用於消化道神經肌肉功能的益生菌的製作方法

2023-12-02 02:25:46

專利名稱：：用於消化道神經肌肉功能的益生菌的製作方法
技術領域：
：本發明涉及使用挑選的益生菌製造營養組合物或藥物，以預防或治療消化道(gut)疼痛或消化道不適、消化道運動機能障礙(motordysfunction)、消化道神經肌肉異常(neuromuscularabnormalities)和消化道感染後的後遺症。本發明還涉及預防或治療消化道疼痛或消化道不適以及持久性消化道運動機能障礙的方法。
背景技術：
：益生菌通常被定義為通過改善宿主的腸道微生物平衡而有利於人或動物宿主的活微生物食物增補劑。至今已經報導或提出了益生菌的若干不同有利作用，如排除螺桿菌(Helicobacter)感染(EP0577903)、增強抗定居抗性(特別是對於梭狀芽孢桿菌(clostridium))、降低血清膽固醇、影響宿主免疫系統(例如在體液和細胞免疫系統水平)。EP0768375公開了能夠植入腸道菌群的雙岐桿菌(Bifidobacteria)，它能粘附腸道細胞並競爭性排除腸道細胞上的病原細菌。WO98/00035公開了含有幾種乳酸細菌的腸用組合物，如通過TCD4+外周血淋巴細胞的數量所測量到的，它們表現出可以刺激免疫系統。當人和哺乳動物出現消化道不適或消化道疼痛時，這些常是消化道運動性障礙或換句話說，消化道神經肌肉異常的症狀。任何年齡的個體在許多情況下都會出現消化道神經肌肉異常。如嬰兒遭受的絞痛(colic)或反覆的腹痛，婦女由於激素周期出現的消化道疼痛等等。就腸易激惹綜合症(IBS)而言，益生菌對這一特殊綜合症的效果在現有技術中並不一致。在最近的一項研究(NiedzielinK等人，Acontrolled，double-blind，randomizedstudyontheefficacyofLactobacillusplantarum299Vinpatientswithirritablebowelsyndrome，EuropeanJournalofGastroenterologyHepatology2001，131143-1147)中發現益生菌可能具有調節消化道的運動性的作用。另一方面，O′SullivanMA和O′Morain的文章(Bacterialsupplementationintheirritablebowelsyndrome.Arandomizeddouble-blindplacebo-controlledcrossoverstudy，DigLivDis2000May；32(4)302-4)中沒有發現乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)菌株GG與安慰劑平均值之間具有顯著差異。其它現有技術確證了此後一發現。ThompsonWG(Probioticsforirritablebowelsyndromealightinthedarkness？，EurJgastroenterolHepatol131135-1136，2001)討論了益生菌對IBS的可能治療作用。本發明的目的之一是減輕與消化道神經肌肉控制和運動功能的改變有關的任何疼痛或不適。本發明總的目的是減少和/或減輕與個體生命中任何可能情況有關的消化道神經肌肉異常。發明概述值得注意的是，益生菌微生物、其代謝物和/或生長底物影響腸道內的神經肌肉控制。具體的，已證明特定的益生菌可用於減輕胃腸道神經肌肉異常(特別是在感染後)。因此，本發明的第一方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造預防或治療消化道疼痛或消化道不適的營養組合物或藥物中的用途。本發明的第二方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造預防或治療消化道運動機能障礙的營養組合物或藥物中的用途。本發明的第三方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造預防或治療消化道神經肌肉異常的營養組合物或藥物中的用途。本發明的第四方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造治療或減輕消化道感染後的後遺症的營養組合物或藥物中的用途。在還有的方面，本發明提供通過向人或動物施用有效量的挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物來預防或治療消化道疼痛或消化道不適的方法。在另一方面，本發明提供預防或治療消化道運動機能障礙或感染後的過度收縮性(hyper-contractility)的方法，該方法包括施用有效量的挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物的步驟。