轉移核酸通過核被膜的細胞轉運系統的用途的製作方法

2023-12-10 10:03:07 2

專利名稱：轉移核酸通過核被膜的細胞轉運系統的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核轉運劑、一種含有所述核轉運劑的基因轉移系統、一種使用所述核轉運劑將DNA轉運到真核細胞核中的方法以及所述核轉運劑在治療癌症、病毒感染、神經系統疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病的基因療法中的用途。
向核中的主動轉運是將遺傳材料轉移到在打算表達遺傳材料之前的時間內不分裂的所有細胞中必不可少的。由於核酸的核轉運系統有利於有效地將DNA轉移到很少分裂或根本不分裂的這些細胞中，因此核酸的核轉運系統非常重要(Dowty等人，1995，Wilke等人，1996)。大多數初級細胞屬於這一類。初級細胞在科學上最感興趣有兩個原因。首先，剛從生物體中分離的所述細胞反映的細胞類型的功能狀態比由此獲得的細胞系的好得多。其次，它們是基因療法的靶細胞。此外，核轉運系統通過使這些細胞也能表達轉移的遺傳材料增加了DNA向建立的細胞系轉移的效率，它們在轉移開始和分析之間的時間內尚未分裂。
遺傳材料在細胞核中有活性。其中的轉運或者可以在核被膜在有絲分裂過程中臨時分裂時在細胞分裂期間同時進行或者它必須主動地進行。
1)通過核定位信號將核蛋白轉運到該細胞核中。
包封該核的雙層膜具有孔。小分子可以經擴散通過這些孔。為了能夠進入核，大於約50kDa的蛋白質需要一核定位信號(NLS)，該信號必須通過轉運機器識別。典型地，足夠的信號由4-8個胺基酸組成，富含正胺基酸精氨酸和賴氨酸並含有脯氨酸。它在進化中強烈地保守，這樣哺乳動物NLS也在酵母中起作用。異源NLS還可以用作將靶分子轉運到核中的工具。為此，NLS可以相對隨機的位置加入到胞質蛋白質的序列中，或者可以化學偶聯到蛋白質或者甚至金顆粒上(參見Grlich，1998)。
2)許多病毒使用其細胞的核蛋白轉運機將其DNA轉運到其核中。
能夠感染靜息細胞的HIV和其它慢病毒使用病毒蛋白和細胞轉運機器將其DNA轉運到其核中。Vpr中的NLS和HIV預整合複合物中的基質蛋白(Gallay等人，1996)是感染不分裂的細胞所必需的(Naldini等人，1996)。儘管幾乎不知道病毒是如何將其基因組轉移到其核中的，但是含有NLS的病毒結構蛋白的幫助甚至可能是一般原理。通過以下觀察也暗示了這一點在HSV衣殼蛋白中的特異性突變防止了病毒DNA向其核中的轉運(Batterson等人，1983)。腺病毒DNA與分裂衣殼的六鄰體蛋白一起轉運到核中(Greber等人，1993)。SV40 DNA向核中的轉運由保持與DNA結合的病毒蛋白(可能是Vp3)介導(Nakanishi等人，1996)。含有NLS的兩種細菌蛋白負責根癌土壤桿菌T-DNA向植物細胞核的輸入(Citovsky等人，1994)。
由於一些病毒能夠感染靜息細胞，因此將例如HIV、腺病毒和皰疹病毒的突變體變體用作開發基因療法方案的DNA轉移載體。首先，這涉及與病毒組分的免疫反應的危險(Friedmann 1994，1996)，其次，將輔助細胞系用於這些系統，為此不能排除突變較少的病毒基因組的釋放。而且，這些系統難以操縱。
已描述了通過含有核定位信號的肽或蛋白質推斷提高轉染效率的幾個人工系統。
A)蛋白質Kaneda等人(1989)以及Dzau和Kaneda(1997，US5,631,237)描述了一種基因轉移系統，它是以使用仙臺病毒、脂質體和意思是支持DNA的核轉運的加入的蛋白為基礎。為此，該組使用HMG-1(″高遷移率組1蛋白″)，一種與DNA結合的鹼性非組蛋白的染色質蛋白質。HMG-1通過一長鹼性區與DNA結合。它位於核內，但沒有已知的NLS。在體外，HMG-1蛋白質與載體DNA形成複合物。純化HMG-1的生產費用高且為勞動密集型。
