活化素-actriia拮抗劑及在治療或預防乳腺癌中的用途的製作方法

2023-12-02 01:07:01

專利名稱：活化素-actriia拮抗劑及在治療或預防乳腺癌中的用途的製作方法
活化素-ACTRI IA拮抗劑及在治療或預防乳腺癌中的用途相關申請的交叉參考本申請要求於2007年2月1日提交的序列號為60/899，070的美國臨時專利申請 和於2007年10月25日提交的序列號為61/000，540的美國臨時專利申請的權益。上述申 請的全部教導在此引入作為參考。
背景技術：
乳腺癌是西方國家女性中最常見的癌症類型，每年影響超過180，000美國女性。 該病發生在由分枝導管系統組成的乳腺。每一個乳腺或乳房包含15到20個稱為乳腺小葉 (lobe)的部分，每個乳腺小葉包含一系列匯集到乳頭的分枝的導管。沿(line)每條導管排 列的上皮細胞負責生產乳汁。侵襲性乳腺癌被認為是由末梢導管/小葉單位的正常上皮細 胞通過一系列不斷增加的異常增殖性病變產生。一旦腫瘤獲得轉移的能力，乳腺癌細胞會 擴散到其它器官，使治療更加困難。最常見的乳腺癌轉移部位是肺、肝、和骨骼。向骨骼的 轉移通常會伴隨劇痛、骨質流失、以及骨折風險增高。在乳腺癌治療中應用的很多抗雌激素 療法也會伴隨骨質流失加速。診斷為乳腺癌的患者通常進行手術和/或放射療法來治療原發瘤，然後用輔助療 法治療可能擴散到遠處的癌細胞。輔助療法由細胞毒化療和/或內分泌療法組成。雖然化 療對治療多種惡性腫瘤有效，但是很多抗腫瘤化合物會誘導不良的副作用。另外，很多腫 瘤對化療和內分泌療法沒有反應或產生抗性。雖然輔助療法改善了乳腺癌患者的死亡率， 但是最常見的組織病理學類型的侵襲性乳腺癌患者的10年生存率仍然只有35%到50% (Weigelt等人2005 Nat. Rev. Cancer 5:591-602)。此外，由於缺乏預後標準，通過單獨局 部療法治癒的很多女性不必要地接受了輔助療法。因此，需要更高效率的且更有效的抗乳腺癌分子靶標。比化療和內分泌療法更低 毒性和/或更有效的替代療法可改善治療方法並提高生存率。此外，有些患者可能存在發 展成擴散性或轉移性乳腺癌的風險，可對這些患者進行預防性治療的藥劑在臨床上是有用 的。因此，本發明的一個目標是提供替代性組合物和方法，用於治療乳腺癌或者抑制或預防 乳腺癌的進展。發明概述部分而言，本公開內容涉及使用活化素拮抗劑以及ActRIIa拮抗劑治療或預防乳 腺癌或乳腺癌伴隨的骨質流失(bone loss)。具體來說，本公開內容提供了治療或預防乳 腺癌的方法，該方法使用充當活化素抑制劑的可溶形式的ActRIIa。儘管可溶性ActRIIa 可能通過活化素拮抗以外的機制影響癌細胞生長或存活，但是合意的治療劑可在活化素拮 抗或ActRIIa拮抗或者兩者的基礎上進行選擇。此類藥劑被統稱為活化素-ActRIIa拮抗 齊U。因此，在某些實施方案中，本公開內容提供使用活化素-ActRIIa拮抗劑在有此需要的 患者中治療或預防乳腺癌的方法，所述活化素-ActRIIa拮抗劑包括，例如，活化素-結合 ActRIIa ^li (activin-binding ActRIIapolypepitde)ActRIIa 靶向活化素或ActRIIa的小分子和適體、以及減少活化素和ActRIIa表達的核酸。如序列 號為11/603,485的美國專利申請(在此引入作為參考)所述，活化素-ActRIIa拮抗劑可用於促進骨生長和提高骨密度。如本文所述，此類拮抗劑還可用於治療或預防乳腺癌、乳腺癌向骨骼的轉移、以及乳腺癌伴隨的骨質流失。在某些方面，本公開內容提供使用多肽治療或預防乳腺癌的方法，所述多肽包括 與活化素結合的可溶性、活化素_結合ActRIIa多肽。可將ActRIIa多肽配製成包含該活 化素_結合ActRIIa多肽和藥學上可接受的載體的藥物製劑。該活化素_結合ActRIIa多 肽可以小於1微摩爾或小於100、10或1納摩爾的Kd與活化素結合。任選地，相對於⑶Fll 和/或⑶F8，該活化素-結合ActRIIa多肽選擇性地結合活化素，並任選地以比結合⑶Fll 和/或⑶F8至少低10倍、20倍或50倍的Kd結合活化素。儘管不希望受到特定作用機制 的束縛，預期這種活化素抑制勝過GDF11/GDF8抑制的選擇性程度說明了對骨骼或腫瘤存 活或生長的影響，而對肌肉沒有一致可測的影響。在許多實施方案中，將選擇ActRIIa多 肽，從而在達到對癌細胞的所需影響的劑量下，引起肌肉中小於15%、小於10%或小於5% 的增長。如通過尺寸排阻色譜所估計，該組合物相對於其它多肽成分可具有至少95%的純 度，任選地，該組合物具有至少98%的純度。用於此類製劑的活化素_結合ActRIIa多肽 可以是本文所述的那些多肽的任意種，例如具有選自SEQ ID N0s:2、3、7或12的胺基酸序 列的多肽，或具有與選自SEQ ID NOs :2、3、7、12或13的胺基酸序列具有至少80%、85%、 90%、95%、97%或99%同一性的胺基酸序列的多肽。活化素-結合ActRIIa多肽可包含天 然ActRIIa多肽的功能性片段，例如包含選自序列SEQ IDNOs :1_3或序列SEQ ID NO 2的 至少10、20、30、50或90個或更多胺基酸，缺失C-末端10至15個胺基酸(「尾部」)的功 能性片段。可溶性、活化素-結合ActRIIa多肽可包括相對天然存在的ActRIIa多肽在氨基 酸序列(例如，在配體結合結構域)中的一個或多個變化。在WO 2006/012627的第59-60 頁(在此引入作為參考)中提供了變化的ActRIIa多肽的實例。胺基酸序列中的變化可以 例如，當其在哺乳動物、昆蟲或其它真核細胞中生成時改變多肽的糖基化，或者相對於天然 存在的ActRIIa多肽改變多肽的蛋白酶解裂解。活化素-結合ActRIIa多肽可以是一種融合蛋白，其具有作為一種結構域的 ActRIIa多肽(例如，ActRIIa的配體結合部分)和提供所需特性(例如改善的藥代動力 學、更簡單的純化、增強的對特定組織的靶向等)的一種或多種其它結構域。例如，融合蛋 白的結構域可增強以下各項中的一種或多種體內穩定性、體內半衰期、攝取/給藥、組織 定位或分布、蛋白複合物的形成、該融合蛋白的多聚和/或純化。活化素_結合ActRIIa融 合蛋白可包含提供所需特性(例如改善的藥代動力學、提高的溶解度或提高的穩定性)的 免疫球蛋白Fc結構域(野生型或突變體)或血清白蛋白或其它多肽部分。在優選的實施 方式中，ActRIIa-Fc融合包含位於Fc結構域和胞外ActRIIa結構域之間的相對非結構化 (unstructured)的接頭。該非結構化的接頭可對應於在ActRIIa的胞外結構域的C-末端 的約15個胺基酸的非結構化區(「尾部」)，或者它可以是相對不含二級結構的1、2、3、4或 5個胺基酸的人工序列或長度在5與15、20、30、50或更多胺基酸之間的人工序列，或者兩 者的混合物。接頭可富含甘氨酸或脯氨酸殘基，並可以例如，含有蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸 的單獨序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重複序列(例如，TG4或SG4單態或重複)。融合 蛋白可包含純化子序列(subsequence)，例如表位標記、FLAG標記、聚組氨酸序列和GST融 合。任選地，可溶性ActRIIa多肽包含選自如下的一種或多種修飾的胺基酸殘基糖基化胺基酸、聚乙二醇化(PEGylated)胺基酸、法尼基化胺基酸、乙醯化胺基酸、生物素化胺基酸、與脂質部分綴合(conjugated)的胺基酸以及與有機衍生劑綴合的胺基酸。藥物製劑還可 包含一種或多種額外化合物，例如可用於治療骨病的化合物。優選地，藥物製劑基本不含熱 原。一般而言，優選在哺乳動物細胞系中表達ActRIIa蛋白，其合適地介導ActRIIa蛋白的 天然糖基化，從而減少患者中的不利免疫應答的可能性。人和CHO細胞系已被成功使用，預 期其它常見的哺乳動物表達系統將是有用的。另外，酵母和其它細胞類型已被遺傳改造以 表達催化糖基化的哺乳動物酶，從而允許在這些非哺乳動物細胞中表達的蛋白上產生嚴格 控制的類似哺乳動物的糖基化。這些重組細胞系還可用於表達本文所述的蛋白。如本文所述的ActRIIa蛋白特指具有所需特性的ActRIIa-Fc (在ActRIIa部分和 Fc部分之間具有最小接頭的形式)，所述特性包括在動物模型中相對⑶F8和/或⑶Fll的 選擇性結合活化素、高親和性配體結合和大於兩周的血清半衰期。在某些實施方式中，本發 明提供使用ActRIIa-Fc多肽和包含此類多肽和藥學上可接受的賦形劑的藥物製劑來治療 或預防乳腺癌的方法。在某些方面，本公開內容提供使用編碼可溶性活化素-結合ActRIIa多肽的核酸 治療或預防乳腺癌的方法。分離的多核苷酸可包含例如上述可溶性、活化素-結合ActRIIa 多肽的編碼序列。例如，分離的核酸可包含編碼ActRIIa的胞外結構域(例如，配體結合結 構域)的序列以及編碼ActRIIa的部分或全部跨膜結構域和/或細胞質結構域，除定位在 該跨膜結構域或細胞質結構域中、或定位在該胞外結構域與該跨膜結構域或細胞質結構域 之間的終止密碼子外的序列。例如，分離的多核苷酸可包含全長ActRIIa多核苷酸序列(例 如，SEQ ID NO :4或5)，或部分截短的形式(truncatedversion)，所述分離的多核苷酸進一 步包含在3'-末端之前至少六百個核苷酸處或其它位置的轉錄終止密碼子，從而使該多 核苷酸的翻譯形成任選地融合至全長ActRIIa的截短部分的胞外結構域。優選的核酸序列 為SEQ IDNO :14。對本文所述方法有用的核酸可操作地連接至表達用啟動子，且本公開內 容提供用此類重組多核苷酸轉化的細胞。所述細胞優選為哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵 巢(CHO)細胞。本公開內容還提供製備可用於治療或預防乳腺癌的可溶性、活化素-結合 ActRIIa多肽的方法。所述方法可包括在合適的細胞(例如CHO細胞)中表達本文公開的任 意核酸(例如，SEQ ID NO :4、5或14)。此類方法可包括a)在適於表達所述可溶性ActRIIa 多肽的條件下培養細胞，其中用可溶性ActRIIa表達構建體轉化所述細胞；和b)回收如此 表達的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可作為粗製的、部分純化的或高度純化 的級分回收。可通過一系列純化步驟實現純化，所述純化步驟包括例如，任意順序的如下步 驟中的一種、兩種或三種或多種A蛋白色譜、陰離子交換色譜(例如Q瓊脂糖)、疏水作用 色譜(例如苯基瓊脂糖)、尺寸排阻色譜以及陽離子交換色譜。在某些方面，本文公開的活化素-ActRIIa拮抗劑(例如可溶性、活化素-結合 ActRIIa多肽)可用於在對象中治療、預防或抑制乳腺癌的方法，包括例如，延遲乳腺癌發 作、抑制乳腺癌進展、減小腫瘤尺寸、防止腫瘤生長、延遲轉移發生或防止轉移(包括向骨 骼轉移)的方法。在某些實施方案中，本公開內容提供在有此需要的患者中減少或抑制 乳腺癌細胞的生長或存活的方法。一種方法可包括對有此需要的對象給予有效量的活化 素-ActRIIa拮抗劑。在某些方面，本公開內容提供活化素-ActRIIa拮抗劑在製備用於治療或預防本文所述乳腺癌的藥物中的用途。本公開內容還涉及聯合療法，其包含活化素-ActRIIa拮抗劑與放射療法、化療(例如，細胞毒藥劑)和/或內分泌療法。所述拮抗 劑可以是ActRIIa-Fc融合蛋白，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQ ID NO :3的氨 基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。在進一步的實施方案中，本發明涉及在具有一種或多種乳腺癌風險因素的患者中 預防或延遲乳腺癌發作的方法。在一些實施方案中，本發明涉及在已診斷患有原髮乳腺腫 瘤或乳腺增殖性病變的患者中預防或延遲轉移性疾病發作的方法。在病人中預防或延遲 乳腺癌發作的方法可包括對有此需要的病人給予有效量的多肽，所述多肽選自a)包含與 SEQ ID NO :2具有至少90%同一性的胺基酸序列的多肽；b)包含與SEQ ID NO :3具有至少 90%同一性的胺基酸序列的多肽；c)包含選自SEQ ID NO 2的至少50個連續胺基酸的多 肽。本發明的其它實施方案涉及在患有乳腺癌的病人中抑制活化素介導的信號傳導 的方法。在某些實施方案中，所述方法包括對所述病人給予有效量的活化素-ActRIIa拮抗 齊U。在進一步的實施方案中，所述拮抗劑是選自以下的多肽a)包含與SEQ ID N0:2具有 至少90%同一性的胺基酸序列的多肽；b)包含與SEQ ID NO :3具有至少90%同一性的氨 基酸序列的多肽；c)包含選自SEQ ID NO 2的至少50個連續胺基酸的多肽。在某些方面，本公開內容提供用於鑑定抑制癌細胞(例如，乳腺癌細胞)生長或存 活的藥劑的方法。所述方法包括a)鑑定與活化素或ActRIIa多肽的配體結合結構域結合 的測試藥劑；b)評估所述藥劑對癌細胞增殖、存活或凋亡的影響。附圖簡述

圖1顯示了在CHO細胞中表達的ActRIIa-hFc的純化。所述蛋白純化為單一的、 充分確定(well-defined)的峰，其通過分級柱(sizing column)(左圖)和考馬斯染色的 SDS-PAGE(右圖)顯現(左泳道分子量標準物；右泳道ActRIIa-hFc)。圖2顯示了通過BiaCore 分析測定的ActRIIa-hFc與活化素及⑶F-11的結合。圖3顯示了在轉移性乳腺癌的小鼠模型中ActRIIa-mFc治療顯著減少了轉移性病 變的形成。在心內注射表達螢光素酶的MDA-MB-231乳腺癌細胞5周後，對小鼠進行非侵入 性觀察(麻醉，螢光成像)。只載體處理的小鼠中12隻顯示可見的轉移性病變，但是12隻 ActRIIa-mFc處理的小鼠中只有4隻顯示可見的病變。發明詳述1.綜述轉化生長因子(TGF-β)超家族包含各種具有共同的序列元件和結構基序的 生長因子。這些蛋白已知對脊椎動物和無脊椎動物兩者中的各種各樣的細胞類型產生生物 學效應。該超家族的成員在胚胎發育過程中在圖式形成和組織特化中起重要功能，並能影 響各種分化過程，包括脂肪生成、肌細胞生成、軟骨發生、心臟發生、血細胞生成、神經發生 以及上皮細胞分化。該家族被分為兩大分支出1^/60 和16 -0/活化素分支，其成員具有 不同的，通常是互補的作用。通過操控TGF-β家族成員的活性，通常可能引起有機體的明 顯生理變化。例如，皮埃蒙特牛與比利時藍牛品種攜帶⑶F8(也稱為肌肉生長抑制因子) 基因的功能喪失突變，其導致肌肉質量的明顯增加。Grobet等人，Nat Genet. 1997,17(1) 71-4。此外，在人中，滅活GDF8等位基因與肌肉質量的上升相關，且據報導與異常的力量相關。Schuelke 等人，N Engl J Med 2004，350 :2682_8。活化素是二聚多肽生長因子，其屬於TGF-β超家族。存在三種主要的活化素形式(A、B和AB)，其為兩種密切相關的β亞基的同源/異源二聚體(分別為βΑβΑ、βΒβΒ 和βΑβΒ)。人基因組還編碼活化素C和活化素Ε，其主要在肝中表達，還已知含有β。或 βΕ的異源二聚體形式。在TGF-β超家族中，活化素是獨特且多功能的因子，它能刺激卵 巢和胎盤細胞中的激素生成，支持神經元細胞存活，根據細胞類型積極或消極影響細胞周 期進展，並至少在兩棲動物胚胎中誘導中胚層的分化(DePaolo等人，1991，Proc SocEp Biol Med. 198 :500_512 ；Dyson 等人，1997，Curr Biol. 7 :81_84 ；Woodruff, 1998，Biochem Pharmaco 1.55 953-963)。