本發明的一個優勢是提供了治療或預防消化道神經肌肉異常和相關的症狀、消化道問題或疾病狀態的可能性。本發明的另一優勢是提供了不施用藥物，而是基於食品級益生菌微生物或它們的衍生物來治療或預防消化道神經肌肉異常的可能性。附圖簡述圖1顯示取自宿主生物的消化道肌肉組織的收縮強度曲線(AUC)下的面積，所述宿主在感染線蟲寄生蟲十天後被餵以不同的益生菌和對照。使用不同濃度的氨甲醯膽鹼引發刺激(細節在實施例2中給出)。AUC是對消化道肌肉收縮的強度和持久性的測量，以及對感染過程中發展的神經肌肉異常的程度的測量。符號表示以下意義◆對照、■嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，johnsonii)、×長雙岐桿菌(Bifidobacteriumlongum)、*乳酸雙岐桿菌(Bifidobacteriumlactis)、▲副乾酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。可見益生菌通常降低AUC，不同的菌株表現出或多或少的明顯效果。圖2顯示描述於圖1但是由電場刺激的肌肉組織的緊張性收縮(A)和位相性收縮(B)，並比較了餵以活的(L.p.)、死的(deadL.p.)副乾酪乳桿菌(CNCMI-2116)益生菌株系以及僅餵以培養基上清液液(Sn)的宿主生物。術語「緊張性增加和位相性收縮」在實施例2和圖3中解釋。如所見的，所有益生菌來源的飼料(活的或死的細菌、上清液)都具有比對照(MRS)明顯更低的緊張性增加和位相性收縮。圖3形象地表示了用於測定感染後的神經肌肉異常的方法的概念。曲線顯示對體外肌肉刺激的記錄。在刺激前記錄基礎張力(tone)(1)和基礎相位(4)。刺激後，肌肉發生收縮，此收縮被記錄為刺激後的張力(2)和刺激後的位相性收縮(5)。也可計算曲線(AUC)下的面積(7)。為了進行統計，比較了對照和處理樣品的緊張性收縮(3)、位相性收縮(6)和AUC(7)。發明詳述在說明書的上下文中，「包含」一詞指「包括，但不僅限於」。它不應被理解為「僅僅由…組成」。為了本發明目的，術語「挑選的益生菌微生物」或簡單地「挑選的益生菌」指的是能夠發揮這裡報導的有利作用的任何微生物，或這類益生菌的混合物或組合。因此益生菌可以選自已知的益生菌株系。然而，至今未知具有益生性質的微生物也可能被證明具有根據本發明的有益的作用，並因此包括於術語「益生菌」中。在本發明的上下文中，術語「營養組合物」旨在包括任何可食用的物質。因此，它可以是設計為人食用的產品，但是此術語也包括動物食用的產品，例如寵物，如狗、貓、兔子、豚鼠、小鼠、大鼠、鳥(例如鸚鵡)、爬行動物和魚食用的產品。然而，此術語也包括其它馴養動物食用的食物，例如家畜(如牛、馬、豬、綿羊、山羊、水牛、駱駝等)的飼料產品。營養組合物可以是用於人消費的食物產品，如飲料、飲品、棒狀食品、點心、冰激凌、奶製品(例如冷藏的或耐貯存的奶製品)、糖食、穀物產品(如早餐穀物)、旨在於微波爐或烤箱中加熱後食用的冷凍產品、即食產品、速食或營養配方製品等。營養配方製品包括任何全營養的或增補的製品。它可以是例如，通常可應用的營養配方製品、嬰兒或幼兒配方製品、用於老年患者的配方製品、用於需要大量護理的患者的配方製品或專門適應用於患有特殊疾病的患者的配方製品。例如，營養配方製品可以適應於患有營養相關問題的患者，所述營養相關問題是例如Crohn氏症、高血糖、肥胖、體重減輕、痢疾、便秘、苯丙酮尿症、肝炎、急性或慢性腎衰竭等等。這類配方製品可以是可復水的，即以幹品的形式存在，或是易於飲用的，例如以液體製品的形式。在本發明的上下文中，術語「消化道神經肌肉異常」包括與異常的或擾亂的消化道肌肉收縮、收縮性或運動性相關聯的所有疼痛或不適相關症狀。例如，這些異常與不正常的膨脹或通便有關，與嬰兒和/或幼兒的絞痛有關，與人或寵物的消化道套疊有關，與消化道被寄生蟲(如線蟲或病原細菌)感染後擾亂的通過腸的轉運時間有關。在本發明上下文中，消化道神經肌肉異常還包括與嬰兒期相關的異常(如作為嬰兒絞痛問題的一部分)、與鍛鍊相關的異常(包括運動誘導的痙攣)和與劇烈鍛鍊和體育運動相關的神經肌肉問題、與妊娠相關的異常和與分娩相關的失調、與具有無關損傷、創傷和感染但其臨床治療或狀況(包括抗生素、固定不動和腸胃外或腸內餵食)導致了腸道神經肌肉功能喪失的臨床患者相關的異常、與衰老有關的異常以及與活動減少、低膳食纖維和微生物區系改變相關的神經肌肉控制喪失、與不尋常的飲食或生活習慣(包括飲酒、表現出神經肌肉副作用的藥物、太空人遇到的重力改變、劇冷或劇熱和再水化(rehydration)問題)相關的異常。「運動機能障礙」等同於通常出現在人或動物的胃腸道被病原生物，如線蟲、絛蟲和某些細菌(如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)或沙門氏菌(Salmonella))感染之後的消化道神經肌肉異常。