無巖藻糖基化CD20抗體與苯達莫司汀的聯合療法的製作方法
2023-12-10 07:41:17 1
本申請是申請日為2010年8月12日、中國申請號為201080035971.x、發明名稱為「無巖藻糖基化cd20抗體與苯達莫司汀的聯合療法」的發明申請的分案申請。
發明領域
本發明涉及無巖藻糖基化cd20抗體與苯達莫司汀用於治療癌症的聯合療法。
發明背景
無巖藻糖基化的抗體
單克隆抗體的細胞介導的效應器功能可以通過工程化改造其寡糖組分來增強，如記載於p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及us6,602,684的。igg1型抗體(即在癌症免疫療法中最常使用的抗體)是在每個ch2域中的asn297處具有保守的n連接的糖基化位點的糖蛋白。附著於asn297的兩個複合雙觸角寡糖掩埋於各ch2域間，與多肽主鏈形成廣泛的接觸，並且其存在對於抗體介導效應器功能諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)是至關重要的(lifely,m.r.等,glycobiology5(1995)813-822；jefferis,r.等,immunol.rev.163(1998)59-76；wright,a和morrison,s.l.,trendsbiotechnol.15(1997)26-32)。p.等.naturebiotechnol.17(1999)176-180和wo99/154342顯示了β(1,4)-n-乙醯葡糖胺轉移酶iii(「gntiii」)(一種催化兩分型寡糖形成的糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(cho)細胞中的過表達顯著提高抗體的體外adcc活性。n297碳水化合物的組成變化或其消除也影響fc結合fcγr和c1q(p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180；davies,j.等,biotechnol.bioeng.74(2001)288-294；mimura,y.等,j.biol.chem.276(2001)45539-45547；radaev,s.等,j.biol.chem.276(2001)16478-16483；shields,r.l.等,j.biol.chem.276(2001)6591-6604；shields,r.l.等,j.biol.chem.277(2002)26733-26740；simmons,l.c.等,j.immunol.methods263(2002)133-147)。
已經報告了討論無巖藻糖基化的和巖藻糖基化的抗體(包括抗cd20抗體)的活性的研究(例如iida,s.等,clin.cancerres.12(2006)2879-2887；natsume,a.等,j.immunol.methods306(2005)93-103；satoh,m.等,expertopin.biol.ther.6(2006)1161-1173；kanda,y.等,biotechnol.bioeng.94(2004)680-688；davies,j.等,biotechnol.bioeng.74(2001)288-294。
cd20和抗cd20抗體
cd20分子(又稱作人b淋巴細胞限制性分化抗原或bp35)是一種已經廣泛描述的位於前b和成熟b淋巴細胞上的疏水性跨膜蛋白(valentine,m.a.等,j.biol.chem.264(1989)11282-11287；及einfeld,d.a.等,emboj.7(1988)711-717；tedder,t.f.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85(1988)208-12；stamenkovic,i.等,j.exp.med.167(1988)1975-80；tedder,t.f.等,j.immunol.142(1989)2560-8)。cd20在大於90％的b細胞非何杰金(hodgkin)氏淋巴瘤(nhl)上表達(anderson,k.c.等,blood63(1984)1424-1433))，但是在造血幹細胞、原b細胞、正常的漿細胞、或其它正常的組織上沒有找到(tedder,t.f.等,j,immunol.135(2)(1985)973-979)。
存在著在其cd20結合模式和生物學活性方面顯著不同的兩種不同類型的抗cd20抗體(cragg,m.s.等,blood103(2004)2738-2743；及cragg,m.s.等,blood101(2003)1045-1051)。i型抗體，如例如利妥昔單抗(rituximab)在補體介導的細胞毒性中是有力的，而ii型抗體，如例如託西莫單抗(tositumomab)(b1)、11b8、at80或人源化b-ly1抗體經由不依賴於胱天蛋白酶的凋亡及伴隨的磷脂醯絲氨酸暴露而有效啟動靶細胞死亡。
表1中匯總了i型和ii型抗cd20抗體共享的共同特徵。
表1：i型和ii型抗cd20抗體的特性
苯達莫司汀(bendamustine)
苯達莫司汀(商品名ribomustin和treanda；又稱為sdx-105)是一種用於治療慢性淋巴細胞性白血病(cll)(kath,r.等,j.cancerres.clin.oncol.127(2001)48-54)和非何杰金氏淋巴瘤(nhl)的氮芥。它屬於稱作烷化劑的藥物的家族。還在對其研究用於治療肉瘤(bagchi,s.,lancetoncol.8(2007)674)。
已經與不同其它藥劑，包括利妥昔單抗一起使用苯達莫司汀作為治療劑(cheson,b.d.等,jclinoncol.27(9)20091492-501；knauf,w.,expertrevanticancerther.(2)9(2009)165-74；plosker,g.l.等,drugs.68(18)(2008)2645-60)。
發明概述
令人驚訝地，我們現在已經發現了同與非無巖藻糖基化cd20抗體利妥昔單抗的組合相比，苯達莫司汀與無巖藻糖基化抗cd20抗體的組合顯示協同的(例如甚至大於疊加的)抗增殖效應。
本發明包括具有佔asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體用於製造與苯達莫司汀聯合治療癌症的藥物的用途。
本發明的一方面是一種治療患有癌症的患者的方法，其通過對需要此類治療的患者與苯達莫司汀組合施用具有佔asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體來進行。
本發明的另一方面是具有佔asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體，其用於與苯達莫司汀聯合治療癌症。
在一個實施方案中，巖藻糖量佔asn297處的寡糖(糖)總量的40％至60％。
在另一個實施方案中，巖藻糖量佔asn297處的寡糖總量的0％。
在一個實施方案中，無巖藻糖基化抗cd20抗體是igg1抗體。
在另一個實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體是人源化b-ly1抗體，而所述癌症是表達cd20的癌症，其在一個實施方案中是b細胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。
在一個實施方案中，在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg的劑量，然後在多至5個4周劑量周期的第1天以800至1200mg的劑量施用人源化b-ly1抗體，並在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天以80mg/m2至110mg/m2的劑量施用苯達莫司汀。
本發明的一個實施方案是一種用於治療癌症的組合物，其包含具有60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀。
發明詳述
本發明包括igg1或igg3同種型的(優選地igg1同種型的)具有佔asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體用於製造與苯達莫司汀聯合治療癌症的藥物的用途。在一個實施方案中，無巖藻糖基化抗cd20抗體以10-9m至10-13mol/l的kd結合cd20。