此外，業已顯示活化素B涉及小鼠乳腺上皮細胞分化的調控 (Robinson 和 Hennighausen，1997Development 124 2701-2708)。在數種組織中，活化素 信號傳導被它的相關異源二聚體抑制素所拮抗。例如，在從腦垂體釋放促濾泡激素(FSH) 的過程中，活化素促進FSH分泌和合成，而抑制素阻止FSH的分泌和合成。可調節活化素 生物活性和/或與活化素結合的其它蛋白包括促濾泡抑制素(FS)、促濾泡抑制素相關蛋白 (FSRP)和α2-巨球蛋白。TGF-β信號由I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚複合物介導，其在受 到配體刺激時磷酸化和激活下遊Smad蛋白(Massagu6，2000，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 169-178)。這些I型和II型受體為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸區的配體_結合胞外結 構域、跨膜結構域和具有預測的絲氨酸/蘇氨酸特異性的細胞質結構域所組成。I型受體為 信號傳導所必需；Π型受體為結合配體以及表達I型受體所需要。I和II型活化素受體在 配體結合後形成穩定的複合物，導致I型受體被II型受體磷酸化。兩種有關的II型受體(ActRIIa和ActRIIb)已被鑑定為活化素的II型受體 (Mathews 和 Vale, 1991，Cell 65 :973_982 ；Attisano 等人，1992，Cell 68 :97_108)。除 了活化素外，ActRIIa和ActRIIb能夠與數種其它的TGF-β家族蛋白(包括ΒΜΡ7、Nodal、 GDF8 和 GDF11)進行生化相互作用(Yamashita 等人，1995，J. Cell Biol. 130 :217_226 ；Lee 和 McPherron，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. 98 :9306_9311 ；Yeo 和 Whitman，2001，Mol. Cell 7 949-957 ；Oh 等人，2002，Genes Dev. 16 :2749_54)。ALK4 是活化素(特別是活化素 A)的 主要的I型受體，而ALK-7也可用作活化素(特別是活化素B)的受體。如本文所述，相對其它TGF- β家族成員(例如⑶F8或⑶Fll)明顯優先結合活化 素A的可溶性ActRIIa多肽(sActRIIa)可用於治療或預防癌症，特別是乳腺癌。雖然不希 望受到任何具體機制的束縛，假定在這些研究中所用的具體SActRIIa構建體顯示極強的 活化素結合(皮摩爾解離常數)，預期sActRIIa的作用主要由活化素拮抗劑作用所引起。 活化素-ActRIIa拮抗劑包括，例如，活化素-結合的可溶性ActRIIa多肽、結合活化素(具 體來說活化素A和B亞基，也稱為β A和β B)並破壞ActRIIa結合的抗體、結合ActRIIa並 破壞活化素結合的抗體、選擇用於活化素或ActRIIa結合的非抗體蛋白(此類蛋白及其設 計和選擇的方法的實例參見例如W0/2002/088171、W0/2006/055689和W0/2002/032925)、 選擇用於活化素或ActRIIa結合的隨機化的肽，通常附著在Fc結構域上。具有活化素或 ActRIIa結合活性的兩種不同蛋白(或其它部分)，特別是分別阻斷I型(例如可溶性I型 活化素受體)和II型(例如可溶性II型活化素受體)結合位點的活化素結合劑，可連接 在一起創建雙功能結合分子。抑制該活化素-ActRIIa信號傳導軸的核酸適體、小分子和其它藥劑也可使用。各種蛋白具有活化素-ActRIIa拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素α亞 基)(儘管抑制素並不在所有的組織中普遍拮抗活化素)、促濾泡抑制素(例如促濾泡抑制 素-288和促濾泡抑制素-315)、FSRP、活化素C、α (2)-巨球蛋白、以及Μ108Α(在位置108 處由蛋氨酸突變為丙氨酸)突變活化素Α。一般而言，活化素的替代形式(特別是在I型受 體結合結構域中具有替代的那些形式)能夠結合II型受體且不能形成活性三元複合物，因 此充當拮抗劑。此外，抑制活化素A、B、C或E或者尤其抑制ActRIIa表達的核酸，例如反義 分子、siRNA或核酶可被用作活化素-ActRII拮抗劑。待使用的活化素-ActRIIa拮抗劑相 對於其它TGF-β家族成員，特別是相對於GDF8和GDF11，可對抑制活化素介導的信號傳導 顯示選擇性。可溶性ActRIIb蛋白確實與活化素結合，但是該野生型蛋白相對於GDF8/11不 顯示出對結合活化素的顯著選擇性。雖然如此，此類ActRIIb多肽，以及具有不同結合特性 的ActRIIb的變化形式(參見，例如WO 2006/012627,pp. 55-59，在此引入作為參考)，可對 癌細胞實現所需的作用。通過與另一種活化素選擇性結合劑偶聯，天然的或變化的ActRIIb 可獲得增加的對活化素的特異性。在本發明的上下文中以及在每個術語所用的特定的上下文中，在本說明書中所用 的術語通常具有其在本領域中的普通含義。在下文以及說明書的其它部分討論了某些術 語，以在描述本發明的組合物和方法以及如何製造和使用它們的方面為從業者提供額外的 指導。術語的任何使用範圍或含義將從該術語所用的特定上下文變得顯而易見。「大約」和「約」一般指在給定測量法的性質和精確性的前提下測得數值的可接受 誤差程度。典型地，示例性誤差程度為在給定的數值或數值範圍的20%以內，優選在10% 以內，更優選在5%以內。或者，特別是在生物系統中，術語「大約」和「約」可表示在一定數量級範圍內，優 選在給定值的5倍以內，更優選在2倍以內的平均值。除非另有說明，本文給出的數量為近 似值，表示在未明確指出時，可推出術語「大約」或「約」。本發明的方法可包括對序列彼此比較的步驟，包括將野生型序列與一種或多種突 變體(序列變體)進行比較。此類比較通常包括聚合物序列的比對，例如，採用本領域熟知 的序列比對程序和/或算法(例如，稍加舉例，BLAST、FASTA和MEGALIGN)進行。本領域技 術人員可容易地理解在此類比對中，當突變包含殘基插入或刪除時，該序列比對將在不包 含該插入或刪除殘基的聚合物序列中引入「間隙」(通常由破折號或「A」表示)。「同源性」及其所有的語法形式和拼寫變體均指具有「共同進化起源」的兩種蛋白 (包括來自相同生物物種的超家族的蛋白，以及來自不同生物物種的同源性蛋白)之間的 關係。此類蛋白(及其編碼核酸)具有序列同源性，這反映在它們的序列相似性，不管是就 百分比同一性而言還是在通過特定殘基或基序以及保守位置的存在方面。術語「序列相似性」及其所有的語法形式指可享有或可不享有共同進化起源的核酸或胺基酸序列之間的同一性或對應性程度。然而，在通常的使用以及在本申請中，當術語「同源性」被副詞例如「高度」修飾時， 可表示序列相似性，並可涉及或可不涉及共同進化起源。術語「乳腺癌」指乳腺的任何增殖性病變或增殖性異常，其包括，例如，良性病變、 惡化前和惡性病變、實體腫瘤以及轉移性疾病(局部轉移，例如III期，和更廣泛的轉移，例 如IV期)。乳腺癌包括但不限於腺癌、小葉(小細胞)癌、導管內癌、乳腺髓樣癌、乳腺粘液腺癌、乳腺小管癌、乳頭乳腺癌、佩吉特氏病以及炎性乳腺癌。乳腺癌還指源於乳腺轉移 性病變的其它器官(例如肺、肝和骨骼)疾病。乳腺癌還包括激素應答性和激素非依賴性 癌症。一般而言，激素非依賴性乳腺癌的特徵是雌激素和/或孕酮受體水平的缺失或降低， 並且這些癌症典型地對用抗激素(特別是抗雌激素)療法的治療具有頑固性。乳腺癌還以 Her2表達為基礎分類，其中Her2+腫瘤比Her2_腫瘤的預後更差。2. ActRIIa 多肽
在某些方面，本發明涉及使用ActRIIa多肽治療或預防乳腺癌的方法。本文所用 的術語「ActRIIa」指來自任意物種的IIa型活化素受體(ActRIIa)蛋白以及通過突變或其 它修飾從該ActRIIa蛋白衍生的變體的家族。本文提及ActRIIa時，應理解為提及目前鑑 定的形式中的任意一種。該ActRIIa家族的成員通常為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸區 的配體結合胞外結構域、跨膜結構域以及具有預測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細胞質結 構域所組成。術語「ActRIIa多肽」包括包含任何天然存在的ActRIIa家族成員多肽及其保留 了有用活性的任意變體(包括突變體、片段、融合體以及擬肽形式)的多肽。參見，例如 TO/2006/012627。例如，ActRIIa多肽包括由任意已知ActRIIa的序列所衍生的多肽，其中 該已知ActRIIa具有與ActRIIa多肽序列有至少80%同一性、任選至少85%、90%、95%、 97%、99%或更高同一性的序列。例如，本發明的ActRIIa多肽可結合ActRIIa蛋白和/ 或活化素並抑制其功能。可根據在體內抑制癌細胞增殖或存活的活性選擇ActRIIa多肽。 ActRIIa多肽的實例包括人ActRIIa前體多肽(SEQ ID NO 1)和可溶性人ActRIIa多肽 (例如，SEQ ID NOs :2、3、7 和 12)。人ActRIIa前體蛋白序列如下MGAAAKLAFAVFLISCSSGA ILGRSETQECLFFNANWEKDRTgQTGVEP CYGDKDKRRHCFATWKgI SGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSP
EVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP YYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFffVYRHHKM AYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKH ENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISH RDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWEL ASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGC VGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL(SEQ ID NO 1)信號肽以單下劃線表示；胞外結構域以粗體表示，而潛在的N-連接的糖基化位點 以雙下劃線表示。人ActRIIa可溶性(胞外)、加工的多肽序列如下ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRT DCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSN PVTPKPP(SEQ ID NO 2)應注意經實驗確定N-末端序列以「ILG... 」起始，並且與文獻中通常主張的 「AIL... 」N-末端序列不同。胞外結構域的C-末端「尾部」以下劃線表示。刪除「尾部」的 序列(A15序列)表示如下ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRT DCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEM(SEQ ID NO 3)
編碼人ActRIIa前體蛋白的核酸序列(Genbank條目NM_001616的核苷酸 164-1705)如下ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTTCTTCAGGTGCTATACTTGGT AGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACC GTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGA AACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTA TATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCAC TTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCTATTACAACATCCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGG GGATTGTCATTTGTGCATTTTGGGTGTACAGGCATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTCCAACTCAAGAC CCAGGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACCACTGCAGTTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATT TGGTTGTGTCTGGAAAGCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACAAACAGTCAT GGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCATGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAA CGAGGCACCAGTGTTGATGTGGATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACTTTCTTAA GGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAACCATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGG ATATACCTGGCCTAAAAGATGGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAATGTGCTGTTGAAA AACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCA TGGACAGGTTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCATTTT TGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTA GATGAATACATGTTGCCATTTGAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGCA TAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAG AATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTA ACAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATC TAGTCTATGA(SEQ ID NO 4)編碼人ActRIIa可溶性(胞外)多肽的核酸序列如下ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAAT CAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGG TTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAA AAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATG GAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC(SEQ IDNO 5)在具體的實施方案中，本發明涉及使用可溶性ActRIIa多肽治療或預防乳腺癌的 方法。