運動機能障礙也可能發生在其它原因導致的發炎過程中或之後。在許多情況下，消化道神經肌肉異常或運動機能障礙是持久的，會持續很長時間。優選的是，本發明的用途涉及與消化道肌肉異常有關的消化道疼痛或不適。「後遺症」是感染後持續的異常或偏離健康狀態，即使是寄生蟲或其它感染因素已從宿主中消除。它們被認為通常對宿主造成不可逆的損害。在本發明上下文中「益生菌來源物質」包括活的或死的益生菌、通過用益生菌發酵獲得的培養基、在發酵後的培養基中發現的代謝物以及它的衍生物，如濃縮物等、發酵底物、通過如過濾或離心去除掉益生細菌後的培養基上清液或保留物。在本發明的一個實施方案中，消化道疼痛或不適、運動機能紊亂或消化道神經肌肉異常由病原體感染消化道引起。本發明上下文中「病原體」包括能夠感染個體消化道並導致疾病狀態的微生物。因此術語「病原體」包括寄生蟲、細菌、病毒、多細胞生物(如線蟲和其它蠕蟲)。益生菌的選擇可以選擇任何合適的微生物作為益生菌。根據本發明，優選的益生菌選自對人或動物的健康發揮有益作用的微生物。文獻中提及了一些可以從中挑選出根據本發明的益生菌的微生物。如EP0862863A2，具體在第3頁，第25-37行，列出了可以從中選擇本發明益生菌的微生物。合適的益生微生物的例子包括酵母如酵母屬(Saccharomyces)、德巴利酵母屬(Debaromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)和球擬酵母屬(Torulopsis)，黴菌如麴黴屬(Aspergillus)、根黴屬(Rhizopus)、毛黴屬(Mucor)和青黴屬(Penicillium)和球擬酵母屬(Torulopsis)以及細菌如雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、庫克菌屬(Kocuria)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostrepococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、氣球菌屬(Aerococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)以及乳桿菌屬(Lactobacillus)。合適的益生菌微生物的具體例子有黑麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(A.oryzae)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、腸膜芽孢桿菌(B.mesentericus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilus)、納豆芽孢桿菌(B.natto)、嗜澱粉擬桿菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛擬桿菌(Bac.capillosus)、棲瘤胃擬桿菌(Bac.ruminocola)、豬擬桿菌(Bac.suis)、青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、B.animalis、短雙岐桿菌(B.breve)、兩岐雙岐桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙岐桿菌(B.infantis)、乳酸雙岐桿菌(B.lactis)、長雙岐桿菌(B.longum)、假長雙岐桿菌(B.pseudolongum)、嗜熱雙岐桿菌(B.thermophilum)、Candidapintolepesii、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳脂腸球菌(Enterococcuscremoris)、E.diacetylactis、糞腸球菌(E.faecium)、中間腸球菌(E.intermedius)、乳酸腸球菌(E.lactis)、E.muntdi、嗜熱腸球菌(E.thermophilus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、L.alimentarius、L.amylovorus、捲曲乳桿菌(L.crispatus)、短乳桿菌(L.brevis)、乾酪乳桿菌(L.casei)、彎曲乳桿菌(L.curvatus)、纖維二糖乳桿菌(L.cellobiosus)、L.delbrueckiiss.Bulgaricus、L.farciminis、發酵乳桿菌(L.fermentum)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、乳酸乳桿菌(L.lactis)、植物乳桿菌(L.plantarum)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、L.sakei、唾液乳桿菌(L.salivarius)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、P.cereviseae(damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Prop.shermanii)、釀酒酵母(Saccharomycescereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staph.xylosus)、Streptococcusinfantarius、Strep.Salivariusss.thermophilus、嗜熱鏈球菌(Strep.thermophilus)、乳鏈球菌(Strep.Lactis)。例如，益生菌株可以選自例如地衣芽孢桿菌(DSM5749)、枯草芽孢桿菌(DSM5750)、乳酸雙岐桿菌(DSM20215)、糞腸球菌菌株(如NCIMB10415、NCIMB11181、NCIMB30098、DSM3520、DSM4788、DSM4789、DSM5464、DSM7134、CECT4515)、E.mundtii(CNCMMA27/4E)、釀酒酵母菌株(如BCCM/MUCL39885、CBS49394、CNCMI-1077、CNCMI-1079、NCYCSc47)、乾酪乳桿菌(NCIMB30096)、L.farciminis(CNCMMA67/4R)、約氏乳桿菌(I-1225CNCM)、副乾酪乳桿菌(I-2116CNCM)、植物乳桿菌(CNCMI-840)、鼠李糖乳桿菌(DSM7133)、乳酸片球菌(CNCMMA18/5M)、Streptococcusinfantarius(CNCMI-841)、嗜熱鏈球菌(Chr.Hansen，)，和它們的混合物。根據本發明，具有示例性保藏菌株的益生菌種的另外例子可以選自羅伊氏乳桿菌(CNCMI-2452、CNCMI-2448、CNCMI-2450、CNCMI-2451)、鼠李糖乳桿菌(CNCMI-2449)、嗜酸乳桿菌(CNCMI-2453)和它們的混合物。在這一段提及的菌株可能特別適合寵物。可以通過篩選方法從以上列出的微生物中挑選根據本發明的有效益生菌。儘管可以使用任何合適的篩選方法，但BarbaraG、VallanceBA在CollinsSMPersistentintestinalneuromusculardysfunctionafteracutenematodeinfectioninmice，Gastroenterology1997；1131224-1232中開發的方法被證明相對快速。此參考文獻公開了一種測量消化道神經肌肉異常程度的模型。因此，可以通過以下步驟挑選合適的益生菌-從一種動物物種或人挑選患有消化道神經肌肉異常的至少一個生物體，-通過腸道途徑向該生物施用益生菌來源物質，-測量該生物消化道肌肉組織的第一收縮性，-將此第一收縮性與陰性對照的第二收縮性相比較，和，-挑選益生菌株，所述益生菌株會導致食用它的生物的肌肉組織具有低於陰性對照的第一收縮性。在有關篩選的段落中用於挑選特定益生菌株的「陰性對照」旨在指患有消化道神經肌肉異常的生物的消化道肌肉組織，並且該生物沒有通過腸道途徑接受益生菌來源物質。篩選包括測量生物消化道肌肉組織的第一收縮性的步驟，此外還包括將此第一收縮性與陰性對照的第二收縮性相比較的步驟。可以通過任何適當的方法測量收縮性。例如，使用BarbaraG、VallanceBA、CollinsSM的方法(見上文)。參見特別是1225-1226頁的章節「用於收縮性研究的組織製備」、「收縮的測量」、「電場刺激的參數」、「藥物和溶液」及「數據表達和統計分析」，在此這些章節被引入為參考。因此，可以在體外測量收縮性，即，解剖消化道節段(例如近端空腸節段)，在組織浴槽中以合適的方式固定此節段，誘導肌肉收縮(例如通過化學或電刺激)，用適當的數據處理器記錄收縮。如圖3所描述的，基礎張力(1)、刺激後的張力(2)和緊張性收縮(3)以及基礎相位(4)、刺激後的位相性收縮(5)、位相性收縮(6)和曲線下面積(7)的測量可以作為收縮性的參數。根據本發明的挑選的益生菌是按照上述篩選方法挑選的、例如相對於陰性對照，在患有消化道神經肌肉異常的生物中能降低消化道肌肉的收縮性的益生菌。在本發明的一個實施方案中，挑選的益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低Th2釋放的細胞因子來影響病原體誘導的免疫反應的益生菌。優選的Th2釋放的細胞因子是IL-4和/或IL-13。在本發明上下文中，「顯著的」指的是P＜0.1(優選p＜0.05)的統計學顯著差異，它是通過將餵以益生菌的感染小鼠(處理)與陰性對照相比而獲得的。