使RNA(mRNA)的量即可。增強子是具有促進啟動子作用效果的鹼基序列，通常在100bp左右。無論其序列的方向如何，增強子可促進轉錄。雖然增強子自身不具有啟動子活性，但它們可從相距數千鹼基對的位置激活轉錄。此外，增強子可存在於被轉錄基因區域的上遊、下遊以及基因內，激活轉錄。如上所述，本發明中對增強子無特殊限制，只要它能增加通過轉錄而生成的mRNA即可。所以，通過抑制轉錄後mRNA的降解、穩定mRNA，而增加細胞內mRNA的含量、提高胺基酸翻譯效率的序列也包括在本發明的增強子範圍內。
本發明中應用的增強子可以是一種或兩種以上同一增強於，也可聯合應用不同種類的多個增強子。
本發明中應用的增強子包括WPRE、CMV增強子、HTLV-I的LTR中存在的R-U5』節段(Mol.Cell.Biol.，Vol.8(1)，p.466-472，1988)、SV40增強子、存在於兔β-球蛋白第二外顯子和第三外顯子之間的內含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.78(3)，p.1527-31，1981)、人生長激素的基因組區域(J Immunol.，Vol.155(3)，p.1286-95，1995)等，但更優選WPRE或CMV增強子。
據報導WPRE是與存在於土撥鼠肝炎病毒基因組序列(GenBankAccession No.J04514)的HBVPRE(人B型肝炎病毒轉錄後調控元件)相類似的區域，是基因組序列第1093位到1684位的592個鹼基的轉錄後調控區域(Journal of Virology，Vol.72，p.5085-5092，1998)。其後，通過用逆轉錄病毒載體進行分析發現，WPRE插入到目的基因3』末端的非翻譯區域可將蛋白質的產量提高5～8倍。另外也有報導，通過插入WPRE也可抑制mRNA的降解(Journal of Virology，Vol.73，p.2886-2892，1999)。廣義上講，象WPRE這樣，通過穩定mRNA而提高胺基酸的翻譯效率的，也屬於增強子。本發明中應用的WPRE更優選序列號3所示的鹼基序列的DNA。
CMV增強子也可用於與WPRE同樣的目的。本發明中應用的巨細胞病毒既可是感染人類的巨細胞病毒(人巨細胞病毒)，也可是感染非人動物的巨細胞病毒。感染非人動物的巨細胞病毒可應用，例如感染嚙齒類的巨細胞病毒(例如，小鼠巨細胞病毒等)。CMV增強子可應用已知的序列，例如可應用GenBank Accession No.X17403(人巨細胞病毒)、GenBank Accession No.L06816(小鼠巨細胞病毒)中記載的CMV增強子。商品化的表達載體(例如，Stratagene的pCMV-Script、Invitrogen的pcDNA3.1)大多將CMV增強子作為CMV啟動子的一部分而插入的。本發明中應用的CMV增強子更優選序列號4所示的鹼基序列的DNA。
啟動子是啟動以DNA為模板的轉錄開始的DNA上的特定鹼基序列。通常具有共有序列，例如對於大腸桿菌等原核生物，通常轉錄開始部位的-10鹼基對部位具有TATAATG序列，-35鹼基對部位具有TTGACA序列。真核生物中，通常-20鹼基對部位具有TATA盒(box)。
可應用哺乳類β-肌動蛋白啟動子作為本發明的β-肌動蛋白啟動子。哺乳類β-肌動蛋白啟動子可應用人類β-肌動蛋白啟動子和嚙齒類β-肌動蛋白啟動子等任何哺乳類來源的β-肌動蛋白啟動子，但優選應用嚙齒類β-肌動蛋白啟動子。作為嚙齒類β-肌動蛋白啟動子可應用，例如小鼠β-肌動蛋白啟動子(GenBank Accession No.NT-039317)、大鼠β-肌動蛋白啟動子(GenBank Accession No.NW-042778)等。本發明中應用的哺乳類β-肌動蛋白啟動子更優選序列號1或2所示的鹼基序列。
嚙齒類包括屬於大白鼠亞目(Myomodonta)、松鼠亞目(Sciuromorpha)、河狐形亞目(Castorimorpha)、始齧亞目(Protrogomorpha)、Bathygeromorphi、豪豬形亞目(Hystricognatha)、豚鼠形亞目(Caviomorpha)的動物，更具體的講，包括小鼠、大鼠、倉鼠等。
通常載體是指用於將所需的基因導入細胞、表達擴增所需基因的運載DNA分子，優選它是營養缺陷型的，具有公知的限制性酶切位點、在宿主內具有複製的能力。通常，載體可包含啟動子、增強子、終止子、SD序列、翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子、複製起始點等。必要時，載體內還可包含能選擇導入了載體的細胞的選擇性標記。選擇性標記包括氨苄青黴素、四環素、卡那黴素、氯黴素、新黴素、潮黴素、嘌呤黴素、零黴素等耐藥基因，能以半乳糖苷酶等酶活性為指標進行篩選的標記，或者能以GFP等螢光發光為指標進行篩選的標記。另外，也可應用能以EGF受體、B7-2等表面抗原為指標進行篩選的選擇性標記。通過應用這樣的選擇性標記，只有那些導入了所述載體的細胞，也就是說只有導入了本發明的載體的細胞才能被篩選出來。此外，載體中還可包含用於多肽分泌的信號序列。作為用於多肽分泌的信號序列，當產生到大腸桿菌的外周質中時，可使用pelB信號序列(J.Bacteriol.，Vol.169(9)，p.4379-4383，1987)。
對本發明中應用的載體無特殊限制，可應用任何載體。具體而言，可以列舉出，例如哺乳動物來源的表達載體(例如pcDNA3(Invitrogen)、pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.，18(17)，p.5322，1990))、pEF、pCDM8、pCXN，昆蟲來源的載體(例如，Bac-to-BAC杆狀病毒表達系統(Invitrogen)、pBacPAK8)，植物來源的表達載體(例如，pMH1、pMH2)、動物病毒來源的載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、逆轉錄病毒來源的載體(例如，pZIPneo)，酵母來源的載體(例如，Pichia Expression Kit(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)，枯草桿菌來源的載體(例如，pPL608、pKTH50)，大腸桿菌載體(例如，M13系載體，pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script)等。本發明中優選應用可以在哺乳動物細胞內表達的載體，或優選應用表達載體。
當用CHO細胞作宿主細胞時，為了使基因穩定表達，且細胞內基因的拷貝數目擴增，可向缺失核酸合成路徑的CHO細胞內導入具有能彌補該缺陷的DHFR基因的載體(例如pCHOI等)，可應用氨甲蝶呤(MTX)使之擴增。
本發明的載體中還可包含編碼反式激活蛋白的DNA。反式激活蛋白是一種能激活基因轉錄的反式作用因子，也叫做反式活化因子。已知的反式激活蛋白有的具有DNA結合能力，通過與順式元件結合而直接促進轉錄，有的不具有DNA結合能力，通過活化其它因子而間接促進轉錄。對本發明中使用的反式激活蛋白無特殊限制，可應用任何一種反式激活蛋白。反式激活蛋白的具體實例包括腺病毒的E1A、人免疫缺陷病毒的Tat、人T細胞白血病病毒的Tax、癌基因產物等，但本發明中優選應用癌基因產物。癌基因是一組基因的總稱，它們存在於動物的正常細胞內，通過其突變活化而誘導細胞癌化。病毒擁有的癌基因叫做病毒性癌基因，作為其來源的正常細胞的基因叫做細胞性癌基因。癌基因的例子包括，例如src、yes、fgr、fms、erbB、abl、kit、crk、mos、raf、sis、ras、myc、fos、jun等。據報導人活化型H-Ras提高插入了β-肌動蛋白啟動子的表達載體的表達效率(Cytotechnology，Vol.16，p.167-178，1994)，本發明中也優選應用Ras。Ras有K-ras、H-ras、N-ras、c-ras，當包含rho基因家族、rab基因家族時稱作ras超家族。本發明中優選應用H-ras。應用Ras作為反式激活蛋白時，Ras既可是野生型也可是活化型。本發明中應用的H-ras更優選序列號5或6的任一種DNA，或者編碼序列號7或8的胺基酸序列的DNA。
