通過翻譯調控基因表達系統檢測和調節細胞死亡的組合物和方法

2023-12-02 07:16:46

專利名稱：通過翻譯調控基因表達系統檢測和調節細胞死亡的組合物和方法
通過翻譯調控基因表達系統檢測和調節細胞死亡的組合物
和方法背景 本技術涉及翻譯調控(例如TR)核酸分子，其編碼在應激和/或垂死細胞中被選 擇性翻譯和早期檢測的mRNA分子。在多個實施方案中，本技術涉及包含此類TR元件的表 達盒、包含此類表達盒的哺乳動物細胞和轉基因動物，以及使用和治療方法。活生物體中的正常生物活性將構成個體基因組的基因的內源表達與對外界的反 應結合起來。在高等真核生物中，基因表達始於細胞核中的基因組DNA轉錄為前mRNA或「初 級」 RNA轉錄物。當前mRNA仍然處於細胞核中的時候，其被修飾以包括5』帽子結構，形成 異核核糖核蛋白(hnRNP)複合物，獲得3』多聚腺苷酸尾巴，並經歷剪接以除去間插DNA序 列(例如內含子)。成熟mRNA隨之被輸出至細胞質，在這裡蛋白質複合物指導(1)藉助5』 帽子結構與核糖體締合，這稱為帽子依賴性翻譯，或者(2)與促進mRNA儲存、加工或降解的 胞質RNA結合蛋白質相互作用。繼核糖體驅動的翻譯之後，3』多聚腺苷酸尾巴的相繼縮短 使得mRNA體運輸至核糖核酸酶(RNAse)複合物，所述核糖核酸酶複合物稱為外來體，降解 衰老的mRNA，並有效終止蛋白質合成。如所預期的那樣，基因表達是高度調控的過程，其必須在特定的時間、以特定的速 率和數量產生期望的基因產物(一般是多肽)。除了轉錄調控之外，轉錄後過程如mRNA衰 變和翻譯均為基因表達的關鍵限制點。由基因突變或對外部刺激的異常反應所產生的細胞 表達譜的變化能夠造成嚴重異常，往往導致細胞死亡，以及表現出疾病表型，這不足為奇。環境因素[如改變的營養水平、細胞因子、激素和溫度轉變]以及環境應激[像低 氧、低血鈣、病毒感染和組織損傷]廣泛或延長的細胞刺激導致帽子依賴性翻譯迅速減弱。 此過程是適應性的，因其削減對於即刻應激反應和恢復而言並非必需的全局蛋白質合成。 然而，這種翻譯減弱並不完全消除核糖體活性，因為許多應激反應產物和恢復基因繼續由 稱為帽子非依賴性翻譯的備選過程來合成(在Guhaniyogi&Brewer，2001，Gene265(l_2) 11-23中綜述)。帽子非依賴性翻譯通過直接將核糖體募集至稱為內部核糖體進入位點(IRES)的 特異性RNA結構而發生。繞過對5’mRNA帽子結構的需求最初被描述為在感染細胞中與細胞 帽子依賴性翻譯近乎完全的抑制無關而翻譯病毒RNA的機制(Jang等人，1988，J. Virol.， 62 2636-43)。一般而言，IRES序列不能夠通過序列同源性鑑定，而充分表徵的IRES元件 已應用功能測定進行了驗證(Mountford 和 Smith, 1995, TIG, 11 (5) :179_184 ；Baird 等人， 2006, NAR, 12 (10) 1755-85).當前的證據表明IRES RNA的構象以及輔助蛋白質與特異性 mRNA序列的結合使得能夠進行核糖體結合。在真核細胞中，IRES指導的翻譯往往與mRNA的 5』非翻譯區(5』 UTR)相關，其含有顯著抑制核糖體依賴性翻譯起始的罕見的長且熱力學穩 定的RNA 二級結構，其具有多個短可讀框(ORF)。然而，許多這些5，UTR IRES元件的IRES 活性的功能驗證由於存在自重疊5』基因啟動子克隆的轉錄效應序列而變得複雜化。嘗試 在IRES報告載體中採用這些5』UTR元件由於這種殘留背景轉錄活性而變得複雜化，這種活 性掩蓋了由這些序列所產生的任何翻譯調控作用。
IRES元件已在許多真核生物mRNA中鑑定(Bonnal S等人，(2003)Nucleic Acids Res. 31 :427-428)，並確保蛋白質或其片段在細胞核失活或急性細胞應激期間在「帽子依賴 性」翻譯起始受抑制時(即凋亡、飢餓、Y-輻射、低氧、有絲分裂或末端分化時)有效表達。 美國公開專利申請No. 2006/0173168公開了通過IRES的內部翻譯起始產生的、來自PLP/ DM20基因C-末端的兩種低分子肽，即PIRP-M和PIRP-L。化學或生物藥物幹預對於特定個體總體健康的影響往往是不確定的。雖然藥物 分子可能補救靶症狀，但是治療可能伴有嚴重的副作用或不期望的毒性，這在一些情況可 比最初的疾病更為嚴重。雖然藥物製品的副作用和毒性常常是已知的，並且可能局限於小 亞群的個體，但是這些效應在此小亞群個體中可能會如此嚴重，以至於藥物可能得不到FDA 的許可，這導致巨大的藥物浪費。美國年產大量的化學品。每年有超過2，000種新化學品引入到市場上，不 過極少 進行過綜合的急性或長期(chronic)毒性檢驗。為了定義新藥物或化學品的潛在毒性，美 國食品和藥物管理局(FDA)要求新藥申請(NDA)，以包括在至少兩種動物物種中進行的大 批毒性、致癌性、誘變性和生殖性/能育性檢驗。頻繁侵入性的檢驗和屍檢終點已經引起了 相當大的來自動物權益團體和普通公眾關於動物苦難的批判。這種情況強調了本領域對於能夠在廣譜細胞類型中檢測急性或長期接觸化學品 後的細胞應激和毒性的備選高通量分子和生物篩選技術的需求。從而需要新方法進行有效 和不太昂貴的毒性檢驗，以提供動物檢驗的可靠備選方案。概述本技術的多方面包括核酸表達盒，其在哺乳動物細胞中可表達並且以5』至3』方 向包含如下元件至少一種轉錄效應序列，TR元件，其編碼在應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子，有效連接於TR元件的核苷酸序列，其為第一可讀框(ORF)序列，編碼多肽或其片 段，並與TR元件共翻譯，和多聚腺苷酸化序列，本文稱為TR表達盒。第一 ORF序列可選自報告基因、細胞毒性腫瘤抑制基因、毒素基因、前藥激活基 因和凋亡前(proapoptotic)基因。在一個實施方案中，轉錄效應序列是啟動子。另一方面，TR表達盒可含有第二 ORF序列，其位於TR序列的5』，並獨立翻譯。第 二 ORF序列可選自與第一 ORF相同的序列。本技術另一方面是提供用TR表達盒轉化的哺乳動物細胞。優選哺乳動物細胞是 胚胎幹(ES)細胞。又在另一方面，本技術提供了確定物質毒性的方法。一種此類方法包括(a)接觸 用TR表達盒轉化的哺乳動物細胞，其中所述第一 ORF序列編碼報告多肽；和(b)檢測報告 多肽的存在或測量其水平，其中與(i)未接觸所述物質或(ii)未轉染的對照細胞相比，所 述報告多肽的存在或其水平的增加指示所述物質的毒性。另一種確定物質毒性的方法包括 (a)用TR表達盒轉染或轉導哺乳動物細胞或穩定轉化哺乳動物細胞系，其中所述第一 ORF 序列編碼報告多肽；(b)使(a)中轉染的細胞與所述物質接觸；和(c)檢測報告多肽的存在 或測量其水平，其中與(i)未接觸所述物質或(ii)未轉染/轉導的對照細胞相比，所述報告多肽的存在或其水平的增加指示所述物質的毒性。又在本技術的另一方面是提供試劑盒，其包括TR表達盒或用此類表達盒轉化的 哺乳動物細胞，以及使用說明書。另一方面，本技術提供了轉基因非人動物，其具有穩定整合到其基因組中的TR表 達盒。優選的轉基因動物是小鼠。又在另一方面，本技術提供了殺死靶細胞的方法，這是通過用TR表達盒轉化所述 細胞，其中第一 ORF序列選自細胞毒性腫瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因或凋亡前基 因。附1是示意圖，顯示了用來產生pTR-ORF載體的親本質粒。圖IA顯示了 pE YFP_Nl 載體的限制性圖譜。圖IB顯示了 pPLPeyfp表達載體，用來表達作為與增強型黃色螢光蛋白 (EYFP)的融合蛋白質的蛋白脂質蛋白(PLP)的PLP同工型。圖IC顯示了 pDM20eyfp表達 載體，表達作為與EYFP的融合蛋白質的DM20蛋白脂質蛋白同工型。功能性質粒元件(限 制性酶位點、複製起點、可讀框等)按照需要以垂直線、方框和箭頭表示。圖2顯示了單順反子pTR-EYFP表達載體的圖示實例。圖2A顯示了 PTRplp_EYFP載 體的圖譜。此載體中的TR-ORF盒由CMV IE轉錄啟動子、源自PLP同工型cDNA序列的TR 元件、EYFP可讀框和SV40多聚腺苷酸化信號組成。圖2B顯示了 pTRdm_EYFP載體的圖譜。 此TR-ORF盒與圖2A類似，除了 TR元件源自DM20同工型cDNA序列。圖3顯示了雙順反子pORF-TR-ORF載體的示意圖。圖3A顯示了 pfLuc_TRplp-EYFP 載體的圖譜。此載體中的雙順反子盒由CMV IE轉錄啟動子、相對於TR轉錄方向而言處於 「有義」取向的螢火蟲螢光素酶(fLuc)基因、與EYFP ORF功能相連的pip特異性TR元件 和SV40多聚腺苷酸化信號組成。顯示了相關的限制性位點和質粒功能元件。圖3B顯示了 PfLuc-TRdm-EYFP質粒的圖譜。圖3C展示了 ρcuLf-TRplp-EYFP載體的圖譜，其中fLuc ORF 在TR表達盒中處於「反義」取向。圖3D顯示了具有反義fLuc ORF的PcuLf-TRdm-EYFP質 粒的圖譜。圖4展示了 Western印跡分析定量，顯示表達雙順反子TR盒的細胞庫在用毒性劑 量的鈣離子載體A23187或蛋白酶體抑制劑MG132處理之後誘導EYFP翻譯。EYFP蛋白水平 通過光密度測定法確定，並表示為對照HEK293細胞(調整為100%)中檢測的蛋白質水平 的百分比。帽子非依賴性翻譯獨立於上遊fLuc ORF的取向(顯示為相對於TR盒處於「有 義」取向的fLuc和「反義」取向的cuLf)。圖5顯示了可用來產生能夠轉導哺乳動物細胞的重組病毒的質粒穿梭載體的示 意圖。圖5A顯示了可用來產生能夠在體外和體內轉導哺乳動物細胞的重組腺伴隨病毒 (rAAV)的pAAV-MCS穿梭載體的圖譜。圖5B顯示了可用來產生轉導哺乳動物細胞、以在應 激和垂死細胞中選擇性地翻譯TR-ORF盒的重組杆狀病毒(rBAC)病毒粒體的pBAC_l穿梭 載體的圖譜。圖6展示了 Western印跡分析定量，顯示表達單順反子TRplp/dm-fLuc盒的細胞在用 毒性劑量的鈣離子載體A23187處理之後誘導fLuc翻譯。fLuc蛋白水平通過光密度測定法 確定，並表示為對照HEK293細胞(調整為100% )的百分比。圖6A顯示了與CMV-fLuc和 HEK293細胞、以及HEK293TRplp-fLuc庫相比，表達TRplp-fLuc盒的4個亞克隆(#3、17、13和16)產生的fLuc蛋白水平。圖6B顯示了與CMV-fLuc、HEK293和HEK293TRdm-fLuc細胞中 的蛋白水平相關的表達TRdm-fLuc盒的5個亞克隆(#12、43、45、2和8)的fLuc蛋白定量。圖7顯示了螢光HEK293TRplp/dm-EYFP細胞中用毒性劑量的鈣離子載體 A23187處理 後6小時和10小時的TR特異性增加。柱形圖代表螢光細胞的直接顯微計數。細胞數表示 為螢光細胞相對於對照HEK293細胞(調整為100% )的百分比。圖8展示了 HEK293TRplp/dm-fLuc細胞在用毒性劑量的鈣離子載體A23187處理後通 過抗fLuc抗體免疫螢光標記染色的TR特異性增加。柱形圖代表染色螢光細胞的直接顯微 計數。細胞數表示為螢光細胞相對於對照HEK293細胞(調整為100%)的百分比。圖9顯示了可通過表達TRplp/dm_EYFP和TRplp/dm-fLuc盒的系列細胞系接觸毒性劑 量的鈣離子載體A23187後產生的TR依賴性翻譯。柱形圖顯示了可通過微板讀數器獲得 的隨意(arbitrary)螢光或螢光素酶單位，表示為處理與未處理培養物的比值。比值超過 1. 0指示細胞呈現TR依賴性翻譯。圖9A顯示了表達TRplp-EYFP盒的8個細胞系與HEK293、 CMV-EYFP和TRplp-EYFP庫相比的結果。圖9B顯示了表達TRplp-fLuc盒的5個細胞系、表達 TR^-fLuc盒的3個細胞系與CMV-fLuc和HEK293對照相比的結果。

圖10顯示了可通過表達TRplp/dffl-fLUC盒的細胞系接觸毒性劑量的鈣離子載體 A23187後產生的TR依賴性劑量反應。圖10A顯示了可通過微板讀數器獲得的HEK293、 HEK293CMV-fLuc、HEK TRplp-fLuc (亞克隆 #3)和 HEI^gSTI^-fLuc (亞克隆 #45)細胞在漸 增濃度毒素中培養後的隨意發光單位圖。圖10B僅顯示了 HEK293和TRplp/dffl-fLUC的結果， 以突出峰值處於6 yM的劑量反應曲線。圖10C顯示了將隨意螢光素酶讀數表示為未處理 細胞中螢光素酶活性百分比的圖。這顯示了可通過CMV-fLuc細胞產生的帽子依賴性翻譯 向TR-0RF細胞呈現的帽子非依賴性螢光素酶活性增加變化；然而，劑量反應曲線的形狀不 變。圖10D顯示了作為與CMV-fLuc細胞讀數比值的隨意螢光素酶讀數。這種比較突出了 高劑量時CMV-fLuc活性的急劇下降，並減小了 TR依賴性翻譯在更高毒素劑量時的明顯下 降。圖11顯示了可通過表達TRplp/dffl-fLUC盒的細胞系接觸毒性劑量的鈣離子載體 A23187後產生的TR依賴性時間反應。圖11A顯示了可通過微板讀數器獲得的HEK293、 HEK293CMV-fLuc、HEK TRplp-fLuc (亞克隆 #3)和 HEI^gSTI^-fLuc (亞克隆 #45)細胞在用 毒性劑量的鈣離子載體A23187培養後作為漸增時間函數的隨意螢光素酶讀數圖。圖11B 是HEK293和TRplp/dffl-fLUC的結果圖，顯示了處理後1. 5小時觀察到螢光素酶活性增加。圖 11C顯示了將隨意螢光素酶讀數表達為處理後0小時的螢光素酶活性百分比的圖。圖11D 顯示了作為與CMV-fLuc細胞比值的隨意螢光素酶讀數。圖12是顯示rBAC TR^-EYFP病毒粒體轉導HT 1080細胞、和在應激和垂死細胞中 呈現TR依賴性翻譯能力的柱形圖。用lOpfu/細胞或25pfu/細胞的rBAC病毒粒體轉導的 細胞在毒性濃度的鈣離子載體A23187中培養13. 5小時或23小時。螢光細胞顯微計數，並 表達為對照HEK293細胞(經感染但未用毒素處理)的百分比。圖13是顯示TRplp_TKsr39細胞庫響應前藥更昔洛韋(ganciclovir)和誘導細胞 死亡能力的圖。HEK293、HEK CMV-EYFP和HEK293TRplp_TKsr39細胞在多種濃度的更昔洛韋 中培養3或4天。細胞生存力通過臺盼藍不相容測定法來確定，且細胞數表達為存活細胞 百分比。與HEK293和HEK CMV-EYFP培養物在任何前藥濃度或時間點顯示出無細胞生存力下降相反，TRplp-TKsr39細胞處於補充更昔洛韋的培養基中3天後展示出生存力減小。到 第4天，TRplp-TKsr39細胞顯示出顯著的細胞死亡和細胞生存力劑量依賴性的減小。圖14是來自多種脊椎動物的髓鞘蛋白脂質蛋白C-末端序列的序列比較表， 所述序列來自如下 NCBI Genbank 號(1)P60201 智人(Homosapiens)、(2) Q5R6E6 猩 猩(Pongo pygmaeus)(猩猩)、(3)XP_001140782 黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩 猩)、(4)XP_001088537 恆河猴(Macacamulatta)(恆河猴)、(5)Q8HXW7 成束猴(Macaca fascicularis)(食蟹獼猴(crab-eating macaque))、(6)NP_999139豬(Sus scrofa)(豬)、 (7)NP_035253小家鼠(Mus musculus)(小鼠)、(8)NP_112252褐家鼠(Rattus norvegicus) (大鼠)、(9)XP 001374483 灰色短尾負鼠(Monodelphis domestica)(負鼠)、(10)P47789 穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)、(11) CAA08909 歐洲牛(Bostaurus)(牛)、(12) 39025 家犬(Can is familiar is)(狗)、(13) CAA43839 原雞(Gallus gallus)(雞)、(14) P47790 斑 胸草雀(Taeniopygia guttata)(珍珠鳥(zebra finch) )、(15) AAW79015 多疣壁虎(Gekko japonicus)(壁虎(geckolizard))、(16)CAA79582 光滑爪蟾(Xenopus laevis)(蛙)禾口 (17)BAA84207 矛尾魚(Latimeria chalumnae)(空棘魚(coelacanth))。在一些物種中存 在的插入突變以雙下劃線顯示。圖15即15A-15C是鼠和人PLP/DM20編碼序列及其TR元件的序列比對圖。注釋 mDM =鼠 DM20cDNA ;mP =鼠 PLP cDNA ；TRd = TRdm[SEQID NO 1] ；TRp = TRplp [SEQ ID NO: 2] ；hDM=人DM20 ；而hP =人PLP。由於DM20序列刪除了全長PLP編碼序列中存在的部分 序列，圖15中DM20序列的編號是不連續的，而在刪除區段之後的DM20編號連續顯示在比 對序列下方。在參照圖15說明本文的序列時，在一些情況下利用PLP/DM20核苷酸位置的 雙重編號，例如殘基560/455 ；這種用法是指可選的PLP和DM20編號，其中PLP編號如比對 序列上方所示，而DM20編號如比對序列下方所示。顯示的末尾表達的密碼子是829/724至 831/726 的「ttc」。應當指出，本文闡述的附圖旨在例舉本技術中材料和方法的一般特徵，以便說明 本文的此類實施方案。這些附圖可能並不精確反應出任何給定實施方案的特徵，而不必然 旨在限定或限制本技術範圍內的具體實施方案。發明詳述如下技術說明就一個或多個發明的主題、製備和用途而言僅僅是舉例性的，而非 旨在限制本申請、或遞交時可能要求本申請優先權的此類其他申請、或由此授予的專利中 要求保護的任何具體發明的範圍、應用或用途。如下定義和非限制性指導須參照本文闡釋 的技術說明予以考慮。本文所用的標題(如「引言」和「概述」)和小標題(如「表達盒」)僅僅旨在總體 上組織本技術公開內容範圍內的主題，而非旨在限制本技術的公開內容或其任何方面。特 別是，在「引言」中公開的主題可以包括一個或多個發明範圍內的技術方面，並且可以不等 同於現有技術的敘述。在「概述」中公開的主題並不是本技術或其任何實施方案完整範圍 詳盡的或徹底的公開。本文引述的參考文獻並不等同於承認那些參考文獻為現有技術或與本文公開技 術的專利性有任何相關性。對於引言中引述的參考文獻內容的討論僅僅旨在提供該參考文 獻作者所作主張的概述，而並不等同於承認此類參考文獻內容的準確性。本說明書說明部分所引述的所有參考文獻在此全文併入作為參考。所述說明和具體實例雖然表示了本技術的實施方案，但僅僅是出於舉例說明的目 的，而非旨在限制本技術的範圍。此外，述及具有指定特徵的多個實施方案時並非旨在排除 其他具有附加特徵的實施方案、或其他整合了不同組合的指定特徵的實施方案。提供具體 實施例是為了舉例說明如何製備、使用和實施本技術的材料和方法的目的，故而除非另有 明確說明，並非旨在表示本技術給定實施方案已經或者尚未進行製備或檢驗。如本文所用，措辭「優選的，，和「優選地」是指在某些情況下提供某些益處的本技 術實施方案。然而，在相同或其他情況下，其他實施方案也可以是優選的。而且，述及一個 或多個優選的實施方案時並不意味著其他實施方案無益，也並非旨在將其他實施方案排除 在本技術範圍之外。如本文所用，術語「包含」、「包括，，和「具有，，及其變形旨在非限制性的，從而述及 羅列款項時並非排除其他也可用於本技術材料、組合物和方法的類似款項。如本文所用，當術語「約」應用於本技術組合物或方法的參數值時，表示該值的計 算或測量允許一些微小的不精確，而不會對所述組合物或方法的化學或物理屬性具有實質影響。當介紹本技術或其優選實施方案的要素時，單數形式冠詞(「a」、「an」、「the」W& "said")旨在表示有一個或多個要素。術語「細胞毒性基因」是指當在靶細胞中表達時通過裂解、凋亡、壞死或任何其他 細胞殺傷機制誘導細胞死亡的核苷酸序列。術語「基因」是指包含生產多肽或前體或RNA (例如，tRNA、siRNA、rRNA等)所必需 的編碼序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分編 碼，只要保留全長或片段的期望活性或功能特性(例如，酶促活性、配體結合、信號轉導等) 即可。該術語也涵蓋結構基因的編碼區以及在5』及3』端鄰近於編碼區的序列，從而基因 對應於全長mRNA的長度。位於編碼區5』並在mRNA上存在的序列稱為5』非翻譯序列。位 於編碼區3』或下遊並在mRNA上存在的序列稱為3』非翻譯序列。術語「基因」涵蓋cDNA以 及基因組形式的基因。基因組形式或基因克隆含有編碼區，其可以被稱為「內含子」或「間 插區域」或「間插序列」的非編碼序列中斷。內含子從核或初級轉錄物中移去或「剪接掉」， 因此不存在於信使RNA (mRNA)轉錄物中。mRNA在翻譯期間發揮功能以規定新生多肽的序列 或胺基酸次序。術語「表達載體」是指包含核酸表達盒的病毒及非病毒載體。術語「表達盒」用來定義含有有效連接於編碼序列、導致該編碼序列在細胞中轉錄 和翻譯的調控元件的核苷酸序列。「哺乳動物啟動子」是指在哺乳動物細胞中發揮功能、或源自哺乳動物細胞的轉錄 啟動子，或兩者兼而有之。「哺乳動物最小啟動子」是指藉助於RNA聚合酶結合正確起始轉錄所必需的「核 心」 DNA序列，但是不存在任何有效連接的轉錄效應序列時，其僅呈現象徵性的轉錄活性。短語「可讀框」或「編碼序列」是指編碼多肽或蛋白質的核苷酸序列。在真核生物 中，編碼區5』側邊界是編碼起始甲硫氨酸的核苷酸三聯體「ATG」，而3』側邊界是規定終止 密碼子的三個三聯體之一(即，TAA、TAG和TGA)。
定義「有效連接」以表示核酸與其他核酸序列以功能關係進行布置。例如，如果啟 動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則其與該序列有效連接；或者如果核糖體結合位點的 布置利於翻譯，則其與編碼序列有效連接。一般而言，「有效連接」表示相連的DNA序列是鄰 接的。然而，增強子不用必須鄰接。連接通過方便的限制性位點處的連接而實現。如果不 存在這樣的位點，則根據傳統慣例使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。「重組」是指方法、試劑及實驗操作的結果，其中核酸或其他生物分子經酶促、化學 或生物切割、合成、組合或以其他方式離體操作以便在細胞或其他生物系統中產生期望的 產物。術語「重組DNA」是指由通過分子生物學技術連在一起的DNA區段所組成的DNA分 子。「轉染」是用來說明將外來物質如外來DNA引入到真核細胞中的術語。其與「轉化」 和「轉導」可互換使用，雖說後一個術語在其更窄的範圍上是指通過起載體作用的病毒向細 胞中引入DNA的過程。因而，經過轉染的細胞稱為「轉染的」、「轉化的」或「轉導的」細胞。如本文所用的術語「質粒」是指獨立複製的DNA片段。其通常為環形或雙鏈。「報告基因」是指任何其表達能夠通過本領域技術人員已知的常規技術進行檢測 或測量的基因。術語「調控元件」或「效應元件」是指轉錄啟動子、增強子、沉默子或終止子，以及 任何翻譯調控元件、多聚腺苷酸化位點，等等。可以安排調控及效應元件，從而其允許、增強 或利於選擇性地生產受其調控的成熟編碼序列。術語「載體」是指可以向其中插入外來DNA片段的DNA分子。一般而言，其含有調 控序列及目的編碼序列。術語載體包括但不限於質粒、粘粒、噬菌粒、病毒載體和穿梭載體。「穿梭」載體是能夠進行原核複製但不含真核複製序列的質粒載體。此複製缺陷型 穿梭載體中所含的病毒DNA序列指導真核宿主細胞中的重組以產生感染性病毒顆粒。如本文所用的術語「物質」是指具有明確化學組成的物質。在本文其與術語「化合 物」可互換使用。術語「病毒載體」是指含有外來遺傳物質以遞送到其所感染的細胞中的病毒。「複製缺陷型」病毒載體不能在「野生型」或其他未經操作的哺乳動物細胞中複製。 為生產顯著量的此類病毒，需要生產細胞系用輔助病毒共轉染或以其他方式修飾以補充或 補償缺失的一種或多種功能。「具有複製能力的」病毒載體能夠感染細胞並進行DNA複製、病毒包裝以及從感染 細胞中釋放。如本文所用的「條件複製型」病毒載體是經設計在特定細胞類型中選擇性表達的 具有複製能力的載體，從而避免不期望的廣譜感染。條件複製可以通過在載體中納入有效 連接於早期病毒基因的組織特異性、腫瘤特異性或細胞類型特異性或其他選擇性誘導的調 控控制序列來實現。術語「應激」和「毒性」用來指細胞天然生物化學及生物物理穩態的混亂。儘管應 激一般導致細胞穩態恢復，但是毒性反應最終導致細胞死亡。本技術中採用的翻譯調控(TR)序列(也稱為「TR元件」)是IRES元件，其可通過 (a)其核酸序列背景和(b)調控翻譯的細胞活性(美國公開專利申請No. 2006/0173168)而 區別於5' UTR IRES。這兩個特徵的組合形成了有效連接於此IRES序列的下遊編碼序列在應激和/或垂死哺乳動物細胞中選擇性翻譯的基礎。因而，本技術考慮應用任何在應激 和/或垂死細胞中選擇性表達的哺乳動物IRES作為TR元件。在一些實施方案中，本技術的IRES元件具有定位於哺乳動物蛋白脂質蛋白(pip) 基因0RF中的帽子非依賴性翻譯活性。在其天然環境中，pip IRES活性位於含有若干在正 常細胞中有效阻斷核糖體掃描內部AUG密碼子的上遊0RF( 「uORF」)的多順反子RNA中。 然而，使細胞接觸毒性劑導致核糖體結合併從特異性內部RNA序列翻譯，從而從pip 0RF的 3』末端翻譯內部胺基酸序列。因而，表達受該TR元件調控的適當編碼序列允許觀察、監測 和調節細胞死亡，這在眾多應用中有用途。本文提供的重組DNA分子允許在應激或垂死細 胞中選擇性地表達含有編碼一個或多個多肽的一個或多個核酸序列的RNA轉錄物。在一些實施方案中，本技術的TR元件源自pip基因的外顯子1-7。雖然不束縛於 特定的理論，基於突變分析數據，相信外顯子1至4足以編碼功能性IRES活性。而且，相信 在應激/死亡特異性翻譯方面起作用的TR調控系統定位於外顯子6和/或7中。與US 2006/0173168中公開的在垂死細胞中表達的IRES元件相比，本技術源自 PLP/DM20的TR元件在所有如下特徵上均有所不同1)核苷酸1 (SEQ ID No. 1和2中)由A突變為T，以除去髓鞘蛋白脂質蛋白PLP 及DM20cDNA中指導全長PLP和DM20合成的野生型AUG起始密碼子，以防止發生這樣的合 成；2)核苷酸4由G突變為A，以在PLP及DM20cDNA的第二可能讀框中創建終止密碼 子，以防止其全長合成；3)核苷酸6、7和8分別由C突變為T、T突變為G、以及T突變為A，以在PLP及 DM20cDNA的第三可能讀框中創建終止密碼子，以防止全長PLP和DM20的合成；4)核苷酸17和18分別由G突變為A、以及T突變為G，以在PLP及DM20cDNA的主 要(第一)可讀框中創建第一終止密碼子，以防止其全長合成；5)核苷酸21由T突變為A，以在PLP及DM20cDNA的主要(第一)可讀框中創建 第二終止密碼子，以防止其全長合成；6)核苷酸27由A突變為T，以從PLP及DM20cDNA的第三可能讀框中去除AUG密 碼子，以防止不存在AUG野生型密碼子時不符合讀框的翻譯起始；和7)從PLP及DM20cDNA中缺失了終止密碼子，以減小對下遊可讀框翻譯的幹擾。因此，本技術源自PLP/DM20的TR元件並不指導PIRP-M或PIRP-L的帽子依賴性 翻譯。除上述變化之外，還向來自DM 20變體cDNA的TR元件中引入了如下突變1)核苷酸511由A突變為T，以去除DM20變體中指導PIRP-M蛋白合成的第一個 符合讀框的內部AUG起始密碼子，以防止發生這樣的合成；和2)核苷酸598由A突變為T，以去除DM20變體中指導PIRP-L蛋白合成的第二個 符合讀框的內部AUG起始密碼子，以防止發生這樣的合成。與此類似，向來自PLP變體cDNA的TR元件中引入了如下突變1)核苷酸616由A突變為T，以去除PLP變體中指導PIRP-M蛋白合成的第一個符 合讀框的內部AUG起始密碼子，以防止發生這樣的合成；和2)核苷酸703由A突變為T，以去除PLP變體中指導PIRP-L蛋白合成的第二個符 合讀框的內部AUG起始密碼子，以防止發生這樣的合成。