在一個實施方案中，巖藻糖量佔asn297處的寡糖(糖)總量的40％至60％。
術語「抗體」涵蓋各種抗體形式，包括但不限於完整的抗體、人抗體、人源化抗體和遺傳工程抗體，如單克隆抗體、嵌合抗體或重組抗體及此類抗體的片段，只要依照本發明的特徵性特性得到保留。如本文中所使用的，術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」指單一胺基酸組成的抗體分子的製備物。因而，術語「人單克隆抗體」指具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恆定區的展現出單一結合特異性的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體是由雜交瘤生成的，所述雜交瘤包含與永生化細胞融合的自具有包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物，例如轉基因小鼠獲得的b細胞。
術語「嵌合抗體」指通常通過重組dna技術製備的包含來自一種來源或物種的可變區，即結合區和自不同來源或物種衍生的恆定區的至少一部分的單克隆抗體。包含鼠可變區和人恆定區的嵌合抗體是特別優選的。此類鼠/人嵌合抗體是包含編碼鼠免疫球蛋白可變區的dna區段和編碼人免疫球蛋白恆定區的dna區段的所表達免疫球蛋白基因的產物。本發明所涵蓋的「嵌合抗體」的其它形式是那些其中類別或亞類已經自初始抗體的類別或亞類修飾或改變的。此類「嵌合」抗體又稱為「類別轉換抗體」。用於生成嵌合抗體的方法牽涉本領域現在公知的常規重組dna和基因轉染技術。參見例如morrison,s.l.等,proc.natl.acadsci.usa81(1984)6851-6855；us5,202,238和us5,204,244。
術語「人源化抗體」指其中的框架或「互補決定區」(cdr)已經進行過修飾以包含與親本免疫球蛋白的特異性相比不同特異性的免疫球蛋白的cdr的抗體。在一個優選的實施方案中，將鼠cdr嫁接入人抗體的框架區中以製備「人源化抗體」。參見例如riechmann,l.等,nature332(1988)323-327；及neuberger,m.s.等,nature314(1985)268-270。
如本文中所使用的，術語「人抗體」意圖包括具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恆定區的抗體。人抗體是現有技術中公知的(vandijk,m.a.和vandewinkel,j.g.,curr.opin.pharmacol.5(2001)368-374)。基於此類技術，可以生成針對極其多種靶物的人抗體。人抗體的例子記載於例如kellermann,s.a.等,curr.opin.biotechnol.13(2002)593-597。
如本文中所使用的，術語「重組人抗體」意圖包括通過重組手段製備、表達、創建或分離的所有人抗體，諸如自宿主細胞諸如ns0或cho細胞或者自對於使用轉染入宿主細胞中的重組表達載體表達的人免疫球蛋白基因或抗體而言轉基因的動物(例如小鼠)分離的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恆定區。依照本發明的重組人抗體已經進行過體內體細胞超突變。如此，重組抗體的vh和vl區的胺基酸序列是雖然自人種系vh和vl序列衍生及與其相關，但可以不天然存在於體內的人抗體種系全集內的序列。
如本文中所使用的，術語「結合」或「特異性結合」指用純化的野生型抗原在體外測定法中，優選地在等離振子共振測定法(biacore,ge-healthcareuppsala,sweden)中抗體對腫瘤抗原的表位的結合。結合親和力通過術語ka(來自抗體/抗原複合物的抗體的結合速率常數)、kd(解離常數)、和kd(kd/ka)限定。結合或特異性結合意指10-8mol/l或更小，優選地10-9m至10-13mol/l的結合親和力(kd)。如此，依照本發明的無巖藻糖基化抗體以10-8mol/l或更小，優選地10-9m至10-13mol/l的結合親和力(kd)特異性結合腫瘤抗原。
如本文中所使用的，術語「核酸分子」意圖包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但是優選的是雙鏈dna。
「恆定域」不直接牽涉抗體對抗原的結合，但是牽涉效應器功能(adcc、補體結合、和cdc)。
如本文中所使用的，「可變區」(輕鏈可變區(vl)、重鏈可變區(vh))意為直接牽涉抗體結合抗原的輕鏈和重鏈域對之每種。人輕鏈和重鏈可變域具有相同的一般結構，並且每個域包含通過三個「高變區」(或互補決定區，cdr)連接的其序列廣泛保守的四個框架(fr)區。框架區採用b-片層構象，而cdr可以形成連接b-片層結構的環。每條鏈中的cdr通過框架區保持其三維結構，並且與來自另一條鏈的cdr一起形成抗原結合位點。
術語「高變區」或「抗體的抗原結合部分」在本文中使用時指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「cdr」的胺基酸殘基。「框架」或「fr」區是與如本文中所限定的高變區殘基不同的那些可變域區。因此，抗體的輕鏈和重鏈包含自n至c端的域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、和fr4。特別地，重鏈的cdr3是對抗原結合貢獻最大的區。cdr和fr區依照kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的標準定義和/或那些來自「高變環」的殘基來確定。
苯達莫司汀是4-[5-[二(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯並咪唑-2-基]丁酸。商品名是ribomustin和treanda；苯達莫司汀又稱為sdx-105)。苯達莫司汀是一種用於治療慢性淋巴細胞性白血病(cll)(kath,r.等,j.cancerres.clin.oncol.127(2001)48-54)和非何杰金氏淋巴瘤(nhl)的氮芥。它屬於稱作烷化劑的藥物的家族。還在對其研究用於治療肉瘤(bagchi,s.,lancetoncol.8(2007)674)。
術語「無巖藻糖基化抗體」指在fc區中在asn297處具有改變的糖基化樣式且具有降低的巖藻糖殘基水平的igg1或igg3同種型的(優選地igg1同種型的)抗體。在asn297處發生人igg1或igg3的糖基化，作為以多至兩個gal殘基為末端的核心巖藻糖化雙觸角複合寡糖糖基化。根據末端gal殘基的量，這些結構稱為g0、g1(α1,6或α1,3)或g2聚糖殘基(raju,t.s.,bioprocessint.1(2003)44-53)。抗體fc部分的cho型糖基化例如由routier,f.h.,glycoconjugatej.14(1997)201-207描述。在非糖修飾的cho宿主細胞中重組表達的抗體在asn297處通常以至少85％的量進行巖藻糖基化。應當理解，如本文中所使用的，術語無巖藻糖基化抗體包括在其糖基化樣式中沒有巖藻糖的抗體。通常已知的是，抗體中典型的糖基化殘基位置是依照eu編號系統的第297位的天冬醯胺(「asn297」)。
「eu編號系統」或「eu索引」一般在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中的殘基時使用(例如kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中報告的eu索引，通過提及而將其明確收入本文)。