此外，本發明的載體可設計為時期特異性地表達基因。時期特異性表達基因的方法包括，例如應用Cre-loxP系統等位點特異性重組的方法。
Cre是來源於大腸桿菌噬菌體P1的重組酶，介導2個loxP序列間的位點特異性重組。loxP序列由8bp位於2個13bp反方向重複序列側翼之間的間隔區域構成，它作為Cre結合的識別序列發揮作用。當將loxP序列插入載體抑制所需基因的表達時，可通過施用Cre除去loxP序列而在合適的時期表達所需的基因。loxP序列的插入部位，可在啟動子和所需基因之間等，只要是抑制所需基因表達的部位即可。Cre的施用既可施用Cre自身，也可施用編碼Cre的基因。轉基因動物等動物中應用Cre-loxP系統時，可通過例如表達Cre的腺病毒感柒而表達所需的基因(Nucleic.Acids.Res.，Vol.23(19)，p.3816-3821，1995)。利用這樣的酶進行位點特異性重組還包括利用Flp-FRT、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)pSR1、解離酶-rfsF、噬菌體Mu Gin等。
此外，除了上述時期特異性表達體系之外，還可應用利用四環素等抗生素的方法，和利用蛻皮激素等激素的方法等。這些方法是本領域技術人員公知的方法，可應用商品化的試劑盒(蛻皮激素表達系統(Invitrogen)、四環素表達系統(Clontech)等)。
本發明還提供導入了本發明載體的宿主細胞。本發明的宿主細胞可作為例如製備和表達所需蛋白質的生產體系使用。作為導入本發明載體的宿主細胞無特殊限制，可使用已經建系的細胞、原代培養的細胞、動物個體、受精卵等任何一種細胞種類。作為本發明的宿主細胞，可應用例如各種動物細胞(例如，哺乳動物細胞)和大腸桿菌等。使用真核細胞時，可應用例如，動物細胞、植物細胞、真菌細胞作為宿主細胞。作為動物細胞，已知有人類、小鼠、倉鼠等哺乳類細胞(例如，CHO、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero)，兩棲類細胞(例如非洲爪蟾卵母細胞(Nature，Vol.291，p.358-360，1981)，或者昆蟲細胞(例如，Sf9、Sf21、Tn5)等。CHO細胞，特別優選應用缺失了DHFR基因的CHO細胞dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4216-4220，1980)和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.60，p.1275，1968)。作為植物細胞，例如菸草(Nicotianatabacum)來源的細胞，已知可作為多肽的生產體系，可以愈傷組織培養。作為真菌細胞，已知有酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，絲狀菌，例如麴黴屬(Aspergillus)，已知如黑麴黴(Aspergillus niger)。使用原核細胞時，利用應用細菌細胞的生產體系。作為細菌細胞包括大腸桿菌(E.coli)，例如JM109、DH5α、HB101等，其它的有枯草桿菌。本發明中優選的宿主細胞包括動物細胞，更優選哺乳動物細胞，特別優選嚙齒類細胞(例如CHO細胞)。
也可應用癌基因活化了的細胞作為本發明的宿主細胞。癌基因活化了的細胞是指與正常細胞相比，癌基因的表達量多的細胞，或者表達突變了的癌基因的細胞。
癌基因活化了的細胞既可是人為活化癌基因的細胞，也可是非人為地活化了癌基因的細胞。作為人為活化癌基因的細胞的具體例子包括導入了含癌基因(野生型或活化型)載體的細胞，和癌基因中人為導入突變的細胞等。作為非人為活化癌基因的細胞的具體例子包括癌化了的細胞(即T24人膀胱癌細胞Nature，Vol.302，p.33-37，1983)等。癌基因活化的機制有啟動子插入、點突變、基因擴增、轉座等。
本領域技術人員可根據細胞的種類適當選擇將本發明的載體導入上述細胞的方法。例如，導入到哺乳動物細胞時可應用選自磷酸鈣法(Virology，Vol.52，p.456，1973)、DEAE-葡聚糖法、應用陽離子脂質體DOTAP(Roche Diagnostics)的方法、電穿孔法(Nucleic.Acids.Res.，Vol.15，p.1311，1987)、脂質轉染法(J.Clin.Biochem.Nutr.，Vol.7，p.175，1989)、病毒感染導入法(Sci.Am.，p.34，1994)、粒子槍等中的任一種方法，導入植物細胞時，可通過電穿孔法(Nature，Vol.319，p.791，1986)、聚乙二醇(EMBO J.，Vol.3，p.2717，1984)、粒子槍法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.185，p.8502，1988)、根癌農桿菌介導的方法(Nucleic.Acids.Res.，Vol.12，p.8711，1984)等進行。
也可應用Trans IT(TaKaRa)、PolyFect Transfection Reagent(QIAGEN)、LipofectAMINE(Invitrogen)等試劑盒。此外，本發明的宿主細胞除包含本發明的載體以外，還可包含具有編碼反式激活蛋白的DNA的載體。
本發明還涉及應用本發明的載體的所需蛋白質的製備方法，以及表達所需DNA的方法。用於製備蛋白質的生產體系有體外和體內的生產體系。體外的生產體系包括使用真核細胞的生產體系和使用原核細胞的生產體系。例如，體外培養上述宿主細胞而得到所需蛋白質。可按照公知的方法進行培養。例如，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM、F10培養基、F12培養基等作為動物細胞的培養液。此時，可並用胎牛血清(FCS)等血清補充液，也可無血清培養。還可向培養基中添加反式激活蛋白。培養時的pH優選6～8。通常，約30～40℃培養約15～200小時，必要時更換培養基，通氣、攪拌。由於培養條件因所使用的細胞種類不同而異，本領域技術人員可適當確定出適宜的條件。例如，培養CHO細胞時，通常CO2氣濃度為0～40％，優選2～10％的條件下，30～39℃、優選約37℃，培養1-14天。作為動物細胞培養用的各種培養裝置，可應用例如發酵罐型tank培養裝置、空運型培養裝置、培養瓶型培養裝置、攪拌式細胞培養型(spinner flask)培養裝置、微載體型培養裝置、流動層型培養裝置、中空纖維(hollowfiber)型培養裝置、滾瓶型培養裝置、填充槽型培養裝置等進行培養。
另一方面，作為體內的生產體系包括，例如使用動物的生產體系和使用植物的生產體系。將目的DNA導入這些動物或植物，在動物或植物體內生產、回收多肽。本發明中的「宿主」包含這些動物、植物。使用動物時，有應用哺乳動物、昆蟲的生產體系。可應用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等哺乳動物(Vicki Glaster，SPECTRUM BiotechnologyApplications，1993)。應用哺乳動物時可應用轉基因動物。例如，可將編碼所需蛋白質的DNA與編碼山羊β酪蛋白等在乳汁中固有產生的多肽的基因一起製備成融合基因。接下來，將包含融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎，將該胚胎移植到雌性山羊中。可從接受胚胎的山羊產生的轉基因羊或其子孫產生的乳汁中獲得所需蛋白質。為了增加轉基因羊產生的含多肽的乳汁量，也可給轉基因羊使用適當的激素(Bio/Technology，Vol.12，p.699-702，1994)。作為昆蟲可使用，例如蠶。應用蠶時，可通過用插入了編碼所需蛋白質的DNA的杆狀病毒感染蠶，從蠶的體液中獲得所需蛋白質(Nature，Vol.315，p.592-594，1985)。