本文所述的術語「可溶性ActRIIa多肽」通常指包含ActRIIa蛋白的胞外結構域的 多肽。本文所用的術語「可溶性ActRIIa多肽」包括任何天然存在的ActRIIa蛋白及其任 何變體(包括突變體、片段以及擬肽形式)的胞外結構域。活化素-結合ActRIIa多肽是 一種保留了與活化素(包括例如，活化素AA、AB、BB或包含C或E亞基的形式)結合的能 力的多肽。活化素-結合ActRIIa多肽將任選以InM或更小的解離常數與活化素AA結 合。ActRIIa蛋白的胞外結構域與活化素結合，並通常為可溶的，因此可被稱為可溶性、活化 素-結合ActRIIa多肽。可溶性、活化素-結合ActRIIa多肽的實例包括SEQ ID NOs :2、 3、7、12和13所示的可溶性多肽。SEQ ID NO :7被稱為ActRIIa-hFc，並在實施例中進一步 描述。可溶性、活化素_結合ActRIIa多肽的其它實例包含ActRIIa蛋白胞外結構域以外的信號序列，例如，蜜蜂蜂毒肽前導序列(SEQ ID NO :8)、組織纖溶酶原激活物(TPA)前導 序列(SEQ ID NO 9)或天然 ActRIIa 前導序列(SEQ ID N0:10)。在 SEQID N0:13 中所示 的ActRIIa-hFc多肽採用tPA前導序列。ActRIIa多肽的功能活性片段可通過篩選從編碼ActRIIa多肽的核酸的相應片段 重組生成的多肽獲得。此外，可採用本領域已知技術(如常規的Merrifield固相f-Moc或 t-Boc化學)來化學合成片段。可(通過重組或化學合成)生成該片段並進行測試，以鑑定 能夠充當ActRIIa蛋白或活化素介導的信號傳導的拮抗劑(抑制劑)的那些肽基片段。ActRIIa多肽的功能活性變體可通過從編碼ActRIIa多肽的相應突變核酸重組生 成的經修飾的多肽庫中篩選獲得。可生成該變體並進行測試，以鑑定能夠充當ActRIIa蛋 白或活化素介導的信號傳導的拮抗劑(抑制劑)的那些變體 。在某些實施方案中，ActRIIa 多肽的功能變體包含與選自SEQ IDNO 2或3的胺基酸序列具有至少75%同一性的氨基 酸序列。在某些情況下，該功能變體具有與選自SEQ ID NO :2或3的胺基酸序列具有至少 80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%^； 100% 同一性的胺基酸序列。功能變體可通過為諸如增強治療效力或穩定性(例如，先體外後體內保存期以及 對體內蛋白酶解降解的耐受性)等目的對ActRIIa多肽的結構進行修飾來生成。在選擇 保留活化素結合時，此類修飾的ActRIIa多肽被認為是天然存在的ActRIIa多肽的功能等 價物。修飾的ActRIIa多肽還可通過例如，胺基酸置換、刪除或添加來生成。例如，可以合 理預期單獨的以異亮氨酸或纈氨酸置換亮氨酸、以穀氨酸置換天冬氨酸、以絲氨酸置換蘇 氨酸或以結構相關胺基酸進行的類似胺基酸置換(例如，保守突變)將不對所得分子的生 物活性產生較大的影響。保守置換是發生在其側鏈相關的胺基酸家族內的那些置換。在 ActRIIa多肽的胺基酸序列中的變化是否產生功能性同系物可通過評估ActRIIa多肽變體 在細胞中以類似於野生型ActRIIa多肽的方式產生應答的能力容易地測定。在某些實施方案中，本發明預期使用具有改變該多肽的糖基化的特定突變的 ActRIIa多肽來治療或預防乳腺癌的方法。可對此類突變進行選擇，以便引入或消除一個或 多個糖基化位點，例如0-連接的或N-連接的糖基化位點。天冬醯胺_連接的糖基化識別 位點通常包含三肽序列，天冬醯胺-χ-蘇氨酸或天冬醯胺-χ-絲氨酸(其中「X」為任意氨 基酸)，其被適當的細胞糖基化酶特異性識別。還可通過對野生型ActRIIa多肽序列進行一 個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基的添加或置換(針對0-連接的糖基化位點)來進行這種改 變。在糖基化識別位點的第一或第三胺基酸位置之一或兩者進行的各種胺基酸置換或刪除 (和/或在第二位置的胺基酸刪除)導致在修飾的三肽序列處的非糖基化。增加ActRIIa 多肽上的糖部分的數量的另一種方式是通過將糖苷化學或酶促偶聯至該ActRIIa多肽。根 據所用的偶聯模式，該糖可被連接至(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基基團；(c)游離巰 基基團，例如半胱氨酸中的那些巰基；(d)游離羥基基團，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸 中的那些羥基；(e)芳族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些芳族殘基；或者(f) 穀氨醯胺中的醯胺基團。可通過化學和/或酶促法來實現將存在於ActRIIa多肽上的一個 或多個糖部分去除。化學去糖基化可涉及，例如，將ActRIIa多肽暴露至化合物三氟甲磺酸 或同等的化合物。該處理導致除了連接糖(N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)以外 大部分或全部糖的裂解，同時保持胺基酸序列完整。ActRIIa多肽上的糖部分的酶促裂解可 通過採用Thotakura等人(1987)Meth. Enzymol. 138 350所述的各種內切和外切糖苷酶來實現。適當時，ActRIIa多肽的序列可根據所用表達系統的類型進行調整，因為哺乳動物、酵母、昆蟲和植物細胞均可導入可受到肽的胺基酸序列影響的不同的糖基化類型(pattern)。 一般而言，雖然其它的哺乳動物表達細胞系也預期有用，但是用於人類的ActRIIa蛋白可 在提供適當糖基化的哺乳動物細胞系(例如HEK293或CHO細胞系)中表達。本公開內容進一步預期生成突變體的方法，特別是生成ActRIIa多肽的組合突變 體組和截短突變體的方法；組合突變體集合對於鑑定功能變體序列特別有用。篩選此類組 合庫的目的可以是生成例如結合活化素或其它配體的ActRIIa多肽變體。下文提供了各種 篩選分析，此類分析可用於評估變體。例如，可針對結合ActRIIa配體的能力篩選ActRIIa 多肽變體，以防止ActRIIa配體與ActRIIa多肽結合或者幹擾ActRIIa配體引起的信號傳 導。ActRIIa多肽或其變體的活性也可在基於細胞的測定或體內測定中進行測試。例 如，可以評估ActRIIa多肽變體對癌細胞增殖或存活的影響。癌細胞可指在活體對象中 構成實體腫瘤的細胞或者在活體對象中來源於腫瘤並擴散到其它部位的細胞(即，轉移細 胞)。此外，癌細胞可指得自或源自腫瘤或癌生長並在體外培養的細胞。癌細胞還包括例 如，可在體外培養或用於動物異種移植研究的細胞系。癌細胞還指通過轉移後的細胞分裂 來自轉移細胞的細胞。所述細胞可以是激素應答的(例如雌激素受體陽性)或激素非依賴 性的(例如雌激素受體陰性)。癌細胞增殖或存活可以在一種或多種重組ActRIIa配體蛋 白(例如活化素)的存在下進行評估，且可轉染細胞以生成ActRIIa多肽和/或其變體，以 及任選的ActRIIa配體。同樣地，可對小鼠或其它動物給予ActRIIa多肽，並進行一種或多 種測量，例如可以評估腫瘤尺寸、或者相對於對照的細胞增殖或凋亡速率。可生成相對於天然存在的ActRIIa多肽具有選擇性或通常提高的效力的源自組 合的變體(Combinatorially-derived variants) 同樣地,突變可產生變體,該變體的胞 內半衰期明顯不同於相應的野生型ActRIIa多肽。例如，該改變的蛋白可使蛋白酶解降解 或其它導致天然ActRIIa多肽的破壞或其它形式失活的細胞過程更加穩定或更加不穩定。 此類變體以及編碼它們的基因可用於通過調節ActRIIa多肽的半衰期來改變ActRIIa多肽 水平。例如，短的半衰期可以產生更為短暫的生物學效應，並對於部分的可誘導表達系統， 可允許更緊密地控制細胞中的重組ActRIIa多肽水平。在Fc融合蛋白中，可在接頭(如果 有)和/或Fc部分進行突變以改變蛋白的半衰期。可通過編碼多肽庫的基因的簡併庫產生組合庫，所述每個多肽包含至少一部分的 潛在ActRIIa多肽序列。例如，可將合成的寡核苷酸混合物酶促連接入基因序列中，從而使 潛在ActRIIa多肽核苷酸序列的簡併組能作為單獨多肽進行表達，或者，作為更大的融合 蛋白組進行表達(例如針對噬菌體展示)。可通過多種方式從簡併寡核苷酸序列生成潛在同系物的庫。簡併基因序列的化學 合成可在自動DNA合成儀中進行，然後可將合成的基因連接入適當的表達用載體中。簡併 寡核苷酸的合成為本領域熟知(例如參見Narang，SA (1983) Tetrahedron 39 3 ；Itakura 等人，(1981) RecombinantDNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Walton 編，Amsterdam :Elsevier pp273_289 ；Itakura 等人』 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53 323 ； Itakura 等人，(1984) Science 198 :1056 ;Ike 等人，(1983)NucleicAcid Res. 11:477)。 此類技術已經被用於其它蛋白的定向進化中(例如參見Scott等人，(1990)SCienCe 249 386-390 ；Roberts ^ 人，(1992)PNASUSA 89 :2429_2433 ;Devlin 等人，(1990)Science 249 :404-406 ;Cwirla 等人，(1990)PNAS USA 87 :6378_6382 ；以及美國專利 5，223，409、 5，198，346 和 5，096，815)。或者，可採用其它的突變形式來生成組合庫。例如，可通過如下方式生成和從庫 中篩選分離ActRIIa多肽變體，例如，丙氨酸分區突變等(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33 :1565-1572 ;Wang 等人，(1994) J. Biol. Chem. 269 :3095_3099 ;Balint 等人，(1993) Gene 137 109—118 ；Grodberg 等人，(1993)Eur. J. Biochem. 218 597-601 ；Nagashima 等人，(1993) J. Biol. Chem. 268 :2888-2892 ;Lowman 等人，(1991) Biochemistry 30: 10832-10838 ；以及 Cunningham 等人，(1989) Science 244 1081-1085)、接頭分區突變 (Gustin 等人，(1993) Virology 193 :653_660 ;Brown 等人，(1992)Mol. Cell Biol. 12 2644-2652 ;McKnight 等人，(1982) Science 232 :316)、飽和突變(Meyers 等人，(1986) Science 232 :613)、PCR突變(Leung等人，(1989)Method CellMol Biol 1:11-19)；或者隨 機突變，包括化學突變等(Miller 等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor，NY ；以及Greener 等人，(1994) Strategies in Mol Biol 7 32-34)。接頭分區突變(特別是在組合設置中)是一種具有吸引力的鑑定截短(生物活 性)形式的ActRIIa多肽的方法。本領域已知用於篩選通過點突變和截短得到的組合庫中的基因產品，以及就此而 言，用於篩選具有某種特性的基因產品的cDNA庫的各種技術。此類技術通常適用於通過 ActRIIa多肽組合突變生成的基因庫的快速篩選。篩選大型基因庫最廣泛使用的技術通常 包括將該基因庫克隆進入可複製的表達載體，用所得的載體庫轉化適當的細胞，並在其中 所需活性的檢測促使編碼所檢測的產物的基因的載體相對容易分離的條件下表達組合基 因。優選的測定包括活化素結合測定和活化素介導的細胞信號傳導測定。在某些實施方案中，在本文所述方法中有用的ActRIIa多肽可進一步包括在 ActRIIa多肽中天然存在的任意修飾之外的翻譯後修飾。這些修飾包括，但不限於，乙醯化、 羧基化、糖基化、磷酸化、脂質化(Iipidation)和醯化。結果是，修飾的ActRIIa多肽可包 含非胺基酸元件，例如聚乙二醇、脂質、多糖或單糖以及磷酸酯/鹽。此類非胺基酸元件對 ActRIIa多肽功能的影響可如本文對於其它ActRIIa多肽變體所述進行測試。當通過裂解 ActRIIa多肽的新生形式在細胞中生成ActRIIa多肽時，翻譯後加工也可對蛋白的正確折 疊和/或功能重要。不同的細胞(例如CH0、HeLa、MDCK、WI38、NIH-3T3或HEK293)對於此 類翻譯後活動具有特定的細胞結構(cellular machinery)和特徵機制，並可被選擇以確保 ActRIIa多肽的正確修飾和加工。在某些方面，ActRIIa多肽的功能變體或修飾形式包括具有至少一部分ActRIIa 多肽和一種或多種融合結構域的融合蛋白。眾所周知的此類融合結構域的實例包括但不 限於聚組氨酸、Glu-Glu、穀胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋 白重鏈恆定區(Fe)、麥芽糖結合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可選擇融合結構域來賦予所 需的特性。例如，一些融合結構域特別有用於通過親和色譜分離融合蛋白。就親和純化而 言，使用親和色譜用的相關基質，例如穀胱甘肽_、澱粉酶_、以及鎳_或鈷_綴合的樹脂。 許多此類基質可以「試劑盒」形式得到，例如Pharmacia GST純化系統和QIAexpress 系統 (Qiagen)與有用的(HIS6)融合伴侶。作為另一實例，可選擇融合結構域以促進ActRIIa多肽的檢測。此類檢測結構域的實例包括各種螢光蛋白(例如，GFP)以及「表位標記」，其通 常為可獲得特異性抗體的短肽序列。容易獲得的特異性單克隆抗體的眾所周知的表位標記 包括FLAG、流感病毒血細胞凝集素(HA)和c-myc標記。在一些情況下，融合結構域具有蛋 白酶切割位點，例如對於Xa因子和凝血酶的切割位點，其允許相關的蛋白酶部分消化該融 合蛋白，從而從中釋放重組蛋白。釋放的蛋白可隨後通過後續的色譜分離從融合結構域中 分離。在某些優選實施方案中，ActRIIa多肽與在體內穩定ActRIIa多肽的結構域(「穩定 齊U」結構域)相融合。「穩定」表示增加血清半衰期的任意情況(anything)，而不論這是否 由破壞減少、腎臟清除率降低或其它藥代動力學作用所引起。已知與免疫球蛋白的Fc部分 的融合為各種蛋白賦予所需的藥代動力學特性。同樣地，與人血清白蛋白的融合可賦予所 需特性。可供選擇的其它融合結構域類型包括多聚(例如，二聚、四聚)結構域和功能結構 域(其賦予另外的生物學功能)。作為具體的實例，本發明提供治療或預防乳腺癌的方法，其使用包含與Fc結構域 融合的ActRIIa的可溶性胞外結構域的融合蛋白(例如SEQ IDNO 6)。THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A) HYTQKSLSLSPGK*任選地，Fc結構域在例如Asp-265、賴氨酸322和Ash_434等殘基處具有一個或多 個突變。在某些情況下，具有一個或多個這些突變(例如Asp-265突變)的突變體Fc結構 域與Fc γ受體的結合能力相對於野生型Fc結構域有所下降。在其它情況下，具有一個或 多個這些突變(例如Asn-434突變)的突變體Fc結構域與I類MHC相關Fc受體(FcRN) 的結合能力相對於野生型Fc結構域有所上升。一般理解，Fc結構域可包含更小或更大部 分的免疫球蛋白恆定區，條件是所得的Fc結構域保留通過二硫鍵共價二聚的能力並形成 相對穩定的可溶性蛋白。應理解該，融合蛋白的不同元件可以與所需功能一致的任意方式排列。例如， ActRIIa多肽可置於異源結構域的C-末端，或者，異源結構域可置於ActRIIa多肽的C-末 端。ActRIIa多肽結構域和異源結構域無需在融合蛋白中相鄰，在任一結構域的C-或N-末 端或者在結構域之間可包含另外的結構域或胺基酸序列。在某些實施方案中，在本文所述方法中有用的ActRIIa多肽可包含能夠穩定 ActRIIa多肽的一種或多種修飾。例如，此類修飾提高ActRIIa多肽的體外半衰期，提高 ActRIIa多肽的循環半衰期或減少ActRIIa多肽的蛋白酶解降解。此類穩定修飾包括但不 限於融合蛋白(包括，例如，包含ActRIIa多肽和穩定劑結構域的融合蛋白)、糖基化位點的 修飾(包括，例如，向ActRIIa多肽附加糖基化位點)以及碳水化合物部分的修飾(包括， 例如，從ActRIIa多肽除去碳水化合物部分)。本文所用的術語「穩定劑結構域」不僅指融 合蛋白情況下的融合結構域(例如Fe)，還包括非蛋白質修飾，例如碳水化合物部分，或非 蛋白質部分，例如聚乙二醇。 在某些實施方案中，本文所述方法使用ActRIIa多肽的分離和/或純化形式，其分 離自其他蛋白，或者基本不含其它蛋白。ActRIIa多肽通常通過從重組核酸表達而產生。