如此，依照本發明的無巖藻糖基化抗體意指其中的巖藻糖量佔asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少(這意味著在fc區中asn297處的寡糖的至少40％或更多是無巖藻糖基化的)的igg1或igg3同種型的(優選地igg1同種型的)抗體。在一個實施方案中，巖藻糖量佔fc區中asn297處的寡糖的40％至60％。在另一個實施方案中，巖藻糖量是50％或更小，並且在又一個實施方案中，巖藻糖量佔fc區中asn297處的寡糖的30％或更小。在一個備選的實施方案中，巖藻糖量佔fc區中asn297處的寡糖的0％。依照本發明，「巖藻糖的量」意指通過maldi-tof質譜術測量的，並以平均值計算的，相對於附著於asn297的所有寡糖(糖)(例如複合的、雜合的和高甘露糖結構)的總和，asn297處寡糖(糖)鏈內所述寡糖(巖藻糖)的量(測定巖藻糖量的詳細規程記載於例如wo2008/077546)。此外，在一個實施方案中，fc區的寡糖是兩分的。可以在工程化改造成表達至少一種核酸的糖修飾的宿主細胞中表達依照本發明的無巖藻糖基化抗體，所述核酸編碼具有gntiii活性的多肽，其量足以部分巖藻糖基化fc區中的寡糖。在一個實施方案中，具有gntiii活性的多肽是融合多肽。或者，可以依照us6,946,292降低或消除宿主細胞的α1,6-巖藻糖基轉移酶活性以生成糖修飾的宿主細胞。可以例如通過發酵條件(例如發酵時間)或者通過組合至少兩種具有不同巖藻糖基化量的抗體來預先確定抗體巖藻糖基化的量。此類無巖藻糖基化抗體及相應的糖工程方法記載於wo2005/044859,wo2004/065540,wo2007/031875,umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180,wo99/154342,wo2005/018572,wo2006/116260,wo2006/114700,wo2005/011735,wo2005/027966,wo97/028267,us2006/0134709,us2005/0054048,us2005/0152894,wo2003/035835,wo2000/061739。這些糖工程抗體具有升高的adcc。依照本發明產生無巖藻糖基化抗體的其它糖工程方法記載於例如niwa,r.等,j.immunol.methods306(2005)151-160；shinkawa,t.等,j.biol.chem.278(2003)3466-3473；wo03/055993或us2005/0249722。
如此，本發明的一方面是igg1或igg3同種型的(優選地igg1同種型的)，特異性結合cd20的，具有佔asn297處的寡糖(糖)總量的60％或更少的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體用於製造與苯達莫司汀聯合治療癌症的藥物的用途。在一個實施方案中，巖藻糖量佔asn297處的寡糖(糖)總量的40％至60％。
cd20(又稱為b淋巴細胞抗原cd20、b淋巴細胞表面抗原b1、leu-16、bp35、bm5、和lf5；序列以swissprot資料庫條目p11836為特徵)是一種位於前b和成熟b淋巴細胞上的具有約35kd分子量的疏水性跨膜蛋白(valentine,m.a.等,j.biol.chem.264(19)(1989)11282-11287；tedder,t.f.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85(1988)208-212；stamenkovic,i.等,j.exp.med.167(1988)1975-80；einfeld,d.a.等,emboj.7(1988)711-7；tedder,t.f.等,j.immunol.142(1989)2560-2568)。相應的人基因是4次跨膜域，a亞家族，成員1，又稱為ms4a1。此基因編碼跨膜4a基因家族的成員。此初生蛋白質家族的成員以共同的結構特徵和相似的內含子/外顯子剪接邊界為特徵，並且在造血細胞和非淋巴樣組織中展現出獨特的表達樣式。此基因編碼b淋巴細胞表面分子，其在b細胞發育及分化成漿細胞中發揮作用。在家族成員的簇中，此家族成員定位於11q12。此基因的可變剪接產生編碼同一蛋白質的兩種轉錄物變體。
術語「cd20」和「cd20抗原」在本文中可互換使用，包括由細胞天然表達的或者在用cd20基因轉染的細胞上表達的人cd20的任何變體、同等型和物種同系物。本發明的抗體對cd20抗原的結合通過滅活cd20而介導對表達cd20的細胞(例如，腫瘤細胞)的殺傷。可以通過下列一項或多項機制而發生對表達cd20的細胞的殺死：細胞死亡/凋亡誘導、adcc和cdc。
如本領域中認可的，cd20的同義詞包括b淋巴細胞抗原cd20、b淋巴細胞表面抗原b1、leu-16、bp35、bm5、和lf5。
依照本發明的術語「抗cd20抗體」是特異性結合cd20抗原的抗體。根據針對cd20抗原的抗cd20抗體的結合特性和生物學活性，兩種類型的抗cd20抗體(i型和ii型抗cd20抗體)可以依照cragg,m.s.等,blood103(2004)2738-2743；及cragg,m.s.等,blood101(2003)1045-1051區別，參見表2。
表2：i型和ii型抗cd20抗體的特性
ii型抗cd20抗體的例子包括例如人源化b-ly1抗體igg1(一種嵌合的人源化igg1抗體，如披露於wo2005/044859中的)、11b8igg1(如披露於wo2004/035607中的)、和at80igg1。通常，igg1同種型的ii型抗cd20抗體顯示特徵性的cdc特徵。與igg1同種型的i型抗體相比，ii型抗cd20抗體具有降低的cdc(若為igg1同種型的話)。
i型抗cd20抗體的例子包括例如利妥昔單抗、hi47igg3(ecacc，雜交瘤)、2c6igg1(如披露於wo2005/103081中的)、2f2igg1(如披露於wo2004/035607和wo2005/103081的)和2h7igg1(如披露於wo2004/056312中的)。
依照本發明的無巖藻糖基化抗cd20抗體在一個實施方案中是ii型抗cd20抗體，在一個更具體的實施方案中，ii型抗cd20抗體是無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體。
與沒有降低巖藻糖的抗cd20抗體不一樣，依照本發明的無巖藻糖基化抗cd20抗體具有升高的抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)。
「具有升高的抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)的無巖藻糖基化抗cd20抗體」意指具有如通過本領域普通技術人員已知的任何合適的方法測定的升高的adcc的無巖藻糖基化抗cd20抗體，如該術語在本文中所定義的。一種公認的體外adcc測定法如下：
1)該測定法使用已知表達被抗體的抗原結合區識別的靶抗原的靶細胞；
2)該測定法使用自隨機選定的健康供體的血液分離的人外周血單個核細胞(pbmc)作為效應細胞；
3)依照下列方案來實施測定法：
i)使用標準的密度離心規程來分離pbmc，並將其以5x106個細胞/ml在rpmi細胞培養基中懸浮；
ii)將靶細胞通過標準的組織培養方法來培養，自具有高於90％的存活力的指數生長期收穫，在rpmi細胞培養基中清洗，用100微居裡51cr標記，用細胞培養基清洗兩次，並以105個細胞/ml的密度在細胞培養基中重懸浮；
iii)將100微升上述最終靶細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定板的每孔；
iv)將抗體在細胞培養基中自4000ng/ml連續稀釋至0.04ng/ml，並將50微升所得的抗體溶液添加至96孔微量滴定板中的靶細胞，一式三份測試覆蓋上述整個濃度範圍的多種抗體濃度；
v)對於最大釋放(mr)對照，含有經標記的靶細胞的平板中的3個另外的孔接受50微升非離子型去汙劑(nonidet,sigma,st.louis)的2％(vn)水溶液，代替抗體溶液(上述第iv點)；
vi)對於自發釋放(sr)對照，含有經標記的靶細胞的平板中的3個另外的孔接受50微升rpmi細胞培養基，代替抗體溶液(上述第iv點)；
vii)然後，將96孔微量滴定板以50xg離心1分鐘，並於4℃溫育1小時；
viii)將50微升pbmc懸浮液(上述第i點)添加至每孔以產生效應:靶細胞比率25:1，並將平板在培養箱中在5％co2氣氛下於37℃放置4小時；
ix)收穫來自每孔的無細胞上清液，並使用γ計數器來量化實驗釋放的放射性(er)；
x)依照公式(er-mr)/(mr-sr)x100對每個抗體濃度計算特異性溶解的百分比，其中er是對所述抗體濃度量化(參見上述第ix點)的平均放射性，mr是對mr對照(參見上述第v點)量化(參見上述第ix點)的平均放射性，而sr是對sr對照(參見上述第vi點)量化(參見上述第ix點)的平均放射性；
