芒果苷元對ptp1b的抑制活性及其應用的製作方法

2023-12-05 22:34:36

專利名稱：芒果苷元對ptp1b的抑制活性及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及芒果苷元對蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制活性、改善胰島素抵抗作用，及在製備治療II型糖尿病、肥胖等代謝症候群、腫瘤和其他PTP1B相關疾病的藥物中的應用。
背景技術：
蛋白酪氨酸的磷酸化水平是細胞內信號轉導的重要調節因素，它由蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase, PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase, PTP)共同調控，PTP1B (Protein tyrosine phosphatase IB， PTP1B)屬於PTP家族，是胰島素信號通路中重要的負調控因子並參與瘦素、多種生長因子、催乳素、整合素、血小板凝集素等的信號轉導過程，與糖尿病、肥胖的胰島素抵抗和瘦素抵抗均有密切關係，與胰島素抵抗、肥胖、血脂代謝紊亂和高血壓等4個代謝症候群主要危險因素顯著相關，在代謝症候群的發生、發展中起重要作用。PTP1B基因敲除小鼠胰島素敏感性顯著提高，而且能維持很好的糖穩態。另外，PTP1B還能夠抑制腫瘤細胞的轉移，與腫瘤細胞凋亡、血管生成有關，在乳腺和上皮細胞中催乳激素-泌乳刺激素的信號轉導中起負調控作用。PTP1B已成為治療II型糖尿病、肥胖症、乳腺癌等多種疾病新型、重要的藥物靶點，在防治代謝症候群、腫瘤等疾病中起重要作用，對其抑制劑的研究也已經成為目前的研究熱點。
芒果苷元(norathyriol， NL)，全稱l, 3， 6, 7-四羥基d山酮(1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone),
其化學結構式如下
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現代藥理研究表明，芒果苷元具有多種生理作用，如抗抑鬱、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、抗氧化及抑制結核桿菌生長等作用，其中抗炎作用的研究較為深入。但目前尚未見其抑制PTP1B、提高胰島素敏感性方面的研究報導。

發明內容
本發明的目的是致力於研究芒果苷元對蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，為人們提供一種新的蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制劑，並通過研究芒果苷元對蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，進一步擴展芒果苷元的藥物用途。
為實現上述目的，申請人從以下幾個方面進行了研究
1、 建立蛋白酪氨酸磷酸酶抑制活性檢測的反應體系，根據PTP1B水解pNPP的磷酸基團而產生顏色反應來檢測化學小分子對PTP1B的抑制活性，並用來測定芒果苷元抑制活性包括ICso值和抑制劑類型。
通過上述體外試驗，申請人發現芒果苷元可顯著抑制PTP1B活性，是一種新型PTP1B抑制劑，其抑制類型為競爭性抑制；
2、 通過小鼠的體內試驗，申請人發現芒果苷元可顯著改善C57BL/6正常小鼠和以胰島素抵抗為特徵的ob/ob糖尿病肥胖模型小鼠的胰島素敏感性，降低實驗動物血糖。
基於上述研究和試驗，申請人首次證實了芒果苷元是活性較好的新型PTP1B競爭性抑制劑，在體內可增加胰島素敏感性，改善實驗動物的高血糖症狀，可以用於製備提高胰島素敏感性、降血糖的藥物，能成為潛在的治療II型糖尿病、肥胖等代謝症候群、乳腺癌藥的物，並可作為潛在的先導化合物進行抗糖尿病、肥胖等代謝症候群、腫瘤和其他與PTP1B相關疾病的藥物進行開發，並可以藉助晶片技術等進一步研究代謝相關的信號通路。