本技術的TR盒在諸如離體或體內檢測細胞死亡；體內或離體確定化合物的細胞 毒性；體內診斷；體內或離體誘導細胞凋亡；體內或離體預防細胞凋亡；以及將細胞應激和 /或死亡成像與隨後的治療相組合等方法中有許多用途。另外，本技術詳細說明了篩選其他 TR盒[即在應激和/或垂死細胞中選擇性表達的IRES元件]的方法。表汰盒本技術一方面涉及在哺乳動物細胞中可表達的核酸表達盒。所述表達盒以5』至 3』方向含有如下元件至少一種轉錄效應序列；編碼在應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯 的mRNA分子的TR元件；有效連接於TR元件的核苷酸序列；和多聚腺苷酸化序列。所述核 苷酸序列為第一可讀框(0RF)序列，編碼多肽或其片段，並與TR元件共翻譯。在多個實施方案中，本技術的TR元件在應激和/或垂死細胞中呈現選擇性翻譯。 術語在應激和/或垂死細胞中「選擇性地翻譯」或「選擇性翻譯」表示在翻譯活性高峰期、 例如在用誘導細胞應激和/或死亡的急性毒性劑(acute toxic agent)處理後約9至約18 小時之內，在超過95%的用TR表達盒轉化的任何細胞系中觀察到mRNA翻譯活性，並且本發 明表達盒第一 0RF的翻譯水平升至在用急性毒性劑處理後相同0RF從缺乏有效連接的TR 元件的相同表達盒轉錄和翻譯時表達水平的至少50%。例如，本技術表達盒中的TR元件在 應激和/或垂死細胞中在用5 P M濃度的鈣離子載體A23187處理後約9小時之內呈現出選 擇性翻譯，其中在超過95%的用該表達盒轉化的HEK293細胞系中觀察到mRNA翻譯，並且該 表達盒第一 0RF的翻譯水平是處理後相同0RF從缺乏有效連接的TR元件的相同表達盒轉 錄和翻譯時翻譯水平的至少50%。在一些情況下，本技術表達盒中的TR元件在應激和/或 垂死細胞中在用5 P M濃度的鈣離子載體A23187處理後約6至約9小時之內呈現出選擇性 翻譯，其中在約96%、97%、98%、99%、99. 5%或99. 9%的用該表達盒轉化的HEK293細胞 系中觀察到mRNA翻譯，並且該表達盒第一 0RF的翻譯水平是處理後相同0RF從缺乏有效連 接的TR元件的相同表達盒轉錄和翻譯時翻譯水平的約55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%或 95%。在本發明的一些實施方案中，TR元件是plpIRES元件，其並不指導PIRP-M或 PIRP-L的翻譯。在其他實施方案中，TR元件並不源自plpIRES。因而，在一個實施方案中，本技術涉及在哺乳動物細胞中可表達的核酸表達盒，其 中所述表達盒以5』至3』方向含有如下元件至少一種轉錄效應序列；編碼在應激和/或 垂死細胞中翻譯的mRNA分子的TR元件；側接TR元件、含有本領域常見限制性酶位點的3』 序列；有效連接於TR元件的核苷酸序列，其為第一可讀框(0RF)序列，編碼多肽或其片段， 並與TR元件共翻譯；和多聚腺苷酸化序列。在優選的實施方案中，TR元件選自人或小鼠TR元件。更優選TR元件選自鼠序列 TR^ (SEQ ID NO 1)禾口 TRplp(SEQ ID NO :2)。11^核酸序列(SEQ ID N0:1)源自小鼠蛋白脂質蛋白基因1的DM20剪接變體 cDNA，但是已經在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、511和598進行了修飾。另外，還去 除了編碼終止密碼子的最後3個核苷酸。TRplp核酸序列(SEQ ID NO 2)源自小鼠蛋白脂質蛋白基因1的PLP剪接變體 cDNA，並且其含有核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、616和703處的修飾。TRplp因存在 核苷酸349-453而有別於TRdm。去除了編碼終止密碼子的最後3個核苷酸。
除TR元件外，本技術的表達盒還包含調控基因表達的上遊轉錄效應序列。在一個 實施方案中，轉錄效應序列是哺乳動物啟動子。另外，轉錄效應子還可包括其他啟動子序列 和/或轉錄調控子，例如增強子和沉默子或其組合。這些轉錄效應序列可包括已知與調控 任何有效連接編碼序列轉錄的細胞組分結合的部分。例如，增強子或沉默子序列可包括結 合已知細胞組分如轉錄調控蛋白質的序列。轉錄效應序列可選自任何適宜的核酸，例如基 因組DNA、質粒DNA、病毒DNA、mRNA或cDNA，或任何適宜的生物(例如，病毒、細菌、酵母、真 菌、植物、昆蟲或哺乳動物)。基於所利用的轉錄和/或翻譯系統選擇適當的轉錄效應序列 落在本領域技術範疇之內。可將任何個體調控序列以野生型排列(如同天然基因組次序存 在)或人工排列安排在轉錄效應元件之中。例如，修飾的增強子或啟動子序列可以包括調 控序列的重複單位，從而通過這些變化修飾載體的轉錄活性。在一個實施方案中，啟動子選自組成型、誘導型、組織特異性、腫瘤特異性和反應 基因啟動子。組成型啟動子可選自例如勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重複(LTR)啟動子、巨 細胞病毒即時早期基因(CMV)啟動子、猿猴病毒40早期(SV40E)啟動子、胞質肌動蛋 白啟動子、腺病毒主要晚期啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在優選的實施方案中，組 成型啟動子是CMV啟動子。在另一優選的實施方案中，組成型啟動子是SV40E啟動子。選擇響應特定的生理或合成信號調控的啟動子能夠允許基因產物的誘導型轉錄。 例如，在轉基因的表達對於生產載體的細胞有毒性的情況下，可能期望防止或減小轉基因 的轉錄。作為舉例，凋亡前轉基因可對於生產之的細胞有毒性。因而，若干誘導型啟動子系 統可用來生產含有編碼毒性蛋白質的轉基因的載體。誘導型啟動子的非限制性實例包括金屬調控的人金屬硫蛋白(hMT-IIA)啟動子、 鋅誘導型人鋅轉運蛋白l(hZnT-l)啟動子、地塞米松(Dex)誘導型啟動子、小鼠乳瘤病毒
(MMTV)啟動子、蛻皮素反應昆蟲啟動子、四環素反應Tet-Oi^^TefOff 系統、冊486
誘導型啟動子和雷帕黴素反應啟動子。在一個實施方案中，誘導型啟動子是金屬硫蛋白 hMT-IIA啟動子。在另一個實施方案中，誘導型啟動子是鋅誘導型hZnT-1啟動子。提供了在哺乳動物宿主細胞中控制誘導基因表達的方法和組合物。例如，通過升 高重金屬離子及糖皮質激素的濃度來誘導包含人金屬硫蛋白(hMT-IIA)及鋅誘導型人鋅 轉運蛋白l(hZnT-l)轉錄調控系統的DNA序列。這些誘導型啟動子由鄰近於本底水平轉錄 調控子的多個金屬調控元件(例如，MRE)組成。在其他情形下，可能期望利用響應激素或抗生素的啟動子來激活轉錄。蛻皮素系 統(Invitrogen，Carlsbad, Calif.)由緊密調控的表達機制構成，其防止本底水平的轉基 因表達，但是允許超過200倍的轉錄誘導。該系統基於果蠅(Drosophila)的雜二聚體蛻皮 素受體，並且當蛻皮素或其類似物(例如幕黎留酮A)與受體結合時，該受體激活啟動子以 開啟下遊轉基因的表達。在此系統中，雜二聚體受體的兩個單體皆由一個載體組成型地表 達，而驅動轉基因表達的蛻皮素反應啟動子位於第二質粒上。因而，將含有受調控轉基因及 受體單體的兩個質粒共轉染至報告細胞允許甚至是毒性轉基因的誘導型表達。Tet-Off 或Tet-On 系統(Clontech，Palo Alto, Calif.)最初由 Gossen 和 Bujard(Gossen和Bujard，1992 ；Gossen等人，1995)開發，利用四環素或四環素衍生物如多 西環素來調控轉基因表達。在Tet-Gn 系統中，通過四環素或多西環素誘導基因表達，而在Tet-Off系統中，抗生素暴露則消除基因表達。這些系統基於源自大腸桿菌(E.coli) 四環素抗性操縱子的兩個調控元件，即四環素操縱子DNA序列和四環素阻遏蛋白。Tet調 控質粒含有帶四環素反應操縱子元件的最小啟動子。第二質粒含有四環素控制的轉錄激活 蛋白，其為融合蛋白，由VP16轉錄激活結構域和Tet-Off系統的野生型四環素阻遏蛋白組 成。在Tet-On 系統中，四環素阻遏蛋白已被改變，從而因存在四環素或多西環素而激活 轉錄。組織特異性啟動子可選自例如轉鐵蛋白(TF)、酪氨酸酶(TYR)、白蛋白(ALB)、肌 肉肌酸激酶(CKM)、髓鞘鹼性蛋白(MBP)、膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)、神經元特異性 烯醇化酶(NSE)和突觸蛋白I(SYN1)啟動子。在一個實施方案中，組織特異性啟動子是突 觸蛋白I(SYm)啟動子。在另一個實施方案中，組織特異性啟動子是ALB啟動子。腫瘤特異性啟動子包括但不限於血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(即KDR、 E-選擇蛋白或內皮糖蛋白(endoglin))、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、erbB2 (V-erb_b2 成紅血細胞白血病病毒癌基因同源物2)、骨鈣蛋白(骨羧基穀氨酸蛋白，BGLAP)、 SLP1 (分泌性白細胞蛋白酶抑制因子或抗白細胞蛋白酶1)、低氧反應元件(HRE)、L-絲束蛋 白(plastin)(淋巴細胞胞質蛋白1)和已糖激酶II(HK2)的啟動子。在一個實施方案中， 腫瘤特異性啟動子是甲胎蛋白(AFP)啟動子。在另一個實施方案中，腫瘤特異性啟動子是 SLP1啟動子。反應基因啟動子優先或獨特地在某些細胞狀態下和/或響應外部化學或環境刺 激(即熱擊或冷擊)而刺激轉錄，其可選自例如早期生長反應基因1 (EGR1/ZIF268)、組織型 血纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)、多藥耐性蛋白l(mdr-l)、HSPA5/Grp78/BIP(70kDa熱 擊蛋白5) ,c-fos(v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物)、c-jun(V-jun肉瘤病毒17癌基 因同源物)的啟動子，或選自細胞周期調控基因，例如但不限於E2F-1 (E2F轉錄因子1)、細 胞周期蛋白Al(CCNAl)和CDC25C(細胞分裂周期25C)。在優選的實施方案中，反應基因啟 動子是HSPA5的啟動子。在另一優選的實施方案中，反應基因啟動子是EGR1啟動子。在一些實施方案中，分離特定的轉錄效應元件，然後有效連接於最小啟動子，以產 生其轉錄活性依賴於單一或有限類型細胞反應(例如，熱擊反應或金屬調控元件)的表達
品.o表達盒可包括物種特異性轉錄調控序列。此類DNA調控序列可基於將要向其中插 入表達盒的細胞類型來選擇，並且可分離自原核或真核細胞，包括但不限於細菌、酵母、植 物、昆蟲、哺乳動物細胞或分離自病毒。在這樣的實例中，將選擇哺乳動物啟動子以在哺乳 動物細胞中表達所選的核酸。本技術的TR表達盒能夠在應激和垂死細胞中進行選擇性基因表達，允許異源0RF 插入在TR序列3』的和多聚腺苷酸化信號的5』。異源基因可為目的基因的全長基因組序列 (例如包括內含子)、合成核酸或cDNA拷貝，其編碼目的蛋白質或多肽，其中多肽包括生物 學活性的(「生物活性」)蛋白質片段。在優選的實施方案中，出於本技術的目的使用cDNA 序列，這是因為通過去除mRNA剪接位點而提供的基因組複雜度減小。因而，在一個實施方案中，第一 0RF序列選自報告基因、細胞毒性腫瘤抑制基因、 毒素基因、前藥激活基因和凋亡前基因。在多個實施方案中，第一 0RF序列是報告基因。如其名稱所暗示的那樣，報告基因並不對其中引入之的細胞賦予任何選擇優勢。相反，報告基因編碼的產物賦予細胞可檢 測的生物化學或視覺可見(例如螢光)表型。報告多肽還可包括融合或雜合多肽，其中另 一多肽融合於多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽通過對編碼一種多肽的核酸 序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)進行符合讀框的克隆而產 生。產生融合多肽的技術在本領域已知，並且包括連接編碼多肽的編碼序列，從而使之符合 讀框，且融合多肽的翻譯處於TR盒的控制之下。例如，對pip 0RF與增強型綠色螢光蛋白 (EGFP) 0RF進行符合讀框的克隆產生了融合蛋白，用來監測該融合蛋白在培養細胞中的表 達、亞細胞定位和生物學效應(Ghandour S等人Glia (2002) 40 (3) 300-11 ；Boucher S等人 J Neurosci(2002)22(5) 1772—83)。—類常用的報告基因編碼酶或其他生物化學標記，當其在哺乳動物細胞中表達 時，造成細胞或細胞環境中可見的變化。此類變化可直接觀察，可包括添加轉變成可檢測 產物的適當底物，或添加和結合代謝示蹤物。這些報告基因的實例有編碼半乳糖甘酶
-gal)的細菌lacZ基因、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、螢火蟲螢光素酶(鞘翅目甲蟲)、 花蟲(Renilla)螢光素酶(海腎)、單純皰疹1胸苷激酶(HSV1-TK)以及突變的單純皰疹1 胸苷激酶(HSVl-sr39tk)基因。在0-gal的情況下，表達細胞與滷素衍生的半乳糖一起孵 育，產生能夠通過組織化學或螢光測定法檢測和定量的有色或螢光產物。在CAT的情況下， 細胞裂解物與放射性標記的氯黴素或其他乙醯基供體分子如乙醯輔酶A —起孵育，並通過 色譜法測定乙醯化的氯黴素產物。其他有用的報告基因編碼自然發螢光的蛋白質，包括綠 色螢光蛋白(GFP)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP)或單體紅色螢光蛋白(mRFPl)。如可從上文看到的那樣，例示性的報告基因可選自GFP、EYFP、mRFPl、^-Gal 和CAT，但是可使用任何本領域已知的其他報告基因。參見例如http World Wide ffebolympusconfocal. com/appli cat ions/fpcolorpalette. html 網址。在優選的實施方案 中，報告基因是螢火蟲螢光素酶。在另一優選的實施方案中，報告基因是花蟲螢光素酶。第一 0RF序列也可編碼細胞毒性腫瘤抑制基因，該基因編碼能夠抑制腫瘤表型和 /或誘導凋亡的多肽。用於實施本技術的腫瘤抑制基因的實例包括P53、腺瘤性結腸息肉 (APC)、乳腺癌-1 (BRCA-1)、BRCA-2、腎胚細胞瘤(WT-1)、成視網膜細胞瘤基因(Rb)、神經纖 維瘤病-1 (NF-1)、NF-2和vonHippel-LindaiKVHL)基因。在優選的實施方案中，細胞毒性 腫瘤抑制基因是P53基因。在另一實施方案中，第一 0RF序列編碼「毒素基因」，其與細胞受體蛋白質結合，並 且在攝入後通過阻斷核糖體組裝或功能而幹擾蛋白質合成。毒素基因的實例包括蛋白質如 假單胞菌外毒素(例如，外毒素A或「ETA」)、蓖麻毒蛋白毒素、白喉毒素等等。在優選的實 施方案中，毒素基因是白喉毒素基因。在另一實施方案中，第一 0RF序列是前藥激活基因(例如，藥物敏感性或自殺基 因)，其編碼將缺乏治療效應的前藥轉化成藥物的蛋白質，所述藥物使表達所述基因的細胞 在接觸所述前藥後易於死亡。前藥基因的實例包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、細胞 色素P450、人脫氧胞苷激酶和細菌酶胞嘧啶脫氨酶和鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)基因。 表達這些基因的細胞變成對前藥更昔洛韋(HSV-tk)、環磷醯胺(細胞色素P450)、阿糖胞苷 (脫氧胞苷激酶)、5_氟胞嘧啶(細菌cytosonine脫氨酶)或硫代黃嘌呤(gpt)敏感。在 優選的實施方案中，前藥激活基因是HSV-tk基因，其還能夠提供重要的治療優勢。在TK催化抗病毒鳥苷類似物更昔洛韋期間，釋放凋亡分子，通過稱為「旁觀者」殺傷的過程殺死周 圍的細胞。雖然有限數目的靶細胞可以最初表達HSV-tk基因，但這種局部的殺細胞效應提 供了對於鄰近非表達的不期望旁觀者細胞的治療效應。在第一 0RF序列是凋亡前基因的實施方案中，這樣的序列導致表達細胞的程序性 細胞死亡或凋亡。凋亡前基因的實例包括P53、p53的凋亡刺激蛋白質(例如ASPP1、ASPP2 和ASPP3)、Bcl-2同源物Bax和Bcl2-L_10 (Diva)、凋亡誘導因子(AIF)、Fas、起始胱天蛋白 酶例如胱天蛋白酶_8和胱天蛋白酶_9，或效應胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶-3。在優選的 實施方案中，凋亡前基因是胱天蛋白酶_3基因。在另一實施方案中，第一 0RF序列編碼包含Fab或單鏈Fv(SCFv)分子的重組細 胞內抗體(「胞內抗體」)，但是不編碼有效的分泌序列，因此被限制在其結合的細胞內區室 中，中和或修飾靶抗原的活性。這種相互作用可以導致直接抑制靶抗原功能、恢復突變缺陷 活性、幹擾抗原的細胞內運輸或限制病理突變蛋白質的摺疊。為發揮其功能，重組胞內抗體 被定向於抗原所在的亞細胞區室。這可通過摻入通常融合在N-或C-末端的信號序列而實 現。例如，KDEL肽序列允許重組抗體滯留在內質網內，因此能夠用來阻斷細胞表面靶向蛋 白質的加工。其他信號序列可摻入在胞內抗體0RF中，以產生細胞核定位、ER或高爾基體 路徑、核仁定位、以及轉運至內體或脂質體區室中。產生單鏈抗體的方法為本領域技術人員公知。作為舉例，有關此類方法，請技術人 員參閱美國專利No. 5，359，046。單鏈抗體("scFv〃或〃 SCA")由通過設計的肽接在一 起的抗體可變輕鏈胺基酸序列(VL)和可變重鏈序列(VH)的組成，所述肽將VL序列的羧基 末端連接於VH序列的胺基酸末端，由此在單個分子上重構抗原結合位點。SCA具有單克隆 抗體的結合特異性和親和力，並且其天然形式為單克隆抗體大小的約1/5至1/6。除了這些 益處之外，全人胞內抗體還能夠直接由人文庫(例如人單重(single-fold)、單鏈可變片段 (scFv)文庫)分離，而無需昂貴耗時的「人源化」過程。幾乎任何類型的生物分子皆能夠作為胞內抗體靶抗原，例如中間代謝物、糖、脂質 和激素以及大分子如複合糖、磷脂、核酸和蛋白質。優選的靶分子是內源蛋白質。已經開 發了參與癌症、傳染病、移植、神經變性疾病(neurodegenerative disease)以及其他與蛋 白質過表達或誘變相關的疾病的許多靶蛋白質的胞內抗體。胞內抗體靶蛋白質的具體實例 包括erbB-2 (雄激素受體)、IL_2受體、表皮生長因子受體、血管內皮生長因子受體2、葉酸 受體、HIV gpl20蛋白、CCR5、CXCR4、a V整聯蛋白、金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9、NF-k B的 RelA亞基、朊病毒樣蛋白質PrP、himtingtin蛋白和澱粉樣前體蛋白。在一個實施方 案中，胞內抗體針對NF-kB的RelA亞基。在第一 0RF編碼分泌抗體融合蛋白的實施方案中，此類蛋白能夠在靶細胞中誘 導凋亡或增強的免疫反應。實例包括產生治療反應的任何抗體融合蛋白，例如人白介 素-2-截短的白喉毒素、抗CD22dsFv-截短的假單胞菌外毒素、抗CD25scFv-截短的假單胞 菌外毒素和抗B4-阻斷的蓖麻毒蛋白(抗CD19)免疫毒素蛋白。在一個優選的實施方案中， 抗體融合蛋白是抗B4-阻斷的蓖麻毒蛋白免疫毒素蛋白。序列變體在某些情況下，有效連接於TR序列的序列元件可能破壞TR表達盒所展示的選擇 性翻譯活性，或者呈現亞佳翻譯活性。為減輕連接的0RF對TR活性的任何影響，本技術提供了所公開核苷酸序列的密碼子使用變體，其採用不改變ORF產物多肽序列(從而不影響生 物活性)的可選密碼子。這些變體基於遺傳密碼的簡併性，藉此若干胺基酸由不止一種密 碼子三聯體編碼。實例可以是密碼子CGT、CGG、CGC和CGA，他們均編碼胺基酸精氨酸(R)。 因而，蛋白質可由變體核酸序列編碼，其在精確序列上有所不同，但仍然編碼具有完全相同 胺基酸序列的多肽。基於密碼子利用/偏好，可選擇密碼子以優化ORF的翻譯效率，而不影 響TR表達盒的調控翻譯。定點誘變是一種通過在多個期望位置之一改變核苷酸序列而產生序列變體的尤 其有用的方法。定點(或位點特異性)誘變應用包含具有期望突變的DNA序列的寡核苷酸 序列，以及 足夠數目的鄰近核苷酸，以提供具有足夠大小和複雜度的序列，以在建議突變兩 側均形成穩定的雙鏈體。一般，優選長度約20至25個核苷酸的合成引物，其中序列建議突 變兩側的約5至10個殘基均被改變。用於定點誘變的典型載體包括所公開的載體以及任 何商業或學術上可得的質粒載體。一般而言，通過使適當的DNA寡核苷酸序列與靶DNA退 火，並通過本領域已知的PCR方法擴增靶序列而引入核苷酸取代。本技術考慮在編碼序列 中應用所有可能的密碼子，以產生用於根據本發明應用的期望的ORF序列。定向進化技術可用來製備具有改進的TR功能的序列變體。在定向進化技術中，可 從含TR的多核苷酸起始，進行至少一輪核酸突變或核酸剪接或同源重組。可按定向或隨機 的方式進行突變、剪接和同源重組。例如，可如上文所述設計一種或多種寡核苷酸進行TR 元件的定點誘變，或者可用一種或多種隨機生成的寡核苷酸與含TR的初始多核苷酸模板 進行接觸。可選地或另外地，可在誤差容許條件和/或易錯聚合酶下進行初始模板的PCR 擴增，以允許引入突變，這是一種稱為「鬆散(sloppy) 」 PCR的技術。與此類似，一組含TR元件的同源多核苷酸可按定向或隨機的方式進行剪接或重 組。例如，可利用一種或多種限制性核酸內切酶隨機地或以預定的方式來消化同源多核苷 酸模板，然後可將所得的片段連接在一起。可選地或另外地，可匯集該組含TR元件的多核 苷酸，並在有利於他們之間同源重組的條件下進行體外或細胞中(in cyto)處理。可採用 突變與剪接或重組技術的組合。任何這些方法皆可進行一輪或一輪以上。在一輪或多輪突變、剪接和/或重組之後，隨之檢驗所得的多核苷酸以篩選其TR 活性。一般，這可通過將報告分子編碼序列置於一種或多種已產生的TR變體的有效控制之 下而進行。然後在置於能夠發生TR翻譯的條件例如應激條件下的細胞中表達所得的構建 體。該檢驗能夠用來檢測TR元件功能方面期望的改進。例如，TR元件翻譯對應激條件的 特異性、TR元件激活對細胞應激反應的敏感性(例如，細胞應激和/或死亡前的生物化學 變化)、或經TR元件激活後翻譯起始的效率(即量度(magnitude))方面的任一改進均可成 為測定的焦點。基於測定結果，可選擇一種或多種改進的TR元件進行應用或進一步的開發；在一 些實施方案中，所選擇的改進的TR元件核酸可用作為起始多核苷酸或用作為起始多核苷 酸組，進行另一輪、或一連串輪的定向進化。在本文的多個實施方案中，TR元件可包含這樣的PLP/DM20多核苷酸或通過突變 之來製備，所述PLP/DM20多核苷酸包含圖15鼠或人PLP/DM20 DNA序列鹼基約27至約 615/510或與之對應的鹼基；且這還可包含鹼基約616/511至約702/597、鹼基約703/598 至約772/666、和/或鹼基約773/667至約810/705或與之對應的鹼基。例如，TR元件可包含這樣的PLP/DM20多核苷酸或通過突變之來製備，所述PLP/DM20多核苷酸包含參照圖15編號的鹼基約27至約810/705或與之對應的鹼基，其中刪除或未刪除鹼基約616/511至約 702/597。在PLP/DM20編碼序列及其或由之構建的TR元件中，可在對應於如下參照圖15所 述的PLP/DM20位置中的一個或多個位置上進行突變而對TR元件功能沒有不利影響，即位 置:01、02、03、04 至 21 (包括缺失全部或部分此區段)、25、26、314、332、560/455、614/509、 622/518至696/591 (包括缺失全部或部分此區段，這去除了外顯子5)、616/511、703/598、 806/701、811/706、817/712、818/713和827/722。在多個實施方案中，除前述之外的其他核 鹼基(nucleobase)可保留在PLP/DM20編碼序列中。例如，在多個實施方案中，此PLP/DM20編碼序列的核鹼基序列可在對應於PLP核 苷酸位置 41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、251-257 和 563-570 的核苷酸 位置上包含多聚嘧啶基序。在一些實施方案中，這樣的序列還可在一個或多個PLP位置 270-274、299-303、490-494、578-582、597-601上包含多聚嘧啶基序；而在一些實施方案 中，還在一個或多個 PLP 位置 626-632、642-648、669-674、707-712、755-761、767-771 和 800-804上包含。與此類似，在多個實施方案中，此PLP/DM20編碼序列的核鹼基序列可在對應於 PLP 核苷酸位置130-133、142-145、190-193、220-223、305-308 的核苷酸位置上包含 GNRA 基序；而在一些實施方案中，還在635-638上包含；而在其他實施方案中，還在一個或多個 位置329-332、343-346和572-575上包含；而在一些實施方案中，又還在一個或多個位置 650-653 和 683-686 上包含。然而，如所提及的那樣，可採取如下位置的突變而沒有不利影響，且在一些情況 下具有增強的效應01、04、06、07、08、17、18、21、27。在一些實施方案中，這些突變可為 01t、04a、06t、07g、08a、17a、18g、21a和27t中一個或多個。可進行突變而對功能沒有不 利影響的其他位置包括一個或多個PLP位置25、26、314、332、560/455、616/511、703/598、 806/701、811/706、817/712、818/713和827/722上的突變。在一些實施方案中，這些可以 是 25g、26c、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、811/706t、817/712a、 818/713a和827/722g中的一個或多個。另外，可在PLP位置614/509上進行插入，例如插 入多達或約5個核苷酸，而對功能沒有不利影響。另外，報告或其他靶基因編碼序列與位置 831/726的融合，例如與之符合讀框的融合，對TR元件功能並不呈現出任何不利影響。在多個實施方案中，可用於本文的PLP或DM20序列可為脊椎動物序列；在一些 實施方案中，這可為人、靈長類動物、嚙齒類動物、馬科動物(equine)、牛科動物(bovine)、 羊(ovine)、豬科動物(porcine)、犬科動物(canine)、貓科動物(feline)、兔科動物 (Iapine)、有袋動物、鳥類、魚類、兩棲動物或爬行動物序列。在多個實施方案中，脊椎動物 序列可為野生型或變體天然序列；在一些實施方案中，脊椎動物序列可為野生型序列。如本文所用，就PLP/DM20序列而言，「脊椎動物共有序列」是指DNA序列1 atgggyykgy wdgakkgytg yrynmgmtgy mtbrtwgggg ymccmttygc ytchbtsrtb61 gccacwgkvy tvtgyttyky tggrgtsgcv ctvttctgyg gmtgyggrca ygargchytv121 asygghacmg armagytvat ygagacmtay ttytccaara aytaccaaga mtaygartay181 ctcatyvayg tsatymaygc yttycagtay gtcatctatg gaaywgccwy yttcttctty
241 cthtwyggrr ycctvctkyt ggcygarggm ttctacacca cmrsygchrt cargcavatc301 ythggsgast wcmrrmccmc mryywkmrrs rrkggsctga kykcwacrgt racwggrggm361 cmkaarggga grrghdcsmg rggmmvvcak cvagyycayw cywtrsagck srtstgtcrb 421 tgyttgggaa artggctmgg acayccygay aagtttgtsg gyrtyacyta tryyhtsacy481 rtyktvtggm tmctrrystt ygcctgctcd gcygtdccyg tvtacatyta yttyaayacc541 tggrycacyt gycagtctat ygcckyccch rssaagacyw cwrccagyrt mrgyasbcts601 tgykcdgayg symgvatgta yggtgtycts ccmtggaayg cbttycchgg saargtktgy661 ggswccarcc tkctbkccat ctgcaaracm rsygagttcc aratgacntt ycayctbttt721 atygckgcvt tygtgggkgc wgcngchacw ctdgtbkcmc tgctcacytw yatgrthgsy781 gcmwcwtwca actwygcygt sctbmrastb aykggccgrr gcwcmaagtt ytga及其DNA互補物、對應於任何前述的RNA序列、具有對應於任何這些的核鹼基序列 的核酸類似物、以及由其編碼的胺基酸序列。如本文所用，就PLP/DM20胺基酸和核苷酸序列而言，「脊椎動物特異性序列」是 指圖14所列物種的PLP或DM20序列，即智人(Homo sapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus) (猩猩)、黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩猩)、恆河猴(Macaca mulatta)(恆河猴)、