Mistry等人(1997)描述了與HMG-1-介導的核轉運有關的實驗。由於作為複合DNA的轉染試劑的其正電荷HMG-1在這裡用於使DNA通過細胞膜。Wako BioProducts公司(Richmond，VA，USA)作為介導核轉運的脂轉染試劑的添加劑銷售(1997)蛋白質HMG-1和-2。
Fritz等人(1996)用小牛胸腺組蛋白或由SV40 NLS和人組蛋白H1組成的重組蛋白進行了一相似試驗。這兩種蛋白都明顯地與DNA形成大的複合物，正如出版物中所示，它們適宜通過細胞膜，但不適宜核轉運。
B)由於含有NLS序列的合成肽生產簡單且費用較低，因此也使用它們。
P.Alestrm的小組(Collas等人，1996，Collas和Alestrm，1996，1997a，b)使用來自SV40的NLS肽複合DNA，並通過該細胞將其轉運到核中。該DNA的結合僅通過對其功能必不可少的NLS的正電荷胺基酸發生。只要DNA與肽複合，這將導致遮蔽核轉運蛋白的實際信號。在由海膽精子在體外形成的分離雄性原核中，當它們在斑馬魚受精卵的溶胞產物中培養時，能觀察到螢光標記的DNA的NLS依賴性轉運。在摩爾比≥100∶1(NLS肽∶載體)和載體拷貝/細胞≥1000時，在斑馬魚胚胎中，當將載體DNA微量注射到細胞的細胞質中時，觀察到螢光素酶表達增加。(在100個肽/載體和1000個注射載體下與0個肽比較獲得了六倍增加。)由於其密度高，可能並非所有NLS都與該DNA完全結合，並且因此部分仍是轉運機器可及的；這可能是為什麼完全可以觀察到作用的原因(參見Sebastyén等人，1998)。轉運機器可能能夠識別由兩個肽序列組成的信號(Boulikas，1993)。
Sebastyén等人(1998)共價地偶聯了成千上百的DNA分子的SV40 NLS肽，並在該DNA鏈的全長上對NLS進行了掃描。由於其大量修飾，該DNA不再能被轉錄。正如該文章中所討論的，由於空間原因，當如此之多的NLS肽結合，致使它們中間不是所有都通過與DNA的負電荷相互作用遮蔽時，DNA明顯地僅被轉運到核中。
Gopal(US5670347)描述了一種由DNA結合鹼性區、彈性鉸鏈區和NLS組成的肽。由於在這種情況下DNA結合也是由胺基酸正電荷完成的，因此試劑與DNA形成意味著同時用於穿過細胞膜轉運的複合物。NLS序列為什麼不應參與DNA結合，以致只要肽偶聯其上，核轉運蛋白的實際信號就可能再被DNA遮蔽的原因並不清楚。而且，產生的複合物可以變得非常大(Emi等人，1997，Niidome等人，1997，Wadhwa等人，1997，Trubetskoy等人，1998)，這將會減少通過核孔轉運(Lanford等人，1986，Yoneda等人，1987，1992)。還未證明起超出多陽離子肽作為轉染試劑的已知功能的作用，它支持DNA通過細胞膜(Sorgi等人，1997，參見Hawley-Nelson等人，1997)。
Gerhard等人(DE-OS 19541679)提出了用於基因轉移的NLS多賴氨酸綴合物。在這種情況下，由陽離子多賴氨酸、陽離子NLS和DNA組成的呈現複合物也確實遮蔽該核轉運信號，只要其與該DNA偶聯。
Szoka(PCT1993，權利要求23-27)通過一嵌入劑將NLS肽與DNA偶聯。在預培養載體和肽(比例為1∶300)之後，脂轉染的效率增加4-5倍。由於其高的正電荷，所用的SV40肽能夠複合DNA。DNA與陽離子肽的複合導致通過提高穿過細胞膜的效率的脂轉染效率增加(Sorgi等人，1997，參見Hawley-Nelson等人，1997)。由此使核轉運稍有減少，至少當生成大的複合物時(參見上面)。由於所用的NLS肽因其電荷與DNA結合，因此削弱了核轉運機器對轉運信號的識別(參見上面)。使用該實施例中所述的誘變嵌入劑限制其應用。Szoka提出，非共價且非特異性，但是，如上所述，結合的轉染用的其它分子也與DNA不能防止NLS肽本身與該DNA結合和複合。沒有討論NLS肽與DNA直接結合的問題。