4)「升高的adcc」定義為上文測試的抗體濃度範圍內觀察到的特異性溶解的最大百分比的增加和/或達到上文測試的抗體濃度範圍內觀察到的特異性溶解的最大百分比的一半所需要的抗體濃度降低。adcc的升高相對於用上述測定法測量的，使用本領域技術人員已知的相同的標準生成、純化、配製和貯存方法，由相同類型的宿主細胞產生的，但是並非由工程化改造成過表達gntiii的宿主細胞產生的相同抗體介導的adcc。
可以通過所述抗體的糖工程來獲得所述「升高的adcc」，其意味著通過工程化改造其寡糖組分來增強單克隆抗體的所述天然的、細胞介導的效應器功能，如記載於umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及us6,602,684的。
術語「補體依賴性細胞毒性(cdc)」指在存在補體的情況中依照本發明的抗體對人腫瘤靶細胞的溶解。優選地，通過在存在補體的情況中用依照本發明的抗cd20抗體處理表達cd20的細胞的製備物來測量cdc。若抗體在濃度100nm時在4小時後誘導20％或更多的腫瘤細胞溶解(細胞死亡)，則發現cdc。優選地，用經51cr或eu標記的腫瘤細胞及釋放的51cr或eu測量來實施測定法。對照包括將腫瘤靶細胞與補體但不與抗體一起溫育。
「利妥昔單抗」抗體(參照抗體；i型抗cd20抗體的例子)是一種針對人cd20抗原的含有遺傳工程嵌合人γ1鼠恆定域的單克隆抗體。此嵌合抗體含有人γ1恆定域，並且以1998年4月17日公告的歸於idecpharmaceuticalscorporation的us5,736,137(andersen等)中的名稱「c2b8」鑑定。利妥昔單抗批准用於治療復發性或頑固性低度或濾泡性、cd20陽性、b細胞非何杰金氏淋巴瘤患者。體外作用機制研究已經顯示了利妥昔單抗展現出人補體依賴性細胞毒性(cdc)(reff,m.e.等,blood83(2)(1994)435-445)。另外，它在測量抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)的測定法中展現出顯著的活性。利妥昔單抗不是無巖藻糖基化的。
術語「人源化b-ly1抗體」指如wo2005/044859和wo2007/031875中所披露的人源化b-ly1抗體，其通過用來自igg1的人恆定域嵌合化及接著的人源化自鼠單克隆抗cd20抗體b-ly1(鼠重鏈可變區(vh)：seqidno:1；鼠輕鏈可變區(vl)：seqidno:2，參見poppema,s.和visser,l.,biotestbulletin3(1987)131-139)獲得(參見wo2005/044859和wo2007/031875)。這些「人源化b-ly1抗體」詳細披露於wo2005/044859和wo2007/031875中。
在一個實施方案中，「人源化b-ly1抗體」具有選自下組的重鏈可變區(vh)：seqidno:3至seqidno:20(wo2005/044859和wo2007/031875的b-hh2至b-hh9和b-hl8至b-hl17)。特別優選的是seq.idno.3、4、7、9、11、13和15(wo2005/044859和wo2007/031875的b-hh2、b-hh3、b-hh6、b-hh8、b-hl8、b-hl11和b-hl13)。在一個具體的實施方案中，「人源化b-ly1抗體」具有輕鏈可變區(vl)seqidno:20(wo2005/044859和wo2007/031875的b-kv1)。在另一個具體的實施方案中，「人源化b-ly1抗體」具有重鏈可變區(vh)seqidno:7(wo2005/044859和wo2007/031875的b-hh6)和輕鏈可變區(vl)seqidno:20(wo2005/044859和wo2007/031875的b-kv1)。此外，在一個實施方案中，人源化b-ly1抗體是igg1抗體。依照本發明，依照記載於wo2005/044859、wo2004/065540、wo2007/031875、umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及wo99/154342中的規程在fc區中糖工程化改造(ge)此類無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體。在本發明的一個實施方案中，所使用的抗cd20抗體是無巖藻糖基化的糖工程人源化b-ly1，稱為b-hh6-b-kv1ge。此類糖工程人源化b-ly1抗體在fc區中具有改變的糖基化樣式，優選地具有降低的巖藻糖殘基水平。在一個實施方案中，巖藻糖量佔asn297處的寡糖總量的60％或更少(在一個實施方案中，巖藻糖的量是40％至60％，在另一個實施方案中，巖藻糖的量是50％或更少，且在又一個實施方案中，巖藻糖的量是30％或更少，且在又一個實施方案中，巖藻糖的量是0％。此外，在一個具體的實施方案中，fc區的寡糖是兩分的。這些糖工程人源化b-ly1抗體具有升高的adcc。
寡糖組分可以顯著影響與治療性糖蛋白的功效有關的特性，包括物理穩定性、對蛋白酶攻擊的抗性、與免疫系統的相互作用、藥動學、和特定(specific)生物學活性。此類特性可能不僅取決於寡糖的存在或缺乏，而且還取決於寡糖的特定結構。可以做出寡糖結構與糖蛋白功能間的一些概括。例如，某些寡糖結構經由與特定碳水化合物結合蛋白的相互作用而介導糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖結構可以被抗體結合，並觸發不想要的免疫反應(jenkins,n.等,naturebiotechnol.14(1996)975-981)。
由於哺乳動物細胞以對於人應用最相容的形式糖基化蛋白質的性能，它是用於生成治療性糖蛋白的卓越的宿主(cumming,d.a.等,glycobiology1(1991)115-30；jenkins,n.等,naturebiotechnol.14(1996)975-981)。細菌糖基化蛋白質非常罕見，並且與其它類型的常見宿主，諸如酵母、絲狀真菌、昆蟲和植物細胞一樣，其產生與自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和(在一些特定的情況中)降低的生物學活性有關的糖基化樣式。在哺乳動物細胞中，在過去二十年期間最常使用中國倉鼠卵巢(cho)細胞。在給予合適的糖基化樣式外，這些細胞容許遺傳穩定的、高生產性克隆細胞系的一致生成。它們可以使用無血清培養基在簡單的生物反應器中培養至高密度，並容許開發安全且可再現的生物工藝。其它通常使用的動物細胞包括幼侖鼠腎(bhk)細胞、nso和sp2/0小鼠骨髓瘤細胞。新近，還已經測試了自轉基因動物的生成(jenkins,n.等,naturebiotechnol.14(1996)975-981)。
所有抗體在重鏈恆定區中的保守位置處都含有碳水化合物結構，其中每種同種型擁有獨特的一批n連接的碳水化合物結構，其易變地影響蛋白質裝配、分泌或功能性活性(wright,a.和monison,s.l.,trendsbiotech.15(1997)26-32)。根據加工程度，附著的n連接的碳水化合物結構變化得相當大，並且可以包括高甘露糖的、多分支的及雙觸角的複合寡糖(wright,a.和morrison,s.l.,trendsbiotech.15(1997)26-32)。通常，存在著特定糖基化位點處附著的核心寡糖結構的異質加工，使得甚至單克隆抗體以多種糖形存在。同樣地，已經顯示了細胞系間存在抗體糖基化的主要差異，而且甚至對不同培養條件下培養的給定細胞系看到次要差異(lifely,m.r.等,glycobiology5(8)(1995)813-22。
一種在維持簡單的生成過程並潛在地避免顯著的、不想要的副作用的情況中獲得效力大幅升高的方式是通過工程化改造單克隆抗體的寡糖組分來增強其天然的、細胞介導的效應器功能，如記載於umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180及us6,602,684的。igg1型抗體(即在癌症免疫療法中最常使用的抗體)是在每個ch2域中的asn297處具有保守的n連接的糖基化位點的糖蛋白。附著於asn297的兩個複合雙觸角寡糖掩埋於各ch2域間，與多肽主鏈形成廣泛的接觸，並且其存在對於抗體介導效應器功能諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)是至關重要的(lifely,m.r.等,glycobiology5(1995)813-822；jefferis,r.等,immunol.rev.163(1998)59-76；wright,a和morrison,s.l.,trendsbiotechnol.15(1997)26-32)。