矣(Macaca. fascicularis) ((crab-eating macaque)) > (Sus scrofa)
(豬)、小家鼠(Mus musculus)(小鼠)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)、灰色短尾 負鼠(Monodelphis domestica)(負鼠)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)、歐洲牛 (Bos taurus)(牛)、家犬(Canisfamiliaris)(狗)、原雞(Gallus galIus)(雞)、斑胸草 雀(Taeniopygia guttata)(珍珠鳥(zebra finch))、多疣壁虎(Gekko japonicus)(壁虎 (gecko lizard))、光滑爪蟾(Xenopus laevis)(娃)禾口矛尾魚(Latimeria chalumnae) (空棘魚(coelacanth))。在一些實施方案中，脊椎動物特異性序列可包含或編碼具有 如下Genbank號的任一胺基酸序列P60201 (人)、Q5R6E6(猩猩)、XP_001140782 (黑猩 猩)、XP_001088537 (恆河猴)、Q8HXW7 (食蟹獼猴)、NP_999139 (豬)、NP_035253 (小鼠)、 NP_112252 (大鼠)、ΧΡ_001374483 (負鼠)、P47789 (兔)、CAA08909 (牛)、39025 (狗)、 CAA43839 (雞)、P47790 (珍珠鳥)、AAW79Ol5 (壁虎)、CAA79582 (蛙)或 BAA^2O7 (空棘 魚)。本領域普通技術人員通過在 http World Wide Webncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez網址的Nucleotide菜單中搜索NCBI Genbank可容易地獲得編碼這些的DNA 序列。例如，有用的DNA序列包括如下Genbank登錄號所列的那些AJ006976 (人)、 CR860432(猩猩)、XM_001140782 (黑猩猩)、ΧΜ_001088537 (恆河猴)、AB083324(食蟹獼 猴)、NM_213974 (豬)、NM_011123 (小鼠)、NM_030990 (大鼠)、ΧΜ_001374446 (負鼠)、 NM_001082328 (兔)、AJ009913 (牛)、X55317 (狗)、X6I66I (雞)、NM_001076703 (殘基 113-946，珍珠鳥)、AY880400 (壁虎)、Z19522 (蛙)禾口 AB025938 (空棘魚)。在多個實施方案中，可用於本文的PLP或DM20序列可為哺乳動物序列；在一些實 施方案中，這可為人、靈長類動物、嚙齒類動物、馬科動物(equine)、牛科動物(bovine)、羊 (ovine)、豬科動物(porcine)、犬科動物(canine)、貓科動物(feline)、兔科動物(Iapine) 或有袋動物序列。如本文所用，就PLP/DM20序列而言，「哺乳動物共有序列」是指DNA序列
1 atgggcytgt tagagtgytg ygcnagatgy ctsgtagggg ccccctttgc ttccytggtg61 gccactggat trtgtttctt tggrgtggca ctsttctgtg gmtgtggaca tgaagchytm121 actggyacag aaaagytaat tgagacmtat ttctccaaaa aytaccaaga ctaygagtat181 ctcatyaatg tgatycatgc yttccagtat gtcatctatg gaactgcctc tttcttcttc241 ctttatgggg ccctcctgct ggcygagggc ttctacacca ccggygcwgt caggcagatc301 tttggcgact acaagaccac catctgcggs aagggcctga gygcaacggt aacagggggc361 cagaagggga ggggttccag aggccaacat caagctcatt ctttggagcg ggtgtgtcat 421 tgtttgggaa aatggctagg acatcccgac aagtttgtgg gcatcaccta tgccytgacy481 gttgtrtggc tcctrgtgtt tgcctgctck gctgtrcctg tgtacattta yttcaayacc541 tggaccacyt gycagtctat tgcckycccy agcaagacyt ctgccagyat aggcastctc601 tgygctgatg ccagaatgta tggtgttctc ccatggaatg ctttyccwgg caargtktgt661 ggctccaacc ttctgtccat ctgcaaaaca gctgagttcc aaatgacstt ccayctgttt721 attgctgcvt tygtgggkgc tgcrgcyaca ctrgtktccc tgctcacctt catgattgct781 gccacttaca acttygccgt cctkaaactc atgggccgag gcaccaagtt ctga及其DNA互補物、對應於任何前述的RNA序列、具有任何這些的核鹼基序列的核酸 類似物、以及由其編碼的胺基酸序列。如本文所用，就PLP/DM20胺基酸和核苷酸序列而言，「哺乳動物特異性序列」 是指圖14所列哺乳動物物種的PLP或DM20序列，即智人(Homosapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus)(猩猩)、黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩猩)、恆河猴(Macaca mulatta)(恆 可 f矣)、 猴(Macaca fascicularis) ( * — f矣(crab-eating macaque))、(Sus scrofa)(豬)、小家鼠(Mus musculus)(小鼠)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)、灰色 短尾負鼠(Monodelphis domestica)(負鼠)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)、歐洲牛 (Bos taurus)(牛)或家犬(Canisfamiliaris)(狗)。在一些實施方案中，哺乳動物特異性 序列可包含或編碼具有如下Genbank號的任一胺基酸序列P60201 (人)、Q5R6E6 (猩猩)、 XP_001140782 (黑猩猩)、XP_001088537 (恆河猴)、Q8HXW7 (食蟹獼猴)、NP_999139 (豬)、 NP_035253(小鼠)、NP_112252(大鼠)、XP_001374483(負鼠)、P47789(兔)、CAA08909(牛) 或39025 (狗)。包含此類TR多核苷酸的TR元件如同包含那些TR元件的表達盒一樣可用 於本文。在多個實施方案中，TR元件可具有與圖15PLP序列或圖15DM20序列分別至少 62%同一性的PLP或DM20核苷酸序列。與之的序列同一性可為至少或約65%、70%、75%、 80%、85%、90%或95%。在一些實施方案中，序列可與之97%、98%、99%或更高同一性。 此類不完全相同的序列將保留PLP或DM20TR元件的有效特徵，即所定義的多嘧啶片、GNRA 基序及其19S rRNA結合位點。在多個實施方案中，此TR元件可用來鑑定誘導、增強或抑制細胞應激反應，例如 對熱應激、冷應激、氧化應激、緊張應激、中毒或其組合的反應的活性劑(agent)。細胞應激 反應可包括凋亡和/或壞死。在一些實施方案中，鑑定此類活性劑的方法可包括鑑定活性 劑誘導、增強、抑制或逆轉細胞應激反應的程度；這可例如通過鑑定與由在TR元件控制下 表達的報告分子所檢測的信號量級成比例的細胞應激反應程度來實現。在多個實施方案中，此TR元件可用於預防性、治療性或姑息性治療需要細胞應激反應防護的受試人的方法。在這樣的實施方案中，所述TR元件為構建體的一部分，其中TR 元件與包含編碼提供細胞應激反應防護的表達產物的編碼序列的多核苷酸有效相連，且所 述治療包括給藥包含此類構建體的組合物。由此提供的防護可為例如隔離或降解毒性劑 (toxifying agent)、穩定細胞中的生物分子、催化形成防護劑、或促使由不同編碼序列表 達防護劑的活性。雙順反子TR表汰念如上面章節所述的表達盒稱為單順反子盒，因為僅存在單個作為TR轉錄物的ORF序列。除單順反子盒之外，本技術還考慮應用雙順反子TR表達盒，其包括兩個ORF序列。從而，在本技術的一個實施方案中，雙順反子TR表達盒包括位於TR序列5』的第 二 ORF序列，除了上文所述的單順反子TR表達盒的相同元件之外，其中第二 ORF序列與TR 元件並不有效連接。因而，本領域技術人員將會容易地意識到，雖然第二 ORF序列與TR序 列和第一 ORF在單個mRNA物質中一起轉錄，但是其獨立於TR元件和第一 ORF序列藉助於 帽子依賴性機制翻譯。當人們希望觀察任何活性劑或分子對帽子依賴性或帽子非依賴性翻 譯的不同影響時，第二 ORF序列具有實用性。例如，毒性劑將誘導帽子依賴性向帽子非依賴 性翻譯轉變。在第二 ORF序列是報告基因的情況下，報告基因活性喪失提供了對帽子依賴 性向帽子非依賴性翻譯轉變的時間和定量衡量。因此，許多實施方案包括雙順反子表達盒， 其中第一 ORF序列是報告基因、細胞毒性腫瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因、抗體、衍生 抗體或凋亡前基因，而第二 ORF序列是報告基因。可選地，雙順反子TR表達盒可包括為報 告基因的第一 ORF序列，和選自細胞毒性腫瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因、單鏈抗體 或凋亡前基因的第二 ORF序列。在此實施方案中，第二 ORF提供推定毒性基因產物的翻譯， 其刺激由帽子依賴性向帽子非依賴性翻譯轉變，這可隨後通過由TR調控的第一 OFR翻譯所 產生的報告基因活性來衡量。本領域技術人員能夠容易地製備任何這些組合。例示性的單 順反子和雙順反子盒示於表1-4。另外，SEQ ID N0:3_4及SEQ ID NO :5_6分別描述了單順反子和雙順反子TR表達 盒具體實例的核酸序列。TRdm單順反子盒(PCMV-TTdm-Luc) (SEQ ID NO 3)含有有效連接於螢火蟲螢光素酶 編碼序列的TRdm核酸序列。該盒的核苷酸1至589對應於來自pEYFP-Nl質粒(Clontech)的 人巨細胞病毒即時早期啟動子。核苷酸590至630對應於人工接頭序列，其由原始pEYFP-Nl 形式廣泛修飾而來。核苷酸631至1356對應於TRdm。接下來的8個核苷酸是人工接頭。核 苷酸1369至1371對應於源自pEYFP-Nl質粒的Kozak共有翻譯起始位點。核苷酸1372至 3024對應於源自phCMV-Luc-FSR質粒(Genlantis)的螢火蟲螢光素酶可讀框。核苷酸3025 至3171、3179至3200、及3207至3223對應於源自pEYFP-Nl質粒的接頭DNA。核苷酸3172 至3178、及3201至3207對應於源自pEYFP-Nl質粒的猿猴病毒40 (SV40)早期基因多聚腺 苷酸化信號。由此盒轉錄的mRNA始於核苷酸583，而止於核苷酸3211或3223。TRplp單順反子盒(pCMV-TRplp-Luc) (SEQ ID NO 4)含有有效連接於螢火蟲熒 光素酶編碼序列的TRplp核酸序列。該盒的核苷酸1至589對應於來自pEYFP-Nl質粒 (Clontech)的人巨細胞病毒即時早期啟動子。核苷酸590至630對應於人工接頭序列(由 原始pEYFP-Nl形式廣泛修飾而來)。核苷酸631至1461對應於TRplp。接下來的8個核苷 酸是人工接頭。核苷酸1470至1476對應於源自pEYFP-Nl質粒的Kozak共有翻譯起始位點。核苷酸1477至3129對應於源自phCMV-Luc-FSR質粒(Genlantis)的螢火蟲螢光素酶 可讀框。核苷酸3230至3276、3284至3305、及3313至3328對應於源自pEYFP-Nl質粒的 接頭DNA。核苷酸3277至3283、及3306至3312對應於源自pEYFP-Nl質粒的SV40早期基 因多聚腺苷酸化信號。由此盒轉錄的mRNA始於核苷酸583，而止於核苷酸3316或3328。TRdm 雙順反子盒(PCMV-Luc-TRdm-EYFP) (SEQ ID NO 5)含有這樣的Rdm 核酸序列， 其具有編碼螢火蟲螢光素酶編碼序列的第二 ORF和編碼EYFP編碼序列(維多利亞多管水 母(Aequorea victoria)綠色螢光蛋白增強型黃綠色變體)的有效連接的第一 0RF。該盒 的核苷酸1至589對應於來自pEYFP-m質粒(Clontech)的人巨細胞病毒即時早期啟動子。 核苷酸590至630對應於人工接頭序列(由原始pEYFP-Nl形式廣泛修飾而來)。核苷酸 631至2283對應於源自phCMV-Luc-FSR質粒(Genlantis)的螢火蟲螢光素酶可讀框。接 下來的6個核苷酸是人工接頭。核苷酸2290至3015對應於TRd^接下來的23個核苷酸 (3016至3038)對應於源自pEYFP-Nl質粒的人工接頭DNA。核苷酸3039至3045對應於源自 pEYFP-Nl質粒的Kozak共有翻譯起始位點。核苷酸3046至3760對應於源自pEYFP-Nl質粒 的EYFP可讀框。核苷酸3761至3912、3920至3941、及3949至3964對應於源自pEYFP-Nl 質粒的接頭DNA。核苷酸3913至3919、及3942至3948對應於源自pEYFP-Nl質粒的SV40 早期基因多聚腺苷酸化信號。由此盒轉錄的mRNA始於核苷酸583，而止於核苷酸3952或 3964。TRplp 雙順反子盒(PCMV-Luc-TRplp-EYFP) (SEQ ID NO 6)含有這樣的 TRplp 核酸序 列，其具有編碼螢火蟲螢光素酶編碼序列的第二 ORF和編碼EYFP編碼序列(維多利亞多管 水母(Aequorea victoria)綠色螢光蛋白增強型黃綠色變體)的有效連接的第一 0RF。該 盒的核苷酸1至589對應於來自pEYFP-Nl質粒(Clontech)的人巨細胞病毒即時早期啟動 子。核苷酸590至630對應於人工接頭序列(由原始pEYFP-Nl形式廣泛修飾而來)。核苷 酸631至2283對應於源自phCMV-Luc-FSR質粒(Genlantis)的螢火蟲螢光素酶可讀框。接 下來的6個核苷酸是人工接頭。核苷酸2290至3120對應於TRplp。接下來的23個核苷酸 (3121至3143)對應於源自pEYFP-Nl質粒的人工接頭DNA。核苷酸3144至3150對應於源自 pEYFP-Nl質粒的Kozak共有翻譯起始位點。核苷酸3151至3865對應於源自pEYFP-Nl質粒 的EYFP可讀框。核苷酸3866至4017、4025至4046、及4054至4069對應於源自pEYFP-Nl 質粒的接頭DNA。核苷酸4018至4024、及4047至4053對應於源自pEYFP-Nl質粒的SV40 早期基因多聚腺苷酸化信號。由此盒轉錄的mRNA將始於核苷酸583，而止於核苷酸4057或 4069。多聚腺苷酸化序列本領域技術人員將會容易地意識到任何多聚腺苷酸化(polyA)信號可摻入在本 文所述單順反子或雙順反子TR表達盒的3』非翻譯區(3』UTR)。可用於本技術的polyA序 列的實例包括SV40早期和晚期基因、HSV-TK、和人生長激素(hGH)序列。在優選的實施方 案中，polyA序列是SV40早期基因序列。任選元件在多個實施方案中，TR盒序列的3』 UTR可包括一個或多個通過改變mRNA穩定性 調控TR基因表達的元件。一般，mRNA衰變例示為mRNApolyA尾巴的喪失、將去腺苷酸化的 RNA募集至外來體、及核糖核酸酶(RNAse)降解。在選擇mRNA方面，此過程通過促進細胞降解系統選擇性識別mRNA的特異性RNA去穩定元件加速。在本發明中，不穩定TR盒mRNA含 有源自編碼細胞反應/恢復基因的mRNA物質的3』 UTR AU富含元件(「ARE")序列。可用於此技術的ARE序列的實例包括來自c-fos、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、c-jun、腫瘤壞死因子α (TNF- α )、和IL_8mRNA的3』UTR序列。在優選的實施方 案中，應用來自c-fos基因的ARE序列。本技術的單順反子和雙順反子表達盒還可包括5』非翻譯區(5』 UTR)，其位於啟 動子的3』和TR元件的5』。在一些實施方案中，這樣的區域包含mRNA轉錄起始位點。在 其他實施方案中，5』非翻譯 區包含內含子序列，其指導mRNA剪接，並且是在體內有效加 工一些mRNA物質所必需的。真核細胞中mRNA剪接的通用機制在Sharp (Science 235 736-771 (1987))中定義和綜述。有四種mRNA剪接所必需的核酸序列5』剪接供體、分支 點、多嘧啶片和3，剪接接納體。共有5，和3，剪接匯合處(Mount, Nucl. Acids. Res. 10 459-472(1992))和分支位點序列(Zhuang等人，PNAS 86 =2752-2756 (1989))是本領域已知 的。在一些實施方案中，5』 UTR序列包含存在於天然基因序列中的天然內含子或者人 工內含子，例如pAAV-MCS載體(Stratagene)中存在的人β _珠蛋白免疫球蛋白序列。另外，本技術的表達盒可包括如下一種或多種位於啟動子序列5』的約15-50個核苷酸的序列，其包括一個或多個用於將TR盒 插入質粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點；位於TR元件3』和ORF序列5』的約15_50個核苷酸的序列，其包括一個或多個用 於插入和有效連接TR元件與ORF序列的限制性位點；位於ORF序列3』和多聚腺苷酸化信號5』的約15_50個核苷酸的序列，其包括一 個或多個用於插入和有效連接ORF序列與多聚腺苷酸化序列的限制性位點；和位於多聚腺苷酸化序列3』的約15-50個核苷酸的序列，其包括一個或多個用於將 TR盒插入質粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點。本文所述的TR表達盒可插入到質粒或病毒(「穿梭」)載體中，這取決於用來 複製TR盒的宿主細胞。一般而言，TR DNA表達盒利用本領域已知的技術插入到所公 開載體的適當限制性核酸內切酶位點處。可用於此目的的眾多載體廣為人知(Miller， Human Gene Therapy 15-14,1990 ；Friedman, Science 244 :1275_1281，1989 ;Eglitis 和 Anderson, BioTechniques 6 :608_614,1988；Tolstoshev 禾口 Anderson, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990 ；Sharp, The Lancet 337 1277-1278,1991 ；Cornetta 等 人，Nucleic AcidResearch and Molecular Biology 36 :311-322,1987 ；Anderson, Science226 :401-409，1984 ;Moen，Blood Cells 17 :407_416，1991 ;Miller 等人， Biotechniques 7:980-990,1989 ；Le Gal La Salle 等人，Science 259 :988_990，1993 ；和 Johnson, Chest 107 :77S_83S，1995)。質粒載體部分地基於待用該質粒轉化的宿主細胞來選擇。例如，質粒中存在的 細菌或哺乳動物選擇標記的存在、複製起點、質粒拷貝數、指導與染色體DNA隨機或位點 特異性重組的能力等等，可影響適當載體的選擇。在一些實施方案中，採用細菌質粒如 pBluescript II、pET14、pUC19、pCMV_MCS和pCMVneo在細菌細胞中增殖本技術的TR盒。在優選的實施方案中，質粒是pCMVneo載體。在另一優選的實施方案中，質粒是pBluescript II載體。在另一實施方案中，TR表達盒插入到哺乳動物或病毒穿梭載體中。哺乳動物穿 梭載體含有哺乳動物選擇標記並確保分離含有穩定基因組整合體的細胞，而病毒穿梭載體 利用重組或遺傳互補確保重構病毒基因組。在一些實施方案中，哺乳動物穿梭載體選自 pCMV、pEYFP-Nl、pEGFP-Nl或pEGFP-Cl質粒。在優選的實施方案中，哺乳動物穿梭載體是 PEYFP-Nl。在一些實施方案中，病毒穿梭載體選自pAAV-MCS (腺伴隨病毒血清型2或AAV2 基因組)或pBac-1、pBacPAK8/9(苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)杆狀病毒基因 組)質粒。在一個優選的實施方案中，病毒穿梭載體是PAAV-MCS。在另一優選的實施方案 中，病毒穿梭載體是PBac-I質粒。為確保表達盒有效遞送至特定細胞、組織或器官中，可將其摻入到促進細胞靶向 的非病毒遞送系統中。例如，可以將包括TR盒的哺乳動物穿梭質粒封裝在脂質體中。脂質 體包括乳液、泡沫、微團、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、片層(lamellar layer)等等。利 用脂質體載體向靶細胞遞送DNA序列如同製備此類脂質體的方法一樣在本領域公知。
可用於實施本技術的病毒包括重組修飾的被膜或非被膜DNA和RNA病毒，優選 選自杆狀病毒科(baculoviridiae)、細小病毒科(parvoviridiae)、小核糖核酸病毒科 (picornoviridiae)、皰疫病毒禾鬥(herpesviridiae)(例如 HSV)、痘病毒禾鬥(poxviridiae) 和腺病毒科(adenoviridiae)病毒。在一些實施方案中，重組病毒是杆狀病毒科病毒。在 優選的實施方案中，杆狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)衍生病毒。在其 他實施方案中，病毒是細小病毒科病毒，例如腺伴隨病毒(「AAV」)。在優選的實施方案中， AAV是AAV血清型2。在另一實施方案中，AAV是AAV血清型1。此清單並非是排他的，並且 可包括例如逆轉錄病毒科(retroviridae)，如慢病毒。選擇的病毒可為無毒性的，或者可作 為製備其病毒載體的一部分使之無毒性。病毒基因組優選通過重組DNA技術修飾以包括TR表達盒，並且可以改造成複製缺 陷型、條件複製型或具有複製能力的。例如，利用條件複製型病毒將病毒複製限於特定、調 節的細胞培養條件可以證明是有用的。本文包括利用具有不止一個「親本」病毒特性的有利元件的嵌合病毒載體。還可 以在本發明中產生並使用最小載體系統，其中病毒骨架僅含有包裝病毒載體所需的序列， 且任選地包括表達盒。一般優選採用來自待處理物種的病毒，例如當用皰疹病毒轉導人細 胞或人細胞系時，則採用人皰疹病毒。在一些情況下，可使用來源於不同於用其轉導的物種 的物種的病毒。例如，源自非人來源血清型的腺伴隨病毒(AAV)可以用於對人進行處理，因 為該非人血清型不會立即被天然或既有的人抗體識別。通過最小化對載體的免疫反應，避 免了載體的快速系統清除，且增加了體內載體效力的持續時間。哺乳動物細胞本技術含TR盒的哺乳動物細胞可用來篩選影響代謝或細胞停滯以及誘導細胞應 激或死亡的分子(例如化學品、藥物、肽和核酸)或環境條件(例如培養條件或操作)。這 些細胞還使我們能夠研究藥物吸收、代謝和安全性，鑑定影響藥物代謝的因素、以及評價和 驗證藥理功效。上文所述任何哺乳動物穿梭載體中的單順反子或雙順反子TR表達盒可轉 化到哺乳動物細胞中。穿梭載體可通過本領域技術人員可利用的任何技術引入到宿主細胞中。這些包括但不限於化學轉染(例如，氯化鈣法、磷酸鈣法)、脂轉染、電穿孔、細胞融合、 顯微注射和病毒感染(Ridgway，A. "Mammalian ExpressionVectors」 24 章，470-472 頁， Rodriguez 禾口 Denhardt 編輯，Butterworhs, Boston MA 1988)。哺乳動物細胞可為分離自動物的哺乳動物細胞(即原代細胞)或哺乳動物細胞 系。從動物分離細胞的方法在本領域公知。在一些實施方案中，原代細胞分離自小鼠。在其 他實施方案中，原代細胞分離自人。又在其他實施方案中，可利用哺乳動物細胞系。例示性 的細胞系包括HEK293 (人胚腎)、HT1080 (人纖維肉瘤)、NTera2D (人胚性畸胎瘤),HeLa (人 宮頸腺癌)、Caco2 (人結腸腺癌)、H印G2 (人肝臟肝細胞癌)、Cos-7 (猴腎)、ES-D3 (小鼠 胚胎幹細胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細胞)和hES Hl (人胚胎幹細胞)。宿主細胞系一 般可由例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、任何批准的布達佩斯條約地點或其他生物保 藏機構獲得。又在其他實施方案中，可利用哺乳動物胚胎幹(ES)細胞，例如小鼠ES細胞mES_D3 或人ES細胞hES HI。 細胞詵擇前述方法需要製備哺乳動物細胞培養物。測定中使用的細胞可以是特製表達TR 盒的重組細胞。一旦用本文所述的TR表達盒轉化哺乳動物細胞或細胞系，則期望選擇第一 和/或第二 ORF高表達的細胞。進行這些的若干方法在本領域已知，並在下文簡要說明。利用存在於哺乳動物穿梭載體中稱為的「顯性選擇標記」的藥物抗性基因進行這 樣的選擇。選擇標記允許分離已經將外源表達載體穩定整合至其基因組DNA中的細胞，從 而功能性地摻入了外源DNA的細胞對相應的藥物形成組成型抗性。這之後最典型的是細胞 在限制培養基中選擇性生長，和確立持續供應重組表達細胞。選擇標記的實例包括新黴素 磷酸轉移酶(「NeoR或G418R」)、潮黴素磷酸轉移酶(「HygR」)和嘌呤黴素N-乙醯基轉移 酶("PurR")ο本領域一般採用兩種方法確立、表徵和儲存表達細胞。第一種包括確立、收集和儲 存所有的轉化和藥物抗性細胞群，其中每個細胞都包含至少一個賦予藥物抗性的轉基因整 合事件，稱為「細胞庫」。第二種包括分離由單個藥物抗性細胞獲得的個體細胞集落/克隆， 篩選期望的性狀，和儲存稱為「細胞系」的細胞原液。與第一種方法提供具有分布廣泛的基因表達水平的混合抗性細胞群形成對照，第 二種方法需要從許多的分離細胞集落中選擇獨特的克隆，以鑑定以期望水平表達期望基因 產物的集落的選擇組。一旦鑑定了這些細胞，就對其進行擴增，在細胞培養物中維持或冷凍 以備將來使用。胚胎幹細胞幹細胞尤其可應用於本發明的方法。多能、成人、胚泡來源的、生殖巢、畸胎瘤來源 的、全能、多能、胚胎(ES)、胚胎生殖(EG)和胚胎癌(EC)細胞都是可用於這些方法的幹細胞 的實例。多能幹細胞可由任何動物如任何哺乳動物的胎兒材料產生。然而，在一個實 施方案中，哺乳動物是嚙齒類動物，例如小鼠、豚鼠或大鼠。在優選的實施方案中，小鼠 ES細胞是mES-D3。