3.編碼ActRIIa多肽的核酸
本文提供編碼本文公開的任意ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)，包括 片段、功能變體和融合蛋白的分離和/或重組核酸。例如，SEQID NO :4編碼天然存在的人 ActRIIa前體多肽，而SEQ ID NO :5編碼加工的ActRIIa胞外結構域。目標(subject)核 酸可以是單鏈的或是雙鏈的。這樣的核酸可以是DNA或RNA分子。這些核酸可以在，例如， 製備ActRIIa多肽的方法中使用，或者直接用作治療劑(例如在基因療法中)。在某些方面，編碼ActRIIa多肽的目標核酸應進一步理解為包括為SEQID NO :4或 5的變體的核酸。變體核苷酸序列包括通過一個或多個核苷酸置換、添加或刪除加以區別的 序列，例如等位基因變體。在某些實施方案中，本發明提供治療或預防乳腺癌的方法，其使用與SEQ ID NO 4 或5具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的分離或重組核酸序 列。本領域普通技術人員將理解與SEQ ID NO :4或5互補的核酸序列、以及SEQ ID NO 4 或5的變體同樣在本發明的範圍之內。在進一步的實施方案中，本文所述核酸序列可被分 離、重組和/或與異源核苷酸序列融合，或者在DNA庫中。在其它實施方案中，在本文所述方法中有用的核酸還包括在高度嚴格的條件下與 SEQ ID NO :4或5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :4或5的互補序列或其片段進行雜交的核 苷酸序列。本領域普通技術人員將容易理解促進DNA雜交的合適的嚴格條件是可以變化 的。例如，可在6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、約45°C下進行雜交，然後在2. Ox SSC,50°C 下洗滌。例如，洗滌步驟中的可選擇鹽濃度從低嚴格性的約2. Ox SSC、50°C至高嚴格性的約 0. 2x SSC、50°C。此外，洗滌步驟中的溫度可從低嚴格條件的室溫(約22°C)上升至高嚴格 條件的約65°C。溫度和鹽可都變化，或者可將溫度或鹽濃度之一保持恆定，而改變另一變 量。在一種實施方案中，本文所述方法中使用的核酸在6x SSC、室溫的低嚴格條件下雜交， 然後在2xSSC、室溫下洗滌。由於遺傳密碼的簡併性而不同於SEQ ID NO :4或5所示核酸的分離核酸也考慮用 於本文所述的方法中。例如，許多胺基酸由超過一個的三聯體所表示。表示相同胺基酸的密 碼子，或同義密碼子(例如，CAU和CAC為組氨酸的同義密碼子)可導致不影響蛋白的氨基 酸序列的「沉默」突變。然而，預期在哺乳動物細胞中存在確實導致目標蛋白的胺基酸序列 變化的DNA序列多態性。本領域技術人員將理解編碼特定蛋白的核酸中的一個或多個核 苷酸(至多約3-5%的核苷酸)的這些變異由於天然等位基因變異可在給定物種的個體中 存在。任何或全部的此類核苷酸變異以及所產生的胺基酸多態性均在本發明的範圍之內。在某些實施方案中，本文所述的重組核酸可以在表達構建體中可操作地連接至一 種或多種調節性核苷酸序列。調節性核苷酸序列通常適合用於表達的宿主細胞。本領域已 知用於各種宿主細胞的多種類型的合適的表達載體以及合適的調節性序列。所述一種或多 種調節性核苷酸序列通常可包括但不限於啟動子序列、前導或信號序列、核糖體結合位點、 轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或活化子序列。本發明考慮本領域 已知的組成型或可誘導啟動子。所述啟動子可以是天然存在的啟動子，或者是合併超過一 個啟動子的元件的雜交啟動子。表達構建體可存在於細胞中的游離體(例如質粒)上，或 者表達構建體可插入染色體中。在優選的實施方案中，表達載體包含可選擇的標記基因，以 允許選擇轉化的宿主細胞。可選擇的標記基因為本領域所熟知，並將隨著所使用的宿主細 胞而變化。
在某些方面，本文所述方法使用包含編碼ActRIIa多肽並可操作地連接到至少 一個調節性序列的核苷酸序列的表達載體。調節性序列為本領域所了解，並被選擇來引 導ActRIIa多肽的表達。因此，術語調節性序列包括啟動子、增強子以及其它表達控制元 件。示例性的調節性序列描述於 Goeddel ;Gene Expression Technology =Methods in Enzymology,Academic Press, San Diego,CA(1990)中。例如，可在這些載體中使用各種在 與DNA序列可操作地連接時控制該DNA序列表達的表達控制序列中的任意一種，以表達編 碼ActRIIa多肽的DNA序列。此類有用的表達控制序列包括，例如，SV40的早期和晚期啟 動子、tet啟動子、腺病毒和巨細胞病毒立即早期啟動子、RSV啟動子、Iac系統、trp系統、 TAC或TRC系統、由T7RNA聚合酶引導表達的T7啟動子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動子 區、fd包被蛋白(coat protein)的控制區、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、 酸性磷酸酶的啟動子(例如Pho5)、酵母α-交配因子的啟動子、杆狀病毒系統的多角體啟 動子以及已知控制原核或真核細胞或其病毒的基因表達的其它序列，及其各種組合。應當 理解，表達載體的設計可取決於諸如待轉化宿主細胞的選擇和/或需要表達的蛋白類型等 因素。此外，還應考慮載體的拷貝數、控制拷貝數的能力以及由該載體編碼的任何其它蛋白 (例如抗生素標記)的表達。可通過將克隆的基因或其部分連接入適合在原核細胞、真核細胞(酵母、鳥類、昆 蟲或哺乳動物)或兩者中表達的載體中產生本文所述的重組核酸。用於生產重組ActRIIa 多肽的表達載體包括質粒和其它載體。例如，合適的載體包括如下類型的質粒用於在原 核細胞(例如大腸桿菌)中表達的PBR322-衍生質粒、pEMBL-衍生質粒、pEX-衍生質粒、 PBTac-衍生質粒以及pUC-衍生質粒。一些哺乳動物表達載體同時包含促進載體在細菌中繁殖的原核序列和一種或 多種在真核細胞中表達的真核轉錄單元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、 pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 和 pHyg 衍生載體是適合真核細 胞轉染的哺乳動物細胞表達載體的實例。這些載體中的一些用來自細菌質粒(如PBR322) 的序列進行修飾，以促進在原核和真核細胞中的複製和藥物抗性選擇。或者，病毒的衍生物 如牛乳頭瘤病毒(BPV-I)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205)可用於在 真核細胞中蛋白的瞬時表達。其它病毒(包括逆轉錄病毒)表達系統的實例可在下文基因 治療傳遞系統的描述中找到。製備質粒和轉化宿主生物所採用的各種方法為本領域熟知。 其它合適原核和真核細胞兩者的表達系統以及一般的重組步驟參見Molecular CloningA Laboratory Manual,第三版，Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis 編(ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001) 0在某些情況下，可能需要採用杆狀病毒表達系統來表達重組多 肽。此類杆狀病毒表達系統的實例包括PVL-衍生載體(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、 pAcUW-衍生載體(例如pAcUWl)以及pBlueBac-衍生載體(例如含β-gal WpBlueBac III)。在優選的實施方案中，設計載體用於在CHO細胞中產生目標ActRIIa多肽，例如Pcmv-Script ^{φ (Stratagene, La Jolla, Calif) > pcDNA4 ^{φ (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)和pCI-neo載體(Promega，Madison, Wise)。顯而易見地，目標基因構建體可用於 引起目標ActRIIa多肽在培養物中繁殖的細胞中表達，例如，以產生蛋白，包括融合蛋白或 變體蛋白，以供純化。
本公開內容還涉及用包含一種或多種目標ActRIIa多肽的編碼序列(例如，SEQ ID NO :4或5)的重組基因轉染的宿主細胞。所述宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。例 如，本文所述的ActRIIa多肽可在細菌細胞(如大腸桿菌)、昆蟲細胞(例如採用杆狀病毒 表達系統)、酵母或哺乳動物細胞中表達。其它合適的宿主細胞為本領域技術人員所已知。本文還提供製備目標ActRIIa多肽的方法。例如，用編碼ActRIIa多肽的表達載 體轉染的宿主細胞可在適當適當條件下培養，以允許發生ActRIIa多肽表達。ActRIIa多肽 可被分泌並從細胞和含有ActRIIa多肽的培養基的混合物中分離。或者，ActRIIa多肽可 保留在細胞質內或者在膜組分中，收穫、裂解細胞並分離蛋白。細胞培養物包含宿主細胞、 培養基和其它副產品。細胞培養的合適培養基為本領域熟知。採用本領域已知的純化蛋 白的技術，可將目標ActRIIa多肽從細胞培養基、宿主細胞或兩者中分離，所述技術包括離 子交換色譜、凝膠過濾色譜、超濾、電泳、採用ActRIIa多肽的特定表位的特異性抗體的免 疫親和純化、以及採用與ActRIIa多肽融合的結構域結合的試劑的親和純化 (例如，A蛋白 柱可用於純化ActRIIa-Fc融合體)。在優選的實施方案中，ActRIIa多肽是包含促進其純 化的結構域的融合蛋白。在優選的實施方案中，通過一系列的柱色譜步驟實現純化，包括， 例如，以任意順序的三種或更多的以下步驟A蛋白色譜、Q瓊脂糖色譜、苯基瓊脂糖色譜、 尺寸排阻色譜以及陽離子交換色譜。純化可通過病毒過濾和緩衝液交換完成。如本文所證 明，ActRIIa-hFc蛋白被純化至通過尺寸排阻色譜測定> 98%，且用SDS PAGE測定> 95% 的純度。該純度水平足以在小鼠、大鼠和非人靈長動物中實現所需的結果。在另一實施方案中，編碼純化前導序列(例如在重組ActRIIa多肽的所需部分N 末端處的聚組氨酸/腸激酶切割位點序列)的融合基因，可允許採用Ni2+金屬樹脂通過親 和色譜來純化所表達的融合蛋白。然後該純化前導序列可通過用腸激酶處理去除，以提供 純化的 ActRIIa 多肽(例如，參見 Hochuli 等人，(1987) J. Chromatography 411 :177 ；和 Janknecht 等人，PNAS USA 88 8972)。製備融合基因的技術是眾所周知的。實質上，按照常規技術將編碼不同多肽序列 的各種DNA片段連接，採用平頭(blunt-ended)或交錯(stagger-ended)末端進行連接，限 制性酶消化以提供合適的末端，適當時填補粘性末端，鹼性磷酸酶處理以避免不想要的連 接，以及酶連接。在另一實施方案中，融合基因可通過包括自動DNA合成儀等常規技術來合 成。或者，可使用在兩個連續基因片段之間產生互補性懸掛的錨定引物進行基因片段的PCR 擴增，此兩個連續基因片段隨後可退火形成嵌合基因序列(例如，參見Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人編，John Wiley & Sons :1992)。4.替代性活化素(alternative activin)和 ActRIIa 拮抗劑本公開內容涉及使用活化素-ActRIIa信號傳導的拮抗劑治療或預防乳腺癌的 方法。儘管可溶性ActRIIa多肽，特別是ActRIIa-Fc是優選的拮抗劑，且儘管此類拮抗 劑可通過不同於活化素拮抗的機制影響乳腺癌細胞生長或存活(例如，活化素抑制可以 是一種藥劑抑制一系列分子活性的傾向的指示劑，所述分子有可能包括TGF-β超家族的 其它成員，且此類集體抑制可導致對乳腺癌細胞生長或存活的所需影響)，其它類型的活 化素-ActRIIa拮抗劑預期也是有用的，包括抗活化素(例如，活化素βΑ、βΒ、β。和βΕ) 抗體，抗ActRIIa抗體，抑制ActRIIa產生的反義、RNAi或核酶核酸，以及其它的活化素或 ActRIIa抑制劑，特別是破壞活化素-ActRIIa結合的那些抑制劑。在某些實施方案中，對活化素B有特異性的拮抗劑(例如抗活化素B抗體)在本發明的方法中是有用的。與ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)特異性反應並與ActRIIa多肽競爭 性結合配體或者其它形式抑制ActRIIa介導的信號傳導的抗體可用作ActRIIa多肽活性的 拮抗劑。同樣地，與活化素β Α、β Β、β。或β E多肽或其任何異源二聚體特異性反應並破壞 ActRIIa結合的抗體可用作拮抗劑。使用由ActRIIa多肽或活化素多肽衍生的免疫原，可通過標準規程(protocols) 製備抗蛋白/抗肽抗血清或單克隆抗體(參見，例如Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow和Lane編(Cold Spring Harbor Press :1988))。哺乳動物如小鼠、倉鼠或兔可通 過ActRIIa多肽的免疫原形式、能夠引發抗體應答的抗原性片段，或融合蛋白進行免疫。給 蛋白或肽賦予免疫原性的技術包括與載體綴合或本領域熟知的其它技術。可在佐劑的存在 下給予ActRIIa或活化素多肽的免疫原部分。