通常，可以在感染後於確定的時期在縱行腸肌肌肉製品(longitudinalmyentericmusclepreparation，LMMP)中測量細胞因子。優選在感染後14天於LMMP中測量細胞因子。可以使用商業可獲得的試劑盒並按照廠商的說明書測量細胞因子濃度。評估益生菌是否能夠顯著降低Th2釋放的細胞因子的優選方法包括小鼠模型，見下述。對每隻雌性NIH瑞士小鼠(6-8周齡)管飼375隻旋毛蟲(Trichinellaspiralis)幼蟲(見BarbaraG.等人的方法，前文)。為了測定益生菌的影響，從感染後的10到21天，感染的小鼠被每日通過管飼餵以100μl1010個益生微生物(細菌、酵母等)，使用100μlMRS作為陰性對照。可以通過解剖整個空腸，在冷的無菌PBS中漂洗，並切成4段來製備LMMP。除去腸繫膜，並將腸段固定在玻璃棒上。使用乾淨的棉籤刮下肌肉層，速凍並儲存於-70℃直到試驗。可以通過組織學評估確證肌肉的成功分離。將肌肉組織置於1ml含有10％NP-40、10mg/ml異丙醇中的PMSF、1mg/ml抑酶肽和1mg/ml亮抑酶肽的裂解緩衝液中。組織勻漿後測定總蛋白質濃度(Bio-RAD蛋白質分析，Hercules，CA，USA)，等分分裝樣品並儲存於-70℃以用於進一步分析。使用商業試劑盒(QuantikineMMurine，Minneapolis，MN，USA)，按照廠商說明書，可以在LMMP中測定IL-4和IL-13(Th2-細胞因子)和其它炎症介質TGF-bl和PGE2的濃度。在本發明的另一實施方案中，益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低COX-2、TGF-β1或PGE2在LMMP中的表達或濃度來影響病原體誘導的炎症的益生菌。可以用如上指出用於IL-4和IL-13的方式以商業可獲得的試劑盒，通過分析LMMP來測量TGF-β1或PGE2濃度。以下給出評估顯著差異(特別是被感染小鼠的LMMP中表達的TGF-β1和COX-2)的優選方法在感染後14天於LMMP中測量TGF-β和COX-2的信使RNA表達。使用一步法從LMMP中分離總RNA(ChonczynskiP，SacciN″SinglestepmethodofRNAisolationbyacidguanidiumthiocyanate-phenol-chloroformextraction，″AnnBiochem162156-159；1987)。按照VerduEF等人的描述(Modulatoryeffectofestrogenintwomurinemodelsofexperimentalcolitis.AmJPhysiolgastrointestLiverPhysiol2000；283G27-36)完成逆轉錄和PCR反應。使用下述引物。HPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，用作標準化對照)有義5』-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3』，反義5』-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3』(SveticA，″Cytokineexpressionafterimmunization″，JImmun1472391-7)。TGFβ有義5』-TCACCCGCGTGCCTAATGGT-3』和反義5』-GGAGCTGAAGCAATAGTTGG-3』(DerynckR，RheeL，NucleicAcidRes1987；153187-97)；COX-2有義5』-TGGTGCCGGGTCTGATGATG-3』，反義5』-GCAATGCGGTTCTGATACTG-3′(Gustafson-Svard等人，Cyclooxygenase-1andcyclooxygenase-2geneexpressioninhumancolorectaladenocarcinomasandazomethaneinducedcolonictumoursinrats.Gut1996；3879-84)；為了排除汙染樣品的基因組DNA的擴增，也使用RNA作為底物進行PCR實驗。擴增後在2％瓊脂糖凝膠中電泳分離15μl的PCR產物，通過溴乙啶染色顯像，並使用55型Polaroidland膠片拍照(Kodak，Rochester，NY)。底片被用於通過KodakDigitalScience1D2.0ImageAnalysis軟體進行帶強度的密度計量學定量。以HPRT管家基因來標準化結果，並以細胞因子對HPRTmRNA的表達比例來表示。在本發明的一個實施方案中，挑選的益生菌是雙岐桿菌。優選的是乳酸雙岐桿菌或長雙岐桿菌。在還有的本發明實施方案中，挑選的益生菌是副乾酪乳桿菌。