Hawley-Nelson等人(US5736392)描述了一種類似系統。將一NLS肽與載體DNA或者直接混合或者在與DNA-結合分子共價偶聯之後混合。然後將生成的複合物用於脂轉染(或其它轉染)。在該系統中，加入沒有NLS的多陽離子肽增加轉染效率，甚至比加入陽離子NLS多。亞精胺與NLS肽偶聯不會使轉染效率進一步增加。因此，同樣在這種情況下，經陽離子肽的DNA的複合僅解釋了擴增作用。由於NLS的存在沒有進一步增加轉染效率，因此可以假定核轉運機器的識別序列在這種情況下也被遮蔽了。
TIB Molbiol公司(傳單1998)描述了PNA寡核苷酸和C-端NLS肽一起轉運以特異性地抑制選擇基因的表達。該NLS用於將這些PNA寡核苷酸轉運到核中，以便它們然後可以與其靶序列雜交。
迄今，將DNA轉運到核中的已知試劑的缺陷是效率非常低。該低效率不足以使靜息細胞成為可轉染的。
因此，本發明的問題在於提供一種核轉運劑，它能將DNA有效轉運到核中，從而靜息或僅非常緩慢分裂的細胞也變為可在有用程度上轉染的。
該問題通過一由兩個模件A和B組成的核轉運劑得到解決，其中模件A特異性地與DNA結合，不會導致通過非特異性結合形成含一個以上DNA分子的複合物，並且模件B含有不與DNA非特異性結合的核定位信號或非NLS信號。本發明的優選核轉運劑含有與DNA序列特異性地結合和/或與DNA端特異性結合的模件A。特別優選的是其中模件A為一合成肽、蛋白質或肽核酸(PNA)的核轉運劑。
在本發明核轉運劑的另一實施方案中，模件B含有一因其電荷不與DNA形成複合物的延長核定位信號。優選核轉運劑中模件B含有一具有幾乎中性淨電荷的延長核定位信號。特別優選核轉運劑中模件B含有一含核定位信號和側翼帶負電荷的胺基酸的延長核定位信號。NLS序列不必與天然存在的NLS序列相同，但是也可以為基於理論考慮的胺基酸序列，只要它起NLS的作用。而且，模件B可以含有肽序列或不直接屬於核定位信號或延長核定位信號的非肽組分。優選為增加核定位信號與模件A之間距離的組分。
而且，本發明涉及一種含本發明核轉運劑和陽離子脂質、肽、多胺或陽離子聚合物的基因轉移系統。
而且，本發明涉及一種將DNA轉運到真核細胞，優選初級細胞的核中的方法，其中使用待轉運的DNA和本發明核轉運劑通過本領域已知的方法轉染這些細胞。
另一實施方案涉及本發明的核定位劑在基因療法，特別是治療癌症、病毒感染、神經系統疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病中的用途。
本發明所用的詞語「核定位信號與DNA的非特異性結合」是指防止核定位信號對於核轉運機器是完全可識別的結合。
本發明所用的詞語「模件A與DNA的特異性結合」，首先是指序列特異性的結合，其中DNA核苷酸的序列對這種相互作用起著決定性作用，其次是指與由DNA單或雙鏈端介導的DNA的共價結合。
本發明所用的詞語「延長核定位信號」是指核定位信號具有附加的側翼胺基酸。優選延長核定位信號具有2-40，優選4-20個附加的側翼胺基酸。
本發明所用的詞語「因其電荷不與DNA形成複合物的延長核定位信號」是指模件B含有其電荷以如下方式分布的核定位信號它與DNA非特異性地相互作用，因此對於核轉運機器來說仍是完全可及的。
本發明所用的詞語「幾乎中性淨電荷」是指核定位信號的延長部分具有與實際核定位信號的正電荷平衡的帶負電荷的胺基酸，這樣在延長核定位信號的整個區域中存在不超過3個剩餘正電荷。
本發明的核轉運劑具有不引起DNA複合的優點。另一優點是該核定位信號可以自由靠近核轉運機器。避免形成削弱核轉運的大的DNA複合物以及當使用本發明的核定位劑時核定位信號對核轉運機器的可接近性，使得DNA向核中的轉運明顯更有效。
根據本發明，DNA-結合部分(模件A)或核定位信號(模件B)都不會導致形成大的DNA複合物。模件A模件A特異性地結合DNA，並且不引起具有一個以上DNA分子的複合物的形成。模件A序列特異性地(即僅因正電荷不是非特異性地)或者共價地與DNA端結合。
模件A可以是不同長度的肽或者蛋白質或者PNA序列(Nielson等人，1991)或者以序列特異性的方式與核酸結合的另一種物質。而且，模件A可以是特異性地與DNA結合的重組蛋白，作為例如lac阻抑物或其高親和力突變體(Kolkhof，1992，Fieck等人，1992)、或者序列特異性地與DNA端(具有LTR核心序列)結合的逆轉錄病毒整合酶(Ellison和Brown，1994)。