先前顯示了β(1,4)-n-乙醯葡糖胺轉移酶i11(「gntii17y」)(一種催化兩分型寡糖形成的糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(cho)細胞中的過表達顯著提高由工程化改造的cho細胞生成的抗成神經細胞瘤嵌合單克隆抗體(chce7)的體外adcc活性。(參見umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180；及wo99/154342，在此通過提及而收錄其全部內容)。抗體chce7屬於具有高腫瘤親和力和特異性，但是在缺乏gntiii酶的標準工業細胞系中生產時具有太少的效力以致在臨床上無用的一大類未綴合的單克隆抗體(umana,p.等,naturebiotechnol.17(1999)176-180)。所述研究第一次顯示了可以通過工程化改造抗體生成細胞以表達gntiii來獲得adcc活性的大幅升高，其還導致恆定區(fc)結合的兩分型寡糖(包括兩分型非巖藻糖基化寡糖)比例的增加，高於天然存在的抗體中找到的水平。
如本文中所使用的，術語「癌症」包括淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺(nscl)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、結腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金(hodgkin)氏病、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌(biliarycancer)、中樞神經系統(cns)新生物、脊柱軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤(glioblastomamultiforme)、星形細胞瘤、神經鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母細胞瘤、腦脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤，包括任何上述癌症的頑固性型式、或一種或多種上述癌症的組合。在一個實施方案中，術語癌症指表達cd20的癌症。
術語「表達cd20」抗原意圖指示分別來自腫瘤或癌症，優選地非實體瘤的細胞中，優選地在t或b細胞，更優選地b細胞的細胞表面上的cd20抗原的顯著水平的表達。可以通過本領域已知的標準測定法來確定患有「表達cd20的癌症」的患者。例如，可以使用免疫組織化學(ihc)檢測、facs或者經由相應mrna的基於pcr的檢測來測量cd20抗原表達。
如本文中所使用的，術語「表達cd20的癌症」指癌細胞顯示cd20抗原表達的所有癌症。優選地，如本文中所使用的表達cd20的癌症指淋巴瘤(優選地b細胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl))和淋巴細胞性白血病。此類淋巴瘤和淋巴細胞性白血病包括例如a)濾泡性淋巴瘤、b)小無核裂細胞淋巴瘤(smallnon-cleavedcelllymphoma)/伯基特(burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤、散發性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)、c)邊緣區淋巴瘤(包括結外邊緣區b細胞淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，malt)、結邊緣區b細胞淋巴瘤和脾邊緣區淋巴瘤)、d)套細胞淋巴瘤(mcl)、e)大細胞淋巴瘤(包括b細胞瀰漫性大細胞淋巴瘤(dlcl)、瀰漫性混合細胞淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴瘤、原發性縱隔b細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺b細胞淋巴瘤)、f)毛細胞白血病、g)淋巴細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫(waldenstrom)氏巨球蛋白血症、h)急性淋巴細胞性白血病(all)、慢性淋巴細胞性白血病(cll)/小淋巴細胞性淋巴瘤(sll)、b細胞幼淋巴細胞白血病、i)漿細胞新生物、漿細胞骨髓瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、j)何杰金氏病。
在一個別的實施方案中，表達cd20的癌症是b細胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。在另一個實施方案中，表達cd20的癌症是套細胞淋巴瘤(mcl)、急性淋巴細胞性白血病(all)、慢性淋巴細胞性白血病(cll)、b細胞瀰漫性大細胞淋巴瘤(dlcl)、伯基特氏淋巴瘤、毛細胞白血病、濾泡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、邊緣區淋巴瘤、移植後淋巴增殖性病症(ptld)、hiv有關的淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、或原發性cns淋巴瘤。
術語「治療方法」或其等同用語在應用於例如癌症時指設計為降低或消除患者中的癌細胞數目，或者減輕癌症症狀的規程或作用過程。癌症或另一種增殖性病症的「治療方法」不必意味著實際上會消除癌細胞或其它病症，實際上會降低細胞數目或病症，或實際上會減輕癌症或其它病症的症狀。經常，甚至會實施具有較低的成功概率，但是然而鑑於醫學史和估計的患者存活預期認為誘導總體有益的作用過程的治療癌症的方法。
術語「共施用」指施用所述無巖藻糖基化抗cd20和苯達莫司汀作為一種單一配製劑或者作為兩種不同配製劑。共施用可以是同時的或者以任意次序序貫的，其中優選地，存在著所有活性劑同時施加其生物學活性的時段。同時或序貫(例如經由靜脈內(i.v.)經由連續輸注(對於抗cd20抗體一次，及最終對於苯達莫司汀一次))共施用所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀。在序貫共施用這兩種治療劑時，在同一天在兩次分開的施用中施用劑量，或者在第1天施用藥劑之一，而在第2天至第7天，優選地在第2天至第4天共施用第二種。如此，術語「序貫地」意指在第一組分(苯達莫司汀或抗體)的劑量後7天內，優選地在第一組分的劑量後4天內；而術語「同時地」意指同時。術語「共施用」就所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀的維持劑量而言意指若治療周期對於這兩種藥物都是合適的，例如每周，則可以或是同時共施用維持劑量。或者，例如，例如每第一至第三天施用苯達莫司汀，而每周施用所述無巖藻糖基化抗體。或者，在一天內或在幾天內序貫共施用維持劑量。
不證自明的是，以「治療有效量」(或僅為「有效量」)對患者施用抗體，所述治療有效量是各種化合物或組合會引發研究人員、獸醫、醫學醫生或其它臨床醫生尋找的組織、系統、動物或人的生物學或醫學應答的量。
所述抗cd20無巖藻糖基化的抗體和苯達莫司汀的共施用量和共施用時機會取決於所治療患者的類型(物種、性別、年齡、重量、等)和狀況和所治療疾病或狀況的嚴重性。可以一次或在一系列治療裡對患者適當地共施用所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀。
若施用是靜脈內的，則所述無巖藻糖基化抗cd20抗體或苯達莫司汀的初始輸注時間可以比隨後的輸注時間長，例如初始輸注為約90分鐘，而隨後的輸注為約30分鐘(若初始輸注耐受良好的話)。