免疫的進展可通過檢測血漿或血清中的抗體 滴度進行監測。標準的ELISA或其它免疫測定可用於以免疫原作為抗原評估抗體水平。在用ActRIIa多肽的抗原性製劑免疫動物後可獲得抗血清，且在需要時可從 該血清中分離多克隆抗體。為了產生單克隆抗體，可從免疫的動物採集抗體生成細胞 (淋巴細胞)，並通過標準的體細胞融合步驟與永生化細胞(如骨髓瘤細胞)融合以獲 得雜交瘤細胞。此類技術為本領域熟知，其包括，例如，雜交瘤技術(最初由Kohler和 Milstein 開發，(1975) Nature，256 :495_497)、人 B 細胞雜交瘤技術(Kozbar 等人，(1983) ImmunologyToday, 4 :72)、以及產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等人，(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)。可通過免疫 化學篩選用於產生與ActRIIa多肽特異性反應的抗體的雜交瘤細胞，並從包含該種雜交瘤 細胞的培養物分離單克隆抗體。還可通過篩選抗體可變區或Fab片段文庫(例如噬菌體呈 現文庫)來產生抗體，以鑑定與選擇的抗原(例如活化素或ActRIIa)相結合的結合物。這 種體外方法通常用於在哺乳動物(尤其是小鼠和人)之間高度保守的蛋白。本文所用的術語「抗體」意在包括完整的抗體，例如任意抗體同種型(IgG、IgA、 IgM、IgE等)，並且包括與選擇的抗原反應的免疫球蛋白的片段或結構域。抗體可使用常規 技術片段化，並根據實用性和/或與感興趣的特異性表位的相互作用篩選片段。因此，該術 語包括能夠與某種蛋白選擇性反應的抗體分子的蛋白酶解裂解片段或重組製備的部分。此 類蛋白酶解和/或重組的片段的非限制性實例包括Fab、F(ab' )2、Fab'、Fv以及包含通 過肽接頭連接的V[L]和/或V[H]結構域的單鏈抗體(scFv)。scFv可共價或非共價連接， 以形成具有兩個或更多個結合位點的抗體。術語抗體還包括多克隆抗體、單克隆抗體、或抗 體和重組抗體的其它純化製劑。術語「重組抗體」表示從使用分子生物學技術構建的核酸 表達的抗體或免疫球蛋白的抗原結合結構域，例如從單鏈抗體開發的人源化抗體或全人源 抗體。單結構域和單鏈抗體也包括在術語「重組抗體」之內。在某些實施方案中，本文所述方法可使用抗體，例如單克隆抗體。還提供了產生新型抗體的方法。例如，產生特異性結合ActRIIa多肽或活化素多肽的單克隆抗體的方法可 包括給予小鼠一定量的免疫原性組合物(其包含有效刺激可檢測免疫應答的抗原多肽)，， 從該小鼠獲得產生抗體的細胞(例如來自脾的細胞)將該產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融 合，以獲得產生抗體的雜交瘤，並測試該產生抗體的雜交瘤，以鑑定產生特異性結合該抗原 的單克隆抗體的雜交瘤。一旦獲得後，雜交瘤在可在細胞培養物中繁殖，任選採用雜交瘤衍生細胞產生特異性結合該抗原的單克隆抗體的培養條件。單克隆抗體可從細胞培養物中純 化。形容詞「與...特異性反應」在指代抗體時，如本領域通常理解的那樣，有意表 示抗體在感興趣抗原(例如ActRIIa多肽)與其它非感興趣抗原之間具有足夠的選擇 性，使得該抗體至少有用於在具體類型的生物樣本中檢測該感興趣抗原的存在。在使 用抗體的某些方法中，例如治療性應用中，可能需要更高程度的結合特異性。單克隆抗 體通常具有更強的趨勢(與多克隆抗體相比)有效區分所需的抗原和交叉反應性多肽 (cross-reactingpolypeptide)。影響抗體抗原相互作用特異性的一個特徵是抗體對該抗 原的親和性。儘管可通過一定範圍的不同親和性實現所需的特異性，一般優選抗體具有約 10-6、1(T、10-8、10-9M或更小的親和性(解離常數)。此外，用於篩選抗體以鑑定所需抗體的技術可影響所得抗體的特性。例如，如果 抗體用於在溶液中結合抗原，測試溶液結合可能是合意的。可利用各種不同的技術來測試 抗體和抗原之間的相互作用，以鑑定具體所需的抗體。此類技術包括ELISA、表面等離子體 共振結合測定(例如，Biacore 結合測定，Biacore AB，瑞典Uppsala)、夾心測定(例如， 順磁珠系統(paramagnetic bead system), IGEN International, Inc. , Gaithersburg, Maryland)、蛋白質印跡、免疫沉澱測定以及免疫組化。作為活化素或ActRIIa拮抗劑的核酸化合物類別的實例包括反義核酸、RNAi構建 體和催化性核酸(catalytic nucleic acid)構建體。核酸化合物可以是單鏈或雙鏈的。雙 鏈化合物還可包含突出端(overhang)或非互補的區域，其中一條或另一條鏈為單鏈的。單 鏈化合物可包含自身互補的區域，表示該化合物形成所謂的「髮夾」或「莖環」結構，具有雙 鏈螺旋結構的區域。核酸化合物可包含與由全長ActRIIa核酸序列或活化素βΑ、βΒ、
或β Ε核酸序列的不超過1000個、不超過500個、不超過250個、不超過100個或不超過50、 35、25、22、20、18或15個核苷酸組成的區域互補的核苷酸序列。互補區域優選至少8個核 苷酸，並任選約18至35個核苷酸。互補區域可落入內含子中，後者是目標轉錄物的編碼序 列或非編碼序列，例如編碼序列部分。一般而言，核酸化合物具有約8至約500個核苷酸或 鹼基對的長度，且任選該長度為約14至約50個核苷酸。核酸可以是DNA(特別是用作反義 時)、RNA或RNA:DNA雜交體。任意一條鏈可包括DNA和RNA的混合物以及不能簡單分類為 DNA或RNA的修飾形式。同樣地，雙鏈化合物可以是DNA DNA、DNA RNA或RNA RNA,且任意 一條鏈也可包含DNA和RNA的混合物以及不能簡單分類為DNA或RNA的修飾形式。核酸化 合物可包含各種修飾的任意一種，包括對骨架(天然核酸中的糖_磷酸酯/鹽部分，包括核 苷酸間連鎖)或鹼基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一個或多個修飾。反義核酸化 合物將優選具有約15至約30個核苷酸的長度，並通常包含一個或多個修飾以改善其特徵， 例如在血清、在細胞或在該化合物可能傳遞位置(例如口服傳遞化合物情況下的胃以及吸 入化合物時的肺)中的穩定性。對於RNAi構建體的情況，與目標轉錄物互補的鏈通常為 RNA或其修飾。另一條鏈可以是RNA、DNA或任意其它變體。雙鏈或單鏈「髮夾」RNAi構建 體的雙鏈體部分通常具有18-40個核苷酸的長度，任選約21-23個核苷酸的長度，只要其用 作Dicer酶底物。催化性或酶促性核酸可以是核酶或DNA酶，並且還可包含修飾的形式。核 酸化合物可在生理條件下，在無義或有義控制影響很小或沒有影響的濃度下與細胞接觸時 抑制約50%、75%、90%或更多的目標的表達。用於測試核酸化合物影響的優選濃度為1、5和10微摩爾。還可測試核酸化合物對例如，乳腺癌細胞或乳腺腫瘤的增殖或存活的影響。5.篩詵測定在某些方面，本發明涉及使用ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)和活化素 多肽鑑定作為活化素-ActRIIa信號傳導途徑的激動劑或拮抗劑的化合物(藥劑)。通過這 種篩選鑑定的化合物可被測試，以評估它們在體內或體外調節癌細胞，特別是乳腺癌細胞 生長或存活的能力。這些化合物可以在例如動物模型(如小鼠異種移植模型)中測試。一 種有用的動物模型是鼠MDA-MB231乳腺癌模型；MDA-MB231細胞不依賴於激素並易於向骨 骼轉移。例如通過以下方法可產生乳腺癌的其它動物模型將大鼠神經母細胞瘤細胞(neu 癌基因最初從此細胞中分離)或neu轉化的WH-3T3細胞移植到裸小鼠中，基本如Drebin 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83 :9129_9133 (1986)所述。有多種方法來篩選通過靶向活化素和ActRIIa信號傳導來治療或預防乳腺癌的 治療劑。在某些實施方案中，可進行化合物的高通量篩選來鑑定在選則的細胞系擾亂活化 素或ActRIIa介導的影響的藥劑。在某些實施方案中，實施該測定以篩選並鑑定特異性抑 制或減少ActRIIa多肽與活化素結合的化合物。或者，該測定可用於鑑定增強ActRIIa多 肽與活化素結合的化合物。在進一步的實施方案中，化合物可通過其與活化素或ActRIIa 多肽相互作用的能力來鑑定。多種測定形式是足夠的，但是根據本公開內容，那些未在本文明確描述的測定將 被本領域普通技術人員所理解。如本文所述，測試化合物(藥劑)可通過任意組合的化學 方法製備。或者，目標化合物可以是在體內或體外合成的天然存在的生物分子。待測試其 作為組織生長調節劑的能力的化合物(藥劑)可通過例如細菌、酵母、植物或其它生物體產 生(例如天然產物)，通過化學產生(例如小分子，包括擬肽)，或通過重組產生。本文考慮 的測試化合物包括非肽基有機分子、肽、多肽、擬肽、糖、激素和核酸分子。在具體的實施方 案中，測試藥劑是分子量小於約2000道爾頓的有機小分子。測試化合物可以單個的、離散的實體提供，或者在更複雜的庫中提供，例如通過組 合化學製備。這些庫可包含例如醇、商代烷烴、胺、醯胺、酯、醛、醚以及其它有機化合物類 另IJ。測試化合物可在測試系統以分離形式或化合物的混合物形式存在，尤其是在初始的篩 選步驟中。任選地，化合物任選可經其它化合物衍生，並具有促進該化合物分離的衍生基 團。衍生基團的非限制性實例包括生物素、螢光素、地高辛、綠色螢光蛋白、同位素、聚組氨 酸、磁珠、穀胱甘肽S轉移酶(GST)、光激活交聯劑或其任意組合。在許多對化合物和天然提取物庫進行測試的藥物篩選程序中，高通量測定是合意 的，以便使給定時段內所考察的化合物數量達到最大化。在無細胞系統中進行的測定(例 如可通過純化或半純化蛋白得到)通常優選作為「初級(primary)」蹄選，因為可生成它們， 以允許快速開發和相對容易地檢測由測試化合物介導的分子目標的改變。此外，測試化合 物的細胞毒性或生物利用度效應通常在體外系統中可被忽略，該測定轉而主要集中在藥物 對分子目標的影響，因其可表現在ActRIIa多肽與活化素之間的結合親和性的改變上。僅為闡述目的，在示例性篩選測定中，感興趣的化合物與通常能夠結合活化素的分離並純化的ActRIIa多肽接觸。然後向化合物與ActRIIa多肽的混合物中加入含有 ActRIIa配體的組合物。對ActRIIa/活化素複合物的檢測和定量提供了用於測定化合物抑 制(或促進)ActRIIa多肽和活化素之間的複合物形成效力的方法。化合物的效力可通過使用各種濃度的測試化合物所得的數據生成劑量響應曲線進行評估。此外，還可進行對照 測定以提供比較基線。例如，在對照測定中，向含有ActRIIa多肽的組合物中加入分離並純 化的活化素，並在沒有測試化合物的情況下對ActRIIa/活化素複合物的形成進行定量。應 當理解，一般而言，反應物的混合順序可以變化，並且可以同時混合。此外，可使用細胞提取 物和溶解物來代替純化蛋白，以提供合適的無細胞測定系統。ActRIIa多肽和活化素之間的複合物形成可通過各種技術檢測。例如，複合物形成 的調節可採用例如可檢測標記蛋白(如放射性標記的(例如，32P、35S、14C或3H)、螢光標記的 (例如，FITC)、或酶標記的ActRIIa多肽或活化素)，通過免疫測定或通過色譜檢測進行定
量。在某些實施方案中，螢光偏振測定和螢光共振能量轉移(FRET)測定可用於直接 或間接測量ActRIIa多肽與其結合蛋白之間的相互作用程度。其它合適的檢測模式包 括，例如基於光波導(PCT公開WO 96/26432和美國專利5，677，196)、表面等離子體共振 (SPR)、表面電荷傳感器和表面力傳感器(surface force sensors)的那些檢測。相互作用陷阱測定(interaction trap assay)，也稱為「雙雜交測定」，也可用於 鑑定破壞或加強ActRIIa多肽與其結合蛋白之間的相互作用的藥劑。參見例如，美國專利 5，283，317 ;Zervos 等人(1993)Cell 72 :223_232 ;Madura 等人(1993) J Biol Chem 268 12046-12054 ；Bartel 等人(1993) Biotechniques 14 :920_924 ；以及 Iwabuchi 等人(1993) 0ncogene8 1693-1696)。在具體的實施方案中，逆雙雜交系統可用於鑑定解離ActRIIa多 肽與其結合蛋白的相互作用的化合物(例如小分子或肽)。參見例如，Vidal和Legrain， (1999)Nucleic Acids Res 27 :919_29 ；Vidal 禾口 Legrain,(1999)Trends Biotechnol 17 374-81 ；以及美國專利 5，525，490,5, 955，280 和 5，965，368。在某些實施方案中，通過其與本文所述的ActRIIa或活化素多肽相互作用的能 力來鑑定化合物。化合物與ActRIIa或活化素多肽之間的相互作用可以是共價或非共價 的。例如，這種相互作用可在蛋白水平下使用體外生物化學方法鑑定，所述生物化學方 法包括光交聯、放射標記的配體結合、以及親和色譜(Jakoby WB等人，1974，Methods in Enzymology 46:1)。在某些情況下，化合物可通過基於機制的測定(例如檢測結合於活化 素或ActRIIa多肽的化合物的測定)進行篩選。這可包括固相或液相結合事件。或者，編 碼活化素或ActRIIa多肽的基因可與報告系統(例如，半乳糖苷酶、螢光素酶或綠色熒 光蛋白)一起轉染進入細胞，並任選地通過高通量篩選對庫進行篩選或對庫的個別成員進 行篩選。可使用其它基於機制的結合測定，例如，檢測自由能變化的結合測定。可在目標 被固定至孔、珠或晶片或者被固定化抗體捕獲或者被毛細管電泳分辨的情況下實施結合測 定。結合的化合物通常可採用比色法或螢光或表面等離子體共振來檢測。6.示例性治療用途在某些實施方案中，本發明提供通過對該個體給予治療有效量的活化素-ActRIIa 拮抗劑(例如ActRIIa多肽)來在有此需要的個體中治療或預防乳腺癌的方法。這些方法 可用於對具有發展乳腺癌的高風險的人(尤其是女性)的治療性和預防性治療。由於每一 位女性都處於發展乳腺癌的風險中，具有發展乳腺癌的高風險的女性是與普通人群或處於 某年齡段的女性人群相比，其風險因素賦予更大發展該病可能性的女性。示例性的風險因 素包括年齡、家族史或遺傳特性(genetic makeup)、生活方式習慣(例如鍛鍊和飲食)、暴露於輻射或其它致癌劑、初次生育年齡、遺傳改變、以及絕經期後的體重增加。本文所用的「預防」疾病或病症的治療係指在統計學樣本中，化合物在治療樣本中相對於未治療對照樣本減少疾病或病症的發生，或者相對於未治療對照樣本，延遲疾病或 病症的一種或多種症狀或特徵的發作。例如，預防乳腺癌可指治療後沒有新的病變，或者沒 有或延遲轉移性疾病。術語「治療乳腺癌」係指相對於未治療對照或相對於治療前疾病的嚴重性，改善疾 病的一種或多種症狀或特徵。該術語並不一定要求接受治療的患者痊癒或者疾病從患者中 完全根除。治療乳腺癌的藥劑可以是減輕疾病的一種或多種症狀或特徵的嚴重性的藥劑。 應注意，腫瘤生長與進展受各種因素影響，包括細胞周期進展與細胞分裂的介體、以及細胞 死亡或凋亡的調節因子。因此，治療乳腺癌可涉及減少癌細胞增殖或減少細胞分裂速率。或 者或另外地，治療乳腺癌可涉及減少癌細胞存活、增加凋亡、或者減少轉移性乳腺癌(尤其 是向骨骼轉移的乳腺癌)發生或嚴重性。因此，在某些實施方案中，治療乳腺癌可涉及既減 少細胞分裂又增加細胞死亡。與機制無關，藥劑治療乳腺癌的有效性可通過可觀察的標準 (metrics)確定，例如癌細胞數量比對照少(由於減少增殖、增加凋亡、或兩者)、或腫瘤尺 寸比對照減小。所以治療乳腺癌或者抑制腫瘤或癌細胞生長預期與導致如此變化發生的機 制無關。