還在本發明另外的實施方案中，挑選的益生菌選自長雙岐桿菌(CNCMI-2170)、乳酸雙岐桿菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)、副乾酪乳桿菌(CNCMI-2116，CNCMI-1292)和它們的混合物。而在本發明的另一實施方案中，益生菌包括死的益生細菌、發酵底物和/或益生菌來源物質。任選的是，益生菌也包括它們的發酵底物，如益生素。本領域技術人員通常知道益生菌的發酵底物，例如雙岐桿菌可利用菊粉和/或寡聚果糖作為發酵底物。益生菌製備本領域技術人員知道如何製備挑選的益生微生物。它們既可以通過商業獲得，也可以通過發酵方法常規產生，並可任選地進行乾燥。技術人員了解，特定的菌株通常具有特定的優選培養基或底物。微生物可以是乾燥的形式，或例如是孢子的形式(對於形成孢子的微生物而言)。技術人員知道如何乾燥發酵後產生的微生物。例如見WO0144440(INRA)或EP0818529(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)，其中描述了粉碎乾燥方法。通常，從培養基濃縮細菌微生物並通過噴霧乾燥法，流化床乾燥法，凍幹法(冷凍乾燥)或其它適當乾燥方法進行乾燥。例如，在乾燥前或乾燥過程中將微生物與碳水化合物(如蔗糖、乳糖或麥芽糖糊精)、脂質或蛋白質(如奶粉)之類的載體材料混合。然而，微生物並非必須以乾燥的形式存在。在發酵之後直接將它們與食物產品混合，然後任選地進行乾燥加工，也可能是合適的。這樣一種方法被描述於WO02065840(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)。同樣，在理論上可以在發酵後直接食用益生菌。進一步的加工(例如為了製備方便的食物產品)並不是益生菌有益性質的前提條件。許多適宜實施本發明的益生菌是商業可獲得的，可以以粉末的形式從各供應商處獲得，例如，可以從Ch.Hansen獲得乳酸雙岐桿菌(DSM20215)。本領域技術人員知道多個不同的益生菌供應商。一些供應商以特定的包囊化形式提供益生菌，以便確保微生物在通過胃腸道的過程中或在產品的儲藏過程中或產品的儲存期有高的存活率。包含具有增加的貯存穩定性而無過多損失的微生物的產品的例子描述於EP0180743和WO02065840(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)。根據本發明的益生菌可以以任何形式通過腸道途徑消費。它們可以加入營養組合物，如食物產品中。另外，它們也可以直接消費，例如以乾燥的形式，或者在發酵產生生物質之後直接消費。例如，益生菌可以以發酵的奶製品，如冷藏的奶製品、酸乳酪或新鮮乾酪的形式消費。在後面這些例子中，也可以直接使用益生菌產生發酵產品本身，因此益生菌至少具有雙重功能本發明上下文中的益生功能和對底物(如奶)發酵以產生酸乳酪的功能。如果將益生菌加入營養配方製品，技術人員知道實現此的可能方案。幹的，例如噴霧乾燥的細菌，如可通過描述於EP0818529的方法獲得的細菌可以以粉末的形式被直接加入營養配方製品或加入到任何其它任選乾燥的食物產品。例如，可以在消費前將粉末益生菌製品加入營養配方製品、早餐穀物、色拉、麵包片。包含特定益生菌的營養配方製品目前是商業可獲得的。例如，由Nestle商品化的含有益生菌的斷奶後配方製品(follow-upformula)，例如特別適合嬰兒的「NAN2或NIDINA2-withBifidus」產品可以被用於本發明的目的，只要提供有效的量即可。可選的是，可以將幹的益生菌加入液體產品，例如飲料或飲品。如果旨在以活的狀態消費細菌，在加入益生菌後，含有益生菌的液體產品應該被相對迅速地消費。然而，如果將細菌加入耐貯存產品，只要益生菌在飲料或飲品中是穩定的，則沒有必要迅速的消費。WO9810666公開了一種乾燥食品組合物連同益生細菌培養物的方法。因此，可以將益生菌與例如汁、基於奶的產品或植物乳汁同時乾燥，產生已經含有益生菌的乾燥產品。可以在以後使用水性液體將這一產品復原。益生菌的量雖然並非強制性的，但是益生菌可以以活的狀態被消費，以旨在使益生菌微生物完好地到達小腸和大腸，並可以在大腸建群。如果情況如此，通常要每日消費足夠劑量的活細菌，以實現成功建群。技術人員了解每日劑量取決於微生物，但是通常介於每日106到1014cfu的範圍，優選每日107到1013cfu。在本發明的上下文中，向約65kg體重的人施用的活益生菌的有效量優選介於每日1010到1014，更優選的介於1011到1013，最優選的介於1-4×1012cfu。優選的活益生菌量相當於大約每日一瓶商業可獲得的、用益生菌株製備的、2dl酸乳酪。一個日份量的食品，或如果優先幾個日份量，則所有這些分量一起將通常添加有以上指出的有效量益生菌。然而，使用死的益生菌、發酵的培養基或簡單地使用益生菌的底物(通常是益生素纖維)也能實現本發明的教導。