此外，當使用植物時，可使用例如菸草。使用菸草時，可將編碼所需蛋白質的DNA插入到植物表達用載體，例如pMON530中，將該載體導入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)等桿菌中。用該桿菌感染例如菸草(Nicotiana tabacum)，從該菸草的葉中獲得所需蛋白質(Eur.J.Immunol.，Vol.24，p.131-138，1994)。
本發明的蛋白質製備方法中，基因的表達可是瞬時表達。以基因的瞬時表達為目的時，例如可應用以具有SV40複製起點的載體(pcD等)轉化染色體上有表達SV40T抗原基因的COS細胞的方法。也可應用來源於多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)的複製起始點。此外，為了提高宿主細胞內基因的拷貝數，表達載體可包含氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。此外，如基因治療等在生物體內表達所需蛋白質時，可將所需的基因插入到載體中，通過例如逆轉錄病毒法、脂質體法、陽離子脂質體法、腺病毒法等將載體導入生物體內。所應用的載體包括，例如腺病毒載體(例如pAdexlcw)和逆轉錄病毒載體(例如pZIPneo)等，但並不限定於此。將所需基因插入到載體等常規的基因操作按照常規方法進行即可(Molecular Cloning，5.61-5.63)。在生物體內施用時，既可用先體外後體內的方式，也可活體內的方式。
按照本發明獲得的所需蛋白質，可從宿主細胞內或細胞外(培養基等)進行分離，純化成基本上純粹、均一的蛋白質。蛋白質分離、純化可使用通常蛋白質純化中所使用的分離、純化方法，對此無任何限制。例如，可適當選擇或聯合應用色譜柱、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳、透析、再結晶等進行分離、純化。作為色譜柱法包括，例如親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、反相色譜、吸附色譜等(Strategies for Protein Purification and CharacterizationALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshaks et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1996)。這些色譜法可應用液相色譜，例如HPLC、FPLC等液相色譜法。純化前或純化後，通過適當的蛋白質修飾酶作用於蛋白質，可添加任意的修飾或進行部分肽的去除。作為蛋白質修飾酶可應用例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、賴氨醯基內肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
製備所需蛋白質時可應用本發明的載體、DNA構建物或宿主細胞。本發明中，所需蛋白質可以是任何蛋白質，也包含蛋白質片段和肽等。作為所需蛋白質的具體例子包括抗體、促紅細胞生成素、集落刺激因子(粒細胞、巨噬細胞、粒細胞巨噬細胞)、白細胞介素1～31、幹擾素、RANTES、淋巴毒素β、Fas配體、flt-3配體、NF-κB受體活化因子的配體(RANKL)、TNF相關的凋亡誘導配體(TRAIL)、CD40配體、OX40配體、4-1BB配體(以及TNF家族的其它成員)、胸腺基質來源的促淋巴細胞生成素、肥大細胞生長因子、幹細胞生長因子、上皮生長因子、生長激素、腫瘤壞死因子、白血病抑制因子、抑瘤蛋白M、血細胞生成素類的造血因子等細胞因子、生長因子等。
此外，本發明的載體或DNA構建物也可用於轉基因動物的製備。轉基因動物的製備可用公知的方法，例如按下述方式製備。首先，將有待在轉基因動物內表達的基因插入到本發明的DNA構建物或本發明的載體中。將該載體、DNA構建物或從中切出的表達盒導入全能性細胞中。可應用受精卵、初期胚、胚胎幹細胞(ES細胞)作為全能性細胞。全能性細胞的導入可通過靜電脈衝、脂質體法、磷酸鈣法、顯微注射或逆轉錄病毒感染等常用的方法進行。將經過上述處理的全能性細胞移植到母體的輸卵管內，使其產仔，從所產仔中篩選具有目的基因的個體。要通過應用目的基因特異的引物進行Southern印跡或PCR來確定是否存在具有目的基因的個體。
對轉基因動物無特殊限制，只要是人以外的動物即可，包括小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、豬、小型豬、牛、綿羊、貓、狗等哺乳動物，小雞等鳥類，魚類，昆蟲類，線蟲類等。從操作上考慮，優選嚙齒類，特別優選小鼠。
本發明的載體或DNA構建物也可用於反義法和RNAi等中。反義法是指具有目的基因互補序列的寡核苷酸存在於細胞內，該反義鏈(反義DNA、反義RNA等)通過與目的基因(目的mRNA、目的DNA)的鹼基配對而抑制轉錄、翻譯，從而抑制目的基因的表達。因此，通過將反義寡核苷酸插入到本發明的載體或DNA構建物中，用該載體或DNA構建物轉化細胞，即可抑制細胞內目的基因的表達。
另外，也可應用RNA幹擾(RNA interfeareneceRNAi)抑制目的基因。RNAi是這樣一種現象當將雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞內時，能特異性降解細胞內與該RNA序列對應的mRNA，從而抑制蛋白質的表達。通常應用雙鏈RNA進行RNAi，也可應用自身互補的單鏈RNA中形成的雙鏈RNA。形成雙鏈的區域即可貫穿全部區域，也可在其部分區域(例如兩末端或單方末端)形成單鏈。RNAi中應用的寡RNA大多應用10～100bp的RNA，通常用19～23bp。因此將設計出的在細胞內形成雙鏈RNA的基因插入到本發明的DNA構建物或本發明的載體中，用該載體或DNA構建物轉化細胞，即可抑制細胞內目的基因的表達。RNAi方法可按照Nature，Vol.391，p.806，1998；Proc.Natl.Acsd.Sci.USA，Vol.95，p.15502，1988；Nature，Vol.395，p.854，1998；Proc.Natl.Acsd.Sci.USA，Vol.96，p.5049，1999；Cell，Vol.95，p.1017，1998；Proc.Natl.Acsd.Sci.USA，Vol.96，p.1451，1999；、Proc.Natl.Acsd.Sci.USA，Vol.95，p.13959，1998；Nature Cell Biol.，Vol.2，p.70，2000等中記載的進行。
此外，本發明的DNA構建物或本發明的載體也可用於基因治療。基因治療是一種以修正突變基因為目的，將正常基因從外部導入患者的細胞內，通過改變細胞的表型而治療疾病的方法。基因治療不僅對遺傳性疾病有效，而且對愛滋病和癌症等其它疾病有效。基因治療分為將基因直接導入生物體，使基因整合到細胞內重組的方法(體內法)，和採集患者的細胞，將基因體外導入到細胞內，再將該細胞移植到患者的方法(先體外後體內法)。
對導入基因的方法沒有任何限制，可通過顯微注射、磷酸鈣法、電穿孔法、粒子槍法、應用逆轉錄病毒等病毒載體的方法進行實施。目前，基因治療中廣泛應用病毒載體。作為病毒載體應用的病毒的例子包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、多瘤病毒、乳頭瘤病毒和慢病毒等。
象粒子槍那樣將基因直接導入的方法已經建立。用體內法導入基因時，對其施用途徑沒有限制，可應用任何途徑，例如可靜脈內、肌肉、皮下、皮內、黏膜、心臟和肝臟等臟器內直接施用。如此，將待導入患者細胞內的基因插入到本發明的DNA構建物或本發明的載體中，通過體內法或先體外後體內法將該DNA構建物或載體導入患者細胞內，進行基因治療。基因治療的具體方法可參照別冊實驗醫學基因治療的基礎技術(羊土社)、別冊實驗醫學基因導入和表達分析實驗法(羊土社)、日本基因治療學會編基因治療開發研究手冊(NTS)。
此外，本發明的DNA構建物或本發明的載體也可用於DNA疫苗的表達。DNA疫苗分為兩種方法，使抗原DNA在體內表達，誘導針對抗原的免疫應答的方法，和以CpG的重複序列作為免疫增強物質的接種方法。接種DNA疫苗時，可在體內合成抗原蛋白質，誘導與病毒等的自然感染同樣的免疫應答。表達DNA疫苗的載體、施用方法、施用途徑等可按與基因治療同樣的方法進行。