預防和治療都可在醫生或其他衛生保健提供者所提供的診斷和給予治療藥劑預期 效果的分析中得到闡明。當觀察目標拮抗劑對人類乳腺癌進展的影響時，可通過可測量疾病的減少或消 失、和/或沒有新病變、或防止轉移來評估影響。例如，活化素-ActRIIa拮抗劑可顯著地減 少或延遲患有非侵襲性和侵襲性乳腺癌的患者的乳腺癌進展。此外，該拮抗劑可在具有該 疾病風險因素的健康女性中預防或降低發展乳腺癌的風險。該拮抗劑還可在具有該疾病史 的患者中降低乳腺癌復發的風險。因此，活化素-ActRIIa拮抗劑可用於在被認為處於發展該疾病的風險中的個體 中預防或遲延乳腺癌的發作，並且此類拮抗劑可用於選則的患者人群。合適的患者人群 的實例包括具有乳腺或卵巢癌家族史的患者，例如其中母親或姐妹已被診斷患有該疾病 的女性患者。還包括BRCA 1/2基因或其它被證明使女性易患乳腺或卵巢癌症的基因發 生突變的患者。在一種實施方案中，用活化素-ActRIIa拮抗劑治療被認為處於發展乳腺 癌的高度風險中，但尚未診斷患有該疾病的患者。此類治療可開始於該患者年齡達到30、 35或40歲時，或者女性患者不試圖懷孕(例如該患者不計劃養育嬰兒)或已達到絕經期 時。具體來說，本文呈現的數據顯示活化素-ActRIIa拮抗劑抑制被引入體循環(general circulation)的乳腺癌細胞系的轉移性擴散，這顯示此類拮抗劑可用於預防乳腺腫瘤的轉 移。此類化合物可用於治療已診斷患有乳腺癌或懷疑患有乳腺癌的任何患者。此外，因發 展乳腺腫瘤的風險升高而考慮進行預防性或選擇性乳房切除術的患者可替代選擇或另外 使用活化素-ActRIIa拮抗劑來減少未檢測的腫瘤轉移性擴散的風險。本文公開的活化素-ActRIIa拮抗劑(尤其是ActRIIa-Fc蛋白)可用於治療 或預防患者(包括患有實體腫瘤的患者以及患有轉移性癌症的患者)的乳腺癌。活化 素-ActRIIa拮抗劑也可給予具有下列症狀的人類對象乳腺癌前病變或良性病變；或者任 何異常增殖性病變，包括典型增生、非典型增生；以及非侵襲性或原位癌。本發明所公開的 拮抗劑還可用於治療或預防激素依賴性或激素應答性癌症(例如雌激素受體陽性癌症)和非激素依賴性癌症(例如雌激素受體陰性或雌激素受體突變癌症)。活化素-ActRIIa拮抗劑還用作其中生長因子或癌基因被激活的癌症(例如，其中已表達c-erbB-2(又稱為 HER-2/Neu)酪氨酸激酶的乳腺癌)的治療劑。活化素-ActRIIa拮抗劑可證實在表達升 高水平(相對於來源於正常乳腺組織的細胞)的活化素(例如A、AB或B)或者升高水平 ActRIIa或ActRIIb的腫瘤中尤其有用。本發明意識到通過使用目標拮抗劑可增強傳統癌症療法(化療、放射療法、光療 法(phototherapy)、免疫療法、和手術)的有效性。因此，活化素-ActRIIa拮抗劑可用於治 療、預防、或控制乳腺癌的聯合療法中。該拮抗劑可聯合放射和/或手術治療，以及細胞毒 化療和/或內分泌療法給予患者。這樣的聯合治療可協同作用並允許減少每個單獨療法的 劑量，由此減少每個療法在較高劑量時出現的有害副作用。在其它情況下，某一療法難以治 療的惡性腫瘤可對兩種或多種不同療法的聯合療法有應答。因此，本公開內容涉及同時或 按序聯合給予活化素-ActRIIa拮抗劑與另一種常規抗腫瘤藥劑，以便增強該抗腫瘤藥劑 的療效或克服對該抗腫瘤藥劑的細胞抗性。僅為闡述目的，可用於聯合抗腫瘤療法的藥物化合物包括氨魯米特、安吖啶、阿 那曲唑、天冬醯胺酶、卡介苗、比卡魯胺、博來黴素、布舍瑞林(buserelin)、白消安、喜樹鹼 (campothecin)、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、秋水仙 鹼、環磷醯胺、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、更生黴素(dactinomycin)、柔紅黴素、己二 烯雌酚、己烯雌酚、多西他賽(docetaxel)、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依託泊 苷、依西美坦、非格司亭(filgrastim)、氟達拉濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺 (flutamide)、吉西他濱、染料木黃酮、戈舍瑞林(goserelin)、羥基脲、伊達比星、異環磷醯 胺、伊馬替尼、幹擾素、依立替康、依羅替康、來曲唑、亞葉酸、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋 咪唑、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美斯納、甲氨喋 呤、絲裂黴素、米託擔、米託蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、諾考達唑、奧曲肽、奧沙利鉬、紫 杉醇、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、嚇吩姆鈉(porfimer)、丙卡巴胼、雷替曲塞、利妥昔 單抗、鏈佐星、蘇拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪酮、硫鳥嘌呤、塞替派、二氯化二茂 鈦(titanocene dichloride)、託泊替康、曲妥珠單抗、維A酸(tretinoin)、長春鹼、長春新 鹼、長春地辛和長春瑞濱。這些化療抗腫瘤化合物可基於其作用機制分為例如如下各組抗代謝物/抗癌 劑，例如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱、吉西他濱和阿糖胞苷)和嘌呤類 似物、葉酸鹽(folate)拮抗劑和相關抑制劑(巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、噴司他丁和2-氯 脫氧腺苷(克拉屈濱))；抗增殖/抗有絲分裂藥劑，包括天然產物，例如長春花生物鹼 (長春鹼、長春新鹼和長春瑞濱)，微管破壞劑例如紫杉烷(紫杉醇、多西他賽)、長春新 鹼(vencristin)、長春鹼(vinblastin)、諾考達唑、埃坡黴素和諾維本、表二鬼白毒素 (epidipodophyllotoxins)(依託泊苷、替尼泊苷)、DNA損傷劑(放線菌素、安吖啶、蒽環類、 博來黴素、白消安、喜樹鹼、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬、環磷醯胺、環磷醯胺(Cytoxan)、更生黴 素、柔紅黴素、多柔比星、表柔比星、六甲三聚氰胺奧沙利鉬、異環磷醯胺、美法侖、美錄瑞塔 明(merchlorehtamine)、絲裂黴素、米託蒽醌、亞硝基脲、普卡黴素、丙卡巴胼、紫杉醇、泰索 帝、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷醯胺和依託泊苷(VP16))；抗生素，例如更生黴素(放線菌素 D actinomycin D)、柔紅黴素、多柔比星(阿黴素)、伊達比星、蒽環類、米託蒽醌、博來黴素、普卡黴素(光神黴素)和絲裂黴素；酶類(L-天冬醯胺酶，其全身性代謝L-天冬醯胺，抑 制不能自己合成天冬醯胺的細胞)；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑，例如氮芥類 (氮芥、環磷醯胺及其類似物、美法侖、苯丁酸氮芥)、亞乙基亞胺類和甲基三聚氰胺類(六 甲三聚氰胺和塞替派)、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝基脲類(卡莫司汀(BCNU)及其類似物、 鏈佐星)、曲嗪類(trazenes)-達卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物，例如葉酸 類似物(甲氨喋呤)；鉬絡合複合物(順鉬、卡鉬)、丙卡巴胼、羥基脲、米託擔、氨魯米特； 激素類、激素類似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳化酶抑制劑 (來曲唑、阿那曲唑)；抗凝血劑(肝素、合成肝素鹽和其它凝血酶抑制劑)；纖維蛋白溶解 劑(例如組織纖溶酶原激活物、鏈球菌激酶和尿激酶)、阿司匹林、潘生丁、噻氯匹定、氯吡 格雷、阿昔單抗；抗轉移藥；抗分泌藥(布雷韋林(breveldin))；免疫抑制劑(環孢黴素、他 克莫司(Π(-506)、西羅莫司(雷帕黴素)、硫唑嘌呤、麥考酚酸嗎乙酯)；抗血管形成化合物 (TNP-470、染料木黃酮)和生長因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、成纖維細 胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管緊張素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體 (曲妥珠單抗)；細胞周期抑制劑和分化誘導劑(維A酸)；mTOR抑制劑、拓撲異構酶抑制 劑(多柔比星(阿黴素)、安吖啶、喜樹鹼、柔紅黴素、更生黴素、恩尼泊苷(eniposide)、表 柔比星、依託泊苷、伊達比星和米託蒽醌、託泊替康、依立替康)、皮質類固醇(可的松、地塞 米松、氫化可的松、甲基強的松龍、潑尼松和潑尼松龍)；生長因子信號轉導激酶抑制劑；線 粒體機能障礙誘導劑和胱冬酶激活劑；以及染色質破壞劑。在某些實施方案中，可用於聯合療法的藥物化合物包括抗血管生成劑，例如 (1) 「血管生成分子」的釋放抑制劑，例如bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)；(2)血管生 成分子的中和劑，例如抗PbFGF抗體；以及(3)內皮細胞對血管生成刺激應答的抑制劑， 包括膠原酶抑制劑、基膜更新(basement member turnover)抑制劑、血管生成抑制類固 醇(angiostaticsteroids)、源於真菌的血管生成抑制劑、血小板因子4、血小板反應蛋白、 關節炎藥物(例如D-青黴胺和硫代蘋果酸金)、維生素D3類似物、α幹擾素等等。另外 提議的血管生成抑制劑參見 Blood 等人，Bioch. Biophys. Acta.，1032 :89_1 18(1990)， Moses 等人，Science，248 1408-1410 (1990), Ingber 等人，Lab. Invest. ,59 44-51 (1988), 以及美國專利 5，092，885,5, 112，946,5, 192，744,5, 202，352 和 6573256。此外，有多種化 合物可用於抑制血管生成，例如，阻斷VEGF介導的血管生成途徑的肽或試劑、內皮抑素蛋 白或其衍生物、血管新生抑制素的賴氨酸結合片段、黑色素或促黑色素化合物、纖維蛋白 溶酶原片段(例如纖維蛋白溶酶原的Kringles 1_3)、肌鈣蛋白(tropoin)亞基、玻連蛋 白α νβ 3的拮抗劑、源自Saposin B的肽、抗生素或其類似物(例如四環素或新黴素)、 包含地諾孕素的組合物、包含偶聯至肽的MetAP-2抑制核心的化合物、化合物EM-138、查 耳酮及其類似物、N-乙醯α連接的酸性二肽酶(naaladase)抑制劑。參見，例如，美國 專利 6，395，718,6, 462，075,6, 465，431,6, 475，784,6, 482，802,6, 482，810,6, 500，431、 6，500，924,6，518，298,6，521，439,6，525，019,6，538，103,6，544，758,6，544，947, 6，548，477,6, 559，126 和 6，569，845。取決於聯合療法的性質，可在其它療法正在施用時和/或之後繼續給予本發明的治療性拮抗劑。本文所述的拮抗劑可以單劑量或多劑量給予。在一些情況下，在傳統療法 之前至少數天開始給予拮抗劑，而在另外的情況下，緊鄰施用傳統療法之前或施用傳統療法時開始給予。7.藥物組合物在某些實施方案中，本文所述的活化素ActRIIa拮抗劑與藥學上可接受的載體一 起配製。例如，ActRIIa多肽可以單獨給予或作為藥物製劑(治療組合物)的組分給予。可 以配製所述目標拮抗劑(subject antagonists)，供以任何方便的方式用於人藥或獸藥中。在某些實施方案中，本文所述的治療或預防乳腺癌的方法包括全身給予所述的組 合物，或者作為植入物或儀器進行局部給藥。給藥時，用於本發明的治療組合物當然是沒有 熱原的生理學上可接受的形式。在本發明的方法中，除也可以任選包含在上述組合物中的 活化素-ActRIIa拮抗劑之外的治療上有用的藥劑也可以與目標拮抗劑同時給予或按序給 予。一般地，將腸胃外給予活化素-ActRIIa拮抗劑。適合腸胃外給藥的藥物組合物可 包含一種或多種ActRIIa多肽，以及與之組合的一種或多種藥學上可接受的無菌等滲水 溶液或非水溶液、分散液、混懸液或乳液；或者可緊鄰使用之前重構成無菌的可注射溶液或 分散液的無菌粉末，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使製劑與有意接受者的血液等滲 的溶質、或者懸浮劑或增稠劑。可在本發明藥物組合物中採用的合適的水性和非水性載體 包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物；植物油，如橄欖 油；以及可注射的有機酯，如油酸乙酯。可保持適當的流動性，例如，通過使用包覆材料如卵 磷脂，在分散液的情況下通過維持所需要的粒度，以及通過使用表面活性劑來維持適當的 流動性。此外，可以遞送到靶組織部位(如乳腺上皮細胞)的形式將組合物包膠囊或注射。 在某些實施方案中，本文所述的組合物可包含能夠將一種或多種治療化合物(如ActRIIa 多肽)遞送到靶組織部位(如乳腺上皮細胞)的基質，為發育著的組織提供結構且最好能 夠被吸收進入體內。例如，所述基質可提供緩慢釋放的ActRIIa多肽。此類基質可由當前 用在其它植入醫療應用中的材料形成。基質材料的選擇基於生物相容性、生物可降解性、機械性質、外觀和界面性質。目 標組合物的具體應用將限定合適的製劑。用於組合物的可能的基質可以是生物可降解的 和在化學上定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其它可能的材料是生物 可降解的且在生物學上充分定義的，例如骨或真皮膠原。進一步的基質由純蛋白或細胞外 基質組分組成。其它可能的基質是非生物降解且經化學定義的，例如燒結的羥磷灰石、生物 玻璃、鋁酸鹽(aluminates)或其它陶瓷。基質可由任意上述類型的材料的組合構成，例如 聚乳酸與羥磷灰石或者膠原蛋白與磷酸三鈣的組合。可以在組合物(如鈣_鋁酸鹽-磷酸 鹽)中改變生物陶瓷，並進行加工，以改變它的孔徑、粒度、粒子形狀和生物可降解性。在某些實施方案中，本文所述的拮抗劑可口服給藥，例如為以下的形式膠囊、扁 囊劑、九劑、片劑、糖錠(使用矯味基料(flavored basis)，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃 芪膠)、散劑、顆粒或作為在水或非水液體中的溶液或混懸液、或者作為水包油或油包水的 液體乳液、或作為酏劑或糖漿、錠劑(採用惰性基質，如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯樹 膠)和/或漱口劑等等，每種形式含有預定量的藥劑作為有效成分。拮抗劑也可以以大藥 丸、藥糖劑或糊劑的形式給予。