因此，發酵的培養基(即使基本不含益生菌，但含有益生菌代謝物)可以被用來實施本發明。換句話說，可以將死的或活的益生菌、它們的培養基、底物或代謝物以與前面描述的針對活益生菌的相同或相似的方式直接加到食物產品中。發酵的培養基、底物或代謝物可以在發酵後通過如離心或過濾與細菌分離。然後可以濃縮、冷卻、冷凍、乾燥(例如噴霧乾燥)上清液或濾液，或直接通過腸道途徑施用給個體。如果幹燥發酵後的培養基，可以將其製成粉末並如前文針對活益生菌所述的加入到任何食物產品中。如果向人施用上清液或發酵培養基，有效量為0.5到3dl，優選1到2dl的30到50小時，優選45到50小時細菌培養後收穫的生長培養基。當在OD600nm估計細菌密度時，通常獲得2到7的OD，這分別表示生長到每毫升2到7×108個細菌。在通過如過濾除去細菌後可以施用上清液。上清液的有效量相當於每天一瓶商業可獲得的、用挑選的益生菌製備的、1到2dl酸乳酪。對於動物(如寵物)，相應的活細菌或上清液的有效量以體重的函數計算。也可以將含有益生菌的發酵培養基勻漿，並與培養基一起進一步加工通常被破壞的益生菌。如已經指出的，益生菌底物(如促進特定益生菌的膳食纖維)可以被用來實現本發明。這是間接實現本發明效果的一種方式。通過促進腸道中特定益生菌株的生長，可以達到與這裡所述相同的效果。給出以下實施例僅為舉例說明，不應該將它們曲解為是對本發明主題的限制。以下實施例1和2旨在檢查補充益生菌是否可以預防或治療短暫的腸黏膜感染後形成的消化道異常和一般的消化道神經肌肉異常。為了檢查這些問題，使用了以急性旋毛蟲感染事件後持續的神經肌肉異常為特徵的小鼠模型。由此發現益生細菌可以逆轉腸感染後的持續消化道神經肌肉異常。這些結果首次表明益生細菌能夠幹擾腸感染過程中的寄生蟲負荷。而且，即使是在寄生蟲感染已建立之後開始施用益生菌，也可以逆轉由這些感染引起的一些長期的胃腸道併發症。這些效果被首次證實高度依賴於所使用的具體益生菌。實施例1預防小鼠感染旋毛蟲的益生菌材料和方法以下在″國立微生物保藏中心″(CNCM)保藏的菌株和商業可獲得的益生菌株被用於實驗。嗜酸乳桿菌(johnsonii)(CNCMI-1225)副乾酪乳桿菌(CNCM1-2116)長雙岐桿菌(CNCMI-2170)乳酸雙岐桿菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)，購自ChristianHansenBioSystemsA/S(CHL)，10-12BogeAllé，P.OBox407，DK-2970Horsholm，丹麥。在旋毛蟲感染(375隻幼蟲)前持續10天，每天用益生菌製品和兩種對照(培養基(MRS)或磷酸緩衝鹽水(PBS))對雌性NIH瑞士小鼠(每組n＝5)進行管飼。貫穿整個實驗連續施用益生菌。旋毛蟲感染後9天，對小鼠實施無痛死亡，計數蠕蟲的數量和測定髓過氧化物酶活力(MPO)。每日管飼量為每種細菌1×109細菌/100μl生長培養基/小鼠/天和100μl過濾的生長培養基/小鼠/天(在實驗中僅用上清液)。結果在使用MRS或PBS進行預防性處理的小鼠之間蠕蟲數量沒有差異，因此所有進一步的實驗使用MRS作為唯一對照組。發現用乳酸雙岐桿菌菌株預處理的小鼠比用MRS及PBS預處理的小鼠趨向於具有更低的蠕蟲數量。另一方面，嗜酸乳桿菌菌株表現出增加蠕蟲負荷(load)。剩下的菌株(就測試的時期和劑量而言)並沒有表現出對蠕蟲負荷有顯著影響。總之，發現當預防性施用時，不同的益生菌菌株對於蠕蟲負荷具有不同的效果。特定的益生菌株(如乳酸雙岐桿菌菌株)能夠降低腸道寄生蟲(如線蟲)的感染負荷。實施例2在小鼠中治療旋毛蟲感染後遺症的益生菌材料和方法在第二個實驗中，小鼠首先被旋毛蟲(375隻幼蟲)感染，並在感染後的10到21天，每日用上述5種益生菌或MRS進行管飼，然後無痛處死小鼠，並取組織進行體外收縮性實驗。在此旋毛蟲模型中，儘管在感染後的第21天寄生蟲已被排出並且腸黏膜炎症已經消退，但神經肌肉異常(過度收縮性)仍然持續。經藥理學刺激(氨甲醯膽鹼)或電刺激(EFS)置於肌肉浴槽中的腸組織之後，通過體外收縮性測量來評估神經肌肉功能。使用的方法根據BarbaraG，VallanceBA，CollinsSMPersistentintestinalneuromusculardysfunctionafteracutenematodeinfectioninmice.Gastroenterology1997；1131224-1232。特殊是見章節「用於收縮性研究的組織製備」和「收縮的測量」。因此，從小鼠中取一小段腸，在37℃於充氧(95％O2/5％CO2)的Krebs溶液中處理。系住腸段的相對末端。組織的一端與等長力傳感器(isometricforcetransducer)(FT03C型；Grass，Quincy，MA)連接，另一端與浴槽的銜鐵(armature)連接。