如果線性DNA鏈端具有為「自殺底物」的序列並可經拓撲異構酶裂解但不驅逐的話，那麼與DNA鏈端的共價結合可以例如經痘病毒的拓撲異構酶1生物介導(Shuman，1994)。模件B模件B為不與DNA非特異性結合的核定位信號或非NLS信號。
本發明的術語「非NLS信號」是指不是核定位信號，但就轉染、基因療法或DNA接種而言用於將DNA轉運到細胞中或在細胞內轉運DNA的信號。
以下屬於非NLS信號細胞表面結構的配體，它能夠介導DNA攝取，例如受體介導的DNA攝取；例如為了促使內體中的DNA過早出來而使膜去穩定化的肽；在細胞中介導與轉運結構結合以利於向核中的胞內轉運的信號。
核定位信號優選為因其電荷或對DNA結合模件A的空間定向不與DNA形成複合物的延長核定位信號(如上所定義的)。核定位信號可以經合成產生或者可以為蛋白質的一部分。
在本發明的核轉運劑中使用的核定位信號中，不通過其正電荷與DNA結合的信號序列-有和沒有側翼區-以如下方式使用作為大多數核定位信號的主要部分的這些電荷作為核轉運機器的信號被遮蔽。
除了核定位信號或非NLS信號之外，模件B可以含有肽序列和非肽組分，它們不是核定位信號或延長核定位信號的一部分。優選它們能較好地立體定位該核定位信號，尤其是增加與DNA分子之間的距離。
經典的NLS的延長序列是完全適宜的，條件是肽的淨電荷幾乎能夠被側翼帶負電荷的胺基酸平衡。這些胺基酸可以天然地存在於蛋白質的這些位置或者可能已在結構考慮的基礎上引入。最初，將負電荷胺基酸定位與許多NLS核心序列相鄰(Xiao等人，1997)。可以證明SV40的NLS作為最徹底調查過的NLS，這些側翼序列可明顯提高核轉運效率(Rihs和Peters，1989，Rihs等人，1991，Chen等人，1991，Jans等人，1991，Xiao等人，1997)。僅在將其化學地偶聯到已由相鄰序列延長的SV40 NLS之後，但是不在將其與SV40核心NLS肽偶聯之後，將大蛋白質(IgM)轉運到核中(Yoneda等人，1992)。
如果NLS為序列特異性地與DNA結合的蛋白質的一部分時，這些序列被DNA遮蔽的危險性相對較低。但是由於其高效率，在這種情況下也可以使用延長的NLS序列。
也可以使用非經典的NLS，例如作為來自流感病毒核蛋白的NLS(Wang等人，1997，Neumann等人，1997)，它們沒有大量過量的正電荷或者不經過常規轉運途逕到達核中。
T.Boulikas(1993，1996，1997)(不完全)概述了打算用於本文的NLS。
最後，可以使用得自核轉運機器本身組分的核轉運信號，作為例如輸入素(importin)α的輸入素β結合結構域(IBB)。經過該結構域，NLS結合蛋白輸入素α與核轉運機器的剩餘部分相連(Grlich等人，1996，Weiss等人，1996)。
在另一優選實施方案中，使非NLS信號經PNA(作為模件A)與現有載體序列結合。PNA和載體之間的結合為序列特異性的。這使得這些非NLS信號可以與幾乎所有常規表達載體偶聯，而不需要對它們進行修飾。
就PNA與DNA的序列特異性結合而言，僅使用載體的那些DNA序列，經PNA的這種遮蔽基本上不削弱DNA的預期目的。
在表達載體的情況下，特別是使用質粒主鏈中的序列，尤其是存在於大多數常規表達載體中的序列(例如氨苄青黴素抗性基因的啟動子)。然而，在表達區的非編碼鏈中結合也是可能的。序列特異性結合的優點是PNA-肽-雜種與DNA簡單而快速的結合。實施例2證實了例如PNA-肽-雜種與雙鏈DNA的簡單而快速的結合反應(5分鐘，65℃)。在PNA部分和實際信號之間可能有一間隔。該間隔可以增加信號與DNA之間的距離，從而例如減少位阻。該間隔還可用於引入預定斷裂點，從而例如使內體環境中的配體分離，由此使DNA結合到胞吞的細胞表面受體上。
本發明首次使靜息細胞或緩慢分裂細胞可轉染至允許以後分析的百分數。剛從動物體或人體分離的大多數細胞(初級細胞)根本不分裂，或者難得分裂，以致在DNA成功地通過細胞膜轉運之後，在其到達核並能夠被表達之前它被失活。至此這使得初級細胞不能轉染，除非它們經人工刺激培養增殖。這種不可避免的後果是這些細胞然後偏離其原始狀態。一種轉染初級細胞的方法允許在體細胞的最初條件下分析遺傳材料。這對於遺傳機理的調查和在體細胞內加工的研究是至關重要的。
