2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫藥用途的製作方法

2023-12-05 15:32:51 3

專利名稱：2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫藥用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑的醫藥用途。
背景技術：
熱休克蛋白90(Heat shock protein，HSP90)，又名熱激蛋白90，大量存在於真核細胞中，是一類ATP依賴的分子伴侶，在維持構型穩定、保持活性和一些蛋白的降解過程中發揮著重要作用(Pearl LH, Prodromou C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annu Rev Biochem，2006，75 :271-294.)。HSP90 在胞漿內主要以同源二聚體的形式存在。越來越多的證據表明，HSP90 二聚體在多種炎症模型中具有促炎活性(Yeo M，et al. Blockage of HSP 90modulates Helicobacterpylori-induced IL_8 productions through the inactivation of transcriptionalfactors of AP-I and NF- κ B. Biochem Biophys Res Commun 2004;320:816-824;Murata M，et al. Heat shock protein 90 is required for increased DNA bindingactivity of activator protein-1, a heterodimer of Fos/JunD， in rheumatoidsynovial cells under inflammatory stimuli. Int J Mol Med2005 ; 15 (4) :649-653;Hsu HY, et al. Geldanamycin interferes with the 90—kDa heat shock protein，affecting lipopoIysaccharide-mediated interleukin-1 expression and apoptosiswithin macrophages. Mol Pharmacol 2007 ；71 (I) :344-356.)。HSP90 的多種客戶蛋白是在炎症的信號通路中起重要作用的蛋白激酶和轉錄因子，包括TAKl、Akt、IKK等(XinYu Liu, et al. HSP90 is required for TAKlstability but not for its activationin the pro-inflammatory signaling pathway. FEBS Lett. 2008 ；582 (29) :4023-4031;Sato S，et al. Modulation of Akt kinase activity by binding to HSP90. Proc NatlAcad Sci USA. 2000 ;97 (20) :10832-10837.)。其中 IKK 活化 NF-κ B 的作用可以被 HSP90抑制劑解除，表明HSP90是IKK活化NF-K B所必需的(Broemer M，eat I. Requirementof Hsp90activity for IkB kinase (IKK)biosynthesis and for constitutive andinducible IKK and NF-κ B activation. Oncogene. 2004 ；23(31) :5378-5386.)。NF-κ B是多種類型細胞中所表達的一種轉錄因子家族，是調節炎症應答系統的關鍵轉錄因子，在炎症及膿毒症中起到至關重要的作用。抑制NF-κ B活性，已成為治療炎症及膿毒症的新焦點。研究表明，HSP90抑制劑17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德黴素(17-AAG)具有明顯抗膿毒血症活性。