此外，本發明的載體或DNA構建物可作為免疫原用於抗體的製備(J.Virol.，Vol.70(9)，p.6119-25，1996)。為了表達作為免疫原的蛋白質或肽，構建本發明的DNA構建物或載體，通過將該載體或DNA構建物施用給免疫動物，在免疫動物的體內表達作為免疫原的蛋白質或肽，產生針對該蛋白質或肽的抗體。更具體而言，例如可按如下方法製備抗體。
首先，將編碼成為免疫原的蛋白質或肽的基因插入到本發明的DNA構建物或載體中。將該DNA構建物或載體施用給免疫動物(非人動物)。可用任何方法進行施用，除直接施用載體的方法之外，還可通過，例如電穿孔法、粒子槍法、應用逆轉錄病毒等病毒載體的方法進行施用。還可與化學物質(布比卡因等)其它物質一起施用。施用途徑可應用任何途徑，例如可靜脈內、肌肉、皮下、皮內、黏膜、心臟和肝臟等臟器內直接施用等。對用致敏抗原免疫的哺乳動物無特殊限制，但優選考慮到與細胞融合時使用的親代細胞的兼容性進行選擇，通常使用嚙齒類動物，例如可使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔、猴等。免疫這樣的哺乳動物，當確認血清中目的抗體的水平上升後，從哺乳動物中分離免疫細胞，進行細胞融合。脾細胞作為特別優選的免疫細胞。
應用哺乳動物的骨髓瘤細胞作為與上述免疫細胞融合的其它親代細胞。優選應用公知的各種細胞株作為該骨髓瘤細胞，例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.，Vol.123，p.1548-1550，1979)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology，Vol.81，p.1-7，1978)、NS-1(Eur.J.Immunol.，Vol.6，p.511-519，1976)、MPC-11(Cell，Vol.8，p.405-415，1976)、SP2/0(Nature，Vol.276，p.269-270，1978)、FO(J.Immunol.Methods，Vol.35，p.1-21，1980)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.Vol.148，p.313-323，1978)、R210(Nature，Vol.277，p.131-133，1979)。上述免疫細胞與骨髓瘤細胞間的細胞融合可基本上按照公知的方法，例如按照Kohler和Milstein(Methods Enzymol.，Vol.73，p.3-46，1981)的方法進行。更具體的講，上述細胞融合可在細胞融合促進劑的存在下在常規的營養培養液中進行。作為融合促進劑可使用，例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，可添加二甲基亞碸等輔助劑以進一步提供融合效率。
免疫細胞與骨髓瘤細胞使用的比率可任意設定。例如優選免疫細胞為骨髓瘤細胞的1-10倍。上述細胞融合中應用的培養液可應用適於上述骨髓瘤細胞增殖的RPMI1640培養液、MEM培養液，其它的用於這種細胞培養的常用的培養液，還可補充胎牛血清(FCS)等血清補充液。細胞融合是，在上述培養液中充分混和預定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞，通常添加30-60％(w/v)濃度的預溫到約37℃的PEG溶液(例如平均分子量1000-6000左右)，混和，形成融合細胞(雜交瘤)。接下來，連續添加適當的培養液，離心除去上清，重複這樣的操作，以去除不利於雜交瘤生長的細胞融合劑。
可通過用常規的選擇培養液，例如HAT培養液(包含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養液)進行培養，來篩選所得雜交瘤。為了使目的細胞雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡，在上述HAT培養液的培養要持續足夠的時間(通常數天～數周)。
除了給人以外的動物免疫抗原獲得上述雜交瘤以外，還可體外致敏淋巴細胞，使致敏的淋巴細胞與人來源的具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，從而獲得具有結合活性的所需的人抗體(參照特開平1-59878)。此外，還可將抗原施用給具有人抗體基因的全部指令的轉基因動物，獲得抗體產生細胞，從該無限增殖化細胞獲得針對抗原的抗體(參照國際專利申請公開號WO94/25585號公報、WO93/12227號公報、WO92/03918號公報、WO94/02602號公報)。如此製備的產生單克隆抗體的雜交瘤，可在常規的培養液中傳代培養，還可在液氮中長期保存。從該雜交瘤獲得單克隆抗體的方法包括按常規方法培養該雜交瘤，獲得其培養上清的方法；或者將雜交瘤接種到適宜的哺乳動物中使之增殖，獲得其腹水的方法。前者適於獲得高純度的抗體，而後者適於抗體的大量生產。
本發明中也可應用重組的單抗作為單克隆抗體，即從雜交瘤克隆抗體基因，插入到適宜的載體中，將載體導入宿主細胞，應用基因重組技術產生重組型單抗(例如，參照Eur.J.Biochem.，Vol.192，p.767-775，1990)。
具體而言，從產生抗體的雜交瘤分離出編碼抗體可變(V)區域的mRNA。按照公知的方法進行mRNA的分離，例如通過鳥嘌呤超離法(Biochemistry，Vol.18，p.5294-5299，1979)、AGPC法(Anal.Biochem.，Vol.162，p.156-159，1987)等製備總RNA，使用mRNA Purification Kit(Pharmacia)等製備目的mRNA。也可通過應用QuickPrep mRNAPurification Kit(Pharmacia)直接製備mRNA。應用逆轉錄酶從所得mRNA合成抗體V區域的cDNA。可用AMV Reverse TranscriptaseFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(生化學公司)等進行cDNA的合成。此外，可使用5』-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)和應用PCR的5』-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.85，p.8998-9002，1988；NucleicAcids Res.，Vol.17，p.2919-2932，1989)等進行cDNA的合成及擴增。從所得PCR產物純化出目的DNA片段，與載體DNA連接。由此製備重組載體，導入大腸桿菌等，選擇集落，製備成所需的重組載體。然後，用公知的方法，例如雙脫氧核苷鏈終止方法確認目的DNA的鹼基序列。獲得編碼抗體V區域的目的DNA後，將其插入到含有編碼所需抗體恆定區域(C區域)的DNA的表達載體中。
為了製備抗體，通常將抗體基因插入到表達載體中，使之在表達調控區域，例如增強子、啟動子的調控下進行表達。隨後，用表達載體轉化宿主細胞，使之表達抗體。抗體基因的表達，既可將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別插入到表達載體中，同時轉化宿主細胞；也可將編碼H鏈和L鏈的DNA插入到單一表達載體中，然後轉化宿主細胞(參照WO94/11523號公報)。
如上所述，本發明的DNA構建物或載體可適用於所需蛋白質的製備、反義法、RNAi法、基因治療、DNA疫苗、轉基因動物、抗體的製備等。
此外，本發明還涉及在宿主細胞內表達所需DNA的方法，它包含將本發明的載體導入與該載體上的β-肌動蛋白啟動子同種動物目來源的宿主細胞內。
所謂動物目是指，在生物有機體Linnaean式等級分類系統中，位於綱之下，科之上的基本等級，或其等級中的門類。作為具體的動物目包括，例如齧齒目、兔形目、象鼻鼩(Macroscelidea)、樹鼩目(Scandentia)等，但優選齧齒目。齧齒目中包含倉鼠、大鼠、小鼠、豚鼠、松鼠、海狸等。通過應用與宿主細胞同一動物目來源的β-肌動蛋白啟動子，可增加所需基因的表達量。