胎兒材料可來自牲畜，例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等。胎兒材料還可 來自靈長類動物包括人。多能幹細胞系已經在例如但不限於雞(Pain，B.等人，(1996)Development (Cambridge, U. K.) 122, 2339-2348),貂(Sukoyan, M. A.等人，(1993)Mol. R印rod. Dev. 36，148-158)、倉鼠(Doetschman，T.等人，(1988) Dev. Biol. 127，224-227)、 豬(Wheeler, M. B. (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 563-568 ；Shim, H.等人，(1997)Biol. R印rod. 57，1089-1095)、恆河猴(Thomson，J. A.等人，(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,7844-7848)和絹毛狨(commonmarmoset) (Thomson, J. A.等人，(1996) Biol. Reprod. 55, 254-259)中報導。幹細胞系的獲得描述在上一段引述的參考文獻中。幹細胞呈現出許多獨特的特性和特性範疇。例如，一些形式的幹細胞系能夠以未 分化的狀態延長離體增殖(> 1年)。幹細胞在增殖和/或分化的同時還能夠維持正常的 核型。幹細胞還能夠呈現出形成生物體中每一種細胞類型的能力(即全能性狀)。其他幹 細胞保留分化成中胚層、內胚層和外胚層組織，包括生殖細胞、卵和精子的能力。一些幹細 胞能夠在某些生長條件下，例如不維持未分化狀態的培養條件下形成胚狀體(EB)。此外，幹 細胞常常能夠通過與胚泡融合形成嵌合體，這是產生轉基因動物所必需的。除保持未分化狀態之外，ES細胞可通過改變生長條件來操作，以誘導分化為特定 的細胞類型(稱為"定向分化")。例如，多能幹細胞可通過諸如藥物、前藥、肽和核酸等分 子而定向為特定的譜系，這些分子1)激活調控分化的內源轉錄程序；2)誘導遍在表達分化 特異性轉錄因子的外源核酸；3)提供培養基中含有誘導分化的生長因子/調控分子的細胞 培養物；或4)允許共培養幹細胞和能夠進行譜系誘導的細胞類型。許多外胚層衍生物(ED) 定向分化方法在下文說明，並且可用於本發明的方法。在多個實施方案中，本技術提供了用於鑑定毒性劑的基於細胞的系統。更具體地， 用TR盒轉化的轉基因ES細胞可通過定向分化編程，以分化為特定的細胞譜系，以提供毒性 劑的離體細胞特異性篩選。在一個實施方案中，TR調控的0RF是報告基因，更具體地是螢 火蟲螢光素酶基因。在另一實施方案中，TR調控的0RF是EYFP蛋白。可利用遺傳操作來改變幹細胞的特性。修飾的幹細胞是具有不同於細胞原始基因 型的遺傳背景的幹細胞。例如，修飾的幹細胞可為表達來自染色體外或整合DNA序列的蛋 白質序列的幹細胞。可利用顯性選擇標記的選擇來修飾幹細胞特性。例如，編碼抗生素抗性 基因的載體的轉化/轉導可用來選擇能夠在抗生素應用中存活的細胞群。表達標記基因的 細胞還可整合順式連接的轉基因如TR盒，從而這些轉基因穩定地摻入基因組中。本領域存 在多種方法製備遺傳修飾幹細胞的細胞系。本技術的一種應用是採用能夠表達TR盒的遺 傳修飾的幹細胞系進行基於細胞的細胞毒性測定的方法。在一個實施方案中，TR盒自CMV 啟動子編碼報告基因如螢火蟲螢光素酶，提供了對細胞死亡進行組成型成像的方法。在另 一實施方案中，TR盒自EGR-1啟動子編碼報告基因如螢火蟲螢光素酶，提供了在早期應激 反應期間對細胞死亡進行成像的方法。預期技術人員能夠基於特定需求或測量和/或誘導 細胞死亡的方法，來設計在轉基因幹細胞中對細胞死亡成像的類似方法。作為舉例，本領域 描述了用於產生幹細胞離體定向分化的許多方法。其中一些在隨後的章節中概述。外胚層 衍生細胞的形成在自發分化的幹細胞中常見，並且一般認為是默認的發育通路。可選擇性 地促進神經外胚層細胞命運，以生成神經先祖和分化的神經細胞類型(例如，神經元、星形 膠質和少突膠質)(Carpenter M K等人2001)。少突膠質細胞可利用FGF (例如FGF2)和表 皮生長因子(EGF)、接著補充視黃酸(RA)而由幹細胞系產生。這些少突膠質細胞前體能夠 成熟，並使神經元重新髓鞘化(Nistor G I等人2005)。可選的多步驟方法能夠通過在RA
32和FGF-2中、然後是RA和sonic hedgehog (SHH)中、而最後是腦源神經營養因子(BDNF)、神 經膠質衍生神經營養因子(GDNF)、胰島素樣生長因子1 (IGF1)和低水平SHH中培養幹細胞 而產生多巴胺能神經元(Park S等人2004 ；Perrier A L等人2004)和運動神經元。相反，用Noggin拮抗劑骨形態發生蛋白(BMP)處理幹細胞培養物生成具有扁平上 皮形態和外胚胎內胚層特徵性基因表達譜的幹細胞，一種常與發育中胚胎的卵黃囊和胎盤 相關的細胞類型。因而，在具有BMP4的無血清培養基中延長培養幹細胞將產生表達與滋養 層或胎盤發育相關的基因(例如，MSX2)和蛋白質(例如人絨毛膜促性腺激素)的扁平上 皮細胞。與此類似，共培養幹細胞與表達基質細胞衍生的誘導活性(SDIA)的小鼠骨髓間 充質PA6細胞系，將產生酪氨酸水解酶陽性(TH+)並表達nurrl和LMXlb基因的混合中腦神 經元(Kawasaki H等人2002 ;Mizuseki K等人2003)，以及色素視網膜上皮細胞。用BMP4 進一步操縱培養條件誘導形成神經嵴細胞和最背側中樞神經系統細胞。抑制SHH促進形成 運動神經元(Troimson A. 2004)。當幹細胞與小鼠骨髓間充質細胞系一起培養時，其還可定 向為中腦多巴胺神經元(例如MS5和S2細胞)，其中存在響應FGF-8、SHH、抗壞血酸/維生 素C和BDNF(Perrier A L等人2004)的Pax2、Pax5和果蠅en_l轉錄因子的相繼表達。部分分化的神經上皮衍生物對FGF-8和SHH的暴露促進，產生具有前腦表型的多 巴胺能神經元；然而，在神經上皮特化期間早期接觸FGF-8，則促進中腦表型和中腦多巴胺 能神經元的分化通路。因此，給藥FGF-8和SHH的次序能夠決定神經元命運。共培養方法還已經用來由幹細胞產生分化的心肌細胞。15-20%的幹細胞培養物 與小鼠內臟內胚層細胞類型END-2 —起培養，形成跳動的心臟肌肉集落(例如心肌細胞) (Mummery C等人2002 ;Mummery C等人2003)。由幹細胞獲得的跳動的心臟肌肉細胞表達 心肌細胞標記，包括a-肌球蛋白重鏈、心肌鈣蛋白和心房利尿鈉因子以及心肌細胞典型 的轉錄因子(例如GATA4和MEF3) (Kehat I等人2001 ；Xu C等人2002)。這些細胞響應藥 理藥物，並呈現出在人胎兒左心室心肌細胞中最常觀察到的心肌細胞作用潛能，這可容易 地與小鼠心肌細胞區分開來(Mummery C等人2003 ;He J Q等人2003)。還可在分化的幹 細胞培養物中形成心房和起搏點樣細胞。這些幹細胞來源的心肌細胞與移植的嚙齒類動物 和豬科動物(porcine)心臟肌肉正常地成為一體，在幹細胞肌細胞和受體小鼠成年心肌細 胞之間形成正常的間隙連接(gap junction connections) (Xue T等人2005 ;Kehat I等人 2004 ；Hassink R J 等人 2003)。通過共培養幹細胞與小鼠胚胎前腸間充質，可生成表達呼吸道特異性標記表面活 性蛋白C(SPC)的II型肺細胞(Denham M等人2002)。當幹細胞作為胚狀體分化或在I型 膠原上培養時，還可誘導形成氣道(airway)上皮組織，然後所得的Clara細胞在氣-流體 界面上生長，形成假復層的表面上皮(Coraux C等人2005)。角質形成細胞可由幹細胞通過胚狀體重新鋪板而獲得(Green H等人2003)。在二 代培養物周圍表達轉錄因子P63的細胞識別角質形成細胞先祖，其產生檢測到細胞角蛋白 14和鹼性核蛋白的更成熟細胞類型。這些細胞能夠形成終端分化的分層上皮，但與從新生 兒或成人皮膚中分離的角質形成細胞上皮不同。胚狀體(EB)還可利用造血細胞因子和BMP-4混合物用來產生造血先祖(Kaufman D S，2001，Chadwick K等人2003)。EB通過從ES細胞培養物中撤去白血病抑制因子(LIF)而形成，並呈現為細胞簇或球形多細胞聚集物。這些先祖與背主動脈的造血先祖在免疫學 上類似。生長因子如幹細胞因子(SCF)、白介素-3和-6(IL-3、IL-6)、粒細胞集落刺激因子 (GCSF)、Flt-3配體、以及血管內皮生長因子-A(VEGF-A) (Cerdan C等人2004)。在接觸激活蛋白A之後可在幹細胞培養物中檢測到內皮細胞(Kubo A等人2004)。 胰島素生產細胞可利用Lumelsky等人的方法通過分化神經外胚層細胞而形成(Lumelsky N等人2001)。與此類似，Segev等人(Segev H等人2004)通過在含有胰島素、轉鐵蛋白、 硒和纖連蛋白的培養基中培養胚狀體產生了胰島樣簇。使解聚的簇在含FGF-2的培養基中 形成簇，然後在懸浮培養物中接觸具有低糖的煙醯胺。高百分比的細胞簇表達胰島素、胰高 血糖素和生長抑素，類似於不成熟的胰腺細胞。對葡萄糖和其他拮抗劑的反應性表明這些 細胞是不成熟的胎兒樣胰腺胰島細胞。Rambhatla等人(2003)報導了幹細胞分化成表達肝細胞標記(白蛋白、a -1-抗 胰蛋白酶、細胞角蛋白8和18)並積累糖原的細胞。用丁酸鈉處理胚狀體或用二甲基亞 碸、接著是丁酸鈉處理貼壁幹細胞培養物得到肝樣內胚層細胞(Lavon N等人2004)。分化 的貼壁幹細胞培養物中的細胞形態可用來選擇表達胎肝標記的內胚層群(Stamp L A等人 2003)。轉基因動物本技術還涉及轉基因動物，其含有穩定整合至其基因組中的TR表達盒。在一些實 施方案中，包含TR盒的靶向核酸構建體引入到多能細胞(例如ES細胞，Robertson，E. J.， In Current Communications in MolecularBiology,Capecchi,M. R.(編輯)，Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, N. Y. (1989)，39-44 頁)中。適宜的 ES 細胞可由任何物 種或特定物種的任何品系獲得或分離。在一些實施方案中，物種是小鼠，如129或C57BL/6 品系。在其他實施方案中，物種是大鼠。雖然不是必需的，多能細胞一般源自與目的受體相 同的物種。ES細胞也可以獲自商業來源(例如GenomeSystems，Inc)、國際保藏機構(例 如 ATCC)、高校研究室(例如，the SitemanCancer Center Murine Embryonic Stem Cell Core, Washington University, St. Louis, M0)，或者可以如 Robertson (同上)所述獲得。 集落來源ES細胞系的實例包括129/SVJ、RW-4和C57BL/6ES細胞(Genome Systems, Inc.) 或 SCC 10、B6/Blu、EDJ22、R1 和 B6/GFP ES 細胞(Washington University)。ES細胞在適宜的條件下，例如，如 Ausubel 等人，CURRENIPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY所述培養。優選地，如E. J. Robertson,同上，71-112頁所述，在非有絲分裂的基質 細胞(例如ST0細胞(尤其是SNC4ST0細胞)和/或原代胚胎成纖維細胞)「飼養層」上 培養ES細胞。培養基優選包括白細胞抑制因子(〃 lif" ) (Gough, N. M.等人，R印rod. Fertil. Dev. 1 :281-288 (1989) ；Yamamori, Y.等人，Science 246 :1412_1416 (1989))，其防 止ES細胞離體分化。轉化了或組成型地表達lif生長因子的基質細胞也可用作為飼養細 胞。靶向構建體通過任何允許引入的分子在其同源區域進行重組的方法，或通過隨 機整合例如但不限於顯微注射、磷酸鈣轉化、脂轉染、病毒載體或電穿孔，而引入到ES細 胞中(Toneguzzo, F.等人，Nucleic Acids Res. 16 :5515_5532(1988) ；Quillet, A.等 人，J. Immunol. 141 17-20 (1988) ；Machy, P 等人，Proc. Natl. Acad, Sci. (U. S. A. )85 8027-8031 (1988))。在一些實施方案中，利用顯微注射將構建體插入到ES細胞中，其中核酸構建體在引入ES細胞之前通過例如用限制性核酸酶消化進行線性化。一方面，本技術提供了利用根據本發明的缺啟動子DNA盒、使之定點重組到目的 靶基因的編碼序列中而在宿主細胞中表達TR盒的方法。相關方面提供了通過在將構建體 引入到宿主基因組之前改造功能性表達構建體而在宿主細胞中表達TR盒的方法。一種這 樣的「基因組轉基因」通過將TR盒插入到大基因組序列(即，包含目的靶基因0RF的粘粒 或人工真核染色體)中進行離體改造，所述大基因組序列代替靶基因0RF，並驅動TR盒由靶 基因的轉錄調控元件表達。大基因組轉基因隨之利用靶基因轉錄調控系統提供在隨機整合 到宿主細胞之後期望的TR盒表達模式。其中已經整合了靶向構建體的那些細胞的篩選和選擇可應用構建體中的陽性選 擇標記和/或陰性選擇標記來實現。在多個實施方案中，構建體中陽性和陰性選擇標記均 含有。一方面，應用依賴於選擇標記表達的方法，例如，通過添加適當的底物來僅選擇表達 陽性選擇標記產物的那些細胞，或消除表達陰性選擇標記的那些細胞。例如，在陽性選擇 標記編碼新黴素抗性的情況下，向轉化的ES細胞培養基中以漸增的劑量添加G418。與此 類似，在應用陰性選擇標記的情況下，向細胞培養物中添加適宜的底物(例如更昔洛韋，如 果陰性選擇標記編碼HSV-TK的話)。在利用適當的底物選擇之前或之後，受體細胞中陽 性和/或陰性選擇標記的存在還可通過其他方法確定，例如雜交、檢測放射性標記的核苷、 PCR等等。在多個實施方案中，首先通過添加陽性和/或陰性選擇標記的適當底物來選擇 具有整合的靶向構建體的細胞。選擇過程中存活下來的細胞隨之通過其他方法，如PCR或 Southern印跡，對整合序列的存在進行篩選。鑑定了在正確的位置含有構建體的適宜ES細胞之後，可將細胞插入到胚胎、優選 胚泡中。胚泡通過灌注妊娠雌性的子宮獲得。實現這一點的適宜方法技術人員已知，並由 例如Bradley等人，(1992)Biotechnology, 10 :534_539闡述。作為舉例，與雄性交配的自 然周期或超排卵的雌性小鼠可用來收穫胚胎進行ES細胞植入。在成功交配後大約3. 5天 回收適齡的胚胎。交配的雌性通過C02窒息或斷頸處死，自切除的子宮角衝洗胚胎，並置於 Dulbecco改良基本培養基+10%牛血清中，以進行ES細胞注射。用內徑大約20 y m的玻璃 顯微針將大約10至20個ES細胞注射到胚泡中。可以通過技術人員已知的多種方法實現 向胚胎中的插入；然而，優選的方法是通過顯微注射。對於顯微注射，將約10-30個ES細胞 收集到微吸管中，並注射到胚胎中，所述胚胎處於適當的發育階段以允許含構建體的外來 ES細胞整合到發育胚胎中。在一個實施方案中，從例如小鼠FVB/N品系中獲得胚泡，而從例 如小鼠C57BL/6品系中獲得ES細胞。就受體雌性小鼠而言，將隨機周期的成年雌性與切除 輸精管的雄性配對。小鼠品系如SwissWebster、ICR或其他可用於此目的。在一個實施方 案中，受體雌性進行交配，從當需要植入含ES細胞的胚泡時，它們處於交配後的2. 5至3. 5 天。在胚胎轉移時，麻醉受體雌性，每克體重腹膜內注射0.015ml 2. 5%阿佛丁。通過直接 在輸卵管上方的體壁中切口露出卵巢，並使卵巢和子宮露出體表。用25號針在子宮角上穿 孔，通過此處轉移胚泡。轉移後，將卵巢和子宮推回體內，以兩針縫合切口。如果要進行其 他轉移，在相對側重複此操作。雖然任何處於正確發育階段的胚胎均適合使用，但優選使用胚泡。另外，優選的 胚泡是雄性的，而且優選具有編碼與ES細胞基因所編碼的不同毛色的基因。以這種方式， 通過查看嵌合毛色(說明ES細胞摻入發育胚胎中)可容易地對後代中敲除構建體的存在進行篩選。因而，例如，如果ES細胞系攜帶黑色皮毛的基因，則選擇的胚泡將攜帶白色或棕 色皮毛的基因。也可以利用Southern印跡和/或PCR來確定目的序列的存在。鑲嵌(嵌 合)後代隨之彼此交配以生成純合動物。純合體和雜合體可以通過對等量的來自為此雜交 產物的小鼠以及為已知雜合體的小鼠和野生型小鼠的基因組DNA進行Southern印跡來鑑 定。可選地，可利用Northern印跡來探測mRNA以鑑定編碼TR盒的轉錄物、0RF核酸序列 或兩者的存在或不存在。另外，可利用Western印跡來評估0RF編碼多肽的表達水平，如果 針對此類多肽的適宜抗體存在的話。作為舉例而非限制，如果多肽是GFP，可利用抗GFP的 抗體。最後，可利用適宜抗體對來自後代的多種細胞進行原位分析(例如固定細胞並用抗 體標記)和/或FACS (螢光激活細胞分選)分析，以查看靶向構建體的存在或不存在。在另一實施方案中，可製備僅在特定器官、組織、細胞或細胞條件下表達TR盒和 0RF核酸序列的轉基因動物。製備此類動物的方案與上文所述相同，除了靶向構建體包含僅 在期望細胞、組織或器官以及細胞條件如重金屬應用下表達的啟動子，從而使TR盒和0RF 編碼多肽的表達限於之。例如，如果期望靶向序列在肝和小腸中表達，則可應用脂肪酸結合 蛋白(FABP)啟動子。在另一實例中，運甲狀腺素蛋白(TTR) (Ye等人，Mol Cell Biol. , 1999 年12月，19 (12)，8570-80)啟動子也是為實現轉基因的肝特異性表達而予以充分說明和廣 泛應用的啟動子。實現基因的組織特異性表達的其他啟動子在本領域公知，且可容易獲得。檢測報告蛋白或報告核酸的方法本技術包括檢測在用其中第一 0RF序列為報告基因的TR表達盒轉化的細胞中表 達的報告蛋白的方法。簡言之，該方法包括使表達此類TR盒的細胞接觸適合於報告多肽翻 譯的條件，和檢測報告多肽的存在。可應用任何細胞，如原代細胞、細胞系、已在受試者內轉 導的細胞，或者植入受試者內的供體細胞。本領域已知多種離體蛋白質檢測方法。例如，多肽可以應用本領域已知特異於該 多肽的方法來檢測。這些檢測方法可以包括應用特異性抗體、形成酶產物或酶底物的消失。 因而，報告蛋白的檢測可應用本領域已知的任何標準方法實現，例如螢光顯微鏡檢、免疫組 織化學或ELISA實驗。例如，螢光顯微鏡檢可用來檢測EYFP和mRFPl。與此類似，針對螢火 蟲螢光素酶或3「半乳糖甘酶的抗體可用來在免疫螢光染色之後對其存在進行檢測。本領域有許多非侵入性的方法體內檢測蛋白質合成。作為舉例，置於TR元件下 遊的1型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVl-TK)ORF可用來通過代謝物示蹤物對體內細胞死亡 進行檢測。與哺乳動物胸苷激酶不同，此酶能夠有效地磷酸化核苷類似物(例如，更昔洛 韋、噴昔洛韋)以及多种放射性衍生物如(9-(4-[18F]_氟-3-羥甲基丁基)鳥嘌呤；[18F] FHBG)，其隨之保留並累積在表達細胞內。因而，如果細胞正經歷應激/死亡，則HSV1-TK會 由TR盒翻譯，導致放射性示蹤物的累積。放射性可應用正電子成像術(PET)來檢測，其允 許監測報告基因表達的詳細定位、量級和持續。還提供了呈現出增強的酶活和/或結合常 數的突變HSV1-TK酶(例如TKsr39)的方法，其通過增強放射性示蹤物的細胞累積而提高 PET成像的靈敏度。在具體實施方案中，說明了表達TR調控的發光蛋白例如螢火蟲螢光素酶的轉基 因細胞和動物。如在具體實施例中所證明的那樣，TR調控的螢光素酶表達起著細胞應激/ 死亡的生物發光報告者的作用。在此實施方案中，螢光素酶尤其可用作為活細胞和生物體 中生物發光低光度成像的報告者。雖然解析度低於MRI或PET，生物發光成像一般伴有靈敏的電荷耦合器件(CCD)相機，允許進行快速、高通量(同時由多個動物進行簡單的數據收 集)、進行性(對同一動物進行重複分析)、非侵入性、非破壞性的體內數據收集。本領域有 多種檢測裝置、成像處理器和成像分析系統。本技術還提供了利用含有有效連接於應激和反應特異性啟動子的TR盒的轉基因 細胞和動物而將TR mRNA合成限於選擇性細胞應激和反應條件的方法。在該方法中，TR核 酸(mRNA)和TR調控的蛋白質翻譯提供了對細胞應激和死亡的獨立衡量。預期該方法將允 許檢測受細胞應激調控的轉錄活性，其並不導致TR盒所檢測的應激/死亡特異性翻譯變 化。本領域有多種方法分離、純化和定量TR mRNA水平，例如定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)、 實時PCR(RT-PCR)、反轉錄酶PCR(RT-PCR)、原位雜交、或者液相或固相支持物中核酸雜交。檢測細胞應激和凋亡的方法在一個實施方案中，如上文所述的檢測報告蛋白的方法尤其可用於檢測細胞應激 和死亡。細胞應激和死亡檢測可離體或體內進行。因而，本方法可用來研究正常生物過程， 細胞對損傷或藥物治療、接觸據認為誘導細胞毒性的化合物或條件的反應，等等。例如，作 為研究生物過程的一部分，技術人員可能希望確定凋亡是否、及以何種程度在例如細胞分 化方面起作用。其還可以用於確定細胞在身體損傷如脊髓創傷之後或在接觸癌症治療藥物 之後的凋亡可能性。另外，凋亡檢測可用於評價例如新藥的細胞毒性。在檢測離體進行的實施方案中，本領域技術人員可應用原代細胞、細胞系或從動 物分離的細胞，如上面的章節所討論的那樣。簡言之，待評價應激或死亡的細胞最初用TR 表達盒轉化，其中第一 0RF序列是報告基因，例如EYFP。轉化細胞的方法在上文討論。細胞 在毒性條件下培養適量的時間，之後應用任何上述方法檢測報告蛋白表達。作為舉例，螢光 顯微鏡檢可用來評價翻譯TR-EYFP盒和呈現毒性表型的細胞數目。另外，針對報告蛋白如 EYFP的抗體可用來通過Western印跡分析確定報告蛋白表達的水平。對於體內應用，可通過任何目前使用的轉化方法如脂質體、電穿孔、顯微注射等， 將TR盒插入到ES細胞系和按照所述產生的轉基因動物中。對於TR盒的組織特異性表達， 可應用組織特異性啟動子。在一些實施方案中，應激特異性啟動子可以有效連接於TR盒， 以進一步將TR表達限於應激細胞。在一個優選的實施方案中，應用哺乳動物穿梭載體將TR 盒遞送至ES細胞中。轉基因動物將與推定的毒性藥物或條件接觸適量的時間，之後可利用 上述方法檢測報告基因轉錄和翻譯。此外，利用屍檢動物組織切片來測定基因表達和蛋白 質合成的多種標準方法在本領域公知。一個實例是應用針對報告蛋白如EYFP的抗體來評 價組織切片中應激和垂死細胞中的細胞和組織特異蛋白質合成以及蛋白質表達水平。在其 他實施方案中，TR盒提供了對細胞應激和死亡進行非破壞性體內成像的方法。作為舉例， 顯微PET掃描可用來評價翻譯TR-TKsr39盒的細胞的定位和數目。胚胎毒性和細胞毒性測定本技術提供了基於來自小鼠和大鼠的分化的轉基因多能胚胎幹細胞(ESC)系、以 及由已經用TR表達盒轉化的嚙齒類動物胚胎的原生殖細胞獲得的轉基因胚胎生殖細胞 (EGC)，來檢測化學誘導的胚胎毒性和畸胎發生(tetratogenic)效應的體外檢驗方法。以 前採用ESC細胞系檢測胚胎毒性和誘變化合物的體外嘗試稱為胚胎幹細胞檢驗或EST，為 本領域已知(Laschinski 等人，Reproductive Toxicol. 5，57—65 (1991) ；Spielmann 等人， Exvivo Toxicol. 10 :119-27(1997))。概括地說，測定體外ES分化的紊亂可與胚胎胚層異常相關。由於異常哺乳動物發育還可引起增強的細胞死亡和由此產生的植入前胚胎死亡、 發育缺陷、發育異常或畸形，早期檢驗方法應用MTT檢驗測量細胞毒性效應。在該實施方案 中，將改良EST方法以利用TR特異性翻譯來研究導致細胞應激/死亡的細胞毒性，這將作 為畸胎發生/胚胎毒性物質殺胚胎(embryocidal)特性的衡量。在一些實施方案中，可檢驗物質對轉基因ES細胞的毒性。技術人員可容易地選擇 用於特定物質的適當ES細胞、以及選擇諸如物質濃度、物質與ES細胞孵育的持續時間、和 檢測方法等因素。一般而言，此類測定利用用TR盒轉化的轉基因ES或EG細胞培養物離體 進行。簡言之，使所檢驗的物質與ESC群接觸一段時間，並如上所述測定TR介導的翻譯活 性。例如，物質可與若干不同的ES細胞培養物孵育若干不同的時間段(例如，12小時，24 小時，48小時，72小時)，其中對每種培養物應用4-20種不同濃度的物質。然後可如上所述 利用報告蛋白檢測的標準方法來確定基於TR的毒性測定。活性劑的毒性潛力可表達為若 幹方式，例如表達為達到細胞死亡所需的時間，或者在給定時間點可檢測的TR調控報告蛋 白的量。在一個優選的實施方案中，應用生物發光來檢測TR調控的報告蛋白。作為舉例而非限制，如果檢驗的物質對檢驗的細胞有毒性，則細胞將快速經歷應 激和死亡，導致翻譯TR盒和TR調控的報告蛋白，如EYFP或螢火蟲螢光素酶。然後可應用 例如螢光或生物發光檢測來確定報告蛋白的存在和/或量。在另一實施方案中，可對事先 已向其至少一些細胞中摻入了 TR盒的動物給藥物質。例如，在向小鼠適當的檢驗組織或組 織部位注射了編碼TR盒(其中第一 0RF序列是報告基因)的病毒之後，可使之接觸潛在的 毒性物質。這將導致注射部位的病灶感染和易感細胞的轉導。本技術提供了通過應用已經 討論的任何體內或離體方法檢測動物細胞中的報告蛋白來測量物質對所述動物的毒性的 方法。又在另一實施方案中，利用標準方法並如上所述，應用轉基因動物或源自轉基因 動物的動物細胞來篩選化合物或物質的細胞毒性。作為例子，在此類篩選測定中，在一段時 間內並以多種劑量，向動物給藥物質或將物質引入到源自這些動物的細胞的培養基中，之 後研究動物或動物細胞中指示細胞毒性的報告蛋白表達。除了上文的細胞毒性測定之外，還可預見在毒性細胞刺激的存在下評價向毒性表 型的「時間」轉換的測定。在這樣的測定中，人們可對應激誘導的自TR盒的由誘導型或應 激調控啟動子轉錄的RNA合成與死亡誘導的TR依賴性蛋白質合成進行比較。轉換測定的 另一實例採用細胞類型特異性或器官特異性轉錄調控元件，以允許應用任何以前說明的檢 測方法來檢測細胞類型特異性或器官特異性毒素。鑑定其他TR元件的方法本技術還提供了通過用在含未知靶mRNA的細胞中誘導應激或死亡的毒性劑刺激 該靶mRNA翻譯，來鑑定在細胞應激/死亡期間選擇性翻譯的翻譯調控(TR)基因的方法。在 用毒性劑如MG132或鈣離子載體A23187處理之後，收穫細胞mRNA，純化，並分離為活躍翻 譯和非翻譯mRNA庫。雖然不束縛於特定的理論，相信編碼迅速響應毒性環境所需蛋白質的 mRNA在接觸毒性劑後快速翻譯，故而所編碼的蛋白質迅速出現。本技術的方法通過製備含 多個核糖體("多核糖體")和無核糖體非翻譯mRNA的mRNA庫，而鑑定在細胞死亡期間活 躍翻譯的mRNA。在應用任何生理、化學或病理應激誘導細胞/組織死亡之後，可利用諸如 蔗糖密度梯度分級分離、高效凝膠過濾色譜或聚丙烯醯胺凝膠基質分離(Ogishima等人，1984，Menaker 等人，1974，Hirama 等人，1986，Mechler，1987，和 Bharucha 和 Murthy，1992) 等方法，將仍然參與翻譯的mRNA (推定的藉助於帽子非依賴性翻譯翻譯的TR基因)與非翻 譯的那些分離開來，因為正在翻譯的mRNA含有結合的核糖體，因此其遷移有別於無核糖體 的非翻譯mRNA。可通過用特異性地抑制或調節轉錄或翻譯以及防止mRNA-核糖體解離的藥物處 理靶細胞/組織，來增強mRNA-核糖體分級分離。此類藥物的實例分別是放線菌素D和環 己醯胺。可對多核糖體級分進行進一步的改進，以通過本領域已知的方法來區分總多核糖 體或膜結合的核糖體(Mechler，1987)。在多核糖體分離以及區分為翻譯和非翻譯庫之後，利用本領域技術人員公知 的禾口 描述在例如 「Molecular Cloning ；A Laboratory Manual，，(ColdSprings Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)中的技術分離 mRNA。可應用其他從 細胞/組織中分離和提取RNA的方法，並且這將是本領域普通技術人員已知的(Mach等人， 1986，Jefferies等人，1994)。利用poly A選擇進一步純化mRNA，以除去任何汙染核糖體 RNA，這在本領域公知。見於各庫中的許多mRNA物質的相對豐度可利用任何本領域常見的差異分析技術 來比較，包括基因表達連續分析法(「SAGE」)、差別展示、寡核苷酸陣列、代表性差別分析 (RDA)、cDNA微陣列和阻抑性削減雜交(SSH)。來自翻譯和非翻譯級分的標記mRNA(cDNA或 PCR產物的形式)可用作為探針來鑑定固定在固相矩陣樣微陣列(GEM)或任何類型的膜上 的cDNA、基因組克隆或mRNA物質，其中克隆可通過電泳、直接上樣或毛細管作用而附著在 膜上。標記可為放射性或螢光的，或摻入修飾鹼基如地高辛配基或生物素。作為對照，將翻 譯級分中的mRNA水平與總的未分級材料進行比較，以區分因轉錄調節所產生的表達水平 差異和因翻譯調節本身所致的表達水平差異。特定mRNA與翻譯mRNA庫強相關能夠表明所 述基因在細胞應激/死亡期間選擇性地表達。在差異表達分析之後，已經鑑定為推定受帽子非依賴性翻譯調控的基因可由任何 可用的基因組或cDNA基因收集物進行PCR擴增，並插入到所述的TR盒中，替換既有的TR 序列而產生「研究性」TR盒。將設計PCR引物以摻入類似於插入到先前所述TR元件中的突 變的突變，以防止自任何帽子依賴性翻譯起始位點的翻譯。將對任何研究性TR元件進行比 較分析，以確定這些克隆是否呈現出選擇性細胞應激和/或死亡特異性翻譯。在多個實施方案中，為呈現TR定義的活性，研究性TR克隆展示出如下翻譯參數a)正常有絲分裂細胞中的最小翻譯活性，通過本領域存在的任何標準測定法確 定，在這些培養物中未展示出大於細胞死亡正常水平的表達水平，b)在用急性劑量的毒性劑如MG132或鈣離子載體A23187處理的細胞中翻譯活性 快速增加，這始於處理後6個小時前但不超過9個小時，c)在超過95%的用研究性TR盒轉化並用急性毒性劑處理的任何細胞系中觀察到 的翻譯活性，d)翻譯水平升至急性毒性劑接觸後無有效連接的TR序列轉錄和翻譯的0RF表達 水平的 50% 以上，優選超過 60%、70%、80%、85%、90%、95%或 100%，e)接近有效連接0RF起始位點處發生的應激或死亡特異性翻譯起始，f)在正常或垂死細胞中不存在任何有效連接的轉錄效應序列/啟動子元件時無