Chatterjee A發現17-AAG可以延長LPS誘導的膿毒血症鼠存活時間，抑制炎症反應，減輕肺損傷(Chatterjee A，et al. Heat shock protein90 inhibitors prolong survival, attenuate inflammation, and reduce lung injuryin murine sepsis. Am J Respir Crit Care Med. 2007 ; 176 (7) :667-675.)，對其作用機制進行研究發現，17-AAG發揮作用是通過抑制HSP90 N末端ATP酶活性實現的。N末端是ATP/ADP 的結合位點，與 HSP90 的功能關係密切(Prodromou C, Pearl LH. Structure andfunctional relationships of Hsp90. Curr Cancer Drug Targets,2003,3 :301-323.)。ATP/ADP結合部位起著構象轉化區的作用，調節HSP90參與的多分子伴侶複合物的裝配。HSP90是通過形成多分子伴侶複合物來穩定客戶蛋白的構象的，若能夠抑制HSP90與促炎因子形成複合物使其構象不穩定，則能夠達到抗炎目的。此外，HSP90的客戶蛋白還包括 Raf-I、突 變型 BRaf、IGF-IR、Her2、C-Met,C-Kit、突變型EGFR等，在腫瘤的發展變化過程中，這些效應蛋白均過度表達(PicardD. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation. Cell Mol LifeSci，2002 ；59(10) :1640-1648.)。一系列研究表明，17-AAG在臨床前試驗中對乳腺癌、骨髓瘤、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤均表現出顯著的抗腫瘤作用。目前，17-AAG作為一類新藥已經進入三期臨床試驗階段。綜上，設計或尋找以HSP90為作用靶點的藥物，對炎症、膿毒血症、以及腫瘤等疾病的防治，具有積極意義。另一方面，系列親和色譜(YamamotoK, Yamazaki A, Mikio Takeuchi M. Aversatile method of identifying specific binding proteins on affinity resins.Anal Biochem,2006, (352) :15-23.)是一種不受藥物溶解性、配基-蛋白複合物解離速度的影響，適合於水溶解性較差的化合物的尋找藥物作用靶點的分離純化方法。其原理是配基兩次與柱材上的結合蛋白作用，對比兩次洗脫液中蛋白條帶差異，確定特異性結合蛋白(圖I)。目前，已經利用該法找到了 FK506的靶蛋白FKBP12、苯磺醯胺基的靶蛋白CA2、氨甲喋呤的靶蛋白二氫葉酸還原酶。是一種用於識別活性成分靶蛋白的常用方法之一。計算機輔助藥物設計，是一種指基於分子對接的資料庫搜索方法，可利用從已建立的大規模化合物的三維結構資料庫幾十到幾百萬個化合物中搜尋與靶標生物大分子活性部位或結合部位相匹配的化合物，也可利用分子對接技術佐證小分子與靶標蛋白的結合。

發明內容
本發明公開了 2-0-a-L-鼠李糖-4，6，4'-三羥基二苯甲酮(以下簡寫為THBP)作為HSP90抑制劑的用途，其可用於製備治療或預防與HSP90相關的疾病，如炎症藥物。發明人利用系列親和色譜技術，識別2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮在人單核細胞株THP-I細胞中的特異性結合的蛋白(圖2)，並通過質譜鑑定和蛋白免疫印跡技術鑑定該蛋白為HSP90。隨後利用計算機模擬分子對接軟體G0LD，採用TOB code :3IED模板，初步確定THBP與HSP90的結合位點位於HSP90的N-末端(圖3，4)。在此基礎上，依據HSP90抑制劑的活性，採用角叉菜膠致小鼠足趾腫脹和脂多糖(LPS)致小鼠急性肺損傷兩個模型，證實THBP與HSP90抑制劑17-AAG體內給藥具有類似活性，提示可作為新類型的HSP90抑制劑，用於防治HSP90介導的炎症、膿毒血症、腫瘤等重大疾病，具有廣闊的應用前景。以下是具體

發明內容