根據疾病的類型和嚴重性，約1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)苯達莫司汀是對患者共施用這兩種藥物的初始候選劑量。在一個實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體(優選地無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)的優選劑量會在約0.05mg/kg至約30mg/kg的範圍中。如此，可以對患者共施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/kg(或其任何組合)的一劑或多劑。在一個實施方案中，苯達莫司汀的劑量會在0.01mg/kg至約30mg/kg，例如0.1mg/kg至10.0mg/kg的範圍中。根據患者的類型(物種、性別、年齡、重量、等)和狀況及無巖藻糖基化抗cd20抗體的類型，所述無巖藻糖基化抗體和苯達莫司汀的劑量和施用日程表可以有所不同，例如，可以例如每1至3周施用所述無巖藻糖基化抗cd20抗體，並且可以每天或每2至10天施用苯達莫司汀。也可以施用較高的初始加載劑量，接著是較低的一劑或多劑。
在一個優選的實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體(優選地，無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)的優選劑量會是在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天的800至1200mg，然後是多至5個4周劑量周期的第1天的800至1200mg的劑量，而苯達莫司汀的優選劑量會是例如在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天(在第1天和第2天在30分鐘裡靜脈內輸注)的80mg/m2至110mg/m2(在一個實施方案中為110mg/m2，在另一個實施方案中為90mg/m2)。或者，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體的劑量可以是在多至8個3周劑量周期的第1天的800至1200mg(例如1000mg)。
在一個實施方案中，藥物可用於預防或降低患有癌症，優選地表達cd20的癌症的此類患者中的轉移或進一步散布。藥物可用於延長此類患者的存活持續時間，延長此類患者的無進展存活，延長響應的持續時間，導致經治療的患者的統計學顯著的且臨床上有意義的改善，如通過存活的持續時間、無進展存活、響應率或響應的持續時間所測量的。在一個具體的實施方案中，藥物可用於提高患者組中的響應率。
在本發明的上下文中，可以在無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀的癌症聯合治療中使用額外的其它細胞毒劑、化療劑或抗癌劑、或增強此類藥劑的效果的化合物(例如細胞因子)。合適地，此類分子以對於意圖的目的有效的量組合存在。在一個實施方案中，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀聯合治療不與所述額外的細胞毒劑、化療劑或抗癌劑、或增強此類藥劑的效果的化合物一起使用。
此類藥劑包括例如：烷化劑或具有烷基化作用的藥劑，諸如環磷醯胺(cyclophosphamide)(ctx；例如)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(chl；例如瘤可寧)、順鉑(cisplatin)(cisp；例如)、白消安(busulfan)(例如，馬利蘭)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(bcnu)、鏈脲菌素(streptozotocin)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)(tem)、絲裂黴素c(mitomycinc)，等等；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)(mtx)、依託泊苷(etoposide)(vp16；例如凡畢士)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)(6mp)、6-硫鳥嘌呤(6-thiocguanine)(6tg)、阿糖胞苷(cytarabine)(ara-c)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-fu)、卡培他濱(capecitabine)(例如，希羅達)、達卡巴嗪(dacarbazine)(dtic)，等等；抗生素，諸如放線菌素d(actinomycind)、多柔比星(doxorubicin)(dxr；例如阿黴素)、柔紅黴素(daunorubicin)(道諾黴素(daunomycin))、博來黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)，等等；生物鹼，諸如長春花生物鹼諸如長春新鹼(vincristine)(vcr)、長春鹼(vinblastine)，等等；及其它抗腫瘤劑，諸如帕西他賽(paclitaxel)(例如泰素)和帕西他賽衍生物、細胞抑制劑、糖皮質激素諸如地塞米松(dexamethasone)(dex；例如地卡特隆)和皮質類固醇諸如潑尼松(prednisone)、核苷酶抑制劑諸如羥基脲、胺基酸消減酶(aminoaciddepletingenzyme)諸如天冬醯胺酶、甲醯四氫葉酸(leucovorin)和其它葉酸衍生物、和相似的多種多樣的抗腫瘤劑。也可以使用下列藥劑作為額外的藥劑：氨磷汀(arnifostine)(例如)、更生黴素(dactinomycin)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)(氮芥)、鏈佐星(streptozocin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、洛莫司汀(lomustine)(ccnu)、多柔比星脂質體(doxorubicinlipo)(例如，)、吉西他濱(gemcitabine)(例如健擇)、柔紅黴素脂質體(daunorubicinlipo)(例如)、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素(mitomycin)、多西他賽(docetaxel)(例如泰索帝)、阿地白介素(aldesleukin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、克拉屈濱(cladribine)、喜樹鹼(camptothecin)、cpt11(伊立替康(irinotecan))、10-羥基7-乙基-喜樹鹼(sn38)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊達比星(idarubicin)、美司鈉(mesna)、幹擾素β、幹擾素α、米託蒽醌(mitoxantrone)、託泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰嘌呤、普卡黴素(plicamycin)、米託坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡黴素(plicamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睪內酪(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)。優選地，無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀聯合治療不與此類額外的藥劑一起使用。
上文所描述的細胞毒劑和抗癌劑及抗增殖性靶物特異性抗癌藥物，如蛋白質激酶抑制劑在化學療法方案中的使用一般在癌症療法領域中得到充分表徵，並且其在本文中的使用歸入關於監測耐受性和效力及關於控制施用路徑和劑量的相同考慮，伴有一些調整。例如，細胞毒劑的實際劑量可以隨通過使用組織培養方法測定的患者的培養細胞應答而變化。一般地，與在沒有額外的其它藥劑的情況中使用的量相比，劑量會是降低的。
有效細胞毒劑的典型劑量可以在製造商推薦的範圍中，並且在通過體外應答或動物模型中的應答指示的情況中，可以降低多至約一個數量級的濃度或量。如此，實際劑量會取決於內科醫生的判斷、患者的狀況、和治療方法的效力，其基於原代培養的惡性細胞或組織培養組織樣品的體外響應性，或合適的動物模型中觀察到的響應。