此外，本發明還涉及在宿主細胞內表達所需DNA的方法，它包含將本發明的載體導入與該載體上的β-肌動蛋白啟動子相同動物種來源的宿主細胞內。
相同動物種來源是指宿主細胞是人細胞時應用人β-肌動蛋白啟動子，宿主細胞是小鼠細胞時應用小鼠β-肌動蛋白啟動子，宿主細胞是倉鼠細胞時應用倉鼠β-肌動蛋白啟動子。按照此方法，通過應用宿主細胞同種來源的β-肌動蛋白啟動子，可增加所需基因的表達量。
此外，本發明還涉及增加所需基因表達量的方法，其特徵在於，應用與宿主細胞相同動物目來源的β-肌動蛋白啟動子。動物目的定義與上面相同。通過應用與宿主細胞相同動物目來源的β-肌動蛋白啟動子，可增加所需基因的表達量。
此外，本發明還涉及增加所需基因表達量的方法，其特徵在於，應用與宿主細胞相同動物種來源的β-肌動蛋白啟動子。相同動物種的定義與上面相同。通過應用與宿主細胞相同動物種來源的β-肌動蛋白啟動子，可增加所需基因的表達量。
此外，本發明中可應用反式激活蛋白來增加所需DNA的表達量。反式激活蛋白既可將含有編碼反式激活蛋白的DNA的載體導入宿主細胞，培養時使反式激活蛋白表達，也可向培養基中添加反式激活蛋白。編碼反式激活蛋白的DNA既可與編碼所需蛋白質的DNA插入到同一載體中，也可插入到不同的載體中，將兩種載體導入細胞內。
先前本說明書中引用的所有文獻均在此引入作為參考。
實施例以下，通過本發明的實施例進一步進行具體說明，但本發明並不限定於實施例。
表達載體pmAct-Luc-neo的構建(1)小鼠β-肌動蛋白啟動子的克隆根據NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及Jacksonlaboratory(http://www.jax.org)公開的小鼠基因組信息，可獲得小鼠β-肌動蛋白的序列信息。合成如下所示的引物序列mAct5-F1(5』-GGGAGTGACTCTCTGTCCATTCAATCC-3』/SEQ ID NO9)及mAcr5-R1(5』-TTGTCGACGACCAGCGCAGCGATATCG-3』/SEQ ID N010)(Especoligo service Co.)，通過PCR擴增小鼠β-肌動蛋白的啟動子區域(1577bp)。應用Takara Bio公司的Takara LA Taq with GC Buffer(cat.RR02AG)的試劑，使用Clontech的Mouse Genomic DNA(cat.6650-1)作為模板DNA，進行PCR。PCR反應液的組成是模板DNA(100ng/ml)1.0μl，2×GC Buffer I 25.0μl，dNTP混合物8.0μl，mAct5-F1(10μM)2.0μl，mAcr5-R1(10μM)2.0μl，H2O 11.5μl，LA Taq(5U/μl)0.5μl。PCR的條件是95℃1分鐘，『95℃30秒、60℃30秒、72℃90秒』35個循環，72℃7分鐘終止反應。用Gene Amp PCR System2400(Applied Biosystems)進行PCR。擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，切出1577bp的條帶，用Mag Extractor(東洋紡社，cat.NPK-601)進行純化。將其克隆到pGEM-T-Easy vetor(Promega，cat.A1360)，通過測序確定其鹼基序列。克隆的小鼠β-肌動蛋白5』區域示於序列號1中。
公共的資料庫序列中，從第305位有13個連續的T。克隆的區域中，如記載的序列所示是14個連續的T。雖與資料庫的序列不同，但直接用於實驗。上述序列中，斜體所示的從第414位開始的CAAT及從第475位開始的TATAA是管家基因的啟動子區域中經常出現的序列，所以推測所得區域是小鼠β-肌動蛋白的啟動子區域。
克隆的區域中包含小鼠β-肌動蛋白的起始密碼於(從上述序列中第1543位開始的ATG)，為了其後載體的構建，合成引物mAct5-BG(5』-AGATCTGGGAGTGACTCTCTGTCCAT-3』/SEQ ID NO11，包含Bgl II位點)和mAct5-HN(5』-AAGCTTGGCGAACTATCAAGACACAA-3』/SEQ ID NO12，包含Hind III位點)(Espec oligo service Co.)，再度通過PCR在必要的區域(1～1542/序列號2)中添加Bgl II(5』末端)、Hind III(3』末端)位點。
PCR反應液的組成是模板DNA(約10ng/ml)1.0μl，2×GC BufferI 25.0μl，dNTP混合物8.0μl，mAct5-HN(10μM)1.0μl，mAct5-BG(10μM)1.0μl，H2O 13.5μl，LA Taq(5U/μl)0.5μl。PCR的條件是95℃30秒，『95℃30秒、60℃30秒、72℃60秒』30個循環，72℃7分鐘終止反應。用Gene Amp PCR System 2400(AppliedBiosystems)進行PCR。如前所述地，將PCR擴增產物克隆到pGEM-T-Easy vetor中，進行序列確定。將如此製備的小鼠β-肌動蛋白片段插入到pGL3-Basic(Promegacat.E1751)的Bgl II-Hind III位點。然後，將載體pGL3-Basic中第4650位的NotI位點轉換成BamHI位點，將與第2004位的BamH I位點間的載體骨架轉換成載體pCXN的載體骨架(BamH I-BamH I片段)，導入新黴素抗性基因，形成pmAct-Luc-neo(圖1)。以下將轉換成pGL3-Basic載體骨架的載體稱作pGLN載體。
(2)WPRE的克隆和pmAct-WPRE-Luc-neo的製備如下，應用Assemble PCR法擴增、克隆土撥鼠肝炎病毒基因組序列(GenBank Accession No.J04514)中第1093～1684的592個鹼基的轉錄後調控序列(WPRE)。使用TaKaRa Ex Taq(cat.RP001B)，在以下的兩個反應體系中進行PCR。
PCR反應1
首先，在以下條件下進行PCR。反應溶液的組成合成DNA(WP-1～WP-6，各10μM，各1μl)6.0μl、10×Ex Taq buffer5.0μl、dNTP混合物8.0μl，H2O 28.5μl，Ex Taq(5U/μl)0.5μl。反應條件94℃5分鐘、『94℃2分鐘、55℃2分鐘、72℃2分鐘』2個循環。此外，添加引物WP-f(10μM)1.0μl、WP-r2(10μM)1.0μl，使總量為500μl，在『94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘』30個循環、72℃5分鐘的反應條件下進行PCR。
PCR反應2
首先，在以下條件下進行PCR。反應溶液的組成合成DNA(WP-5～WP-17，各10μM，各1μl)13.0μl、10×Ex Taq buffer5.0μl、dNTP混合物8.0μl，H2O 21.5μl，Ex Taq(5U/μl)0.5μl。反應條件94℃5分鐘、『94℃2分鐘、55℃2分鐘、72℃2分鐘』2個循環。此外，添加引物WP-f2(10μM)1.0μl、WP-r(10μM)1.0μl，使總量為500μl，在『94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘』30個循環、72℃5分鐘的反應條件下進行PCR。
用Gene Amp PCR System 2400(Applied Biosystems)進行PCR。擴增的PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，反應1切出大約200bp的條帶，反應2切出大約400bp的條帶，用QLAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，cat.28704)進行純化。