用於口服給藥的固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣劑、散劑、顆粒等等)中，一種或多種治療拮抗劑可與一種或多種藥學上可接受的載體(例如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣)和/或 以下物質中的任意種混合(1)填充劑或增量劑，如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或 矽酸；(2)粘結劑，如羥甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/阿拉伯樹 膠；(3)保溼劑如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、褐藻酸、某些矽酸 鹽以及碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，如石蠟；(6)吸收促進劑，如季銨化合物；(7)溼潤劑，如鯨 蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，如高嶺土和膨潤土； (9)潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬 脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉及其混合物；以及(10)著色劑。在膠囊、片劑和丸 劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩衝劑。相似類型的固體組合物也可以在軟和硬填充 明膠膠囊中用作填充劑，其使用諸如以下的賦形劑乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等 寸。用於口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、微乳液、溶液、混懸液、糖漿 和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型可包含本領域通常使用的惰性稀釋劑(如水或其它 溶劑)、增溶劑和乳化劑(如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二 醇、1，3- 丁二醇)、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、 甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀釋劑，口服 組合物也可以包含佐劑，如溼潤劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、香料和防腐 劑。除了活性化合物，混懸液可包含懸浮劑，如乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇、 失水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃芪膠，及其混合物。有用於本文所述的方法中的組合物也可以含有佐劑，如防腐劑、溼潤劑、乳化劑和 分散劑。通過包含各種抗菌劑和殺真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等) 來保證防止微生物的作用。也可希望將等滲劑(如糖、氯化鈉等)包含入組合物中。此外， 可通過包含延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來延長可注射藥物形式的吸收。應該理解，適合於治療或預防乳腺癌的給藥方案將由主治醫師考慮各種因素來確 定，所述因素改變本發明的目標化合物(如ActRIIa多肽)的作用。所述各種因素包括但不 限於患者的年齡、性別、飲食、疾病的嚴重性、給藥時間、以及其它的臨床因素。將其它已知 的生長因子加入到最終的組合物中也可影響劑量。通過周期性地對各種因素進行評估來對 病程進行監測，所述因素包括但不限於腫瘤的大小、階段或組織學分級、雌激素或孕酮受 體狀態、血管浸潤以及區域淋巴結轉移。臨床醫師也可以監測諸如以下的標誌蛋白uPA/ PAIl的水平(高水平的uPA和PAIl與轉移的高風險有關)以及Her-2基因擴增和/或蛋 白表達(其也與轉移相關)(Weigelt等人2005 Nat. Rev. Cancer 5 :591_602)。可證明基 因表達譜也有助於監測疾病的進展(van 『t Veer等人2002 Nature 415 :530_536和van de Vijver 等人 2002N. Engl. J. Med. 347 1999-2009)。在某些實施方案中，本發明還提供治療或預防乳腺癌的方法，該方法涉及用於在 體內產生ActRIIa多肽的基因治療。此類治療通過將ActRIIa多核苷酸序列引入牽涉乳腺 癌的細胞或組織(如乳腺上皮細胞)中，而達到其治療效果。使用重組表達載體(如嵌合 病毒或膠體分散系統)可實現遞送ActRIIa多核苷酸序列。優選地，ActRIIa多核苷酸序 列的治療性遞送使用靶向脂質體。本文所教導的能用於基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或RNA病毒(如逆轉錄病毒)。逆轉錄病毒載體可以是鼠類或禽類逆轉錄病毒的衍生物。 其中可插入單個外源基因的逆轉錄病毒載體的例子包括但不限於莫洛尼小鼠白血病病毒 (MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠類乳腺腫瘤病毒(MuMTV)和勞氏肉瘤病毒(RSV)。 多種其它的逆轉錄病毒載體可以合併(incorporate)多個基因。所有這些載體可以轉移或 合併用於可選擇標誌的基因，以致可識別和產生轉導細胞。可通過附加例如糖、糖脂或蛋白 質使逆轉錄病毒載體具有靶向特異性。通過使用抗體來實現優選的靶向性。本領域技術人 員將會認識到，可將特異性的多核苷酸序列插入逆轉錄病毒基因組中或附加到病毒包膜， 以允許靶向特異性遞送含有ActRIIa多核苷酸的逆轉錄病毒。或者，組織培養細胞可用編碼逆轉錄病毒結構基因gag、pol和env的質粒通過常 規的磷酸鈣轉染進行直接轉染。然後這些細胞用含有感興趣基因的載體質粒轉染。所得的 細胞將逆轉錄病毒載體釋放入培養基中。用於ActRIIa多核苷酸的另一種靶向遞送系統是膠體分散系統。膠體分散系統 包括大分子複合物、納米膠囊、微球體、珠粒和脂質基(lipid-based)系統，脂質基系統包 括水包油乳液、膠束、混合膠束以及脂質體。本發明優選的膠體系統是脂質體。脂質體是 人工膜囊泡，其用作體內和體外的遞送工具。RNA、DNA和完整的病毒粒子可包裹在水性內 部，並以生物學活性形式遞送到細胞(參見例如Fraley等人Trends Biochem. Sci.，6 :77， 1981)。使用脂質體載體進行有效基因轉移的方法在本領域內是公知的，參見例如Marmino 等人Biotechniquesj :682，1988。脂質體組合物通常是磷脂的組合，其通常與類固醇，尤 其是膽固醇組合。也可使用其它的磷脂或其他的脂類。脂質體的物理特徵取決於PH值、離 子強度和二價陽離子的存在。用於產生脂質體的脂類的例子包括磷脂醯基化合物，如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、 磷脂醯絲氨酸、磷脂醯乙醇胺、鞘脂、腦苷脂以及神經節苷脂。例示性的磷脂包括卵磷脂醯 膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼和二硬脂醯磷脂醯膽鹼。脂質體的標靶也可能基於，例如器官特 異性、細胞特異性和細胞器特異性，這在本領域內是公知的。
實施例以上對本發明進行了概述，參考以下的實施例將更容易理解本發明，所包括的實 施例僅僅是闡述本發明的某些方面和實施方案，並不意欲限制本發明。實施例1 :ActRIIa_Fc融合蛋白申請人:構建了一種具有人ActRIIa胞外結構域的可溶性ActRIIa融合蛋白， 其用最少的接頭融合於人或小鼠的Fc結構域。所述構建體分別稱為ActRIIa-hFc和 ActRIIa—mFc。ActRIIa-hFc (SEQ ID NO 7)如下所示，其純化自CHO細胞系ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRT DCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNK ALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白在CHO細胞系中表達。考慮三種不同的前導序列(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML) :MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO 8)；(ii)組織纖溶酶原激活物(TPA) :MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO 9)；以及(iii)天然的序列MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(SEQ ID N0:10)。選擇的形式採用TPA前導序列，且具有以下的未加工的胺基酸序列MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCY⑶KDKRRHCFATW KNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 13)這種多肽用以下的核酸序列編碼ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGC GCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAM CTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCC ATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGAC AGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGT CACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGTCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGAC CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC(SEQ ID NO 14)ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc都明顯易於重組表達。如圖1中所示，所述蛋白被純 化為單一、充分確定的蛋白峰。N-末端排序揭示單一序列-ILGRSTQE(SEQ ID N0:11)。純 化可通過一系列的柱色譜步驟來實現，包括例如任意順序的以下方法中的三種或更多種 蛋白質A色譜，Q瓊脂糖色譜，苯基瓊脂糖色譜、尺寸排阻色譜以及陽離子交換色譜。所述 純化可用病毒過濾和緩衝液交換來完成。如尺寸排阻色譜測得的，ActRIIa-hFc蛋白純化 至純度> 98%，而通過SDS PAGE測得的純度> 95%。ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc對配體表現出高的親和性，尤其對活化素A。使用標準的胺偶聯程序將⑶F-Il或活化素A( 「ActA」)固定在Biacore CM5晶片上。將 ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白載入到系統中，對結合進行測定。ActRIIa-hFc以 5X ΙΟ"12的解離常數(Kd)與活化素結合，蛋白以9. 96X ΙΟ"9的Kd與⑶Fll結合(參見圖2)。 ActRIIa-mFc的行為類似。在藥代動力學中研究中，ActRIIa-hFc非常穩定。分別給予大鼠lmg/kg、3mg/kg或lOmg/kg的ActRIIa-hFc蛋白，並分別在24、48、72、144和168小時測量蛋白的血漿濃度。 在分開的研究中，大鼠的給予劑量為lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg。在大鼠中，ActRIIa-hFc 的血清半衰期為11-14天，兩周以後，藥物的循環水平相當高(對於開始的給藥劑量為Img/ kg、10mg/kg 或 30mg/kg,分別為 11 μ g/ml、110 μ g/ml 或 304 μ g/ml)。在獼猴中，血清的半 衰期基本上大於14天，其在開始的給藥劑量為lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg時的藥物循環 水平分別為 25 μ g/ml、304 μ g/ml 或 1440 μ g/ml。實施例2 :ActRIIa-hFc蛋白的表徵使用組織纖溶酶原前導序列SEQ ID NO :9，使ActRIIa-hFc融合蛋白在穩定轉染 的CHO-DUKX Bll細胞中從pAID4載體(SV40ori/增強子，CMV啟動子)表達。按以上實 施例1中所述純化的蛋白的序列為SEQ IDNO :7。Fc部分是如序列SEQ ID NO 7中所示的 人IgGl Fc序列。唾液酸分析結果表明蛋白中平均含有約1. 5-2. 5摩爾的唾液酸/摩爾 ActRIIa-hFc融合蛋白。這種純化的蛋白在所有測試的動物中表現出顯著長的血清半衰期，包括病人中的 25-32天的半衰期(見以下的實施例3)。與報導的在人293細胞中表達的ActRIIa-hFc融 合蛋白(del Re 等人 J Biol Chem. 2004. 1217 ；279 (51) :53126_35)相比，CHO 細胞表達的 物質對活化素B配體具有更高的親和性。此外，使用tPa前導序列比使用其它的前導序列 提供更大的產量，並且與天然的前導序列表達的ActRIIa-Fc不同，使用tPa前導序列提供 了高純度的N-末端序列。使用天然的前導序列產生兩種主要的ActRIIa-Fc，每種都具有不 同的N-末端序列。實施例3 人類臨床試驗在隨機雙盲安慰劑對照研究中，將實施例2中所述的蛋白給予病人。該研究的主 要目的在於評價蛋白在健康的絕經後的女性中的安全性。將48位對象隨機分成6組，接受 單劑量的ActRIIa-hFc或安慰劑(5組活性劑1組安慰劑)。靜脈給予(IV)的劑量範圍為 0. 01-3. Omg/kg，皮下給予(SC)的劑量範圍為0. 03-0. lmg/kg。給所有的對象給藥120天。 如果在進入研究的6個月內，有對象服藥後影響骨代謝，那麼將其從研究中排除。給每個組 作安全性評價以確定劑量的遞增量。除了藥代動力學(PK)分析之外，還通過測量骨形成和 吸收的生物化學標記以及FSH水平，評價ActRIIa-hFc的生物活性。該研究中沒有報導嚴重的不良事件(adverse events)。不良事件(AEs) —般輕微 且短暫。AEs的初步分析包括頭痛、升高的實驗室數值、發冷的症狀、嘔吐、靜脈滲透以及注 射部位的血腫。ActRIIa-hFc的PK分析顯示劑量的線性分布，且平均半衰期為約25_32天。 ActRIIa-hFc的曲線下面積(AUC)與劑量線性相關，SC劑量給藥之後，吸收基本上完成。這 些數據表明SC是劑量給藥的合意方式，因為它為藥物提供相當的生物利用度和血清半衰 期，同時避免在IV劑量給藥的頭幾天伴有的藥物血清濃度峰值。