用Grass7E多道記錄儀記錄反應。用EFS和氨甲醯膽鹼(細節見上述參考文獻)產生刺激。通過計算機分析刺激的收縮，由此測量了基礎張力、位相性收縮、緊張性收縮和緊接於收縮後的最大張力，並計算了曲線下面積。圖3形象化表示了基礎張力(1)、刺激後的張力(2)和緊張性收縮(3)以及基礎相位(4)和刺激後的位相性收縮(5)、位相性收縮(6)和曲線下面積(7)的概念。結果圖1顯示曲線下的面積，此面積考慮了刺激後收縮的時期和這一時期內的收縮張力。在餵以上述提及的益生菌株的小鼠和對照小鼠之間可見明顯的差異(更小的曲線下面積)，證實在前面的情況下刺激後的收縮更短和/或張力更小。圖1中的符號具有以下意義◆對照、■嗜酸乳桿菌(johnsonii)、×長雙岐桿菌、*乳酸雙岐桿菌、▲副乾酪乳桿菌。圖2表示描述於圖1的但是由電場刺激的肌肉組織的緊張性收縮(A)和位相性收縮(B)，並比較了餵以活的(L.p.)、死的(deadL.p.)副乾酪乳桿菌(CNCMI-2116)益生菌株和僅餵以培養基上清液(Sn)的宿主生物。對照是MRS培養基。可見，在感染後的21天，與僅餵以MRS的小鼠相比，餵以益生菌來源的飼料(活的或死的細菌、上清液)的小鼠的消化道肌肉具有明顯降低的收縮張力。其數值接近於未感染小鼠的數值。結論這些結果導致結論益生菌能夠使感染後的腸肌肉過度收縮狀態正常化。換句話說，益生菌減少了胃腸道感染後持續的後遺症。這些效果因菌株而不同，在本實驗中使用益生菌株副乾酪乳桿菌(CNCMI-2116)產生最實質的效果，而選用於本實驗的所有雙岐桿菌菌株也呈現出這些效果。實驗的整體結論是特定的益生菌株(如副乾酪乳桿菌(CNCMI-2116))能夠直接影響肌肉的收縮性。這一普遍性發現的結果是通過施用適當的益生菌，可以以一種一般性方式治癒、治療和/或預防在個體的生命中許多情況下發生的胃腸道神經肌肉異常(消化道收縮)。異常的消化道收縮發生在遭受絞痛、消化道疼痛或消化道不適的嬰兒、幼兒、青少年和成年人中，例如描述於IBS中的那些。異常的消化道收縮可能導致人和寵物發生消化道套疊，它們可能導致消化道鼓脹及不規則和不適當的通過腸的轉運時間。可以作出結論在這些情況下，通過施用益生菌能達到一般的緩解效果。權利要求1.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造預防或治療消化道疼痛或消化道不適的營養組合物或藥物中的用途。2.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造預防或治療消化道運動機能障礙的營養組合物或藥物中的用途。3.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造預防或治療消化道神經肌肉異常的營養組合物或藥物中的用途。4.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在製造治療或減少消化道感染後的後遺症的營養組合物或藥物中的用途。5.根據權利要求1-3任一項的用途，其中消化道疼痛或不適、運動機能障礙或消化道神經肌肉異常是由病原體感染消化道引起的。6.根據前述權利要求中任一項的用途，其中挑選的益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低Th2釋放的細胞因子來影響病原體誘導的免疫反應的益生菌。7.根據前述權利要求中任一項的用途，其中益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低COX-2、TGF-β1或PGE2在縱行腸肌肌肉中的表達或濃度來影響病原體誘導的炎症的益生菌。8.根據前述權利要求中任一項的用途，其中挑選的益生菌是雙岐桿菌。9.根據權利要求1-7中任一項的用途，其中挑選的益生菌是副乾酪乳桿菌。10.根據權利要求1-7中任一項的用途，其中挑選的益生菌選自長雙岐桿菌(CNCMI-2170)、乳酸雙岐桿菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)、副乾酪乳桿菌(CNCMI-2116，CNCMI-1292)和它們的混合物。11.根據前述權利要求中任一項的用途，其中益生菌包括死的益生細菌、發酵底物和/或益生菌來源物質。全文摘要本發明涉及在營養組合物或藥物中使用益生菌來預防或治療消化道神經肌肉異常。這類異常與例如嬰兒絞痛、一般的消化道疼痛或消化道不適等有關。本發明具體涉及治療或預防感染後的消化道神經肌肉異常。益生菌可以以活的或死的狀態被施用，也可以直接使用發酵培養物的上清液來實現這裡描述的有利效果。文檔編號C12N1/20GK1678329SQ03820003公開日2005年10月5日申請日期2003年7月23日優先權日2002年7月23日發明者I·科爾蒂希杜拉,E·韋爾杜德貝爾希克,P·貝爾希克,S·M·柯林斯申請人:雀巢技術公司