應用各反應產物再進行PCR。使用Takara Bio公司的Takara ExTaq(cat.RR001B)的試劑。反應液的組成是反應1產物1.0μl，反應2產物1.0μl，10×Ex Taq buffer5.0μl、dNTP混合物8.0μl，WP-f(10μM)1.0μl、WP-r(10μM)1.0μl，H2O 32.5μl，Ex Taq(5U/μl)0.5μl。反應條件94℃30秒、『94℃15秒、72℃2分鐘』5個循環，『94℃15秒、70℃2分鐘』5個循環，『94℃15秒、68℃2分鐘』28個循環，72℃5分鐘。
擴增的PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，切出大約600bp的條帶，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，cat.28704)進行純化。將反應產物克隆到pGEM-T-Easy vetor(Promegacat.A1360)中，確定鹼基序列。可以驗證與GenBank Accession No.J04514中第1093～1684位的序列相同。用Xbal消化pGEM-T/WPRE，將所得WPRE片段插入到pmAct-Luc-neo的Xbal部位，製成pmAct-WPRE-Luc-neo。序列號3中顯示了克隆的WPRE的序列，使用的合成的DNA(序列號13～33)如下所示。
使用的合成DNA
WP-1AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAA(SEQ lD NO13)WP-2GCGTATCCACATAGCGTAAAAGGAGCAACATAGTTAAGAATACCAGTCAA(SEQ ID NO14)WP-3ACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTC(SEQ ID NO15)WP-4TTATACAAGGAGGAGAAAATGAAAGCCATACGGGAAGCAATAGCATGATA(SEQ ID NO16)WP-5TTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTG(SEQ ID NO17)WP-6GTGCACACCACGCCACGTTGCCTGACAACGGGCCACAACTCCTCATAAAG(SEQ ID NO18)WP-7CGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGG(SEQ ID NO19)WP-8GTCCCGGAAAGGAGCTGACAGGTGGTGGCAATGCCCCAACCAGTGGGCGT(SEQ ID NO20)WP-9CAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGA(SEQ ID NO21)
WP-10TGTCCAGCAGCGGGCAAGGCAGGCGGCGATGAGTTCCGCCGTGGCAATAG(SEQ ID NO22)WP-11TTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTG(SEQ ID NO23)WP-12CCATGGAAAGGACGTCAGCTTCCCCGACAACACCACGGAATTGTCAGTGC(SEQ ID NO24)WP-13TGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGC(SEQ ID NO25)WP-14GAGGGCCGAAGGGACGTAGCAGAAGGACGTCCCGCGCAGAATCCAGGTGG(SEQ ID NO26)WP-15ACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTG(SEQ ID NO27)WP-16GAGGGCGAAGGCGAAGACGCGGAAGAGGCCGCAGAGCCGGCAGCAGGCCGCGGGAAG(SEQ ID NO28)WP-17GTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO29)WP-fTCTAGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATT(SEQ ID NO30)WP-rTCTAGAAGGCGGGGAGGCGGCCCAAA(SEQ ID NO31)WP-f2ATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG(SEQ ID NO32)WP-r2GTGCACACCACGCCACGTTGCC(SEQ ID NO33)
(3)phCMV-mAct-Luc-neo的製備將CMV增強子區域(序列號4)克隆到pmAct-Luc-neo載體的EcoR I位點，完成phCMV-mAct-Luc-neo的製備(圖1)。
(4)對照載體的構建將來自DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(參考文獻WO92/19759)的人EF1α啟動子與CMV增強子一起插入到pGLN載體的MCS，製成pCEF-Luc-neo(圖1)。實驗中應用的所有載體均用QIAGEN公司的EndoFree Plasmid Maxi Kit(cat.12362)進行純化。
載體向CHO細胞的導入及表達測定(1)載體向CHO細胞的導入將2μg載體分別與20μl PLUS(tm)Reagent(Invitrogen，Cat.No.11514-015)混和，用OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium(Invitrogen，Cat.No.11058-021)將體積調整為200μl，室溫保持15分鐘。向其中加入20μlLipofectAMINE(Invitrogen，Cat.No.18324-012)、180μl OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium，室溫再放置15分鐘。用50μl OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium將CHO細胞調整為96孔Cell Culture Cluster(Corning，Cat.No.3595)每孔2×104細胞。將上述製備的DNA溶液20μl添加到CHO細胞內，37℃、CO2培養箱內培養3小時，將載體導入CHO細胞內。隨後，輕輕移去培養上清，添加CHO細胞用的培養基。CHO細胞用培養基是向CHO-S-SFMII培養基(Invitrogen，Cat.No.12052-098)中添加1/100量的HT Supplement(100×)、liquid(Invitrogen，Cat.No.11067-030)、1/100量的Penicillin-Streptomycin(Invitrogen，Cat.No.15140-122)使用。該狀態下，37℃、CO2培養箱內培養2天。
(2)螢光素酶活性的測定用Luciferase Assay System(Promega，Cat.No.E1501)測定螢光素酶活性。除去培養基，每孔添加100μl 5倍稀釋的試劑盒中附帶的5×Passive lysis buffer，振蕩，溶解細胞。將10μl細胞溶解液轉移到Assay Plate Tissue Culture Treated White with Clear Bottom(Corning，Cat.No.437842)。用MicroLuMAT(Berthold)進行測定，用WinGlow-Control Program LB96PV ver.1.24軟體獲取數據。
以上測定結果表明，製備的pmAct-Luc-neo比pCEF-Luc-neo的活性顯著升高(p＜0.0009，非配對t檢驗)(圖2)。這表明，本發明的小鼠β-肌動蛋白啟動子比現有的CEF啟動子更強。此外，還發現通過添加WPRE增強子或CMV增強子，小鼠β-肌動蛋白啟動子活性顯著增加(pmAct-WPRE-Luc-neo與pmAct-Luc-neo相比，p＜0.0005；phCMV-mAct-Luc-neo與pmAct-Luc-neo相比，p＜0.0007非配對t檢驗)(圖3)。