在本發明的上下文中，在表達cd20的癌症的無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀聯合治療外，可以實施有效量的電離輻射和/或可以使用放射性藥物。放射源可以是在所治療的患者外部或內部。在來源在患者外部時，已知療法為外部束放射療法(ebrt)。在放射源在患者內部時，治療稱作近程治療(bt)。本發明的上下文中使用的放射性原子可以選自下組，包括但不限於鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鎝-99、碘-123、碘-131、和碘-111。也有可能用此類放射性同位素標記抗體。優選地，無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀聯合治療不與此類電離輻射一起使用。
放射療法是一種用於控制不可切除的或不能手術的腫瘤和/或腫瘤轉移的標準治療。已經在組合放射療法與化學療法時看到改善的結果。放射療法基於如下的原則，即對靶區域投遞的高劑量放射會導致腫瘤和正常組織兩者中的生殖細胞(reproductivecell)死亡。放射劑量方案一般在放射吸收劑量(gy)、時間和分級方面限定，並且必須由腫瘤學家仔細限定。患者接受的放射量會取決於各種考慮因素，但是兩項最重要的是腫瘤相對於身體的其它重要結構或器官的位置和腫瘤已經擴散的程度。經歷放射療法的患者的典型治療過程會是在1至6周時段裡的治療日程表，以單一每日分數約1.8至2.0gy一周5天對患者施用10-80gy的總劑量。在本發明的一個優選的實施方案中，在用本發明的聯合治療和放射治療人患者中的腫瘤時存在著協同。換言之，在與放射，任選地有額外的化學治療劑或抗癌劑組合時，依靠構成本發明的組合的藥劑對腫瘤生長的抑制得到增強。例如，輔助放射療法的參數包含在wo99/60023中。
可以依照已知的方法，諸如通過靜脈內施用(以推注或者通過在一段時間裡連續輸注)，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、或鞘內路徑對患者施用無巖藻糖基化抗cd20抗體。在一個實施方案中，此類抗體通過靜脈內或皮下施用來施用。
依照已知的方法，例如通過靜脈內施用(以推注或者通過在一段時間裡連續輸注)，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、或經口路徑對患者施用苯達莫司汀。依照一個實施方案，通過靜脈內或腹膜內施用來施用此類抗體。
如本文中所使用的，「藥學可接受載體」意圖包括與藥學施用相容的任何和所有材料，包括溶劑、分散介質、塗層材料、抗細菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、和與藥學施用相容的其它材料和化合物。除非任何常規的介質或藥劑與活性化合物不相容，涵蓋其在本發明的組合物中的用途。也可以將補充的活性化合物摻入組合物中。
藥物組合物：
可以通過用藥學可接受的無機或有機載體加工依照本發明的抗cd20抗體和/或苯達莫司汀來獲得藥物組合物。可以使用乳糖、玉米澱粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等，例如諸如片劑、包衣片劑、錠劑和硬明膠膠囊的載體。適合於軟明膠膠囊的載體是例如植物油、蠟、脂肪、半固體和液體多元醇等。然而，根據活性物質的性質，通常在軟明膠膠囊的情況中不需要載體。適合於生成溶液和糖漿劑的載體是例如水、多元醇、甘油、植物油等。適合於栓劑的載體是例如天然的或硬化的油、蠟、脂肪、半液體或液體多元醇等。
此外，藥物組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩定劑、溼潤劑、乳化劑、增甜劑、著色劑、香料、用於改變滲透壓的鹽、緩衝劑、掩蔽劑或抗氧化劑。它們也可以含有其它治療上有價值的物質。
本發明的一個實施方案，組合物包含具有60％或更小的巖藻糖量的所述無巖藻糖基化抗cd20抗體(在一個實施方案中，所述抗體是無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)和苯達莫司汀兩者，其在治療癌症，特別是表達cd20的癌症中使用。
所述藥物組合物可以進一步包含一種或多種藥學可接受載體。
本發明進一步提供了特別在癌症中使用的藥物組合物，其包含(i)第一有效量的具有60％或更小的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體(在一個實施方案中為無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)，和(ii)第二有效量的苯達莫司汀。任選地，此類組合物包含藥學可接受載體和/或賦形劑。
通過將具有期望純度的抗體與任選的藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑(remington’spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.編(1980))混合以凍幹配製劑或水溶液形式為貯存製備依照本發明使用的僅無巖藻糖基化抗cd20抗體的藥物組合物。可接受的載體、賦形劑、或穩定劑在所採用的劑量和濃度對於接收者無毒，並且包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑諸如edta；糖諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反荷離子諸如鈉；金屬複合物(例如，zn-蛋白質複合物)；和/或非離子型表面活性劑諸如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。
苯達莫司汀的藥物組合物可以與上文對無巖藻糖基化抗cd20抗體描述的藥物組合物類似。
在本發明的又一個實施方案中，將無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀以兩種不同配製劑配製。
活性成分還可以包載於例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類技術披露於例如remington’spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.編(1980)。
可以製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質是定型產品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(us3,773,919)、l-穀氨酸和l-穀氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)、及聚-d-(-)-3-羥基丁酸。
要用於體內施用的配製劑必須是無菌的。這容易通過過濾流過無菌濾膜來實現。
本發明進一步提供了一種用於治療癌症的方法，包括對需要此類治療的患者施用(i)第一有效量的具有60％或更小的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體(在一個實施方案中為無巖藻糖基化的人源化b-ly1抗體)，和(ii)第二有效量的苯達莫司汀。
在一個實施方案中，巖藻糖量是40％至60％。
優選地，所述癌症是表達cd20的癌症。
優選地，所述表達cd20的癌症是b細胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。
優選地，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體是ii型抗cd20抗體。
優選地，所述抗體是人源化b-ly1抗體。
優選地，在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg的劑量，然後在多至5個4周劑量周期的第1天以800至1200mg的劑量施用所述人源化b-ly1抗體，並在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天以80mg/m2至110mg/m2的劑量施用苯達莫司汀。