39轉錄或翻譯活性，g)在正常或垂死細胞中在從研究性TR盒中除去了任何TR序列的表達細胞中無 TR特異性mRNA剪接證據，h)在包括不少於3種細胞系的多個細胞類型或代表3個截然不同組織類型的組織 中檢測到應激或死亡特異性翻譯。在優選的實施方案中，研究性TR元件將源自哺乳動物細胞，優選人細胞。在另一 實施方案中，研究性TR元件將源自嚙齒類動物細胞，優選小鼠細胞。
影響細胞應激或毒件的物質的篩詵測定本技術的TR表達盒在毒性檢驗中的應用包括將表達TR盒的細胞系與待篩選的活 性劑混合(一般是將其添加到培養基中)。本技術還提供了誘導、改善或預防細胞應激或毒 性的物質或化合物的高通量篩選測定。在一個實施方案中，化合物的細胞毒性能力應用上文所述的任何細胞毒性測定或 者通過檢測與TR元件共翻譯的報告蛋白來評價。簡言之，化合物通過與事先已用TR表達 盒轉化細胞一起孵育來檢驗，其中第一 ORF序列編碼報告蛋白。接下來，篩選細胞中報告蛋 白的表達，其中報告蛋白的存在指示化合物的細胞毒性潛力。而且，細胞中報告蛋白的濃度 越高，和/或表達報告蛋白的細胞的百分比越大與化合物細胞毒性增加相關。在另一實施方案中，為了鑑定能夠減輕或預防細胞毒性的物質，在上文所述的任 何哺乳動物細胞或轉基因動物接觸促進或誘導細胞毒性的條件之後，向所述細胞或動物給 藥推定的治療物質。例如，細胞可最初接觸輻照或用誘導細胞毒性的藥物如甲氨蝶呤處理。 在推定的治療物質與細胞或轉基因動物一起孵育之後，與未處理細胞或動物相比，處理細 胞或動物中報告蛋白的差異表達指示該物質減輕或預防細胞毒性的能力。例如，如果報告 基因是GFP，與未處理的相比，處理細胞或動物中GFP表達減小指示物質減小細胞毒性的能 力。對本領域普通技術人員而言將會顯而易見的是，處理細胞或動物中報告蛋白表達減小 程度越大，用來處理此類細胞或動物的物質預防或減輕細胞死亡的能力越大。這種方法可以在鑑定具有對抗例如癌症治療中應用的許多藥物細胞毒性的能力 的物質方面特別有用。此類藥物一般稱為「化療」劑，並且包括DNA破壞劑，例如甲氨蝶 呤、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、絲裂黴素(mitomycin)、放線菌素 D(actinomycin D)、博來黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicomycin)、紫杉醇(taxol)、長春 新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、順鉬(cisplatin)、卡莫司汀(carmustine)、 _ 夕去☆ (melphalan) > ^F ^ Iit 月安(cyclophosphamide) > T Sl M ^f (chlorambucil)、 異環磷醯胺(ifosfamide)、亞硝基脲(nitosurea)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬 (raloxifene)、雌激素受體結合劑、吉西他濱(gemcitabien)、諾維本(navelbine)、法尼基 蛋白轉移酶抑制劑、反鉬transplatinum、5-氟尿嘧啶、替莫唑胺(temazolomide)，以及它 們的類似物和衍生物。每一種化療劑一般伴有若干副作用，包括皮膚、胃腸道、骨髓、肝和腎 中的應激和死亡。同樣伴有毒性的其他藥物例示為鎮靜劑、抗炎劑、抗生素、止痛劑、麻醉劑、抗病毒 藥等通用範疇。例如，抗生素呈現出的毒性表型範圍從輕微的胃腸道症狀，到更為嚴重的肝 毒性、腎毒性、貧血、肌痛、關節痛和心臟毒性不等。另外，減少常用化合物如食品添加劑、社會藥物(social drug)細胞毒性的物質以及可選的醫學療法可應用上述方法來鑑定。食品添加劑、同樣也用於藥物、化妝品和某些醫 療裝置(即隱形眼鏡)生產的一個實例是著色劑。酒石黃(FD&C Yellow No. 5)，一種用來 著色飲料、甜品粉、糖果、冰淇淋、蛋奶糊和其他食品的化合物，能夠在顯著比例的接觸個體 中引起皮膚創傷(蕁麻疹)和一般毒性。其他具有潛在細胞毒性作用的食品添加劑包括膽 固醇替代品蔗糖聚酯(olestera)、亞硫酸鹽和穀氨酸一鈉(MSG)。在MSG的情況下，小部分 人群罹患MSG症候群，一種以細胞應激/毒性為特徵伴有神經症狀的病況，包括頸部灼傷 感、前臂和胸部麻木、向臂和背部輻射的麻刺感、上軀和頭部發熱/虛弱、胸痛、噁心、呼吸 困難、瞌睡和一般嗜睡。還可鑑定對抗社 會藥物如酒精飲料和咖啡因液體(例如，咖啡、可 樂、茶等)效應的物質。可選的醫學療法包括例如草藥如人參、銀杏(ginkgo biloba)、黑點 葉金絲桃(St. John' s wort)、麻黃和卡瓦胡椒(kavaZ)。任何物質或化合物均可以用來檢驗其誘導、改善或預防細胞死亡的能力。例如，可 應用例如由商業來源獲得小分子文庫。篩選此類文庫，包括組合篩選文庫(例如，肽、化學 品或寡核苷酸文庫)是研究大量物質的快速有效方式。組合方法通過創建基於活性但否則 不期望物質建模的二代、三代或四代物質，還適於快速進化潛在藥物。待篩選的物質或化合物還可包括天然存在物質的片段或部分，或者可以發現作為 已知物質的活性組合，否則將是無活性的。除了由化學成分或人造物質衍生或合成的化合 物之外，還可測定從天然來源如動物、細菌、真菌、植物來源(包括葉子和莖皮)和海洋樣品 分離的化合物。此類化合物的非限制性實例包括蛋白質、肽、胺基酸、小分子、核酸、脂質、營 養補充物如維生素或礦物質、藥物或任何其他可以由已知的毒性通路抑制劑或刺激物通過 理性藥物設計而設計的物質。誘導細胞死亡的方法本技術提供了誘導細胞死亡的活性劑。此類誘導細胞死亡的活性劑通過誘導因激 活細胞死亡或抑制抗細胞死亡細胞通路所致的細胞死亡而對多種疾病發揮期望的藥理作 用。此類活性劑包括這樣的藥物，其包含具有上述作用的物質作為活性成分。本技術的一個應用在於產生改進患者治療功效，同時減小治療應用的任何有害副 作用的療法。在許多情況下，應用組合療法來解決多種臨床問題，包括與過度增生性疾病治 療的細胞抗性相關的那些問題。在本技術的上下文中，考慮基於TR調控多肽的補充療法能 夠與治療性手術、化療、放療、基因療法、激素療法或免疫療法治療、以及採用凋亡或細胞周 期調節劑治療這些病症的可選療法結合使用。過度增生性疾病包括與任何類型的異常細胞 生長或異常細胞生長調控相關的疾病和病況。在本技術的方法中，患者為哺乳動物，優選人。多種過度增生性和退行性疾病可 按照本技術的方法治療。考慮通過本技術治療的過度增生性疾病的非限制性實例有癌症、 銀屑病、類風溼性關節炎、炎症性腸病、骨關節炎、以及口腔、前列腺、乳腺、皮膚的瘤前病變寸。一個優選的實施方案是在受試者中通過殺死癌細胞、誘導癌細胞凋亡、減小轉移 的發生或數目、減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減小腫瘤或癌細胞的血液供應、促進針對癌 細胞或腫瘤的免疫反應、預防或抑制癌症進展、或通過組合基於TR的治療與有效殺死或抑 制細胞增生的其他治療而增加癌症受試者壽命而負面影響癌症的方法。例如，如果通過本 發明確定，來自患者的腫瘤細胞對治療無反應且不經歷細胞死亡，則可給藥通過腫瘤特異性啟動子轉錄的編碼毒素基因、前藥激活基因、腫瘤抑制基因或免疫治療劑的TR盒以刺激凋亡。作為舉例，通過腫瘤特異性啟動子轉錄的編碼胸苷激酶基因(例如HSVlTKsr39酶 衍生物)的TR盒，可例如利用重組病毒載體，遞送至腫瘤特異性啟動子在其中優先有活性 的特定腫瘤類型中。TR盒在這些細胞中的轉錄將允許此酶在因適度化療或放療治療而應激 的腫瘤細胞中選擇性地翻譯。通過用特異性前毒性(protoxic)核苷類似物如阿昔洛韋和 更昔洛韋處理HSV-TKsr39表達細胞，觀察到特別的優勢，因為此酶產生一磷酸鹽中間體， 其隨之被細胞激酶磷酸化而提供強效DNA合成抑制劑。這使表達HSV-TK的細胞對更昔洛 韋的毒性作用極端敏感，而哺乳動物TK酶相對不敏感，產生大的治療指數。應用HSV-TK基 因遞送的腫瘤建模試驗已經證明了確立腫瘤的完全消退和長期動物存活，即使僅部分腫瘤 細胞真正用HSV-TK基因轉導也是如此。這種所謂的「旁觀者」殺細胞效應提供了重要的治 療優勢，因其避免了用HSV-TK基因感染/轉導100%的腫瘤細胞的需求。預期技術人員能 夠基於其中優選細胞死亡的特定應用而設計類似的治療方法。在本技術的上下文中，考慮TR調控的蛋白質能夠與其他細胞死亡療法同時應用。 可選地，TR補充療法可在其他治療之前或之後，時間間隔範圍從數分鐘到數周。在第一種治 療和TR治療分開應用的情況下，人們將會確保在各遞送時間之間的重要時間段不會過期， 從而第一活性劑與TR調控的治療劑仍將發揮有利的組合效應。另一實施方案考慮將基於TR的成像和細胞死亡系統與標準細胞死亡療法組合的 方法。提供了作為醫學治療副作用而對細胞死亡成像的優勢，而且這樣的話，給藥編碼報 告和促死亡(pro-death) 0RF的單順反子和雙順反子TR表達盒允許基於載體TR盒進行時 間成像。在一個實例中，可向腫瘤細胞遞送兩種TR表達載體，從而一種載體表達TR調控的 報告0RF，而第二種載體表達TR調控的細胞死亡0RF。在這種情況下，在標準治療劑如化療 藥物所致的細胞應激後的帽子非依賴性翻譯，將指導針對靶向腫瘤細胞的TR依賴性細胞 成像和TR促死亡活性的補充治療。可選地，可將單個雙順反子TR盒轉導到腫瘤細胞中， 其中上遊0RF編碼報告0RF，而TR調控的0RF是細胞死亡調控蛋白。在這個實例中，上遊 0RF將允許帽子依賴性翻譯以及觀察死亡之前的細胞轉導，從而可在化療應用之前觀察轉 導效率，然後當化療應用誘導了帽子非依賴性翻譯時則消失。因此，可通過改變TR盒組成 和治療劑應用的時機選擇來設計有效的成像_處理模式，預期這會允許最小化副作用和場 外(off-site)活性。而且，可應用雙順反子TR表達盒，從而兩個0RF序列均編碼細胞毒性蛋白質。例 如，第一和第二 0RF序列可編碼任意組合的凋亡前、前藥激活、單鏈抗體和毒素基因，如下 面的非限制性組合所例示的那樣p53和白喉毒素、p53和sr39TK、sr39TK和篦麻毒蛋白毒 素、白喉毒素和篦麻毒蛋白毒素，以及P53和BRCA-1。TR盒可作為裸質粒DNA應用於細胞，或者可如上所述利用病毒轉導到細胞中。在 一個實施方案中，在特定細胞或組織類型中選擇性地表達TR盒可能是有益的。為此目的， 可應用含有通過調控啟動子選擇性轉錄的TR盒的組織、細胞及條件特異性病毒。例如，如 果欲靶向特定的癌細胞類型，則可如上所述應用腫瘤特異性啟動子。預防細胞死亡的方法本技術的一個實施方案在於提供抑制細胞死亡的治療劑。本技術提供了抑制細胞
42死亡的治療劑，其由於激活細胞存活或抑制細胞死亡細胞通路通過抑制細胞死亡而能夠對 多種疾病發揮期望藥理作用。此類藥物包含具有上述作用的物質作為活性成分。本技術的一個應用在於產生改進患者治療功效，同時減小治療應用的有害副作用 的療法。一般而言，應用抗細胞死亡療法來解決與慢性和急性細胞死亡相關的臨床問題。在 本技術的上下文中，考慮TR調控的多肽能夠與其他治療如治療性手術、化療、放療、基因療 法、激素療法或免疫療法治療、以及可選的物理療法如誘導的低溫結合使用，以預防細胞死 亡。慢性退行性疾病將例示為任何在患者大部分的壽命中造成漸進性細胞死亡的疾病或病 況。急性退行性疾病將例示為任何造成即刻細胞死亡的劇烈創傷或病況。在本技術的方法中，優選患者是哺乳動物，更特別是人。多種退行性疾病可按照本 技術的方法治療。慢性退行性疾病的非限制性實例將包括神經疾病如阿爾茨海默病、帕金 森氏病以及其他組織疾病如肝臟壞死。與此類似，急性退行性疾病將例示為創傷性損傷，例 如急性脊髓損傷、急性神經損傷、創傷性腦損傷、骨折、中風、充血性心力衰竭和嚴重燒傷。一個優選的實施方案是在受試者中由於原位TR調控的基因表達或組合有效抑制 細胞死亡的其他治療而通過阻斷細胞死亡來預防細胞死亡的方法。作為舉例，TR調控的抗 凋亡基因的表達能夠減小凋亡細胞中的細胞死亡。如本文所用，術語「凋亡」是指稱為程序 性細胞死亡的生理過程。凋亡不同於其他形式的因為例如缺血或壞死而發生的細胞死亡， 因為凋亡是主動的、ATP依賴性形式的細胞死亡，其一般需要新RNA和蛋白質合成。通過細 胞特異性啟動子轉錄的、編碼抗凋亡基因如BCL2(B細胞CLL/淋巴瘤2)、BCL2L1 (Bcl-xl ； BCL2 樣 1)、BCL2A1 (Bfl-1/Al ；BCL2 相關蛋白 Al)、BAG1 (BCL2 相關抗死亡基因)、TRAF1 (腫 瘤壞死因子受體相關因子1)、BIRC3(C-IAP2 ；含3個重複的杆狀病毒凋亡蛋白抑制劑 (baculoviralinhibitor of apoptosis protein repeat-containing))、BIRC5 (存活蛋 白；含5個重複的杆狀病毒凋亡蛋白抑制劑)、BAK1(BCL2拮抗劑/殺傷蛋白(killer) 1)或 API5 (凋亡抑制劑5)的TR盒可例如應用重組病毒載體遞送到啟動子在其中優先有活性的 脊髓神經元中。TR盒在這些細胞中轉錄將允許在因創傷性脊髓損傷而經歷凋亡的脊髓神經 元中選擇性地翻譯抗凋亡蛋白。預期技術人員能夠基於其中優選預防細胞死亡的特定應用 而設計類似的治療方法。在一個優選的實施方案中，抗凋亡基因為BCL2。在另一優選的實 施方案中，優選的抗凋亡基因為TRAF 1。在本技術的上下文中，考慮TR調控的蛋白質能夠與其他細胞死亡療法同時應用。 TR補充療法可在其他治療之前或之後，時間間隔範圍從數分鐘到數周。在第一種治療和TR 治療分開應用的情況下，人們將會確保在各遞送時間之間的重要時間段不會過期，從而第 一活性劑與TR調控的治療劑仍將發揮有利的組合效應。另一實施方案考慮將基於TR的成像和抗凋亡/細胞死亡與標準死亡預防療法組 合的方法。提供了作為醫學治療副作用而對細胞死亡成像的優勢，而且這樣的話，給藥編碼 報告和抗死亡0RF的單順反子和雙順反子TR表達盒允許基於載體TR盒進行時間成像。例 如，癌症患者中的健康細胞由於通常靶向特定敏感器官的化療治療的副作用而往往經歷凋 亡。在一個實例中，可例如通過注射病毒載體向敏感器官遞送兩種TR表達載體，從而一種 載體表達TR調控的報告0RF，而第二種載體表達TR調控的抗凋亡0RF。在這種情況下，在 化療劑所致的細胞應激後的帽子非依賴性翻譯，將指導靶向器官中的TR依賴性細胞成像 和TR抗凋亡活性的補充治療。可選地，可將單個雙順反子TR盒轉導到敏感器官中，其中上遊0RF編碼報告0RF，而TR調控的0RF是抗凋亡蛋白。在這個實例中，上遊0RF將允許帽子 依賴性翻譯以及觀察應激之前的細胞轉導，從而可在化療應用之前觀察轉導效率，然後當 化療調控的死亡誘導了帽子非依賴性翻譯時則消失。因此，可通過改變TR盒組成和治療劑 應用的時機選擇來設計有效的成像_處理模式，預期這會最小化副作用和場外(off-site) 活性。為利用本方法，TR表達盒可作為裸質粒DNA應用於潛在的垂死細胞，即經歷應激 或細胞死亡的細胞，或者可如所述的那樣利用病毒轉導到細胞中。給藥路徑根據細胞損傷 類型、細胞在體內的定位之處等因素而變化多樣。技術人員能夠容易地確定特定情形下優 選的給藥路徑。例如，對於肌肉損傷，可應用含TR盒的脂質體或載體。在一個實施方案中， 在特定細胞或組織類型中選擇性地轉錄TR盒可能是有益的。為此目的，已經構建通過調控 啟動子選擇性轉錄的組織、細胞及條件特異性盒。例如，如果特定的細胞類型對治療誘導的 細胞死亡/凋亡敏感，則可如上所述應用細胞特異性啟動子。在另一實例中，如果特定的細 胞條件誘導細胞死亡，則由反應啟動子調控的TR盒可以作為治療劑應用。還考慮本方法可用來培養大規模細胞培養物。一般而言，當擴增細胞時，至少其中 的一些由於混合等原因會經歷細胞應激和/或凋亡。因而，通過用含抗凋亡基因的TR盒 轉化細胞，更少的細胞會經歷凋亡。例如，本方法可用在生物反應器如Wave Bioreactor 中，組合Cellbag —次性袋(disposable bag)進行細胞培養。參見例如美國專利 No. 6，544，788。試劑盒本技術提供了向期望檢驗化合物或活性劑對細胞應激/死亡的影響的實體提供 服務的方法。方法包括向實體提供本技術的細胞、組合和試劑用於藥理學篩選。當與體內 治療劑治療結合應用時，本技術提供了用於確定、成像和定量就在細胞或組織內造成的細 胞應激/死亡而言的醫學治療毒性的診斷試劑盒和方法。本文還提供了以任何數目的獨立容器、包裝、管、瓶等包含一種或多種本文所述組 分的試劑盒，或者所述組分可以以任意組合在此類容器中混合。試劑盒含有如上所述的TR 表達盒或用TR表達盒轉化的哺乳動物細胞。根據一個實施方案，這種試劑盒中的多個細胞 源自單個細胞系，其中每個細胞均含有在誘導細胞應激/死亡時經歷帽子非依賴性翻譯的 特異性TR盒。任選地，本技術的試劑盒還可以含有一種或多種試劑用於檢測TR盒的轉錄 (例如用於PCR擴增的盒特異性寡核苷酸)、來自TR盒的翻譯(例如抗體或酶底物)的試 劑，一種或多種已知誘導或抑制啟動子活性(從而是TR盒的表達)的對照化合物，一種或 多種產生明確的毒性反應(從而促進TR盒的應激/死亡特異性翻譯)的對照化合物，一種 或多種抑制、影響或激活藥物靶標或由TR盒表達的藥物代謝酶的分子或其他化合物，和/ 或有關使用試劑盒的載體、細胞或其他組分進行藥物篩選或驗證的書面信息。上述試劑盒 和本技術方法中所採用的寡核苷酸基於其在高嚴謹條件下與由TR盒合成的轉錄產物進行 特異性雜交的能力來選擇。選擇寡核苷酸序列的多種方法在本領域已知。在提供TR表達盒的情況下，優選表達盒作為載體例如質粒或病毒的一部分而提 供。本文所述的任何TR表達盒均可在試劑盒中應用。在一些實施方案中，在試劑盒中應用 的單順反子TR表達盒含有報告基因例如GFP或EGFP作為第一 0RF序列。在其他實施方案 中，雙順反子TR表達盒包括相同或者不同的兩個報告基因。試劑盒中提供的哺乳動物細胞優選來自哺乳動物細胞系，例如HEK293。藥物組合物本技術還提供了包含TR表達盒和可藥用載體的藥物組合物。TR表達盒可作為其 自身、作為載體的一部分或作為哺乳動物細胞的一部分提供。藥物組合物優選以生物有效量或治療有效量、單獨或組合一種或多種其他活性劑 向受試者給藥。治療有效量是當給予有效的時間段時實現期望的治療或臨床效果的劑量。核酸構建體的治療活性量可以根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重以及 組合物在個體體內引發期望反應的能力等因素而變化不等。可以調整劑量方案以提供最佳 治療反應。例如，可以每日給藥數個分份劑量，或者如治療情況的緊急所表明的那樣成比例 減小劑量。細胞結合形式核酸的治療有效量可以按照核酸的量或者以細胞當量來規定。因而有效量為約lng至約lg/kg受體體重，更優選約lng至10mg/kg，更優選約 lug至約lmg/kg。適合於內部給藥的劑量優選每單位含有(對於後面的劑量範圍)約 0. lmg至約lOOmg活性成分。活性成分基於組合物總重可以以重量計從約0. 5%到約95% 不等。可選地，表達核酸的細胞的有效劑量為每個受試者約104至約109個細胞，更優選約 106至約108個細胞，優選是分次劑量。細胞治療領域的技術人員能夠容易地調整這些劑量 而無需過度實驗。包含TR表達盒或由其轉染的細胞的藥物組合物可通過任何便利的方式，例如通 過注射或輸注給藥。優選的給藥路徑包括靜脈內、鞘內、腦室內、皮下、皮內和肌肉內路徑。 其他可能的路徑包括口服給藥、吸入或直腸給藥。視給藥路徑而定，本技術的藥物組合物可以包被在保護組合物免受可以使組合物 失活的酶、酸和其他自然條件作用的材料中。例如，可應用載體如脂質體(包括水包油包水 乳劑以及傳統脂質體(Strejan等人，(1984) J. Neuroimmunol 7:27))。在這樣的情況下， TR表達盒自身或作為載體的一部分可分散或各自存在於由附於脂質層的水性同心層構成 的微粒中。活性蛋白質優選存在於水性層中以及脂質層中、內側或外側，或者，無論如何存 在於一般稱為脂質體懸浮液的非均質系統中。疏水層或脂質層一般包含磷脂如卵磷脂和 鞘磷脂，類固醇如膽固醇，或多或少的離子表面活性物質如雙十六烷基磷酸、硬脂胺或磷脂 酸，和/或其他疏水性質的材料。可藥用載體(本文還稱為「載體」)在本領域還稱為賦形劑、運載體(vehicle)、 助劑(auxiliary)、佐劑或稀釋劑，一般為藥學惰性物質，賦予組合物適宜的稠度或形式， 而不減小組合物的功效。如果載體在給藥哺乳動物尤其是人時不產生不可接受的有害、 過敏或其他不適宜反應，則一般認為是可藥用的或藥理上可接受的。「可藥用載體」包括 例如任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、以及等滲劑和吸收延遲劑。 此類介質和活性劑用於藥物活性物質的用途在本領域公知。藥物的製劑在例如Hoover， John E. , Remington ' s Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co., Easton, Pennsylvania (1975)以及 Liberman, H. A.禾口 Lachman, L.編輯，Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, NewYork, N. Y. (1980)中討論。可注射製品例如無菌可注射水性或油質懸浮液可根據現有技術利用適宜的分散 劑或潤溼劑及懸浮劑來配製。無菌可注射製品還可以是處於無毒可接受稀釋劑或溶劑中的 無菌可注射溶液或懸浮液。可接受的運載體和溶劑中可以採用的有水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，傳統上採用無菌不揮髮油作為溶劑或懸浮介質。另外，脂肪酸如油酸可 用於製備注射物。可應用二甲基乙醯胺，表面活性劑，包括離子型和非離子型去垢劑，以及 聚乙二醇。溶劑和潤溼劑如上文所討論的那些的混合物也是有益的。可注射組合物的延長 吸收可通過在組合物中納入延遲吸收的活性劑例如，單硬脂酸鋁和明膠而實現。用於本文所討論化合物直腸給藥的栓劑可通過混合活性活性劑與適宜的非刺激 性賦形劑來製備，如可可脂、合成的單酸_、雙酸_或三酸甘油酯、脂肪酸或聚乙二醇，它們 在常溫為固態，但在直腸溫度為液態，因此將會在直腸中溶解而釋放組合物。用於口服給藥的固體劑型可以包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在此類固 體劑型中，化合物通常與一種或多種適合於所示給藥路徑的佐劑混合。如果口服給藥，則化 合物可與乳糖、蔗糖、澱粉粉末、鏈烷酸纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、 氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽及鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙 烯醇混合，然後壓片或裝入膠囊以便利地給藥。此類膠囊劑或片劑可含有控釋製劑，這可通 過將活性化合物分散在中羥丙基甲基纖維素中提供。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型 還可包含緩衝劑如檸檬酸鈉、或碳酸鎂或鈣或碳酸氫鎂或鈣。片劑和丸劑可另外製備為具 有腸衣。出於治療目的，用於胃腸外給藥的製劑可為水性或非水性等滲無菌注射液或懸浮 液的形式。這些溶液和懸浮液可由具有一種或多種提及用於口服給藥製劑的載體或稀釋劑 的無菌散劑或顆粒劑來製備。化合物可溶於水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花 生油、芝麻油、苯甲醇、氯化鈉和/或多種緩衝液中。其他佐劑和給藥模式在藥學領域廣為 人知。用於口服給藥的液體劑型可包括含有本領域常用惰性稀釋劑如水的可藥用乳液、 溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。此類組合物還可包含佐劑，例如潤溼劑、乳化劑和懸浮劑以及甜 味劑、矯味劑和芳香劑。在可霧化的氣霧劑製品中，本技術的藥物組合物可與固態或液態惰性載體材料組 合提供。此類製品可包裝在擠瓶(squeeze)中，或與加壓的揮發性、通常是氣態推進劑混 合。氣霧劑製品除了本技術的組成外，還可含有溶劑、緩衝劑、表面活性劑和抗氧化劑。微生物作用的預防可以通過多種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔 丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實現。例示性的表達盒下表1和2分別描述了眾多單順反子和雙順反子TR盒。如先前所討論的那樣，單 順反子TR盒包含有效連接於3』 0RF序列的TR元件之一，而雙順反子盒包含有效連接於上 遊和下遊0RF序列的TR元件。例示性的單順反子盒如SEQ ID NO :3_4所示，而雙順反子序 列例示為SEQ ID N0:5-6。出於兩個表格的目的，能夠應用的具體啟動子、TR元件和0RF序 列在上文更詳細地說明。表1.單順反子TR表達盒啟動子TR元件 0RF序列組成型TR& 報告基因組成型TRplp 報告基因誘導型TR& 報告基因
46誘導型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應基因 反應基因 組成型 組成型 誘導型 誘導型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應基因 反應基因 組成型 組成型 誘導型 誘導型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應基因 反應基因 組成型 組成型 誘導型 誘導型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應基因 反應基因 組成型 組成型
TR, TR,
pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR,
-pip
dm
-pip
dm
pip
dm
pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR,
-pip
dm
-pip
dm
pip
dm
pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR
-pip
dm
-pip
dm
pip
TR, TR, TR,
dm
pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR,
-pip
dm
-pip
dm
pip
dm
pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR
-pip
dm
-pip
dm
pip
報告基因 報告基因 報告基因 報告基因 報告基因 報告基因 報告基因
細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 細胞毒性腫瘤抑制子 毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因
毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 凋亡前基因 凋亡前基因
誘導型TRdm
誘導型TRplp
組織特異性TRdm
組織特異性TRplp
腫瘤特異性TRdm
腫瘤特異性TRplp
反應基因TRdm
反應基因TRplp
表2.雙順反子TR表達盒
啟動子 第一 0RF序列
組成型報告基因
組成型報告基因
誘導型報告基因
誘導型報告基因
組織特異性報告基因
組織特異性報告基因
腫瘤特異性報告基因
腫瘤特異性報告基因
反應基因報告基因
反應基因報告基因
組成型報告基因
組成型報告基因
誘導型報告基因
誘導型報告基因
組織特異性報告基因
組織特異性報告基因
腫瘤特異性報告基因
腫瘤特異性報告基因
反應基因報告基因
反應基因報告基因
組成型報告基因
組成型報告基因
誘導型報告基因
誘導型報告基因
組織特異性報告基因
組織特異性報告基因
腫瘤特異性報告基因
腫瘤特異性報告基因
反應基因報告基因
凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因
TR元件 第二 0RF序列 TRdffl 報告基因 TRplp 報告基因 TRdffl 報告基因 TRplp 報告基因 TRdffl 報告基因 TRplp 報告基因 TRdffl 報告基因 TRplp 報告基因 TRdffl 報告基因 TRplp 報告基因 TRdffl 細胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl毒素基因
反應基因毒素基因TRdm報告基因
反應基因毒素基因TRpip報告基因
組成型前藥激活基因TRdm報告基因
組成型前藥激活基因TRpip報告基因
誘導型前藥激活基因TRdm報告基因
誘導型前藥激活基因TRpip報告基因
組織特異性前藥激活基因TRdm報告基因
組織特異性前藥激活基因TRpip報告基因
腫瘤特異性前藥激活基因TRdm報告基因
腫瘤特異性前藥激活基因TRpip報告基因
反應基因前藥激活基因TRdm報告基因
反應基因前藥激活基因TRpip報告基因
組成型凋亡前基因TRdm報告基因
組成型凋亡前基因TRpip報告基因
誘導型凋亡前基因TRdm報告基因
誘導型凋亡前基因TRpip報告基因
組織特異性凋亡前基因TRdm報告基因
組織特異性凋亡前基因TRpip報告基因
腫瘤特異性凋亡前基因TRdm報告基因
腫瘤特異性凋亡前基因TRpip報告基因
反應基因凋亡前基因TRdm報告基因
反應基因凋亡前基因TRpip報告基因
除表1和2所示的表達盒之外，下表3和4還描述了單順反子和雙順反子TR表達
盒的具體實例。本領域技術人員能夠容易地意識到，表3和4中描述的組合是作為舉例顯 示而非限制。表3.單順反子TR表達碧監的具體實例
啟動子TR元件ORF序列
巨細胞病毒即時早期(CMV) TRdm螢火蟲螢光素酶
CMVTRpip螢火蟲螢光素酶
金屬硫蛋白-ITRdm螢火蟲螢光素酶
金屬硫蛋白-ITRpip螢火蟲螢光素酶
突觸蛋白ITRdm螢火蟲螢光素酶
突觸蛋白ITRpip螢火蟲螢光素酶
甲胎蛋白TRdm螢火蟲螢光素酶
甲胎蛋白TRpip螢火蟲螢光素酶
熱擊蛋白70TRdm螢火蟲螢光素酶
熱擊蛋白70TRpip螢火蟲螢光素酶
CMVTRdmp53
CMVTRpipp53
50
甲胎蛋白花蟲螢光素酶TRpip胸苷激酶sr39
熱擊蛋白70花蟲螢光素酶TRdm胸苷激酶sr39
熱擊蛋白70花蟲螢光素酶TRpip胸苷激酶sr39
CMV花蟲螢光素酶TRdm胱天蛋白酶3
CMV花蟲螢光素酶TRpip胱天蛋白酶3
金屬硫蛋白-I花蟲螢光素酶TRdm胱天蛋白酶3
金屬硫蛋白-I花蟲螢光素酶TRpip胱天蛋白酶3
突觸蛋白I花蟲螢光素酶TRdm胱天蛋白酶3
突觸蛋白I花蟲螢光素酶TRpip胱天蛋白酶3
甲胎蛋白花蟲螢光素酶TRdm胱天蛋白酶3
甲胎蛋白花蟲螢光素酶TRpip胱天蛋白酶3
熱擊蛋白70花蟲螢光素酶TRdm胱天蛋白酶3
熱擊蛋白70花蟲螢光素酶TRpip胱天蛋白酶3一般方法如本文所用的分子生物學技術、生物化學技術和微生物技術在本領域公知 常用，並描述在例如 Sambrook J 等人(1989)，Molecular Cloning :ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor (2001)及其第三版；Ausubel，F. M. (1987)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associatesand Wiley-interscience ； Ausubel, F. M. (1989)，Short Protocols inMolecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-interscience ；Innis，M. A. (1990)，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications，Academic Press ；Ausubel, F. M. (1992)，Short Protocols in MolecularBiology :A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub. Associates ；Ausubel，F. M. (1995)，Short Protocols inMolecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub. Associates ；Innis, M. A.等人(1995)，PCRStrategies，Academic Press ；Ausubel，F. M. (1999)，Short Protocols inMolecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology，Wiley，且為年更新；Sninsky， J.J.等人(1999)，PCRApplications Protocols for Functional Genomics，Academic Press ；Specialissue， Jikken Igaku [Experimental Medicine] 〃 Idenshi Donyu &Hatsugenkaiseki Jikkenho [Experimental Method for Gene introduction&Expression Analysis] ，Yodo-sha，1997等出版物中。每一種這些出版物中的相關部分(或者很可能 是全文)併入本文作為參考。任何技術可以用在本文將核酸分子引入到細胞中，包括例如轉化、轉導、轉 染等。此類核酸分子引入技術在本領域公知常用，並描述在例如Ausubel F.A.等人 編 輯(1988)，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York，N. Y.； Sambrook J 等人(1987)Molecular Cloning :ALaboratory Manual，第 二片反及其第 三 片反，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N. Y. ；Special issue，Jikken Igaku [Experimental Medicine] Experimental Method for Geneintroduction&Expression Analysis"，Yodo-sha，1997 等出版物中。基因引入可通過如 本文所述的方法如Northern印跡分析和Western印跡分析或其他公知常用技術來確認。本技術多肽的胺基酸缺失、取代或添加可通過作為公知技術的位點特異性 誘變方法來進行。一個或幾個胺基酸缺失、取代或添加可按照Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 二 片反，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology，增刊 1 至 38，John ffiley&Sons (1987-1997) ；Nucleic Acids Research,10,6487(1982) ；Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,79,6409(1982) ；Gene,34, 315 (1985) ；Nucleic Acids Research,13,4431 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci.USA,82, 488(1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,81,5662(1984) ；Science,224，1431(1984) ；PCT W085/00817(1985) ；Nature, 316,601 (1985)等出版物中所述的方法來進行。
實施例提供如下非限制性的實施例以進一步舉例說明本技術。本領域技術人員應當理 解，如下實施例中公開的技術代表發明人發現在實施本技術方面運轉良好的方法，因而可 視為構成其實施方式的實施例。然而，本領域技術人員根據本發明公開應當理解，可對公開 的具體實施方案做出許多改變而依然獲得同樣或相似的結果，而不偏離本技術的精神和範圍。 實施例I-構建單順反子TR盒該實施例描述了含有「單順反子」盒(圖2)的哺乳動物表達載體的製備，其允許 在細胞應激和死亡期間在翻譯調控(TR)序列的控制下選擇性地翻譯可讀框(0RF)。該實施 例中描述的PTR-0RF質粒構建體含有哺乳動物啟動子，有效連接於單個蛋白質編碼序列的 TR元件，以及mRNA多聚腺苷酸化信號(即，TR表達盒)。A.製備TR調控的表達盒為了證明TR調控翻譯的可行性和功效，製備了初始系列的含TR表達盒的哺乳 動物表達載體。pTR-EYFP表達載體基本如下構建。將對應於PLP-16至+858的DNA片段 和DM20cDNA序列克隆到pEYFP-Nl載體中，生成pPLPeyfp和pDM20eyfp表達載體(圖1)。 PEYFP-N1質粒的哺乳動物表達序列含有CMV早期啟動子/增強子，EYFP 0RF和SV40早期 多聚腺苷酸化信號。pEYFP-m骨架中的其他哺乳動物特異性元件包括SV40複製起點，由融 合於新黴素磷酸轉移酶基因的SV40早期(大T)基因啟動子和來自單純皰疹病毒胸苷激酶 基因的多聚腺苷酸化信號組成的盒。此表達盒所提供的新黴素抗性可用作為可選擇標記， 來製備穩定轉化的哺乳動物細胞。為在大腸桿菌中選擇和生長，SV40啟動子上遊的細菌啟 動子提供了卡那黴素抗性，而PUC19複製起點允許質粒在大腸桿菌中增殖。pPLPeyfp和pDM20eyfp表達載體的第一輪寡核苷酸定點誘變應用內部寡核苷酸 引物集合[L205. 5w(SEQ ID NO 7)和 L205.3w(SEQ ID NO 8) ；L235. 5(SEQ ID NO 9)和 L235. 3(SEQ ID NO :10)]，以分別去除TR&序列中核苷酸511和598處以及TRplp序列中核 苷酸616和703處的翻譯起始密碼子。該嘗試中所用的誘變方法如TK 0RF的QuikChange 誘變所述那樣，參見後續章節。應用5』特異性引物集合[RI-st0p_s(SEQ ID N0:11)和 RI-stop_a(SEQ ID NO :12)]的接著發生的突變改變了兩種TR序列，從而通過插入終止密 碼子並去除5』鄰近AUG起始密碼子而消除了帽子依賴性翻譯。隨後，3』特異性引物集合
55[H-Xh-Xb_s (SEQ ID NO 13)和 H_Xh_Xb_a (SEQ ID NO 14)去除了 PLP/DM20 翻譯終止密碼 子，並在TR序列和EYFPAUG密碼子之間的間插序列中引入了 Hindlll、Xhol和Xbal位點。 定點誘變的方法在本領域公知(例如，QuikChange誘變試劑盒，Stratagene)，並在該實施 例的後續章節討論。這些構建體命名為pTRplp_EYFP和PTR&-EYFP (圖2)。因而，PTRplp_EYFP 質粒中的TR表達盒由CMV即時早期啟動子/增強子、PLP TR序列、EYFP 0RF和SV40多聚 腺苷酸化信號組成。與此類似，pTRdffl-EYFP質粒中的TR表達盒含有CMV啟動子/增強子、 DM20TR序列、EFYP 0RF和SV40多聚腺苷酸化信號。這些構建體及後續衍生物的序列身份利用任何或全部如下測序引物得到了證實 SK15(SEQ ID NO :15)、SK16(SEQ ID NO 16)、SK17 (SEQ IDNO : 17)、EYFP (-) 1 (SEQ ID NO: 18)、EYFP(-)2(SEQ ID NO :19)、BAC_1(SEQ ID NO :20)、BAC_2(SEQ ID NO :21)或BAC-3(SEQ ID NO 22)。B.選擇ORF並克隆到TR盒中為證明多種ORF的TR調控，通過改變TR調控的ORF創建了許多不同的質粒。利 用單順反子PTRplp/dm-EYFP質粒的衍生物通過修飾一些或所有這些功能元件來構建其他 單順反子TR-0RF載體，包括(a)交換pCMV IE啟動子，(b)去除EYFP 0RF，和/或(c)視 需要添加或減少限制性位點。為將非EYFP ORF克隆到與EYFP ORF相同的位置，利用定 點誘變以 AUGback_s(SEQ ID NO :23)和 AUGback_a (SEQ ID NO :24)引物集合在 H-Xh-Xb 序列上遊插入了兩個核苷酸。這允許後續的0RF特異性PCR引物集合包括1)共同的5』 序列，以完全相同的Kozak共有序列替換了天然的翻譯起始密碼子，和2)5』 Hindlll和 3，Xhol限制性酶位點，其允許定向克隆。在用Hindlll和Xhol消化後，將這些0RF特異性 PCR 片段克隆到 pTRplp-0RF 和 PTR&-0RF 載體中。EYFP、fLuc、TK、CAT 和 LacZ ORF 分別由 pEYFP-Nl (Clontech)、phCMV-LUC-FSR (Gen 1 antis)、pHSV106 (GenBank sequenceV00470)、 pCAT-增強子(Promega)和pAAV_LacZ (Stratagene)質粒載體進行PCR擴增。製備了如下 例示性的質粒pTRplp-fLuc，其包括pip TR元件以及利用 Luc-1(SEQ ID NO :25)和 Luc_2 (SEQ ID NO 26)引物集合PCR擴增的螢火蟲螢光素酶(fLUC)ORF;pTI^-fLuc，其包括dm20TR元件以及利用Luc_l和Luc_2引物集合PCR擴增的fLUC 0RF ；pTRplp-TK，其包括 pip TR 元件以及利用 TK-1(SEQ ID NO :27)和 TK-2 (SEQ ID NO: 28)引物集合PCR擴增的HSV胸苷激酶(TK) ORF ；pTR^-TK,其包括dm20TR元件以及利用TK-1和TK-2引物集合PCR擴增的TK 0RF ；pTRplp-CAT，其包括 pip TR 元件和利用 CAT-1 (SEQ ID NO :29)和 CAT-2 (SEQ ID NO: 30)引物集合PCR擴增的細菌氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)ORF;pTR^-CAT,其包括dm20TR序列以及利用CAT-1和CAT-2引物集合PCR擴增的CAT 0RF ；pTRplp-LacZ,其包括 pip TR 序列以及利用 LacZ-1 (SEQ ID NO 31)和 LacZ-2 (SEQ ID NO 32)引物集合PCR擴增的、編碼半乳糖甘酶蛋白的細菌LacZ 0RF ；和pTR^-LacZ,其包括dm20TR元件以及利用LacZ_l和LacZ_2引物集合PCR擴增的 LacZ 0RF。
C.定點誘變TR調控的0RF該實施例表明可改變TR調控的0RF，以改善由TR盒翻譯的蛋白質的功能特徵，或 消除任何可能干擾TR調控的RNA序列/結構。在該實施例中，利用Sr39-1 (SEQ ID NO 33) 和Sr39-2(SEQ ID NO 34)引物集合在TKORF中插入了 5個TK sr39胺基酸突變(Gambhir 等人；Proc Natl Acad SciUSA ；97 :2785_2790)。與野生型TK蛋白相比，TKsr39蛋白展示出有益的動力學特性，例如前藥結合增強 (對GCV比野生型蛋白高83倍)，在較低前藥濃度時前藥介導的細胞殺傷增加，以及代謝物 示蹤物結合更優(例如18F標記的噴昔洛韋)。在後一種情況下，這種增強的結合效率改進 了非侵入性成像技術如正電子成像術。為驗證TR盒中的定點誘變過程和產生改進的TK標記蛋白，利用寡核苷酸指導的 誘變在野生型TR-0RF序列中插入TKsr39DNA突變。定點誘變方法在本領域公知(例如， QuikChange定點誘變試劑盒，Stratagene)。基本上，構建了含有期望突變的寡核苷酸引物 (例如Sr39-1和Sr39-2)。以Sr39引物集合對pTRplp_TK和pTRdm_TK模板進行PCR擴增 (95 °C 30秒，1個循環；95°C 30秒、55°C 1分鐘、68°C 12分鐘，12個循環)，在呈指數擴增的 DNA鏈中摻入了突變。擴增後，DNA用特異性識別甲基化和半甲基化DNA的Dpnl限制性酶 消化。由於PTRplp-TK和pTRdm-TK模板在甲基化陽性細菌菌株中生長，Dpnl消化在細菌轉化 之前除去了親本模板。轉化的細菌在選擇性培養基中塗板，並利用分離的菌落製備DNA小 量製備物，通過限制性圖譜分析和DNA測序對其進行分析。所得的質粒稱為PTRplp-TKsr39 和 pTI^-TKsrfg。PTRplp_TKsr39 載體在 pHSV106TK 0RF 中包括 pip TR 元件以及 HSV-lTKsr39 突變(SEQ IDN0 ;39)。與此類似，pTRdm_TKsr39 質粒在 pHSV106TK 0RF 中含有 dm20TR 元件以及 TKsr39 突變(SEQ ID NO 40)。實施例II-構建雙順反子TR盒該實施例描述了含有雙順反子TR盒(圖3)的哺乳動物表達載體的製備，其允許 帽子依賴性地翻譯TR盒上遊的0RF，和在細胞應激和死亡期間在翻譯調控(TR)元件的控制 下帽子非依賴性地翻譯0RF。這些載體允許由單個mRNA研究帽子依賴性和帽子非依賴性翻 譯過程。A.在TR-EYFP盒上遊插入螢火蟲螢光素酶0RF通過在含EYFP基因(0RF1)的TR盒上遊插入螢火蟲螢光素酶(fLuc)ORF(稱為 0RF2)來構建雙順反子載體。phCMV-LUC-FSR載體(Genlantis)用EcoRI消化，純化含fLuc 序列的限制性片段，並克隆到PTRplp-EYFP和PTR&-EYFP載體(圖3)的EcoRI位點中。fLuc 0RF的取向通過限制性圖譜分析來驗證，並回收正向(有義)和反向(反義)插入體。有義 載體稱為 pfLuc-TRplp-EYFP 和 pfLuc-TI^-EYFP 質粒，而反義載體稱為 pcuLf-TRplp_EYFP 和 pcuLf-TR^-EYFP 質粒。有義p0RF-TR-0RF載體編碼單個mRNA物質，其允許上遊0RF組成型、穩態、帽子依 賴性地翻譯，而有效連接於TR元件的0RF在細胞應激和死亡期間選擇性、帽子非依賴性地 翻譯。反義雙順反子載體作為TR活性的對照，提供大段的上遊mRNA序列，其在結構上阻斷 TR調控的0RF在正常細胞中的帽子依賴性翻譯。在應激和垂死細胞中，來自反義載體的蛋 白質合成是TR調控的帽子非依賴性翻譯。例如，pfLuc-TRplp-EYFP載體編碼單個mRNA物質，其組成型地呈現出fLuc 0RF的帽子依賴性翻譯，和在細胞應激和死亡期間EYFP 0RF自pip TR元件的選擇性帽子非依賴 性翻譯。與此類似，單個mRNA物質由pfLuc-TI^-EYFP盒轉錄，其提供fLUC 0RF的帽子依 賴性翻譯，和在細胞應激和死亡期間EYFP 0RF自dm20TR元件的帽子非依賴性翻譯(圖4)。實施例III-構建和產生用於在哺乳動物細胞中表達TR盒的重組病毒載體設計重組腺病毒相關病毒(rAAV)和杆狀病毒(rBAC)載體，以產生能夠以TR表達 盒轉導哺乳動物細胞的感染性病毒粒體。為舉例說明，製備了一系列指導TR表達盒在哺乳 動物細胞中由CMV-IE啟動子/增強子組成型表達的rAAV和rBAC病毒。A.向重組AAV (rAAV)病毒粒體中插入TR盒 PAAV-TRplp 和 pAAV_TRdm 轉移(或穿梭)載體衍生自 pAAV-MCS 載體(Stratagene)。 為允許細菌繁殖，pAAV-MCS骨架提供了(1)細菌內醯胺酶基因，(2)pUC19複製起點，和 ⑶進行單鏈DNA合成的H複製起點。為進行AAV病毒生產和哺乳動物基因表達，pAAV-MCS 質粒含有側接CMV IE啟動子/增強子的左側和右側腺伴隨病毒-2 (AAV2)反向末端重複 (ITR)、CMV IE轉錄起始位點、珠蛋白內含子、用於克隆的多個獨特的限制性位點(多克 隆位點或MCS)和人生長激素多聚腺苷酸化信號(圖5)。通過用EcoRI/XhoI消化適當的TR-0RF表達質粒並克隆到pAAV-MCS載體的 EcoRI/XhoI 位點來產生 TR-0RF 盒。例如，PTRplp-fLUC 和 pTRdm-fLUC 質粒可用 EcoRI/XhoI 消化，並克隆到pAAV-MCS載體的EcoRI/XhoI位點，以創建下文所列的pAAV_TR_LUC穿梭載 體。在限制性圖譜分析和/或DNA測序後，可產生如下pAAV-TR-0RF穿梭載體的實例pAAV-TRplp-EYFP,其含有 pip TR 序列和 EYFP 0RF ；pAAV-TR^-EYFP,其含有 dm20TR 元件和 EYFP 0RF ；PAAV-TRplp-fLuc，其含有pip TR元件和螢火蟲螢光素酶0RF ；pAAV-TI^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；pAAV-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；pAAV-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；PAAV-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；pAAV-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；pAAV-TRplp_CAT，其含有pip TR元件和細菌氯黴素乙醯基轉移酶(CAT) 0RF ；pAAV-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；PAAV-TRplp-LacZ,其含有 pip TR 序列和細菌 LacZ 0RF ；禾口pAAV-TR^-LacZ,其含有 dm20TR 元件和 LacZ 0RF.為回收重組AAV2病毒顆粒，利用需要pAAV穿梭載體、pAAV-RC(具有複製能力的 輔助質粒)和pHelper (腺病毒輔助質粒)的三質粒轉染方法轉染HEK293細胞。rAAV三 質粒方法在本領域公知，並在下文簡要說明。pAAV穿梭載體與7. 3kb的pAAV-RC載體和 11. 6kb的pHelper載體一起共轉染到包裝細胞系中。pAAV-RC載體編碼感染性病毒粒體所 需的r印(DNA複製蛋白)和cap (AAV2衣殼蛋白)基因。pHelper載體含有缺失的腺病毒基 因組，其表達AAV生產所需的多種腺病毒基因。由三種質粒表達的蛋白質與腺病毒E1A和 E1B蛋白(由HEK293細胞提供)之間的遺傳互補允許在pAAV穿梭載體中左側和右側反向 末端重複(L-ITR和R-ITR)處的重組之後生成包裝的病毒粒體。
對於該實施例，利用標準磷酸鈣轉染方案用15iig pAAV-TR-ORF穿梭載體或 15 u gpAAV-PLP/DM20eyfp 質粒、10 u g pAAV-RC 質粒和 10 u gpHelper 載體轉染 HEK293 細 胞。轉染後，HEK293細胞孵育總計72小時。此時收集細胞，除去培養基，並利用三次凍融 循環產生裂解物。通過2500rpm離心10分鐘製備澄清的裂解物。能夠以這種方式生成的rAAV-TR-ORF病毒的具體實例包括rAAV-TRplp-EYFP，其含有有效連接於 EYFP 0RF 的 pip TR 元件；rAAV-TR^-EYFP,其含有連接於 EYFP 0RF 的 dm20TR 序列；rAAV-TRplp-fLuc，其包括pip TR元件和螢火蟲螢光素酶0RF ；rAAV-TR^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；rAAV-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rAAV-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rAAV-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rAAV-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rAAV-TRplp-CAT,其含有 pip TR 元件和 CAT 0RF ；rAAV-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；rAAV-TRplp-LacZ,其含有 pip TR 序列和細菌 LacZ ORF ；禾口rAAV-TR^-LacZ,其含有 dm20TR 元件和 LacZ ORF.B.製備轉導TR表達盒的重組杆狀病毒(rBAC)病毒粒體利用pBAC-1穿梭轉移骨架(Novagen)製備一組哺乳動物表達載體。商業pBAC -l 載體是設計用來通過polh啟動子在昆蟲細胞中克隆和表達重組蛋白質的杆狀病毒轉移質 粒。該商業pBAC-1質粒含有(1)細菌0 -內醯胺酶基因，以及(2)pUC19複製起點和(3)fl 複製起點(圖5)。該載體還含有polh啟動子和一系列常用來克隆0RF以在昆蟲細胞中表 達的獨特的限制性位點。側接昆蟲表達元件的是DNA重組所需的杆狀病毒序列，即晚期表 達因子2(lef-2)和可讀框1629 (orf 1629)基因。以pBAC穿梭載體和複製缺陷型杆狀病毒 DNA轉染昆蟲細胞，允許lef-2/orfl629穿梭載體序列與病毒DNA中同源序列之間的重組， 並生成具有複製能力的重組病毒。為提供哺乳動物表達，通過連接以Bglll和BamHI消化的pBAC_l載體，除去了病 毒polh啟動子和polh轉錄起始位點，從而產生了 pBAC polh-質粒。對於該實施例，CMV IE啟動子/增強子利用向PCR片段中引入5』StuI位點和3』EcoRI位點的寡核苷酸引物集 合[CMV-1(SEQ ID NO 35)和 CMV-2 (SEQ ID NO 36)]進行 PCR 擴增。擴增的 DNA 用 StuI 和EcoRI切割，並定向克隆到pBAC polh-載體的StuI/EcoRI位點中，得到pBAC_CMV質粒。 為引入mRNA多聚腺苷酸化信號，使兩種含有側接Avrll和SphI限制性位點的SV40早期多 聚腺苷酸化信號的互補寡核苷酸[PolyA-l(SEQ ID NO :37)和PolyA-2 (SEQ ID N0:38)]退 火，並克隆到pBAC-CMV載體的Avrll/SphI位點，以創建pBAC-CMV-PolyA質粒。用EcoRI/NotI 從 PTRplp_EYFP 和 pTRdm_EYFP 質粒中移出 TR-0RF 盒，並克隆到 pBAC-CMV-PolyA載體的EcoRI/NotI位點，以創建下文所列的pBAC穿梭載體。在相關的方 法中，下文所列的其他pBAC穿梭載體通過用EcoRI/XhoI消化適當的TR-0RF表達質粒並克 隆到pBAC-CMV-PolyA載體的EcoRI/Xhol位點中而產生。在限制性圖譜分析和/或DNA測序後，產生了如下pBAC-TR-0RF穿梭載體的具體