使初級細胞可轉染的本發明的教導對基因療法的完全人造的基因轉移系統也是一個重要的步驟。這種基因轉移系統必需具有3個功能性組分一種使DNA通過細胞膜的組分，為此已證實陽離子脂類和其它陽離子聚合物相對適合。它必須含有將DNA轉移到靶細胞(通常是非分裂性的)的核中的另一組分，以及介導DNA整合到基因組中的第三組分。在本發明中，首次描述了可以用作第二組分的有效試劑。可用於基因療法的完全人造的基因轉移載體可望比目前使用的病毒系統更容易地生產，成本更低，更易操作，並且它不易遭受這些系統的內在危險。例如已提出基因治療方案用於治療癌症、AIDS和各種遺傳疾病，並將在醫學中發揮重要作用。
在這些至今已可轉染的培養細胞中通過使那些在DNA通過細胞膜與分析之間的時間內不分裂的細胞可以用於攝取DNA，本發明所述的核轉運劑也可增加轉染效率。由於甚至對許多建立的細胞系而言轉染效率的增加將會有利於分析並且因所需細胞材料的量降低而有助於降低成本，由此這是很重要的。當然，這對於初級細胞和建立的細胞系之間的所有階段也是如此。
以下實施例用於說明本發明，但並不打算限制本發明的範圍。
實施例1PNA-肽-雜種使用NLS PNA核轉運劑。使用能夠侵入DNA雙鏈的PNA序列(Nielson等人，1991，Nielson，US5,539,082)。
在幾乎所有表達載體的質粒主鏈中，完全適合與PNA高親和相連的兩個序列位於氨苄青黴素抗性基因和複製起點中。
作為肽組分，所用的肽含有或者1)″SV21″NH2-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH(肽1；SEQ ID NO1)，或者2)″SV27″NH2-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH(肽2；SEQ IDNO2)。
以下PNA序列位於每個肽的N-端。或者A)″ori″NH2-CCTTTCTCCCTTC-肽(SEQ ID NO3)，或者B)″ssp″NH2-CTCTTCCTTTTTC-肽(SEQ ID NO4)，或者C)肽-PNA雜種序列NH2-CCTTT-GGGGGGG-TTTCC-肽(SEQ ID NO5)，在平均表達載體(5kb)中它具有約30個結合位點(G＝胺基酸甘氨酸)。
將5μg溶於水中的載體DNA在10μl 25μM NLS-PNA中在60℃下培養10分鐘。然後用RPMI將該反應混合物調整至250μl。
將60-80％鋪滿的5×106個中國倉鼠卵巢(CHO)細胞用5mM EDTA脫附，在15ml PBS中洗滌(在50×g下離心10分鐘)。將該顆粒再次懸浮在250μlRPMI中並與預培養的DNA混合，轉移到電穿孔杯(間隙寬0.4cm)並在室溫下培養10分鐘。電穿孔(210V，975μF，BioRad GenePulser)之後，將該電穿孔杯在37℃下培養另外10分鐘，之後將這些細胞接種於預熱培養基中。
為了明確地顯示在實驗開始和分析之間還未分裂的這些細胞被轉染，按照所述方法用pMACS 4.1(人CD4的表達載體)轉染細胞，並且對細胞分裂的評價如下轉染之前，通過在1μM羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯(CFDA，SE)(Molecular Probes，Eugene，USA)中培養將細胞標記上綠色螢光。通過細胞分裂使細胞亮度降低至50％。使用流式細胞器(FACSCalibur)在單細胞水平上測得，未分裂的細胞(100％綠色螢光)也表達轉染的基因(用與Cy5偶聯的抗-CD4抗體染色之後為暗紅色螢光)。
實施例2PNA-NLS與現有載體序列的快速結合將PNA-肽-雜種與雙鏈DNA偶聯。
現有載體序列可以經PNA用NLS-肽幾乎定量地(90％)標記5分鐘。為了實現經PNA的熱不穩定性組分的結合，在37℃下培養1小時就足夠標記大多數DNA(表1)。