ActRIIa-hFc導致快速、持 續地劑量依賴性增加骨特異性鹼性磷酸酶(BAP)的血清水平，BAP是合成代謝性骨生長的 標誌，以及導致劑量依賴性降低C-末端1型膠原蛋白端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平， C-末端1型膠原蛋白端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶5b是骨吸收的標誌。其它的標誌(例如 P1NP)顯示非決定性的結果。BAP水平在最高藥物劑量處顯示接近最大的效果，這表明在劑 量為0. 3mg/kg時，增加到高達3mg/kg時，可實現對該合成代謝性骨的生物標誌的半最大效應。作為藥效效果與藥物的AUC的關係計算，EC50為51465(天* ng/ml)。在最高的測試劑 量水平下，這些骨的生物標誌變化大約持續120天。與活化素的抑制一致的血清FSH水平 也存在劑量依賴性降低。對健康的絕經後女性給予單劑量的ActRIIa-hFc是安全的，且對測試的劑量水 平範圍有良好的耐受性。延長的PK和藥效效果表明間斷性的劑量給藥對未來的研究將 是合適的。例如，基於血清半衰期的劑量給藥可以按月進行，或者按照每2、3、4、5或6周 一次的順序進行。此外，由於藥效效果延續遠超出藥物在血清的停留時間，可基於藥效效 果進行劑量給藥，意思是每3個月或者每2、3、4、5、6或甚至12個月劑量給藥，也可對病 人有效產生所需要的效果。這種臨床試驗表明ActRIIa-hFc在人中是一種骨合成代謝劑 (osteoanabolic agent)，其生物學證據是骨形成的增加和骨吸收的減少。t施例4 :ActRIIa-Fc改善或予頁防由M癌轉移引fe的骨質、流失據估計65-75%的乳腺癌轉移到骨，使得骨結構發生實質性損壞，增加骨折的 風險，並引起疼痛和其它的副作用。我們在已經轉移到骨的乳腺癌的小鼠模型中測試了 ActRIIa-Fc 的效果。將人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的亞系(克隆2287，Kang等人Cancer Cell 2003， 第3卷537-549)在體外培養，並在密度為5 X IO6細胞/ml時收穫細胞。MDA-MB-231是一 種高度有能力種入(seeding into)骨並引起骨損害的細胞系，，所述損害與骨轉移所導致 的損害類似。在研究的第0天將10 μ 1細胞注射入6周齡的雌性無胸腺裸鼠的脛骨中。在 研究的第10天，小鼠接受ActRIIa-mFc (10mg/kg/每周2次/皮下)(η = 8)或者PBS載體 (η = 7)。採用雙能量X線吸收測量法(PIXIMus)以每周的間隔測試骨礦物質密度的變化， 以評價疾病的進展。小鼠用ActRIIa-mFc治療4周，然後被處死，收集每隻動物的脛骨(注 射腫瘤和未腫瘤化的脛骨兩者)。然後對脛骨進行處理並準備用於顯微計算機輔助斷層造 影(microCT)和組織學分析。與相對側的腿部相比，給無胸腺裸鼠脛骨內注射MDA-MB-231細胞促進經注射的 脛骨中的骨溶性損害的發展。近端的脛骨的MicroCT分析表明，與用PBS載體治療的小鼠 的未腫瘤化的脛骨相比，帶有MDA-MB-231的脛骨中的骨松質的量減少62%。與載體治療相 比，ActRIIa-mFc治療導致未處理(naive)脛骨或帶有腫瘤的脛骨分別增加70%或147% (兩個均P < 0. 01)。ActRIIa-mFc治療的小鼠的帶有腫瘤脛骨的骨松質密度與用VEH治療 的小鼠的未處理脛骨相似(P = 0. 39)。因此，ActRIIa-mFc能夠消除骨中與有乳腺腫瘤細胞的存在相關的骨損害。實施例5 =ActRIIa-Fc減少乳腺癌轉移並促進存活作為轉移性疾病的模型，可以通過心內注射將MDA-MB-231細胞引入小鼠中。 注射入左心室的細胞將通過血流遷移，並在遠端部位形成轉移性病變。衍生的細胞系 MDA-MB-231-luc-D3H2LN(Caliper Life Sciences)是表達螢光素酶的細胞系，其允許使用 生物光子成像技術(Caliper LifeSciences)非侵入性地監測轉移性腫瘤的形成。這種模 型用於評價ActRIIa-mFc對減少轉移性乳腺癌病變的形成的潛力。通過心內注射將MDA-MB-231-1UC-D3H2LN細胞引入到26隻無胸腺的裸鼠中。所 述裸鼠中的14隻用載體(磷酸鹽緩衝鹽水-PBS)治療，12隻用ActRIIa-mFc (10mg/kg,每 周2次，皮下注射)治療，在對腫瘤給藥前2周開始注射，並持續整個研究過程。對另外9隻小鼠模擬注射細胞並用ActRIIa-mFc治療。周期性地麻醉小鼠，並使發射的生物螢光顯 現，以檢測轉移進展的形成。ActRIIa-mFc治療組表明實質性減少轉移性損害的發展。到第5周，14隻用載體 治療的小鼠中的12隻表現出指示有轉移擴散的多個強烈螢光信號，而12隻用ActRIIa-mFc 治療的小鼠中只有4隻表現出相似的損害(圖3)。螢光強度的定量表明治療的小鼠中的熒 光信號大約降低10倍。
此外，ActRIIa-mFc治療顯著地增加小鼠的存活。到研究的第40天，用載體治療的 所有(14/14)小鼠都已經死亡或者安樂死(按照用於人道處理研究動物的標準程序)，而用 ActRIIa-mFc治療的小鼠中只有2隻(2/12)死亡或安樂死。到第45天，12隻用ActRIIa-mFc 治療的小鼠中的3隻死亡或安樂死，模擬注射的小鼠無一死亡。因此，在這種轉移性乳腺癌 的模型中，ActRIIa-mFc治療導致實質性減少轉移性損害的形成，並促進存活。這些數據表 明，ActRIIa-Fc可用於治療病人的乳腺癌，尤其是與其它療法結合治療，所述其它療法例如 為針對原發性腫瘤的手術、激素治療或者傳統的化療。實施例6 替代件ActRIIa-Fc蛋白公開號為W02006/012627的國際專利申請中(參見第55-60頁)(將其整體納入 本文中作為參考)描述了根據本文所描述的方法可以採用的各種ActRIIa變體。替代的構 建體可以將C-末端尾部(ActRIIa的胞外結構域的最後15個胺基酸)刪除。以下表示此 類構建體的序列(加下劃線的部分為Fc部分)(SEQ ID NO 12)ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRT DCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWV DVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK併入作為參考本文所提及的所有出版物和專利都整體地納入本文中作為參考，猶如每一個單獨 的出版物或專利具體且單獨地納入本文中作為參考一樣。如果出現牴觸，以本發明，包括本 文中的任何定義為準。雖然討論了本主題的具體實施方案，但以上的說明書只是作為說明之用，並非作 限制。顯然，本領域的技術人員在讀完本說明書和以下權利要求書之後可作出很多的變化。 本發明的完整的範圍應當通過參考權利要求書及其等同物的全部範圍，以及說明書連同此 類變化來確定。
權利要求
在病人中治療或預防乳腺癌或乳腺癌相關的骨質流失的方法，所述方法包括對患者給予有效量的ActRIIa-Fc融合蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白選自a)包含與SEQID NO 2具有至少90%同一性的胺基酸序列的多肽；b)包含與SEQID NO 3具有至少90%同一性的胺基酸序列的多肽；和c)包含SEQID NO 2的至少50個連續胺基酸的多肽。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白具有一種或多種如下特性i.以至少1(T7M的Kd與ActRIIa配體結合；禾口ii.在細胞中抑制ActRIIa信號傳導。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含一種或多種修飾的氨 基酸殘基，其選自糖基化胺基酸、聚乙二醇化胺基酸、法尼基化胺基酸、乙醯化胺基酸、生 物素化胺基酸、與脂質部分綴合的胺基酸以及與有機衍生劑綴合的胺基酸。
5.如權利要求2所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQIDN0 3的氨 基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQIDN0 3的氨 基酸序列具有至少95%同一性的胺基酸序列。
7.如權利要求2所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQIDN0 3的氨基 酸序列。
8.如權利要求2所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQIDN0 2的氨基 酸序列。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白為由兩個多肽形成的二聚 體，所述多肽各自包含與SEQ ID NO :2的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列， 並且其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含3個或多個唾液酸部分。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含SEQIDN0 2的胺基酸序列。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白包含3到5個唾液酸部分。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述方法導致所述患者骨骼肌質量低於10%的增加。
13.如權利要求11所述的方法，其中給予所述ActRIIa-Fc融合蛋白，以便在患者中達 到至少0. 2mg/kg的血清濃度。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白具有SEQIDN0 :7的胺基酸序列。
15.如權利要求11所述的方法，其中所述ActRIIa-Fc融合蛋白在正常、健康的人中的 血清半衰期介於15到40天之間。
16.如權利要求11所述的方法，其中對所述患者給予所述ActRIIa-Fc融合蛋白的頻率 不超過每周一次。
17.如權利要求11所述的方法，其中對所述患者給予所述ActRIIa-Fc融合蛋白的頻率不超過每月一次。
18.如權利要求11所述的方法，其中對所述患者給予所述ActRIIa-Fc融合蛋白的頻率 不超過每3個月一次。
19.如權利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述患者正在接受受骨抗吸收療法、 或者在給予所述ActRIIa-Fc融合蛋白之前1年之內已經接受骨抗吸收療法。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述抗吸收劑選自二膦酸鹽藥劑、RANK配體拮抗 劑以及骨保護素拮抗劑。
21.如權利要求1至18中任一項所述的方法，其進一步包括對所述病人給予放射療法、 內分泌療法或細胞毒藥劑。
22.如權利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述病人為具有一種或多種乳腺癌 風險因素的女性。
23.治療或預防乳腺癌或乳腺癌相關的骨質流失的方法，所述方法包括向有此需要的 對象給予有效量的活化素-ActRIIa拮抗劑。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑為活化素或ActRIIa 拮抗劑多肽。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑為選自下列的抗體a.抗活化素抗體；和b.抗ActRIIa 抗體。
26.如權利要求25所述的方法，其中給予所述活化素-ActRIIa拮抗劑導致延遲乳腺癌 的發作、抑制乳腺癌進展、延遲發生轉移或減小腫瘤尺寸。
27.如權利要求23所述的方法，其中所述對象為人。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述人為具有一種或多種乳腺癌風險因素的女性。
29.如權利要求23所述的方法，其進一步包括對所述對象給予放射療法、內分泌療法 或細胞毒藥劑。
30.鑑定對治療或預防乳腺癌有用的藥劑的方法，所述方法包括a.鑑定與ActRIIa配體競爭性結合於ActRIIa多肽的配體結合結構域的測試藥劑；和b.評估所述藥劑對乳腺癌細胞增殖或存活的影響。
31.在患有乳腺癌的病人中抑制活化素介導的信號傳導的方法，所述方法包括對病人 給予有效量的活化素-ActRIIa拮抗劑。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑為活化素或ActRIIa 拮抗劑多肽。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑為活化素或ActRIIa 拮抗劑多肽。
34.如權利要求31所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑是選自下列的抗體a.抗活化素抗體；和b.抗ActRIIa 抗體。
35.如權利要求31所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑多肽選自a.包含與SEQ ID NO :2具有至少90%同一性的胺基酸序列的多肽；b.包含與SEQID NO :3具有至少90%同一性的胺基酸序列的多肽；c.包含選自SEQID NO 2的至少50個連續胺基酸的多肽。
36.如權利要求31所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑多肽具有一種或多種 如下特性i.以至少1(T7M的Kd與ActRIIa配體結合；禾口ii.在細胞中抑制ActRIIa信號傳導。
37.如權利要求35所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑多肽為融合蛋白，除 ActRIIa多肽結構域之外，其包含增強下列各項中的一種或多種的一個或多個多肽部分 體內穩定性、體內半衰期、攝取/給藥、組織定位或分布、蛋白複合物的形成和/或純化。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述融合蛋白包含選自下列的多肽部分免疫球 蛋白Fc結構域和血清白蛋白。
39.如權利要求37所述的方法，其中所述活化素-ActRIIa拮抗劑多肽包含一種或多種 修飾的胺基酸殘基，其選自糖基化胺基酸、聚乙二醇化胺基酸、法尼基化胺基酸、乙醯化氨 基酸、生物素化胺基酸、與脂質部分綴合的胺基酸以及與有機衍生劑綴合的胺基酸。
40.ActRIIa-Fc融合蛋白在製備用於在病人中治療或預防乳腺癌或乳腺癌相關的骨質 流失的藥物中的用途。
41.用於在病人中治療或預防乳腺癌或乳腺癌相關的骨質流失的ActRIIa-Fc融合蛋白。
42.活化素-ActRIIa拮抗劑在製備用於在對象中治療或預防乳腺癌或乳腺癌相關的 骨質流失的藥物中的用途。
43.用於在對象中治療或預防乳腺癌或乳腺癌相關的骨質流失的活化素-ActRIIa拮 抗劑。
44.活化素-ActRIIa拮抗劑在製備在患有乳腺癌的病人中抑制病人活化素介導的信 號傳導的藥物中的用途。
45.用於在患有乳腺癌的病人中抑制活化素介導的信號傳導的活化素-ActRIIa拮抗劑。
全文摘要
在某些方面，本發明提供了用於治療或預防人乳腺癌的組合物和方法。
文檔編號A61K38/18GK101835485SQ200880011264
公開日2010年9月15日 申請日期2008年2月1日 優先權日2007年2月1日
發明者J·克諾普夫, J·西赫拉, R·庫馬 申請人:阿塞勒隆製藥公司