小鼠c-H-ras基因的克隆及改變(1)小鼠c-H-ras基因的克隆已經有報導，人活化型H-ras可增強插入了人β-肌動蛋白啟動子的表達載體的表達效率(Cytotechnology，Vol.16，p.167-178，1994)。但是尚無活化型H-Ras、野生型H-Ras、活化型K-Ras對小鼠β-肌動蛋白啟動子效果的相關報導，所以對小鼠H-Ras(活化型、野生型)、人活化型K-Ras對小鼠β-肌動蛋白啟動子的效果進行了檢驗。
根據NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開的GenBankAccession No.M30733信息，合成了引物mRas-F1(5』-TCCTGGATTGGCAGCCGCTGTAGAAGC-3』/SEQ ID NO34)，及mRas-R1(5』-GTTCATCTGGCTAGCTGAGGTCACTGC-3』/SEQ ID NO35)(Espec oligoservice Co.)，通過PCR擴增小鼠c-H-ras基因。應用Takara Bio公司的Takara LA Taq with GC Buffer試劑，使用Clontech的EmbryoMarathon-Ready DNA day 15(cat.7459-1)作為模板cDNA，進行PCR。
PCR反應液的組成是模板DNA1.0μl，2×GC Buffer I 25.0μl，dNTP混合物8.0μl，mRas-F1(10μM)2.0μl，mRas-R1(10μM)2.0μl，H2O 11.5μl，LA Taq(5U/μl)0.5μl。PCR的條件是95℃60秒，『95℃30秒、60℃30秒、72℃60秒』35個循環，72℃7分鐘終止反應。用Gene Amp PCR System 2400(Applied Biosystems)進行PCR。擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，切出660bp的條帶，用Mag Extractor(東洋紡社)進行純化。將其克隆到pGEM-T-Easyvetor(Promega)，通過測序驗證其鹼基序列。驗證的小鼠c-H-ras的cDNA序列如序列號5所示。資料庫中第62位的鹼基為A，克隆的c-H-ras為G。用NCBI的小鼠基因組資料庫進行檢索顯示該部分的序列為G，所以直接用於實驗。
(2)小鼠c-H-ras的改變為了在CHO細胞內能更有效的表達小鼠c-H-ras，應用引物RAS-ATG(5』-GCCACCATGACAGAATACAAGCTT-3』/SEQ ID NO36)和RAS-R2(5』-TCAGGACAGCACACATTTGC-3』/SEQ ID NO37)進行PCR。將起始密碼子上遊的序列轉變成符合Kozak rule(Nucleic Acids Research，Vol.15(20)，p.8125-8148，1987)的序列，同時除去編碼蛋白質的3』UTR。應用Takara Bio公司的Takara LA Taq(cat.RR002A)試劑，以先前克隆到pGEM-T-Easy載體的小鼠c-H-ras為模板cDNA，用以下的反應體系進行PCR。
PCR反應液的組成是模板DNA1.0μl，10×LA PCR buffer II(不含Mg2+)5.0μl，dNTP混合物5.0μl，MgCl2(25mM)5.0μl，RAS-ATG(10μM)2.0μl，RAS-R2(10μM)2.0μl，H2O 29.5μl，LA Taq(5U/μl)0.5μl。PCR的條件是95℃60秒，『95℃30秒、60℃30秒、72℃60秒』35個循環，72℃7分鐘終止反應。用Gene AmpPCR System 2400(Applied Biosystems)進行PCR。擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，切出576bp的條帶，用Mag Extractor(東洋紡社)進行純化。將其克隆到pGEM-T-Easy vetor(Promega)，通過測序驗證其鹼基序列。改變的小鼠c-H-ras的cDNA序列如序列號6所示。
(3)小鼠活化型H-Ras的製備應用Stratagene的QuickChangeTMSite-Directe MutagenesisKit(cat.#200518)，向上述小鼠c-H-ras中引入點突變(將上述序列中有下劃線的G變成T)，使第12位的胺基酸變成纈氨酸，製成活化型H-ras。使用的引物是mRasV12-F(5』-GTGGTGGGCGCTGTAGGCGTGGGAAAG-3』/SEQ ID NO38)和mRasV12-R(5』-CTTTCCCACGCCTACAGCGCCCACCAC-3』/SEQ ID NO39)。反應液的組成是模板DNA、H-Ras/pGEM-T-Easy(10μg/ml)2.0μl，10×反應緩衝液5.0μl，dNTP Mix1.0μl，mRasV12-F(100ng/μl)1.25μl，mRasV12-R(100ng/μl)1.25μl，H2O 38.5μl，Pfu Turbo聚合酶(2.5U/μl)1.0μl。反應條件是95℃30秒，『95℃30秒、55℃1分鐘、68℃7分20秒』12個循環。用Gene Amp PCR System 2400進行PCR。按照試劑盒中的使用手冊，用PCR擴增產物轉化經Dpn I處理的大腸桿菌。然後，從所得大腸桿菌回收質粒，通過測序驗證所導入的突變。小鼠活化型H-ras的胺基酸序列如序列號7所示。
同樣製備人活化型K-Ras。實驗中使用的K-Ras的胺基酸序列如序列號8所示。
這些基因均插入到pCXN載體(Gene，Vol.108，p.193-200，1991)中，分別叫做pCXN-H-Ras(小鼠c-H-ras)、pCXN-A-H-ras(小鼠活化型c-H-ras)、pCXN-A-K-Ras(人活化型K-ras)。
癌基因產物Ras對啟動子活性的影響(1)向CHO細胞導入載體如下，以不同的比例混和兩種或3種載體，製備成2μg要導入CHO細胞的載體(表1)。用與實施例2相同的方法導入CHO細胞，測定螢光素酶活性。


該結果表明，pmAct-Luc-neo因pCXN-H-Ras(小鼠c-H-ras)、pCXN-A-H-Ras(小鼠活化型c-H-ras)、pCXN-A-K-Ras(人活化型c-K-ras)的存在，其啟動子活性提高(圖4)。以上結果顯示癌基因產物Ras(無論活化型、野生型、H-Ras、K-Ras)賦予本發明的小鼠β-肌動蛋白啟動子更強的活性。
產業上利用的可能性到目前為止，用於在動物細胞內生產蛋白質的載體中一直應用EF1α啟動子(WO92/19759)和CMV啟動子應用。近年，生物製劑在醫藥品中的份額增大，特別是許多抗體製品上市。與傳統作為生物製劑的紅細胞生成素、G-CSF、幹擾素等細胞因子相比，抗體製品必須大量施用。因此在動物細胞內大量表達蛋白質對穩定供給廉價的抗體藥品很重要。與傳統的技術相比，本發明的方法可更大量的產生蛋白質，所以從產業的觀點來看具有應用性。此外，在抗體製品的製備過程中，用抗原免疫動物的過程是必要的。但已經揭示也可通過將抗原基因插入到表達載體中，用該載體免疫動物。本方法的優點是可以省略純化抗原的過程。免疫過程中，在施用了載體的動物體內儘可能多的產生抗原很重要，因此表達載體越強越好。單克隆抗體的製備中，通常應用小鼠和大鼠，但我們認為本發明的載體適於該用途。此外，當插入到基因治療中使用的載體中時，也可用於人類的臨床。