將100ng表達載體在TE(pH7.8)中用25μM的不同PNA-肽-雜種在65℃或者37℃下培養5分鐘-3小時。這裡所用的PNA序列NH2-CTCTTCCTTTTTC-COOH(SEQ ID NO6)與氨苄青黴素抗性基因的啟動子結合。
在其C-端定位一21個胺基酸的肽(肽1)或一27個胺基酸的肽(肽2)或者一10AEEA-單位的間隔(Fmoc-AEEA-OH間隔，PerSeptive生物系統公司，Framingham，USA)，之後是一27個胺基酸的肽(肽3)。接著用限制性核酸內切酶Earl進行結合測定。限制酶切DNA用YOYO(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)染色，在瓊脂糖凝膠上分離並用螢光掃描器(ImagePlate Reader FLA 2000，分析軟體L-Process，1.6版，東京富氏膠捲有限公司)定量。DNA經限制性核酸內切酶Earl的裂解在PNA結合位點受到抑制。其它Earl限制位點用作該反應的內部控制。
℃分鐘肽1 肽2肽35 94％96％ 91％65 10 96％97％ 95％15 96％97％ 95％60 85％90％ 74％37 12091％91％ 76％18094％94％ 90％表1以輸入DNA的百分數顯示的肽標記DNA的部分PNA與DNA的結合反應簡單、強烈且快速。這種結合幾乎不可逆，並且因此適合細胞轉運過程。與蛋白質比較，肽和PNA合成的費用不會太高並且可以容易且長時間地貯藏。
實施例3使用PNA-NLS轉染在分裂細胞系中，與未經轉運的DNA相比，轉染DNA的主動核轉運誘發其較快的表達。假如該轉染DNA在細胞質中存活時間足夠長，則轉染DNA在有和沒有核轉運試劑的快速分裂細胞中的表達速度應逐漸地接近。其原因是留在細胞質中的轉染DNA在細胞分裂過程中可以到達其核中。使用阿非迪黴素可以大大降低細胞的分裂活性和轉染能力。主動核轉運可消除這種轉染效率降低的影響。
為了電穿孔，將5μg溶於水中的線性化載體-DNA在有或者沒有25μMPNA-NLS(肽3NH2-(AEEA)10-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH)的最終體積10μl中在65℃下培養10分鐘。下面的步驟如實施例1中所述。
為了脂轉染，將3μg溶於水中的載體-DNA在有或者沒有25μM PNA-NLS(肽3)的最終體積10μl中在65℃下培養10分鐘。按照廠家說明用脂轉染胺試劑(Life Technologies GmbH，Karlsruhe)進行轉染。
為了基本上抑制CHO細胞的分裂，在沒有血清情況下將細胞培養24小時，之後用血清和20μg/ml阿非迪黴素(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Deisenhofen)培養12小時。所有隨後的脂轉染步驟都是在有20μg/ml阿非迪黴素的情況下進行的。轉染結果示於

圖1中。
雖然僅有幾個細胞分裂，但是與存在於大多數表達載體中的序列偶聯的兩個電中性NLS在轉染之後早期能夠使轉染細胞的百分數加倍。因使用阿非迪黴素細胞分裂速度降低而引起的轉染效率的降低可以以這種方式消除。
實施例4序列特異性結合NLS-融合蛋白使用大腸桿菌lac阻抑物的高親和結合突變體作為序列特異性DNA-結合蛋白。該突變體對lac操縱基因序列具有10-15M的結合常數(Kolkhof，1992)。該高親和力是通過絲氨酸61被亮氨酸替換實現的。
這裡所用的核轉運蛋白缺失最後30個C-端胺基酸(位置331-360)並且位置330的亮氨酸被絲氨酸替換。這些突變蛋白形成同型二聚體，而不是同型四聚體，因此含有單個DNA-結合位點，而不是兩個位點。但是也可以使用四聚體作為本發明的核轉運劑。
這些二聚體變體各自在N-端延伸作為一個NLS「N1D」NLS1MPKKKRKV-MKPVTLYDVA...
「N2D」NLS2MEEDTPPKKKRKVEDL-KPVTLYDVA...