I基於系列親和色譜技術識別HSP90為THBP特異性結合蛋白實驗材料Epoxy-activated sepharoseTM6B(GE Healthcare),氫氧化鈉(南京化學試劑有限公司，AR)，甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，CR)，A8600-4000乙腈(Roe ScientificInc.)，高糖DMEM培養基(GIBCO);青黴素，鏈黴素(山東魯抗醫藥股份有限公司);胰蛋白酶(南京生興生物技術有限公司)；新生牛血清(民海生物)；細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒(碧雲天)；亮肽素、抑肽酶、胰蛋白酶抑制劑(AMERESC0);溴酚藍(上海生工)；β-巰基乙醇(南京大治生物技術有限公司)；其他試劑均購自南京化學試劑廠。THP-I細胞株(人白血病單核細胞株)，購自 中國科學院上海生化細胞所。電子分析天平Mettler_ToledoInstr. (Shanghai) Ltd, DSHZ-300 多用途恆溫水浴振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)，HP-Ol真空泵(江蘇漢邦科技有限公司)，Z-323K冷凍離心機(HERMLE，德國)。實驗方法精密稱取3· 53mg THBP 與 O. 0 Epoxy-activated sepharose 6B (EAS-6B)柱材進行水浴震蕩反應，溫度40°C，水浴振蕩20h，轉速110r/min，即得以THBP為配基的親和介質。測定其偶聯率為39%。親和介質取出後用pH8. O的IM乙醇胺封閉液浸泡過夜，並用高濃度pH4. O, pH8. O緩衝鹽交替3次衝洗待用。取製備好的THBP-EAS-6B柱材60 μ I與人白血病單核細胞THP-I細胞裂解液稀釋至Iml含量3mg進行孵育，4°C條件下緩慢攪動4h，瞬時離心，將上清液轉移至另一離心管，再另加入THBP-EAS-6B 60 μ 1，同上操作。取兩次孵育的柱材部分用定量緩衝液洗滌，加入變性劑煮沸5min，瞬時離心，分別得到上清液X，Y用於10% SDS-P AGE電泳，硝酸銀染色，對得到的凝膠進行掃描。實驗結果由圖2所示，通過第一次與第二次特異性結合條帶的灰度值差異性分析，位於85KD與100KD之間的條帶，第一次特異性結合蛋白條帶的灰度值明顯大於第二次孵育的條帶的灰度值，推斷條帶為THBP的特異性結合條帶，通過質譜鑑定和蛋白免疫印跡技術鑑定該蛋白為HSP90(圖3)。2基於計算機虛擬分析技術佐證THBP和HSP90的相互作用實驗方法使用PDB資料庫中下載的晶體模板TOB code 3IED,採用GOLD對接程序實施分子對接。模板TOB code :3IED中的自帶小分子的三維坐標被用於定義活性區域，活性位點半徑為10A,範德華力和氫鍵相互作用的退火參數分別為4和2.5A,其他參數保持默認值。實驗結果有文獻表明，許多HSP90抑制劑在N-末端區域與ATP競爭性結合(圖4)，N-末端區域是重要的抑制劑結合位點。本研究結果如圖5所示，初步確定THBP與HSP90的結合位點位於HSP90的N-末端，THBP位於HSP90的N-末端的空腔內，與空腔契合較好。表明THBP與HSP90空腔契合較好，能作為HSP90潛在的抑制劑。3 THBP作為HSP90抑制劑的體內活性驗證3. I THBP不同劑量對角叉菜膠誘導的小鼠足趾腫脹的影響實驗方法ICR小鼠50隻，雄性，體重20±2g，隨機分為5組，即模型組、THBP I. 25mg/kg,5mg/kg,20mg/kg三組、陽性對照組地塞米松(DEX,5mg/kg)。模型組灌胃給予相應體積純淨水，其他各組灌胃給予相應藥物，給藥後I小時足底注射4%角叉菜膠，用螺旋測微儀測量各組小鼠注射角叉菜膠後的1、2、3、5、8小時的足厚，並計算腫脹度。腫脹度(％)=(致炎前足厚一致炎後足厚)X 100% /致炎前足厚。實驗結果由表I可見，THBP 1.25、5、20mg/kg能抑制角叉菜膠所致小鼠足蹠腫脹。與對照組相比，在致炎第l、2、3、5、8h時，THBP I. 25mg/kg作用存在顯著或極顯著性差異；在致炎第I、2、8h時，THBP 5mg/kg作用存在顯著性差異或極顯著性差異，在致炎第I、2、3、5、8h時， THBP 20mg/kg作用存在顯著性差異或極顯著性差異。表I THBP對角叉菜膠致小鼠足蹠腫脹的影響(l±s，n=10)
劑g ...................................................................................................................腫脹度(%)............................................................................................................