序列表110CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA120利用哺乳類β肌動蛋白啟動子的表達體系130C1-A0311P150JP 2003-4052691512003-12-0316039170PatentIn version 3.121012111577212DNA213小鼠(Mus musculus)4001gggagtgact ctctgtccat tcaatccagg ccccgcgtgt ccctcaaaca agaggccaca 60caaatagggt ccgggcctcg atgctgaccc tcatccactt aagtgctcga tatccacgtg 120acatccacac ccagagggtc ctggggtggt tgggtgaccc ccagaatgca ggcctagtaa 180ccgagacatt gaatggggca gtgtccacaa gggcggaggc tattcctgta catctgggcc 240tacggagcca gcacccatcg ccaaaactct tcatcctctt cctcaatctc gctttctctc 300tcgctttttt ttttttttct tcttcttttt tttttttttt ttcaaaagga ggggagaggg 360ggtaaaaaaa tgctgcactg tgcggcgagg ccggtgagtg agcgacgcgg agccaatcag 420cgcccgccgt tccgaaagtt gccttttatg gctcgagtgg ccgctgtggc gtcctataaa 480acccggcggc gcaacgcgca gccactgtcg agtcgcgtcc acccgcgagc acagcttctt 540tgcagctcct tcgttgccgg tccacacccg ccaccaggta agcagggacg ccgggcccag 600cgggccttcg ctctctcgtg gctagtacct cactgcaggg tcctgaggat cactcagaac 660ggacaccatg ggcgggtgga gggtggtgcc gggccgcgga gcggacactg gcacagccaa 720
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223人工序列描述人工合成的引物序列40029gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcct562103021130212DNA213人工的220
223人工序列描述人工合成的引物序列40030tctagaaatc aacctctgga ttacaaaatt 302103121126212DNA213人工的220
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223人工序列描述人工合成的引物序列40032atcctggttg ctgtctcttt atgag 252103321122212DNA213人工的220
223人工序列描述人工合成的引物序列40033gtgcacacca cgccacgttg cc 222103421127212DNA213人工的220
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223人工序列描述人工合成的引物序列40035gttcatctgg ctagctgagg tcactgc27
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223人工序列描述人工合成的引物序列40036gccaccatga cagaatacaa gctt 242103721120212DNA213人工的220
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223人工序列描述人工合成的引物序列40039ctttcccacg cctacagcgc ccaccac2權利要求
1.一種DNA構建物，其中哺乳類β-肌動蛋白啟動子與增強子功能性連接。
2.權利要求1的DNA構建物，其中增強子為巨細胞病毒CMV。
3.權利要求1的DNA構建物，其中增強子為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件WPRE。
4.權利要求1～3任一項的DNA構建物，其中哺乳類β-肌動蛋白啟動子為嚙齒類β-肌動蛋白啟動子。
5.權利要求2的DNA構建物，其中CMV增強子包含序列號4所示的鹼基序列，哺乳類β-肌動蛋白啟動子包含序列號2所示的鹼基序列。
6.權利要求3的DNA構建物，其中土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件WPRE包含序列號3所示的鹼基序列，哺乳類β-肌動蛋白啟動子包含序列號2所示的鹼基序列。
7.一種載體，它包含權利要求1～6任一項中的DNA構建物。
8.權利要求7的載體，包含功能性結合到哺乳類β-肌動蛋白啟動子下遊的所需DNA的DNA。
9.權利要求7或8的載體，其帶有可表達地編碼反式激活蛋白的DNA。
10.權利要求9的載體，其中反式激活蛋白為癌基因產物。
11.權利要求10的載體，其中癌基因產物為Ras。
12.權利要求8～11任一項的載體，其中所需DNA為編碼所需蛋白質的DNA。
13.一種帶有權利要求8～12任一項中載體的細胞。
14.一種帶有權利要求8～12任一項中載體、癌基因活化了的細胞。
15.權利要求14的細胞，其中癌基因活化了的細胞是導入了包含編碼反式激活蛋白基因的載體的細胞。
16.權利要求14的細胞，其中癌基因活化了的細胞是癌化了的細胞。
17.權利要求13～16任一項的細胞，其是哺乳動物的細胞。
18.權利要求17的細胞，其是嚙齒類細胞。
19.權利要求13～18任一項的細胞，其特徵在於，它與β-肌動蛋白啟動子來源於相同的動物目。
20.權利要求19的細胞，其特徵在於，它與β-肌動蛋白啟動子來源於相同的動物種。
21.一種非人轉基因動物，其中導入了權利要求8～12任一項的載體。
22.一種全能性細胞，其中導入了權利要求8～12任一項的載體。
23.一種製備所需蛋白質的方法，它包括培養帶有權利要求12中載體的細胞，從培養的細胞或培養基中回收表達的蛋白質。
24.權利要求23中的方法，其中包括向培養基中添加反式激活蛋白。
25.一種在宿主細胞內表達所需DNA的方法，包括將權利要求8～12任一項的載體導入與載體上的β-肌動蛋白啟動子來源於相同動物目的宿主細胞。
26.一種在宿主細胞內表達所需DNA的方法，包括將權利要求8～12任一項的載體導入與載體上的β-肌動蛋白啟動子來源於相同動物種的宿主細胞。
27.一種在宿主細胞內表達所需DNA的方法，包括將權利要求8中的載體及帶有可表達的編碼反式激活蛋白的DNA導入與權利要求8中載體上的β-肌動蛋白啟動子同種來源的宿主細胞。
28.權利要求25～27任一項的方法，其中宿主細胞為哺乳動物細胞。
29.權利要求25～27任一項的方法，其中宿主細胞為嚙齒類細胞。
30.一種增加所需DNA表達量的方法，其特徵在於，將來源於與宿主細胞相同動物目的β-肌動蛋白啟動子插入到所需DNA的上遊。
31.一種增加所需DNA表達量的方法，其特徵在於，將來源於與宿主細胞相同動物種的β-肌動蛋白啟動子插入到所需DNA的上遊。
32.權利要求30或31的方法，其特徵在於還插入了增強子。
33.權利要求32的方法，其中增強子為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件WPRE。
34.權利要求32的方法，其中增強子為CMV增強子。
35.權利要求30～34任一項的方法，其特徵在於插入了編碼反式激活蛋白的基因。
36.權利要求30～35任一項的方法，其中宿主細胞為哺乳動物細胞。
37.權利要求30～35任一項的方法，其中宿主細胞為嚙齒類細胞。
全文摘要
通過組合不同基因的啟動子和增強子，比較、檢驗啟動子的活性，結果發現CMV增強子與哺乳類β－肌動蛋白啟動子、或者土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)與哺乳類β－肌動蛋白啟動子聯合而形成的雜合啟動子比現有的啟動子更強。此外發現通過與反式激活蛋白癌基因產物Ras同時表達，可提高該β－肌動蛋白啟動子的活性。
文檔編號G06F12/14GK1914320SQ200480041348
公開日2007年2月14日 申請日期2004年12月3日 優先權日2003年12月3日
發明者角田浩行, 羽生清 申請人:中外製藥株式會社