(這些NLS-序列以黑體顯示並且分別相應於SEQ ID NO8和SEQ IDNO9。序列MKPVTLYDVA...和KPVTLYDVA...表示上述大腸桿菌lac阻抑物。)NLS1相應於SV40病毒大T抗原的NLS。NLS2代表具有中性淨電荷且由SV40-NLS和來自多瘤病毒VP2-蛋白的NLS的N-端側翼區組成的雜種。
lac-操縱基因-序列可以在大量表達載體中發現並且能夠容易地與任意序列相連作為PCR引物的突出端。
實施例5含有NLS的lac-阻抑物突變體的DNA結合將以下lac-操縱基因-序列用於結合測定天然存在的操縱基因AATTGTGAGC GGATAACAATT和一完全回文操縱基因-序列AATTGTGAGC GCTCACAATT。
將0.7ng長1kb的放射性標記DNA-片段經限制性核酸內切酶裂解成914bp和86bp長的片段，然後在室溫下分別用lac-阻抑物NLS-1-二聚體或NLS-2-二聚體培養30分鐘。然後在聚丙烯醯胺凝膠上將這些片段分離(圖2)。含有lac-操縱基因的86bp-片段因特異性結合而受到阻礙。非特異性結合導致缺乏lac-操縱基因的914bp-片段受到阻礙。在完全特異性結合的情況下，幾乎觀察不到任何非特異性結合。
其它實驗證實，使用不同條件，例如在細胞培養基PPMI、150mM氯化鈉或由10mM Tris/HCl(pH7.2)、10mM氯化鉀和3mM乙酸鎂的緩衝液中用兩個測定的操縱基因-序列都達到了穩定的結合。
實施例6DNA通過lac-阻抑物-NLS的核轉運將約8μg(100pmol)lac-阻抑物-NLS-突變體用2μg(100pmol)長30bp的雙鏈DNA培養，在兩端用螢光染料Cy5在室溫下在總體積300μl的10mMTris/HCl(pH7.2)、10mM KCl、3mM乙酸鎂和50μg/ml BSA中標記30分鐘。通過一Microcon-filter(Amicon)離心將未結合的DNA分離。然後將樣品緩衝液改變為細胞注射緩衝液(76mM K2HPO4，17mM KH2PO4，14mMNaH2PO4(pH 7.2))。
將一由與lac-阻抑物-突變體結合的DNA和螢光素標記的BSA(BSA-FITC)組成的混合物分別微量注射(帶Femtotips的EppendorfTransjektor 5246，直徑為0.5μm，注射壓力為55hPa，注射時間為0.5秒)到50個NIH3T3-細胞中。注射10-15分鐘之後，經螢光顯微鏡檢查分析細胞(圖3)。在成功注射到細胞質中之後，僅BSA-FITC留在細胞質中(1a、2a和3a)。與lac-阻抑物-NLS-突變體結合導致可以分析的幾乎所有細胞，在少於15分鐘(NLS1-二聚體，2b)和少於10分鐘(NLS2-二聚體，3b)內分別將DNA轉運到核中時，幾乎沒有DNA留在細胞質中。對照證實，沒有結合蛋白質的標記DNA留在細胞質中(1b)。
實施例7用lac-阻抑物-NLS轉染將1μg長1.1kb且含有一完全表達基因盒和後接一完全回文lac-操縱基因-序列的多腺苷酸序列的線性DNA在50μl等滲0.5×RPMI(用於脂轉染)或150mM NaCl(用於使用聚乙烯亞胺的轉染)中與不同濃度的lac-阻抑物-蛋白質(分別為約2.5μg、0.3μg和0.15μg二聚體，以及5μg、0.6μg或0.3μg四聚體)一起在室溫下培養30分鐘。按照廠家說明將樣品與脂轉染胺試劑(Life Technologies)或聚乙烯亞胺(PEI、ExGen 500、Fermentas)複合並添加到融合NIH3T3-細胞中。結果示於圖4。
轉染後4小時測定的轉染效率可以由lac-阻抑物-NLS增加3-4倍。在本文所述的實施例中，轉染前，培養粘著NIH3T3細胞至融合，使得細胞分裂大大受到抑制。轉染後4小時，僅有幾個細胞分裂。另外，由於以下事實使在本實施例中無論如何受到限制的分裂速度對轉染有關的時間減少經胞吞作用攝取的轉染DNA不得不留在胞內體和隨後與陽離子轉染試劑的複合物中，之後它可被轉運到待表達的核中。脂轉染胺試劑-DNA-複合物的存留時間可能要比與聚乙烯亞胺的DNA-複合物的存留時間明顯長，這使得使用脂轉染胺試劑的lac-阻抑物-NLS的作用不太清楚。24小時後大多數細胞分裂一次，此後有和沒有核轉運試劑的轉染DNA的表達速度漸漸接近。