如本文中所使用的，術語「患者」優選地指出於任何目的需要用無巖藻糖基化抗cd20抗體治療的人(例如，患有表達cd20的癌症的患者)，且更優選地需要此類治療以治療癌症、或癌前狀況或損傷的人。然而，術語「患者」也可以指非人動物，優選地哺乳動物諸如犬、貓、馬、牛、豬、綿羊和非人靈長類，等等。
本發明進一步包括與苯達莫司汀聯合治療癌症的無巖藻糖基化抗cd20抗體。
本發明進一步包括在治療癌症中使用的具有60％或更小的巖藻糖量的無巖藻糖基化抗cd20抗體和苯達莫司汀。
優選地，所述無巖藻糖基化抗cd20抗體是人源化b-ly1抗體。
優選地，癌症是表達cd20的癌症，更優選地b細胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)。
優選地，在6周劑量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg的劑量，然後在多至5個4周劑量周期的第1天以800至1200mg的劑量施用所述人源化b-ly1抗體，並在多至6個4周劑量周期的第1天和第2天以80mg/m2至110mg/m2的劑量施用苯達莫司汀。
提供以下實施例和圖以幫助理解本發明，其真正的範圍在所附權利要求書中列出。應當理解，可以在不背離本發明精神的前提下對列出的規程做出修飾。
序列表
seqidno:1鼠單克隆抗cd20抗體b-ly1的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列。
seqidno:2鼠單克隆抗cd20抗體b-ly1的輕鏈可變區(vl)的胺基酸序列。
seqidno:3-19人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hh2至b-hh9、b-hl8、和b-hl10至b-hl17)。
seqidno:20人源化b-ly1抗體的輕鏈可變區(vl)的胺基酸序列。b-kv1
附圖描述
圖1無巖藻糖基化ii型抗cd20抗體(b-hh6-b-kv1ge)與苯達莫司汀的聯合治療的體內抗腫瘤活性(與利妥昔單抗(巖藻糖基化i型抗cd20抗體)與苯達莫司汀的組合相比及與各種單一療法相比)。
實施例
實驗規程
ii型抗cd20抗體(b-hh6-b-kv1ge)與苯達莫司汀的聯合治療的抗腫瘤活性
測試劑
無巖藻糖基化抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge(無巖藻糖基化的人源化b-ly1，糖工程化改造的b-hh6-b-kv1，參見wo2005/044859和wo2007/031875)以來自glycart,schlieren,switzerland的儲備溶液(9.4mg/ml)提供。抗體緩衝液包含組氨酸、海藻糖和聚山梨酯20。自儲液將抗體溶液在pbs中適當稀釋，用於在先注射。
臨床級利妥昔單抗(mabthera)獲自hoffmannlaroche,basel。
苯達莫司汀購自mundipharmagmbh,limburganderlahn,germany。自製造的25mg/ml儲備溶液調節需要的稀釋液。
細胞系和培養條件
將人z138套細胞淋巴瘤細胞系在補充有10％胎牛血清(paalaboratories,austria)和2mml-穀氨醯胺的dmem中於37℃在水飽和氣氛中於8％co2常規培養。使用傳代4來移植。將細胞與matrigel共注射。
動物
將雌性scid米色小鼠；到達時年齡為3-4周(購自charlesriver,sulzfeld,germany)在無特定病原體的條件下以12小時光照/12小時黑暗的日周期依照約定的準則(gv-solas；felasa；tierschg)維持。實驗研究方案得到地方政府審閱並批准。到達後，將動物在動物房的檢疫部分維持1周以習慣於新的環境及觀察。定期實施連續健康監測。飲食食物(provimikliba3337)和水(酸化的ph2.5-3)任意提供。
監測
每天對動物控制臨床症狀和不利作用的檢測。對於貫穿整個實驗的監測，每周兩次記錄動物的體重，並在分期後通過測徑器測量腫瘤體積。
動物的處理
動物處理在腫瘤細胞接種後19天的隨機化當天開始。在研究第19天和第26天以指定劑量1mg/kgi.p.q7d以單一藥劑施用人源化的無巖藻糖基化抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge或利妥昔單抗。在同一天施用相應的媒介物。在第19天、第20天、第21天和第22天以3mg/kgi.p.給予苯達莫司汀。在聯合療法組中，在第19天在這兩種抗體後8小時施用化療劑。
體內腫瘤生長抑制研究
在腫瘤細胞接種後第33天在實驗結束時，與對照組相比，給予利妥昔單抗、抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge、利妥昔單抗和苯達莫司汀組合、或抗cd20抗體和苯達莫司汀組合的動物中分別有如表1中給出的腫瘤生長抑制(tgi)。僅用苯達莫司汀的處理在本實驗中沒有顯示任何抗腫瘤活性。
通過比較抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge/苯達莫司汀組合組與僅抗cd20抗體b-hh6-b-kv1ge的處理，存在著大於疊加的效應。
統計學評估
在第33天終止研究。統計學評估基於sauc。與媒介物組(組1)相比，腫瘤生長在組2(b-hh6-b-kv1ge，1mg/kg，一周一次，i.p.)中(以tcr為0.72(ci0.59-0.86)指示)、在組3(利妥昔單抗，1mg/kg，一周一次，i.p.)中(以tcr為0.78(ci0.65-0.93)指示)、在組5(b-hh6-b-kv1ge，1mg/kg，一周一次，i.p.，與苯達莫司汀組合，3mg/kg，研究日19-22，i.p.)中(以tcr為0.46(ci0.34-0.59)指示)及在組6(利妥昔單抗，1mg/kg，一周一次，i.p.，與苯達莫司汀組合，3mg/kg，研究日19-22，i.p.)中(以tcr為0.67(ci0.54-0.81)指示)受到統計學顯著抑制。在研究結束時，組4(苯達莫司汀，3mg/kg，研究日19-22，i.p.)顯示與對照組相當的腫瘤生長。
通過tukey-kramer檢驗(p<0.001)分析，與單一處理相比，b-hh6-b-kv1ge與苯達莫司汀的組合對腫瘤生長抑制顯示大於疊加的(協同的)且統計學顯著的影響(參見表1和圖1)。
表1：基於sauc和tgi(％)的參數tcr及低的和高的置信區間(ci)
序列表
羅切格利卡特公司(rocheglycartag)
無巖藻糖基化cd20抗體與苯達莫司汀的聯合療法
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2009-08-14
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小鼠(mussp.)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hh2)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hh6)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hh7)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hh8)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hh9)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hl8)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hl10)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hl11)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hl12)
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人源化b-ly1抗體的重鏈可變區(vh)的胺基酸序列(b-hl17)
19
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