"_(mg/kg)_l_h_2h__3h__5h_8h_
模型 I 26.08±4.97 27.26±6XI5 23/77±6^89 20.80t7.46 15.58±6.52 THBP 1.25 19.82土5.06* 18.67±.98** 18.38±3.16* 15.03±2.85* 10.25士 3.02*
5.0018.84±4.83** 19.49±5.20** 18.58±4.80 15.57±4.08 10.21 士 3.43*
20.0018.69士5.05** 19.35±4.09** 16.88±4.05* 14.42±3.23* 9.45±3.57* DEX 5.00 18.64±3.53** 16.21±4.18** 13.02 士5.37** 10.39±3.52** 4.54士 3.23***P < 0. 05，林P < 0. 01與模型組比較3. 2 THBP與17-AAG單劑量對角叉菜膠誘導的小鼠足趾腫脹的影響實驗方法ICR小鼠40隻，雄性，體重20±2g，隨機分為4組，即模型組、THBP I. 25mg/kg組、17-AAG組、陽性對照DEX 1.25mg/kg組。各組給予相應藥物後採用同上的方法進行活性觀察。實驗結果結果由表2可見，THBP I. 25mg/kg能抑制角叉菜膠所致小鼠足蹠腫脹，且在致炎第l、5、8h時，與模型組相比存在顯著性差異；17-AAG I. 25mg/kg也能夠抑制足腫脹，且在致炎第8h時，與模型組作用存在顯著性差異。其中在致炎第Ih時，17-AAG與THBP組相比存在顯著性差異(P < O. 05)，提示即THBP比17-AAG起效較快。表2 THBP和17-AAG對角叉菜膠致小鼠足蹠腫脹的影響(}±s，n=10)
~~mZ\ 劑量腫脹度(％)
一_(mg/kg)_Ui_2h_3h_5h_8h_
^2438±5l2 2095± 88 Τ24±4Λ02 士 4.94
THBP 1.25 19.88 士5.10* 20.45土5.62 16.43士 S.64 12.98 士4.66* 9.25土 5.23*
17-AAG 1.25 24.44±5.07 21.48i4.34 16.57土4.62 14.44±5.02 9.34土 5.62* DEX 5.00 18,50士 7,41* 17,66 土5.64* 12.07土 4.91** 9.90±4.80** 5.30±3.91***Ρ < O. 05，林P < O. 01與空白對照組比較3. 3 THBP對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的影響實驗方法ICR小鼠50隻，雄性，體重20±2g，隨機分為5組，即空白組、模型組、THBP 5mg/kg, 17-AAG 5mg/kg組、陽性對照DEX 3mg/kg組。除空白組、模型組灌胃給予相應體積O. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液各組灌胃給予相應藥物，Ih後除空白對照外每隻小鼠尾靜脈注射30mg/kg的LPS無菌生理鹽水溶液。8h後處死小鼠，取右肺稱取溼重。將右肺置於60°C烘箱24h後稱取乾重。記錄並計算肺乾濕比。肺乾濕比=右肺溼重/右肺乾重。實驗結果由表3可見，模型組與空白組相比，肺溼比明顯增加，存在顯著性差異，提示模型小鼠出現明顯肺水腫。THBP與17-AAG 5mg/kg均可明顯降低小鼠急性肺損傷引發的肺水腫，經統計，與模型組相比，具有極顯著性差異。提示THBP與HSP90抑制劑類似，具有明顯抗肺損傷的活性。表3 THBP對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的影響(文±s, n=5)
權利要求
1.2-0- a -L-鼠李糖-4，6，4'-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的用途。其中2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮為圖I結構化合物。
2.權利要求I的用途，2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮可用於製備治療炎症藥物的用途。
3.權利要求I的用途，2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮可用於製備治療肺損傷及膿毒血症的用途。
全文摘要
本發明涉及2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫藥用途，其可用於製備治療或預防與熱休克蛋白90相關的疾病的藥物。具體為熱休克蛋白90抑制劑2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羥基二苯甲酮在防治急性炎症、肺損傷或膿毒血症的用途。
文檔編號A61P11/00GK102961391SQ20121015127
公開日2013年3月13日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者寇俊萍, 餘伯陽, 鹿思思, 呂燕妮, 劉倩 申請人:中國藥科大學