59實例pBAC-TRplp-EYFP,其含有 pip TR 序列和 EYFP 0RF ；pBAC-TR^-EYFP,其包括 dm20TR 元件和 EYFP 0RF ；PBAC-TRplp-fLuc，其包括pip TR元件和螢火蟲螢光素酶0RF ；pBAC-TI^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；pBAC-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；
pBAC-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；PBAC-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；pBAC-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；PBAC-TRplp-CAT,其含有pip TR元件和細菌氯黴素乙醯基轉移酶(CAT) 0RF ；pBAC-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；PBAC-TRplp-LacZ,其包括 pip TR 序列和細菌 LacZ 0RF ；禾口pBAC-TR^-LacZ,其包括 dm20TR 元件和 LacZ 0RF.產生感染性rBAC病毒粒體的方法在本領域公知。簡言之，過程可如下文所概述的 那樣予以說明。重組杆狀病毒顆粒的回收通過用pBAC-TR穿梭載體和BacVector-2000 (或 BacVector-3000)三重切割病毒 DNA (Novagen)轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9)細胞來實現。遺傳重組導致CMV-TR盒插入到杆狀病毒基因組中，並包裝到BAC病毒 粒體中。在該實施例中，將500ng穿梭載體與lOOng BacVector三重切割病毒DNA混合，並 利用昆蟲Genejuice轉染試劑(Novagen)轉染500，000Sf-9細胞1小時。細胞在無血清 BacVector昆蟲細胞培養基中洗滌，並覆上完全培養基(含5%胎牛血清)4_5天。此時收集 培養基覆蓋物(overlay)中的細胞，並通過2000rpm離心10分鐘沉澱。將這種原代病毒培 養基原液轉移到無菌管中，並於4°C貯存。利用上文所述的培養基覆蓋物方法通過Sf-9細 胞低滴度感染(感染性0. lpfu/細胞)來製備高滴度rBAC病毒原液(稱為二代或三代原 液)。rBAC滴度通過標準蝕斑覆蓋物(plaque overlay)技術來確定。利用rBAC病毒DNA 製備物的限制性圖譜分析來驗證病毒的完整性和組成。能夠以這種方式生成的rBAC-TR-0RF病毒的具體實例包括rBAC-TRplp-EYFP,其包括有效連接於 EYFP 0RF 的 pip TR 元件；
rBAC-TR^-EYFP,其包括連接於 EYFP 0RF 的 dm20TR 序列；rBAC-TRplp_fLuc，其包括pip TR元件和螢火蟲螢光素酶0RF ；rBAC-TR^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；rBAC-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rBAC-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rBAC-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rBAC-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rBAC-TRplp-CAT,其含有 pip TR 元件和 CAT 0RF ；rBAC-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；rBAC-TRplp-LacZ,其包括 pip TR 序列和細菌 LacZ 0RF ；
和 rBAC-TRdm-LacZ，其包括 dm20TR 元件和 LacZ 0RF。
實施例IV-製備穩定表達TR-0RF盒的哺乳動物細胞
A.細胞培養所有哺乳動物細胞於37°C、5% C02維持在完全培養基中，其為Dulbecco改良 Eagle 培養基(DMEM) (Invitrogen Life Technologies)，補充有 10%胎牛血清(Hyclone)、 3. 7g/L 碳酸氫鈉和 30-50mg/L 硫酸慶大黴素(Invitrogen Life Tech nologies)。B.轉染並分離穩定轉化的哺乳動物細胞哺乳動物轉染利用磷酸鈣轉染方法(利用試劑如Prefeetion 哺乳動物轉染系 統，Promega)或非脂質Transfectol轉染試劑(Continental LabProducts)如賣主所述進 行。在該實施例中，用多種單順反子pTR-ORF載體轉染HEK293細胞，這包括PTRplp_EYFP、 pTR^-EYFP、pTRplp-fLuc、pTR^-fLuc、pTRplp_TK、pTRdm_TK、pTRplp_CAT、pTRdm_CAT、pTRplp_LacZ 和pTRdm-LacZ載體。在相關的嘗試中，將雙順反子載體pfLuC-TRplp-EYFP、pfLuC-TRdm-EYFP、 pcuLf-TRplp-EYFP 和 pcuLf-TRm-EYFP 引入到 HEK293 細胞中。在轉染之前，哺乳動物細胞生長至50-70%匯合，並在添加DNA/轉染試劑混合物 之前1-3小時補料。標準轉染試驗含15iig質粒DNA。各DNA/轉染試劑混合物與細胞一 起孵育過夜。此時替換培養基，再孵育24小時，並在轉染後大約48小時應用G418選擇性 DMEM培養基(500 u g/mL)。每兩天更換選擇培養基，為期2_3周，期間大部分細胞剝落，而 G418抗性「原代」集落出現。視集落的數目和密度而定，在庫分離或集落亞克隆之前使存活細胞在無G418培 養基中生長3-5天。一旦集落達到適當大小，通過相差或螢光顯微鏡檢研究各板，並標出 集落進行亞克隆。將火焰消毒的克隆環置於具有薄塗層脂肪的集落周圍，並通過胰蛋白 酶-EDTA(Invitrogen)處理取出細胞。傳代至24孔板之後，在鋪板後24-48小時對亞克隆 補料，並生長至80%匯合。可選地，選擇板上的所有「原代」集落收集在一起於一份樣品，轉 移到100mm皿或T-75燒瓶中，鋪板後24小時補料，並生長至80%匯合。收集的集落被稱為 穩定細胞「庫」。在一些情形下，由合併的樣品製備穩定集落。對於這種嘗試，在集落亞克隆之前稀 釋細胞並重新鋪板。細胞庫以1 2500至1 5000範圍的比例進行稀釋，傳代至100mm 皿中，並使之生長成為集落(約1周)。所得集落隨之如原始選擇板所述進行加工。每種細胞分離物利用一種或多種實施例V-VIII中所述的細胞毒性測定法來測 定，以驗證TR-0RF mRNA在應激或垂死細胞中的表達和選擇性翻譯。候選細胞來源，不論是 亞克隆還是庫，冷凍貯存。對於冷凍，細胞生長至90%匯合，用胰蛋白酶-EDTA處理(室溫 1分鐘)，每100mm皿收集在2mL冷凍培養基(90%胎牛血清，10% DMS0)中，並轉移到冷凍 管(1ml細胞/管)中。冷凍管於慢速冷凍容器的-70/-80°C冷凍器中放置16-24小時，然 後浸入液氮中進行長期貯存。對於該實施例，從PTRplp-EYFP、pTRdm-EYFP、PTRplp-fLuc 和 pTRdm-fLuc 質粒 轉染後分離的集落中製備穩定的HEK293細胞系。可選地，在用pTRplp-TK、pTRdm_TK、 pTRplp-CAT,pTR^-CAT,PTRplp-LacZ 和 pTRdm_LacZ 表達載體以及雙順反子 pfLuc_TRplp-EYFP、 pfLuc-TR^-EYFP, pcuLf-TRplp-EYFP 和 pcuLf-TRdm_EYFP 質粒轉染後分離 HEK293 庫。如下 文描述的細胞毒性測定之一所確定的那樣，每種細胞分離物組成型地表達獨特的單順反子 TR-0RF或自CMV IE啟動子/增強子的雙順反子0RF2_TR-0RFlmRNA，和在應激或垂死細胞 中選擇性地翻譯有效連接於TR元件的0RF。
實施例V-利用Western印跡分析進行細胞毒性測定的方法A.表達單順反子TR表達盒的哺乳動物細胞的Western印跡分析對於該實施例，利用Western 印跡分析證實了 TRplp_EYFP、TRdm_EYFP、TRplp-fLUC或 TR^-fLUC表達盒在穩定轉化的HEK293細胞中的表達和調控。細胞系或庫在6孔板或60mm 皿中生長至約60%匯合，並用補充毒性化學品的完全培養基處理。對於該實施例，毒性劑為 蛋白酶體抑制劑MG132(50微摩)或鈣離子載體A23187(5-6. 7微摩)，如通過臺盼藍染色 所確定的那樣，顯示它們造成HEK293細胞在24小時內徹底的細胞死亡。對照樣品用新鮮 培養基處理。處理和對照細胞通過移液管移取，收集在培養基中，800rpm沉澱5分鐘(室 溫)，並貯存在-70/-80°C或立即加工得到總蛋白質。對於蛋白質提取，將細胞重懸於等體積的懸浮緩衝液(lOOmM NaCl, 10mM Tris-HCl [pH 7. 6]，ImM EDTA, lmg/mL 抑酶肽，100 u g/mLPMSF)和 2 X SDS 緩衝液(lOOmM Tris-HCl[pH 6. 8]，4% SDS，20%甘油，200mM DTT)中。冷凍細胞在重懸之前在冰上解凍。 提取物幾次通過配有26G針的注射器而均質化。樣品隨後於室溫孵育1-2小時。將樣品轉 移至-70/-80°C貯存或加到SDS PAGE凝膠上並通過Western印跡分析研究。為確保Western印跡上等同的蛋白質上樣水平，最初通過SDS PAGE分離10 yL各 蛋白質提取物，在Preblot凝膠固定劑(25%異丙醇，10%乙酸)中固定過夜，並在0. 05% 考馬斯藍(0. 05%亮藍R，50%甲醇，10%乙酸)中室溫染色20分鐘。凝膠在10%乙酸中脫 色，並真空乾燥。在Western印跡之前利用乾燥的凝膠對樣品進行任何必要的體積調整。Western印跡分析是本領域充分確立的技術，並在下文概述。在SDSPAGE凝膠分離 和通過電泳使蛋白質轉移到固相膜支持物上以後，膜乾燥過夜。隨後的Western分析需要 膜再水合，用蛋白質溶液(5%奶粉或3%BSA)洗滌，以封閉濾膜上偶見的蛋白質結合位點， 與識別TR調控的0RF的抗體一起孵育，並利用標記的二抗進行化學發光檢測。對於EYFP 蛋白而言，一抗是抗GFP抗體(Molecular Probes ； 1 500至1 1500稀釋)。與此類似， fLUC蛋白利用抗fLUC抗體(Sigma;l 1000稀釋)檢測。在與一抗一起孵育和大規模洗 滌(1XPBS-T)之後，通過與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗兔或抗小鼠抗體(Amersham; 1 5000至1 10000稀釋)一起孵育來檢測結合一抗的蛋白質。在與二抗一起孵育和大 規模洗滌之後，由ECL試劑系統(Amersham)如賣主所述檢測反應蛋白質。對於該實施例，表達TRplp-fLUC、TR^-fLUC或fLUC mRNA的HEK293細胞系的結果 示於圖6。在用毒性水平的鈣離子載體A23187處理後，在應激和垂死細胞中觀察到fLuc 蛋白水平非常顯著地增加，而未處理培養物中不明顯。個體蛋白質帶在Beckman DU7400 分光光度計上通過光密度測定法定量。用鈣離子載體A23187處理的細胞庫和細胞系呈現 出fLUC蛋白質水平增加，範圍為未處理TR^-fLUC/TI^-fLUC細胞中檢測到的蛋白質水平 的160-800%。在應激和垂死HEK293TRplp-fLuc表達細胞中觀察到fLuc蛋白水平的平均 增加是402. 8% (n = 5)，這類似於在鈣離子載體處理的HEK293TRdm-fLuc細胞中觀察到的 524. 3% (n = 6)增加。而且，在應激和垂死細胞中，表達TR-fLUC盒的細胞所呈現出的fLUC 蛋白水平高至表達帽子依賴性CMV-fLuc序列的細胞所產生的蛋白質水平的110% (圖6)。B.應用穩定表達雙順反子TR盒的細胞進行的細胞毒性測定在該實施例中，表達fLUC-TRplp-EYFP、fLUC-TRdm_EYFP、pcuLf-TRplp-EYFP 或 pcuLf-TR^-EYFP表達盒的HEK293細胞庫如上所述以鈣離子載體A23187和MG132處理。簡言之，如上所述利用Western印跡細胞毒性方法測定了兩種報告蛋白的翻譯。有義載體中 上遊報告蛋白(fLUC)的翻譯反映了帽子依賴性翻譯，而下遊報告蛋白(EYFP)的水平與帽 子非依賴性(即TR調控的)翻譯相關。雖然帽子依賴性翻譯可能在反義構建體中測量不 到，但是帽子非依賴性翻譯能夠由有效連接於TR元件的0RF檢測到。這些測定中使用的一 抗和二抗以及測定方法同上。在誘導細胞應激和死亡之後，在所有表達TR表達盒的細胞庫中檢測到通過EYFP 蛋白水平增加所測量的TR介導的翻譯。EYFP蛋白水平增至未處理細胞水平的130-750%。 雖然抗EYFP和抗fLuc抗體可能無法應用於單個印跡，但是來自單順反子TR盒的帽子非依 賴性翻譯比雙順反子取向的更為有效(圖4)。同樣明顯的是，帽子非依賴性TR介導的翻譯 不因在TR表達盒上遊插入反義fLuc 0RF而受抑制。實施例VI-利用螢光顯微鏡檢的細胞毒性測定方法可通過若干方法來檢測和定量單細胞、組織或細胞懸液的螢光，例如在顯微鏡下 視覺檢查、自動化或半自動化螢光成像、流式細胞儀分析、在螢光計或微板讀數器中利用適 當的濾波器裝置進行螢光光譜分析。對於該實施例，利用在顯微鏡(Nikon TE2000-S)下 的視覺檢查來驗證表達TRplp-EYFP、TRdm-EYFP、TRplp-fLUC和TRdm-fLUC mRNA的應激和垂死 HEK293細胞中的TR翻譯調控。A.直接觀察細胞毒性事件期間TR介導的EYFP翻譯在本研究中，用CMV-EYFP、TRplp_EYFP或TRdm_EYFP表達盒轉化的HEK293細胞在 自發螢光EYFP蛋白翻譯後直接予以觀察。在毒素添加前一天，將200，000細胞(HEK293、 HEK293CMV-EYFP、HEK293TRplp-EYFP 或 HEK293TRdm_EYFP)鋪板至含火焰消毒玻璃載玻片的 6 孔板中。細胞在完全DMEM培養基中培養24小時。應用補充5i!m鈣離子載體A23187的新 鮮培養基，並於Ohr、2hr、4hr、6hr、9hr、1 Ohr、1 lhr和25hr收集載玻片。載玻片於4%多聚 甲醛中固定10分鐘，以1XPBS大規模洗滌，並封固進行螢光顯微鏡檢。利用EYFP選擇性濾波器裝置(filter set) (Nikon)於6hr和10hr時間點進行熒 光細胞計數，並示於圖7。在未處理細胞培養物中，EYFP陽性細胞頻率範圍在1. 5-2. 5%, 與這些培養物中通過臺盼藍染色所確定的非存活細胞頻率一致。在毒素處理之後，來自 TR-EYFP盒的EYFP翻譯，定義為至少5個含有總計不少於500個細胞的隨機切片中的 螢光細胞數，作為時間的函數增加。相反，未在HEK293或HEK CMV-EYFP細胞中檢測到 螢光細胞數的顯著變化。TRplp-EYFP表達細胞中螢光細胞頻率升至未處理對照培養物的 1000-2300%。在TRdm-EYFP表達細胞中觀察到類似的增加，其細胞數升至對照培養物的 600-1465% (圖 7)。B.直接觀察細胞毒性事件期間TR介導的fLUC翻譯為研究來自TR-fLUC盒的TR介導的翻譯，翻譯的fLUC蛋白需要用螢光抗體進行 免疫標記。在本研究中，用CMV-fLUC、TRplp-fLUC或TR-fLUC表達盒轉化的HEK293細胞在 應用一抗抗fLUC抗體(Sigma)和物種特異性的羅丹明標記的二抗(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)免疫檢測fLUC蛋白之後予以觀察。核DNA的DAPI標記是本領域公 知的方法，故而用來標記細胞核。在毒素接觸前40 小時，將 300,000 細胞(HEK293、HEK293CMV_fLUC、 HEK293TRplp-fLUC 亞克隆 #3、HEK293TRplp-fLUC 亞克隆 #17、HEK293TRdm-fLUC 亞克隆 #12 或
63HEK293TRdm-fLUC亞克隆#45)鋪板在12孔板中的火焰消毒玻璃蓋片上。細胞在完全DMEM 培養基中培養。應用補充6. 7iim鈣離子載體A23187的新鮮培養基，並於12小時收集載玻 片。蓋片於4%多聚甲醛中固定(室溫10分鐘)，以1 XPBS大規模洗滌，於100%甲醇中 透化(室溫2分鐘)，以1XPBS洗滌，於3%BSA中封閉(室溫5分鐘)，並與一抗抗fLUC 抗體(Sigma;l 500稀釋)室溫孵育1小時。在一抗染色後，蓋片以1 XPBS大規模洗滌， 並與羅丹明標記的抗兔二抗(Kirkegaard and PerryLaboratories ； 1 100 至 1 200 稀 釋)室溫孵育1小時。此後，蓋片於1 XPBS中洗滌，以DAPI標記(室溫30秒)，於1 XPBS 中洗滌，並封固進行螢光顯微鏡檢。利用羅丹明選擇性和DAPI濾波器裝置(Nikon)進行螢光細胞計數，並示於圖8。 在未處理細胞培養物中，fLUC陽性細胞頻率範圍在2. 4-7. 2%,比通過臺盼藍染色所確定 的非存活細胞的正常頻率高1-3倍。隨後經視覺檢查DAPI染色的細胞核確立，抗fLUC抗體 與分裂末期的細胞選擇性地交叉反應，這導致對未處理培養物中細胞應激的估算提高。在 毒素處理後，與未處理樣品中的陽性細胞數相比，HEK293TRplp-fLUC亞克隆#3和#17細胞系 中的fLUC陽性細胞頻率分別增加了 1150%和2245%。與此類似，HEK293TRdm-fLUC亞克隆 #12和#45細胞系中的fLUC陽性細胞數分別增加了 3640%和1440%。實施例VII-利用微板讀數器的細胞毒性測定方法設計微板讀數器以利用高密度樣品陣列上的吸光度、螢光和發光來掃描、分析和 獲得數值結果。在該實施例中，利用微板讀數器測量由TR-0RF盒翻譯的螢光和發光標記蛋 白。A.微板讀數器測定方法對於該實施例，利用微板讀數器評價表達TRplp_EYFP、TRdm_EYFP、TRplp-fLUC和 TR^-fLUC表達盒的HEK293細胞。為定量TR翻譯反應，將24，000細胞鋪板在96孔微量滴 定板中，使之生長約40小時，以在與毒性劑孵育之前達到合適的細胞密度。各孔用不含毒 素或含明確濃度毒素的完全DMEM培養基培養，並在37°C孵育特定的時間段。在那時，利用 FLU0star0ptima(BMG Labtech)微板讀數器上的螢光或化學發光來測量TR-0RF反應。直接檢測自發螢光EYFP蛋白的螢光團通過用螢光素濾波器(545nm)或YFP濾波 器(YFPex)激發處於黑色光學底96孔板中的樣品，並利用1000-2000的增益測量590nm或 544nm的發射來實現。為減小與培養基組分相關的背景螢光，板在1200rpm室溫離心3分 鍾，以收集任何漂浮細胞，並在檢測之前將培養基替換為200 u 11 XPBS。對於fLUC蛋白，通 過活細胞或裂解細胞螢光素酶測定期間產生的發光來定量蛋白活性。對於活細胞測定，細 胞如上但在白色光學底96孔板中培養。毒素孵育後，96孔板在1200rpm離心3分鐘以沉澱 剝落的細胞。通過注射20 yl溶於檸檬酸鈉/DMS0測定緩衝液中的D-螢光素溶液(50% lOOmM檸檬酸鈉，pH 5. 2,50% DMS0,6. 7mM ATP和3. 35mM D_螢光素)並孵育45秒允許細 胞透入而形成發光。利用透鏡濾波器以2000-3000的增益檢測發光。對於裂解細胞測定，細胞如上但在常規平底96孔板中培養。毒素孵育後，96孔板 如上離心。除去培養基，替換為50iU細胞裂解緩衝液(25mMTris-磷酸(pH 7. 8)、10%甘 油，TritonX-100，lmg/ml BSA, 2mM EGTA 和 2mM DTT)，並在室溫孵育 10 分鐘。細胞裂 解利用相差顯微鏡來驗證，並將裂解物轉移到白底96孔板中。通過注射5iU溶於反應緩 衝液中的D-螢光素溶液(25mM甘氨醯甘氨酸(pH 7. 8)、15mM MgS04,4mM EDTA，15mM磷酸鉀，ImM DTT，lmM輔酶A，6. 7mM ATP和3. 35mM D_螢光素)形成發光。振蕩4秒後，利用透 鏡濾波器以2000-3000的增益測量發光值。B.以固定的時間和毒素濃度測量細胞毒性事件利用基於固定的時間和毒性劑濃度的測定來鑑定呈現出TR介導的翻譯的細胞 集落 / 庫。在該實施例中，用 CMV-EYFP、TRplp-EYFP、TRdm_EYFP、CMV-fLUC、TRplp-fLUC 或 TR^-fLUC表達盒轉化的HEK293集落在用補充有6. 7 y m鈣離子載體A23187 (由臺盼藍染 色定義的毒性濃度)的DMEM培養基孵育12小時後進行TR特異性翻譯反應篩選。集落最 初在60-100mm皿中增殖至70-80%匯合，轉移到96孔板中，並利用細胞毒性培養基如上文 所述測定。顯示了獨立組的HEK293TRplp-EYFP集落(圖9)以及選擇的HEK293TRplp-fLUC 和TL-fLUC集落(圖9，活細胞測定)的特徵性結果。作為該篩選測定的實例， HEK293TRplp-EYFP亞克隆#41和HEK293TRplp-fLUC亞克隆#3展示出顯著的TR反應，故而選 擇進行隨後的Western印跡和顯微鏡檢驗證。C.作為毒素濃度的函數測量細胞毒性事件(劑量反應)劑量反應測定是定義候選細胞毒性劑的毒性濃度所必需的。為確立TR介導的細 胞反應和鑑定TR有效劑量，使TRplp-fLUC (亞克隆#3)和TI^-fLUC (亞克隆#45)表達盒轉 化的HEK293細胞接觸一系列亞毒性至毒性濃度的鈣離子載體A23187 (0、InM、10nM、lOOnM、 1 ii M、2 ii M、4 ii M、6 u M、8 u MUO u M) 12小時，並如上文所述利用裂解細胞螢光素酶測定進 行分析(圖10)。在12hr的時間點，利用原始螢光素酶數(圖10，圖A和B)，最初在1 y M時檢測到 各盒TR介導的翻譯，其中fLUC峰值處於6 y M。更低的亞毒性劑量不產生明顯的TR特異性 翻譯活性，而8-10 yM毒素濃度呈現出fLuc活性下降。然而，將帽子依賴性與帽子非依賴 性螢光素酶值進行關聯時會產生不同的結果。針對Ohr時間點的均值(表達為100% )調 整各螢光素酶值的均值，產生了類似於原始數據結果的劑量反應曲線(圖10，圖C)。相反， 針對HEK293CMV-fLUC對照細胞所呈現出的帽子依賴性核糖體活性顯著下降來調整TR表達 盒所生成的帽子非依賴性fLuc值，導致顯著更高的表觀翻譯率和即使在測試的最高毒素 劑量時帽子非依賴性翻譯不太顯著的下降。D.作為時間的函數測量細胞毒性事件(時間反應)利用時間反應測定來定義在毒性水平細胞毒性劑孵育期間TR調控的翻譯的時 機選擇。HEK293TRplp-fLUC 亞克隆 #3 和 HEK293TRdm-fLUC 亞克隆 #45 在 6. 7 ii m 鈣離子 載體 A23187 中培養不同的時間(0hr、l. 5hr、3hr、4. 5hr、6hr、7. 5hr、9hr、10. 5hr、12hr 和 13. 5hr)，並如上文所述利用裂解細胞螢光素酶測定進行分析(圖11)。到孵育後1. 5小時，利用原始螢光素酶數，在各種TR轉化的細胞系中能夠檢測到 顯著的TR特異性翻譯(圖11，圖A和B)。1. 5小時之後，翻譯活性線性增加，直至孵育後9 小時，此時翻譯呈現出明顯的平臺或稍有降低的活性。然而，同前面一樣，將帽子依賴性與 帽子非依賴性翻譯進行關聯時會產生不同的圖形。針對Ohr時間點的均值(表達為100%) 調整各螢光素酶值的均值，產生了類似於原始數據結果的劑量反應曲線(圖11，圖C)。相 反，針對在HEK293CMV-fLUC細胞中所觀察到的帽子依賴性翻譯顯著下降來調整TR表達盒 所生成的帽子非依賴性fLuc值，導致顯著更高的表觀翻譯活性和直至12小時的翻譯活性線性增加，之後是表觀翻譯下降。實施例VIII-利用重組病毒將TR表達盒轉導到哺乳動物細胞中和在細胞毒性事 件期間測定TR介導的翻譯的方法A.用rAAV-TR-ORF病毒粒體轉導哺乳動物細胞的方法該實施例欲顯示利用rAAV轉導將TRplp_EYFP和TRdm_EYFP盒遞送到HEK293和 HT1080細胞中。HEK293或HT1080細胞塗布在火焰消毒的玻璃載玻片上，生長至60-70%匯 合(1-2天)，以L-DMEM(含2%胎牛血清的DMEM)洗滌，並用rAAV感染2小時。將培養基 替換為DMEM，10% FBS,並使細胞孵育24小時。在如上文所述進行直接顯微鏡檢或Western 分析之前，感染的細胞用補充毒性水平MG132(25iiM)的DMEM，10% FBS處理24小時。與未 感染的對照細胞相比，用rAAV病毒粒體轉導的細胞呈現出螢光EYFP蛋白的選擇性翻譯。B.利用rAAV基因遞送測定細胞毒性事件HT1080細胞鋪板在6孔板中，並使之生長直至70-80 %匯合。這些細胞用 rAAV-TR^-EYFP病毒粒體(感染複數l_10pfu/細胞)轉導24小時，然後用含有已知誘導 凋亡/細胞死亡的培養基處理。對於該實施例，向轉導的HT1080細胞中分開或混合添加 含有50iiM MG132、2iiM毒胡蘿蔔內酯、ly g/ml放線菌素D、20 y g/ml放線菌酮、ImM 二丁 基環狀-腺昔單憐酸酉旨(dibutrylcyclic-adenosine monophosphate) (dbcAMP) >200 u g/ ml G418、5iiM鈣離子載體A23187、10ii g/ml絲裂黴素D、5%甲醇或10%乙醇的DMEM，培養 24hr。此時加工未處理和處理的細胞，並通過Western印跡分析、直接顯微鏡檢分析或板讀 數器分析如上文所述進行研究。預期TRdm-EYFP盒在於細胞毒性培養基中培養的轉導HT1080細胞中有翻譯活性。C.利用rBAC病毒粒體以TR-0RF盒轉導哺乳動物細胞該實施例欲顯示利用rBAC轉導將TRplp_EYFP和TRdm_EYFP盒遞送到HEK293細胞 中。HEK293細胞塗布在火焰消毒的玻璃載玻片上，生長至60-70%匯合(1_2天)，以無血清 DMEM洗滌，並用rBAC感染1_2小時。將培養基替換為DMEM，10% FBS,並使細胞孵育24小 時。在直接顯微鏡檢研究之前，感染的細胞用補充5iiM鈣離子載體A23187的DMEM，10% FBS處理24小時。與未感染的對照細胞相比，用rBAC病毒粒體轉導的細胞呈現出螢光EYFP 蛋白的選擇性翻譯。D.利用rBAC基因遞送系統測定細胞毒性事件HT1080細胞鋪板在6孔板中，並使之生長直至70-80%匯合。兩組HT1080細胞用 rBAC-TR^-EYFP病毒粒體(感染複數lOpfu/細胞和25pfu/細胞)轉導24小時，然後用含 5iiM鈣離子載體A23187的培養基處理13. 5hr和23hr。此時加工未處理和處理的細胞，並 通過螢光顯微鏡檢分析如上文所述進行研究。如圖12所示，TRdm-EYFP盒在於細胞毒性培養基中培養的轉導HT1080細胞中有翻 譯活性。與感染(10pfu/ml)但未處理的細胞樣品相比，在13. 5hr (lOpfu/細胞時3344%, 以及25pfu/細胞時4925 % )和23hr (lOpfu/細胞時725 %，以及25pfu/細胞時875 % )時 觀察到EYFP陽性細胞的顯著增加。總細胞計數顯示在23hr時細胞剝落增加造成陽性細胞 總數表觀下降，因為23hr時貼壁細胞數下降超過50%。實施例IX-利用從TR表達盒表達的前藥0RF誘導細胞毒性事件的方法由於正常細胞毒性事件(即，細胞接觸抑制、失巢凋亡等)，哺乳動物細胞培養物中一般含有1-10%的非存活細胞。如果這些細胞轉錄有效連接於TR盒的前藥0RF，則應激 或垂死細胞會選擇性地翻譯前藥0RF，並使這些應激細胞對正常並不影響親本細胞類型的 前藥敏感。A.通過改變毒素濃度和變量時間來誘導細胞毒性事件在該實施例中，HEK293、HEK CMV-EYFP和HEK TRplp_TKsr39細胞用不同量的前藥 更昔洛韋處理，並在孵育4天後利用臺盼藍染色測定來檢驗細胞死亡。細胞鋪板在6孔板 中，生長至70-80%匯合，並用補充更昔洛韋(0、10碰、100碰、111] 、511]\1或1011]\0的DMEM， 10% FBS處理4天。在孵育後3天和4天進行存活細胞計數(圖13)。 HEK293或HEK CMV-EYFP細胞在任何濃度的更昔洛韋中培養3或4天後並不呈現 任何顯著增加的細胞死亡。在這些培養物中，98-100%的細胞在整個處理期中保持臺盼藍 存活。相反，如通過具有變形的細胞形態、濃縮的核和臺盼藍反應性的剝落細胞所例示的那 樣，HEK293TRplp-TKsr39細胞在3天內呈現出一些顯微鏡檢細胞死亡。此時在10 y M更昔 洛韋培養基中，細胞生存力從未處理培養物中的98. 5%降至低至86%的細胞生存力。3天 後，與未處理細胞相比，lOnM培養物不呈現任何細胞生存力的下降，不過在lOOnM樣品中檢 測到輕微下降。再過24小時後，顯微鏡檢分析確立，很大比例的用高於lOnM劑量更昔洛韋處理的 HEK293TRplp-TKsr39細胞培養物剝落並明顯死亡(圖13)。這通過臺盼藍細胞生存力測定得 到了證實，其檢測到在所有更昔洛韋劑量下的細胞生存力下降，從lOnM培養物中的99. 7% 細胞存活力到10y M更昔洛韋培養基中33. 7%的生存力。該實施例確立，應激或垂死細胞 中TR盒的翻譯能夠用來選擇性地合成在前藥應用後能增強細胞死亡的前藥蛋白。TKsr39 蛋白的應用提供了依賴於選擇性翻譯起始的旁觀者殺傷的實例，並彰顯了選擇性翻譯在補 充基因療法中的用途。在詳細說明了本技術之後，不脫離所附權利要求書中界定的本技術範圍的改變和 變動是可行的，這是顯而易見的。而且，應當理解，本公開中的所有實例雖然舉例說明了本 技術，但是作為非限制性實例提供的，因此不應理解為限制如此舉例說明的本技術的各個方面。