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序列表110AMAXA GmbH120轉運核酸通過核被膜的細胞轉運系統的用途130201-1(1)140141150DE 199 00 513.31511999-01-08150DE 199 33 939.21511999-07-201609210121121212PRT213人工序列2202234001Gly Lys Pro Thr Ala Asp Asp Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys15 10 15Arg Lys Val Glu Asp20210221127212PRT213人工序列2202234002Gly Lys Pro Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser15 10 15Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp20 25210321113212DNA213人工序列220223DNA為PNA(肽核酸)4003cctttctccc ttc 13210421113212DNA213人工序列220223DNA為PNA(肽核酸)4004ctcttccttt ttc13210521117212DNA/PRT213人工序列220223DNA為PNA；混合肽/PNA序列4005ccttt Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly tttcc 17210621113212DNA213人工序列220223DNA為PNA4006ctcttccttt ttc13210721127212PRT213人工序列2202234007Gly Lys Pro Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser15 10 15Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp20 2521082118212PRT213人工序列220223序列相應於SV40病毒大T抗原的NLS4008Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val15210921116212PRT213人工序列220223序列相應於由SV40 NLS和來自多瘤病毒VP2蛋白的NLS的N-端側翼區組成的中性雜種4009Met Glu Glu Asp Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Leu15 10 1權利要求
1.一種核轉運劑，由兩個模件A和B組成，其中模件A與DNA特異性結合，並且不導致形成含一個以上DNA分子的複合物，並且其中模件B含有不介導該核轉運劑與該DNA非特異性結合的核定位信號。
2.如權利要求1的核轉運劑，其中模件A序列特異性地與DNA結合。
3.如權利要求1的核轉運劑，其中模件A特異性地與DNA端結合。
4.如權利要求1-3任一項的核轉運劑，其中模件A為肽、蛋白質或PNA(肽核酸)。
5.如權利要求1-4任一項的核轉運劑，其中模件B含有一因其電荷不與DNA形成複合物的延長核定位信號。
6.如權利要求5的核轉運劑，其中模件B含有一具有幾乎中性淨電荷的延長核定位信號。
7.如權利要求6的核轉運劑，其中模件B含有一延長核定位信號，它含有核定位信號和側翼帶負電荷的胺基酸。
8.如權利要求5-7任一項的核轉運劑，其中模件B除了含有核定位信號或延長核定位信號之外，還含有不直接屬於核定位信號的肽序列或非肽組分。
9.如權利要求1的核轉運劑，其中模件A為PNA，模件B含有代替NLS信號或除NLS信號之外的非NLS信號。
10.如權利要求1的核轉運劑，其中模件A為一以序列特異性方式與DNA結合的蛋白質，模件B含有代替NLS信號或除NLS信號之外的非NLS信號。
11.如權利要求9的核轉運劑，其中非NLS信號選自能夠介導DNA攝取的細胞表面結構的配體、使膜去穩定化的肽和在細胞中介導與轉運結構結合的信號，以及引起保留在核中的信號。
12.一種基因轉移系統，含有權利要求1-11任一項的核轉運劑和一陽離子脂質、肽、多胺或陽離子聚合物。
13.一種將DNA轉運到真核細胞的核中的方法，其中所述細胞用待轉運的DNA和權利要求1-1 1任一項的核轉運劑轉染。
14.如權利要求13的方法，其中所述真核細胞為初級細胞。
15.一種含有權利要求1-11任一項的核轉運劑的藥用組合物。
16.權利要求1-11任一項的核轉運劑在基因療法中的用途。
17.權利要求1-11任一項的核轉運劑在治療癌症、病毒感染、神經系統疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病的基因療法中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種核轉運劑、一種含有所述核轉運劑的基因轉移系統、一種使用所述核轉運劑將DNA轉運到真核細胞核中的方法以及所述核轉運劑在治療癌症、病毒感染、神經系統疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病的基因療法中的用途。
文檔編號A61P35/00GK1339068SQ00803447
公開日2002年3月6日 申請日期2000年1月3日 優先權日1999年1月8日
發明者G·希本科頓, R·克裡斯汀 申請人:阿馬克薩有限公司