6權利要求
在哺乳動物細胞中可表達的核酸表達盒，其中所述表達盒以5』至3』方向包含如下元件至少一種轉錄效應序列，TR元件，其編碼在應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子，有效連接於TR元件的核苷酸序列，其為第一可讀框(ORF)序列，編碼多肽或其片段，並與TR元件共翻譯，和多聚腺苷酸化序列。
2.權利要求1的表達盒，其中TR元件來自小鼠。
3.權利要求1的表達盒，其中TR元件選自SEQID NO 1和SEQ ID NO :2。
4.權利要求1-3中任一項的表達盒，其中轉錄效應子選自組成型、誘導型、組織特異 性、腫瘤特異性和反應基因啟動子。
5.權利要求4的表達盒，其中組成型啟動子選自逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV)長 末端重複(LTR)啟動子、巨細胞病毒即時早期基因(CMV)啟動子、猿猴病毒早期(SV40)啟 動子、胞質肌動蛋白啟動子、腺病毒主要晚期啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
6.權利要求5的表達盒，其中組成型啟動子是CMV啟動子。
7.權利要求4的表達盒，其中誘導型啟動子選自hMT-IIA啟動子、Dex誘導型啟動子、 MMTV啟動子、蛻皮素反應昆蟲啟動子、Tet-0n啟動子、Tet-Off啟動子、RU486誘導型啟動 子和雷帕黴素反應啟動子。
8.權利要求7的表達盒，其中誘導型啟動子是hMT-IIA啟動子。
9.權利要求4的表達盒，其中組織特異性啟動子選自TF啟動子、TYR啟動子、ALB啟 動子、CKM啟動子、MBP啟動子、GFAP啟動子、NSE啟動子和SYN1啟動子。
10.權利要求9的表達盒，其中組織特異性啟動子是SYN1啟動子。
11.權利要求4的表達盒，其中腫瘤特異性啟動子選自VEGF、KDR、AFP、CEA、erbB2、 muc-l/DF3、ALA、BGLAP、SLPl、HRE、Grp78/BIP 和 HK2 的啟動子。
12.權利要求11的表達盒，其中腫瘤特異性啟動子是HK2啟動子。
13.權利要求4的表達盒，其中反應基因啟動子選自EGRl、t-PA、mdr-l、hSp70、c-fOS、 c-jun、E2F-l、HSPA5、CCNAl 和 cdc25C 的啟動子。
14.權利要求13的表達盒，其中反應基因啟動子是HSPA5啟動子。
15.權利要求1-14中任一項的表達盒，其中第一0RF序列選自報告基因、細胞毒性腫 瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因和凋亡前基因。
16.權利要求15的表達盒，其中第一0RF序列是報告基因。
17.權利要求16的表達盒，其中報告基因選自疋6 、6 3￥ 、螢光素酶、1^以、〔八!\ TK 和 TKsr390
18.權利要求17的表達盒，其中報告基因是螢光素酶。
19.權利要求15的表達盒，其中細胞毒性腫瘤抑制子選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、 WT-1、成視網膜細胞瘤、NF-1、NF-2和VHL。
20.權利要求19的表達盒，其中細胞毒性腫瘤抑制子是p53。
21.權利要求15的表達盒，其中毒素基因選自假單胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白毒素和白喉毒素。
22.權利要求21的表達盒，其中毒素基因是白喉毒素。
23.權利要求15的表達盒，其中前藥激活基因選自TK和TKsr39。
24.權利要求23的表達盒，其中前藥激活基因是TKsr39。
25.權利要求15的表達盒，其中凋亡前基因選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、WT-l、Rb、 NF-UNF-2 和 VHL 基因。
26.權利要求25的表達盒，其中凋亡前基因是p53。
27.權利要求1-26中任一項的表達盒，其中所述核苷酸序列還包含位於TR元件5』的 第二可讀框(0RF)序列，其並不與TR元件有效連接。
28.權利要求27的表達盒，其中第二0RF序列選自報告基因、細胞毒性腫瘤抑制子、 毒素基因、前藥激活基因和凋亡前基因。
29.權利要求28的表達盒，其中報告基因選自疋6 、6 工￥ 、螢光素酶、1^以、〔八!\ TK 和 TKsr390
30.權利要求29的表達盒，其中報告基因是螢光素酶。
31.權利要求16-18中任一項的表達盒，其中所述核苷酸序列還包含位於TR元件5』 的第二可讀框(0RF)序列，其並不與TR元件有效連接，且編碼細胞毒性腫瘤抑制子、毒素基 因、前藥激活基因或凋亡前基因。
32.權利要求31的表達盒，其中細胞毒性腫瘤抑制子選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、 WT-1、Rb、NF-1、NF-2 和 VHL 基因。
33.權利要求32的表達盒，其中細胞毒性腫瘤抑制子是p53。
34.權利要求31的表達盒，其中毒素基因選自假單胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白毒素和白 喉毒素。
35.權利要求34的表達盒，其中毒素基因是白喉毒素。
36.權利要求31的表達盒，其中前藥激活基因選自TK和TKsr39。
37.權利要求36的表達盒，其中前藥激活基因是TKsr39。
38.權利要求31的表達盒，其中凋亡前基因選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、WT-l、Rb、 NF-1、NF-2 和 VHL 基因。
39.權利要求38的表達盒，其中凋亡前基因是p53。
40.權利要求1-39中任一項的表達盒，其中多聚腺苷酸化序列選自SV40早期基因、 SV40晚期基因、HSV-TK和hGH polyA尾巴。
41.權利要求40的表達盒，其中polyA尾巴是SV40早期基因polyA尾巴。
42.權利要求1-41中任一項的表達盒，其中所述核苷酸序列還包含位於啟動子序列3』 和TR元件5』的5』非翻譯區，並包含mRNA轉錄起始位點。
43.權利要求42的表達盒，其中5』非翻譯區包含指導mRNA剪接的內含子序列。
44.權利要求1-43中任一項的表達盒，其中所述核酸序列還包含如下一種或多種位於啟動子5』的約15-50個核苷酸的序列，其包含一個或多個用於將所述盒插入質粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點；位於TR元件3』和0RF序列5』的約15-50個核苷酸的序列，其包含一個或多個用於插 入和有效連接TR元件與0RF序列的限制性位點；位於0RF序列3』和多聚腺苷酸化序列5』的約15-50個核苷酸的序列，其包含一個或多個用於插入和有效連接0RF序列與多聚腺苷酸化序列的限制性位點；和位於多聚腺苷酸化序列3』的約15-50個核苷酸的序列，其包含一個或多個用於將所述 盒插入質粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點，其中添加任何所述序列均使翻譯保持符 合讀框。
45.權利要求1-44中任一項的表達盒，其中所述表達盒包含在質粒、穿梭載體或病毒 載體之中。
46.權利要求45 的表達盒，其中質粒選自pCMVneo、pCMV-MCS、pBluescript II、pET14 和 pUC19。
47.權利要求46的表達盒，其中質粒是pCMVneo。
48.權利要求45的表達盒，其中穿梭載體選自pCMV、pEYFP-Nl、pEGFP-Nl和 pEGFP-Cl。
49.權利要求48的表達盒，其中穿梭載體是pEYFP-Nl。
50.權利要求45的表達盒，其中病毒載體選自pAAV-MCS、pBac-l和pBacPAK8/9。
51.權利要求50的表達盒，其中病毒載體是pAAV-MCS。
52.用權利要求1-51中任一項的表達盒轉化的哺乳動物細胞。
53.權利要求52的哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞選自HEK293、HT1080、 NTERA-2D、HeLa、Caco2、H印G2、BALBC/3T3 和 Cos_7。
54.權利要求52的哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞是胚胎幹細胞。
55.權利要求54的哺乳動物細胞，其中胚胎幹細胞是鼠胚胎幹細胞mES-D3或人胚胎幹 細胞hES。
56.確定物質毒性的方法，其中所述方法包括(a)使根據權利要求52-55中任一項的哺乳動物細胞與所述物質接觸，其中所述第一 0RF序列編碼報告多肽；和(b)檢測報告多肽的存在或測量其水平，其中與未接觸所述物質或未轉染的對照細胞 相比，所述物質的毒性與報告多肽的存在或其水平增加相關。
57.權利要求56的方法，其中測量報告多肽的蛋白質水平。
58.權利要求56的方法，其中測量報告多肽mRNA的存在或水平。
59.權利要求56-58中任一項的方法，其中接觸哺乳動物細胞的步驟離體進行。
60.權利要求56-58中任一項的方法，其中接觸哺乳動物細胞的步驟在體內進行。
61.權利要求56-60中任一項的方法，其中報告多肽是螢光素酶。
62.確定物質對哺乳動物的毒性的方法，其中所述方法包括(a)用權利要求1-18和27-39中任一項的表達盒轉染哺乳動物細胞或哺乳動物細胞 系，其中所述第一 0RF序列編碼報告多肽；(b)使(a)中轉染的細胞與所述物質接觸；和(c)檢測報告多肽的存在或測量其水平，其中與未接觸所述物質或未轉染的對照細胞 相比，所述物質的毒性與報告多肽的存在或其水平增加相關。
63.權利要求62的方法，其中測量報告多肽的蛋白質水平。
64.權利要求62的方法，其中測量報告多肽mRNA的存在或水平。
65.權利要求62-64中任一項的方法，其中報告多肽是螢光素酶。
66.用於毒性測定的試劑盒，其包含(a)權利要求1-51中任一項的表達盒；和(b)有關試劑盒使用的說明書。
67.用於毒性測定的試劑盒，其包含(a)權利要求52-55中任一項的哺乳動物細胞；和(b)有關試劑盒使用的說明書。
68.轉基因非人動物，其包含穩定整合到所述動物基因組中的權利要求1-51中任一項 的表達盒。
69.權利要求68的轉基因非人動物，其中所述動物是小鼠。
70.在靶細胞中誘導凋亡的方法，其包括用權利要求19-39中任一項的表達盒轉化所 述細胞。
71.權利要求70的方法，其中所述第一0RF序列是選自以下的細胞毒性腫瘤抑制基因 p53、APC、BRCA-1、BRCA-2、WT-1、成視網膜細胞瘤、NF-1、NF-2 和 VHL。
72.權利要求70的方法，其中所述第一0RF序列是選自以下的前藥激活基因TK和 TKsr39。
73.權利要求72的方法，其中前藥激活基因與前藥一起遞送。
74.權利要求70的方法，其中所述第一0RF序列是選自以下的凋亡前基因p53、APC、 BRCA-1、BRCA-2、WT_ 1、Rb、NF_ 1、NF-2 禾口 VHL 基因。
75.檢測細胞應激和/或凋亡的方法，其中所述方法包括(a)獲得根據權利要求52-55中任一項的哺乳動物細胞，其中所述第一0RF序列編碼報 告多肽；和(b)檢測報告多肽的存在或測量其水平，其中與未轉染的對照細胞相比，細胞應激和/ 或凋亡的水平與報告多肽的存在或其水平增加相關。
76.在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞系中檢測細胞應激和/或凋亡的方法，其中所述 方法包括(a)用權利要求1-18和27-39中任一項的表達盒轉染所述哺乳動物細胞或哺乳動物細 胞系，其中所述第一 0RF序列編碼報告多肽；和(b)檢測報告多肽的存在或測量其水平，其中與未轉染的對照細胞相比，細胞應激和/ 或凋亡的水平與報告多肽的存在或其水平增加相關。
77.權利要求75-76中任一項的方法，其中所述方法在步驟(b)之前包括使哺乳動物細 胞與能夠誘導細胞應激和/或凋亡的物質接觸的步驟。
78.權利要求75-77中任一項的方法，其中測量報告多肽的蛋白質水平。
79.權利要求75-77中任一項的方法，其中測量報告多肽mRNA的存在或水平。
80.權利要求77的方法，其中接觸哺乳動物細胞的步驟離體進行。
81.權利要求77的方法，其中接觸哺乳動物細胞的步驟在體內進行。
82.權利要求75-81中任一項的方法，其中報告多肽是螢光素酶。
83.鑑定在應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯的IRES元件的方法，其中所述方法包括(a)用能夠誘導細胞應激和/或死亡的物質處理真核細胞，以獲得處理的細胞；(b)從處理的細胞中獲得mRNA；(c)使結合在核糖體上的mRNA與未結合的mRNA分離；(d)獲得至少一種結合在核糖體上的mRNA的DNA序列；和(e)檢驗所述DNA序列指導帽子非依賴性翻譯的能力。
84.權利要求83的方法，其中步驟(c)通過在蔗糖密度梯度上分級分離、高效凝膠過濾 色譜或聚丙烯醯胺凝膠基質分離來進行。
85.權利要求83的方法，其中真核細胞是哺乳動物細胞。
86.預防哺乳動物細胞凋亡的方法，其包括用權利要求1-14中任一項的表達盒轉化所 述哺乳動物細胞，其中所述第一 0RF序列編碼抗凋亡蛋白。
87.權利要求86的方法，其中抗凋亡蛋白選自:BCL2、BCL2L1、BCL2A1、BAG1、TRAF1、 BIRC3、BIRC5、BAK1 或API5。
88.權利要求87的方法，其中抗凋亡蛋白是BCL2。
89.權利要求87的方法，其中抗凋亡蛋白是TRAF1。
90.藥物組合物，其包含權利要求1-51中任一項的表達盒和可藥用載體。
91.TR元件，其包含與參照序列突變變體相同的核苷酸序列，所述參照序列包含(A)對應於至少圖15PLP序列的核苷酸1-831、且與之具有至少62%序列同一性的PLP 核苷酸序列，或(B)對應於至少圖15DM20序列的核苷酸1-726、且與之具有至少62%序列同一性的 DM20核苷酸序列；且所述參照序列包含(C)位於圖15 PLP 的核苷酸位置 41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、 251-257和563-570、或與之對應位置上的多嘧啶片，(D)位於圖15PLP的核苷酸位置1-3、616-618、703-705和811-813、或與之對應位置 上的ATG序列，(E)位於圖15 PLP 的核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223 和 305-308、或 與之對應位置上的GNRA序列，和(F)位於圖15PLP的核苷酸位置503-512、或與之對應位置上的ISSrRNA結合位點；其中(G)所述突變變體(1)包含參照序列的如下突變，所述突變(a)消除ATG1、ATG616 和 ATG703，和(b)在圖15PLP的核苷酸位置2-4、6-8、16-18和19-21、或與之對應的位置上引入終 止密碼子序列；和(2)保留了多嘧啶片(C)、GNRA序列(E)和18SrRNA結合位點(F)。
92.根據權利要求91的TR元件，其中(A)或⑶中的序列同一性至少或約為70%。
93.根據權利要求92的TR元件，其中(A)或⑶中的序列同一性至少或約為80%。
94.根據權利要求93的TR元件，其中(A)或⑶中的序列同一性至少或約為90%。
95.根據權利要求91的TR元件，其中消除ATG1、ATG616和ATG703的突變(G1)將各 ATG轉換為TTG。
96.根據權利要求91的TR元件，其中所述參照序列包含脊椎動物PLP共有核苷酸序1atgggyykgywdgakkgytgyrynmgmtgymtbrtwggggymccmttygcytchbtsrtb61gccacwgkvytvtgyttykytggrgtsgcvctvttctgyggmtgyggrcaygargchytv121asygghacmgarmagytvatygagacmtayttytccaaraaytaccaagamtaygartay181ctcatyvaygtsatymaygcyttycagtaygtcatctatggaaywgccwyyttcttctty241cthtwyggrrycctvctkytggcygarggmttctacaccacmrsygchrtcargcavatc301ythggsgastwcmrrmccmcmryywkmrrsrrkggsctgakykcwacrgtracwggrggm361cmkaargggagrrghdcsmgrggmmvvcakcvagyycaywcywtrsagcksrtstgtcrb421tgyttgggaaartggctmggacayccygayaagtttgtsggyrtyacytatryyhtsacy481rtyktvtggmtmctrrysttygcctgctcdgcygtdccygtvtacatytayttyaayacc541tggrycacytgycagtctatygcckyccchrssaagacywcwrccagyrtmrgyasbcts601tgykcdgaygsymgvatgtayggtgtyctsccmtggaaygcbttycchggsaargtktgy661ggswccarcctkctbkccatctgcaaracmrsygagttccaratgacnttycayctbttt721atygckgcvttygtgggkgcwgcngchacwctdgtbkcmctgctcacytwyatgrthgsy781gcmwcwtwcaactwygcygtsctbmrastbaykggccgrrgcwcmaagttytga或包含所述脊椎動物PLP共有序列、其中核苷酸349-453已經缺失的脊椎動物DM20共 有序列。
97.根據權利要求91的TR元件，其中所述參照序列具有哺乳動物PLP共有核苷酸序列1atgggcytgttagagtgytgygcnagatgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtg61gccactggattrtgtttctttggrgtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytm121actggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtat181ctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttc241ctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatc301tttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacggtaacagggggc361cagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcat421tgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccytgacy481gttgtrtggctcctrgtgtttgcctgctckgctgtrcctgtgtacatttayttcaayacc541tggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctc601tgygctgatgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttyccwggcaargtktgt661ggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgacsttccayctgttt721attgctgcvttygtgggkgctgcrgcyacactrgtktccctgctcaccttcatgattgct781gccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttctga或包含所述哺乳動物PLP共有序列、其中核苷酸349-453已經缺失的哺乳動物DM20共 有序列。
98.根據權利要求91的TR元件，其中所述參照序列包含天然PLP或DM20多肽的核苷酸序列。
99.根據權利要求98的TR元件，其中所述參照序列包含天然哺乳動物PLP或DM20多 肽的核苷酸序列。
100.製備改進的TR元件的方法，其包括(A)提供至少一種含TR元件的核酸，(B)通過定向進化技術修飾所述核酸的核苷酸序列，以產生修飾的TR元件，和(C)通過操縱所述修飾的TR元件來表達由表達構建體編碼的至少一種表達產物，所述 表達構建體的可讀框序列通過所述修飾的TR元件選擇性地翻譯，和(D)檢測步驟(C)中進行的表達相對於應用步驟(A)的TR元件表達所觀察到的呈現出 改進的至少一種特性，由此將所述修飾的TR元件鑑定為改進的TR元件。
101.根據權利要求100的方法，其中定向進化技術包括(1)對所述核酸進行突變，(2) 對至少兩種具有不同TR元件核苷酸序列的同源核酸進行剪接或同源重組，或(3)既包括 ⑴又包括⑵。
102.根據權利要求101的方法，其中(1)中的突變產生、或者(2)中的剪接或同源重組 應用具有TR核苷酸序列的突變核酸，所述TR核苷酸序列為圖15 PLP或DM20序列的突變 形式。
103.根據權利要求102的方法，其中突變形式在序列上與圖15PLP或DM20序列至少是70%同一。
104.根據權利要求100的方法，其中(A)中的核酸包括至少一種具有圖15PLP或DM20 序列的核苷酸序列的核酸。
105.根據權利要求100的方法，其中⑶中的特性是如下任一改進TR元件翻譯對應 激條件的特異性、TR元件激活對細胞應激反應的敏感性、或經TR元件激活後翻譯起始的效 率(即量度)。
106.根據權利要求100的方法，其中(D)中的表達包括在能夠表達所述表達產物的條 件下維持含有所述表達構建體的哺乳動物細胞。
107.根據權利要求106的方法，其中哺乳動物細胞是人細胞。
108.TR元件在鑑定誘導、增強或抑制細胞應激反應的活性劑的方法中的用途。
109.根據權利要求108的用途，其中應激包括熱應激、冷應激、氧化應激、緊張應激、中 毒、或其組合。
110.根據權利要求108的用途，其中細胞應激反應包括凋亡和/或壞死。
111.TR元件在鑑定活性劑誘導、增強、抑制或逆轉細胞應激反應所達程度的方法中的 用途。
112.根據權利要求111的用途，其中細胞應激反應的程度鑑定為與由在TR元件控制下 表達的報告分子所檢測的信號量度成比例。
113.TR元件在預防性、治療性或姑息性治療需要細胞應激反應防護的受試人的方法中 的用途，所述TR元件為構建體的一部分，其中TR元件與包含編碼提供細胞應激反應防護 的表達產物的編碼序列的多核苷酸有效相連，且所述治療包括給藥包含所述構建體的組合 物。
114.根據權利要求113的用途，其中所述防護是隔離或降解毒性劑(toxifying agent)、穩定細胞中的生物分子、催化形成防護劑、或引起自不同編碼序列的防護劑表達的 活性。
115.用在哺乳動物細胞中可表達的核酸表達盒轉化的哺乳動物細胞，其中所述表達盒以5』至3』方向包含如下元件(A)至少一種轉錄效應序列，(B)包含根據權利要求91的TR元件、編碼PLP/DM20肽的TR元件，所述TR元件能夠被 哺乳動物細胞轉錄，以形成能夠在其應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子，(C)有效連接於TR元件的核苷酸序列，其包含編碼多肽的第一可讀框(0RF)，並能夠與 TR元件共轉錄及與所述mRNA分子共翻譯，和(D)多聚腺苷酸化序列。
116.權利要求115的哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞選自HEK293、HT1080、 NTERA-2D、HeLa、Caco2、H印G2、BALBC/3T3 和 Cos_7。
117.權利要求115的哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞是胚胎幹細胞。
118.權利要求117的哺乳動物細胞，其中胚胎幹細胞是鼠胚胎幹細胞mES-D3或人胚胎 幹細胞hES。
119.轉基因非人動物，其包含穩定整合到所述動物基因組中的在哺乳動物細胞中可表 達的核酸表達盒，其中所述表達盒以5』至3』方向包含如下元件(A)至少一種轉錄效應序列，(B)包含根據權利要求91的TR元件、編碼PLP/DM20肽的TR元件，所述TR元件能夠被 哺乳動物細胞轉錄，以形成能夠在其應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子，(C)有效連接於TR元件的核苷酸序列，其包含編碼多肽的第一可讀框(0RF)，並能夠與 TR元件共轉錄和與所述mRNA分子共翻譯，和(D)多聚腺苷酸化序列。
120.權利要求119的轉基因非人動物，其中所述動物是小鼠。
121.用於毒性測定的試劑盒，其包含(A)在哺乳動物細胞中可表達的核酸表達盒，其中所述表達盒以5』至3』方向包含如下 元件(1)至少一種轉錄效應序列，(2)包含根據權利要求91的TR元件、編碼PLP/DM20肽的TR元件，所述TR元件能夠被 哺乳動物細胞轉錄，以形成能夠在其應激和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子，(3)有效連接於TR元件的核苷酸序列，其包含編碼多肽的第一可讀框(0RF)，並能夠與 TR元件共轉錄和與所述mRNA分子共翻譯，和(4)多聚腺苷酸化序列；和(B)有關試劑盒使用的說明書。
122.用於毒性測定的試劑盒，其包含(a)權利要求115-118中任一項的哺乳動物細胞；和(b)有關試劑盒使用的說明書。
全文摘要
本技術涉及包含TR元件和有效連接於TR元件的核苷酸序列的核酸表達盒，其中所述TR元件編碼在應激和/或垂死細胞中翻譯的mRNA分子，所述核苷酸序列為第一可讀框(ORF)序列，編碼多肽或其片段，並與TR元件共翻譯。本技術還涉及包含此類表達盒的哺乳動物細胞和轉基因動物。此外還包括的是包含所述表達盒的試劑盒，以及用於確定毒性和殺死靶細胞的方法。
文檔編號C12N15/82GK101861391SQ200880110916
公開日2010年10月13日 申請日期2008年8月7日 優先權日2007年8月10日
發明者L·卡洛克, M·齊普赫爾 申請人:韋恩州立大學