圖l:偏礬酸鈉對PTP1B抑制率曲線圖。
測定不同濃度的陽性對照物偏礬酸鈉(NaV03)對重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制率，相對濃度作圖，得到NaVO3的IC50為0.32^M。圖2:芒果苷元對PTP1B抑制率曲線圖。
測定不同濃度芒果苷元對重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制率曲線，相對濃度作圖，其IC5o為9.2 ^M。
圖3:芒果苷元對PTP1B抑制的雙倒數圖。在酶存在的條件下，固定抑制劑的濃度，改變底物的濃度，用Lineweaver-Burk法，以l/s為橫坐標、1/V為縱坐標作圖得到五條回歸直線，這五條直線交於Y軸，從而判斷芒果苷元對PTP1B的抑制類型為競爭性抑制。
圖4:芒果苷元對正常小鼠ip.胰島素的血糖變化圖。
數據用ANOVA法進行統計學處理(n=ll)，其中各組血糖水平與對照組相比，NL(5、 40mg/kg)在30、 60、 90、 120 min四個時間點有顯著性差異*; <0.05。圖5:芒果苷元對ob/ob小鼠ip.胰島素的血糖變化圖。
數據用ANOVA法進行統計學處理(n=5)，其中各組血糖水平與對照組相比，NL(40mg/kg)在60、 90、 120 min三個時間點有顯著性差異V<0.05。
具體實施例方式
通過以下實施例進一步詳細說明本發明，但應注意本發明的範圍並不受這些實施例的任何限制。
材料與來源
試劑芒果苷元；重組人源PTP1B (Merck);對硝基苯磷酸二鈉pNPP (Sigma);偏礬酸鈉(Sigma) ; MOPS (Sigma) ; DTT (Sigma);胰島素(江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司)；C57BL/6小鼠(軍事醫學科學院實驗動物中心)，ob/ob小鼠(JacksonLab)。
器材XFLOUR4酶標儀；恆溫培養箱；強生穩豪血糖儀
實施例l芒果苷元對PTP1B的抑制活性測定(ICs。值的測定)
芒果苷元用少量DMSO溶解後用MOPS緩衝液稀釋，取10 nl加入至100 ^反應體系中(pH7.0， 25mMmops， lmMEDTA， 2mMDTT， 0.1MNaCl)，使其終濃度分別為1500、 150、 15、 1.5、 0.15 pM，加入底物pNPP至16 mM，加入重組人PTP1B 5 ng後置於37'C反應30 min。加10 1M NaOH終止反應，置酶標儀上測定405 nm波長條件下的吸收值A,以偏礬酸鈉(NaV03)作為陽性對照，以不加PTP1B為空白對照，計算抑制率。用抑制率對濃度做圖，得到芒果苷元ICso為9.2 pM，偏礬酸鈉ICso為0.32 ^M。
實施例2芒果苷元對PTP1B的抑制動力學測定
分別配製不同濃度的pNPP (32、 16、 8、 4、 2mM)和不同濃度的NL溶液(1.25、2.5、 5、 10、 20nM)。每個NL濃度對應5組pNPP濃度做抑制活性測定，根據OD405的變化求出V，對應的底物濃度為S，根據L-B方程分別作圖。結果表明，各條直線交於Y軸，故可判斷NL為PTP1B的競爭型抑制劑。
實施例3芒果苷元在改善正常小鼠胰島素敏感性方面的作用
C57BL/6小鼠隨機分為5組，每組11隻，分別為對照組、NL不同劑量給藥組(100、60、 40、 15 mg/kg)。給藥組分別灌胃給予不同濃度的NL (用0.5%CMC-Na水溶液混懸)，對照組灌胃給予0.5n/。CMC-Na水溶液。連續給藥7天，末次給藥後禁食12h，按1 U/kg腹腔注射胰島素，分別於O、 15、 30、 60、卯、120min取血測量血糖值。
胰島素耐量實驗(Insulin Tolerance Test, ITT)實驗顯示，NL (5、 40mg/kg)可顯著改善C57BL/6小鼠胰島素敏感性，降低其血糖，在後四個時間點有顯著性差異(pO.05)。
實施例4芒果苷元在改善ob/ob小鼠胰島素敏感性方面的作用ob/ob小鼠隨機分為2組，每組5隻，分別為對照組和給藥組，給藥組灌胃給予40
mg/kgNL溶液(用0.5n/。CMC-Na水溶液混懸)，對照組灌胃給予0.5%CMC-Na水溶液。
連續灌胃7天，末次給藥後禁食12h，按l U/kg腹腔注射胰島素，分別在0、 15、 30、
60、卯、120 min取血測量血糖值。
ITT實驗顯示，40mg/kg劑量NL可顯著改善ob/ob小鼠胰島素敏感性，降低其高血
糖症狀，在後三個時間點有顯著性差異(/7<0.05)。
權利要求
1、芒果苷元作為蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制劑的應用。
2、 權利要求1所述芒果苷元作為蛋白酪氨酸磷酸酶IB的競爭型抑制劑的應用。
3、 芒果苷元在製備提高胰島素敏感性、降血糖的藥物中的應用。
4、 芒果苷元在製備治療包括糖尿病、肥胖症在內的代謝症候群、腫瘤和其他與蛋白酪氨酸磷酸酶IB相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及一種四羥基酮芒果苷元(norathyriol)，對蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制活性測定、改善胰島素抵抗作用及在治療PTP1B相關疾病藥物中的應用。通過體外酶抑實驗證明，本發明證實芒果苷元是重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B的競爭型抑制劑，IC50值為9.2μM；芒果苷元可使C57BL/6正常小鼠、ob/ob糖尿病模型小鼠對胰島素的敏感性明顯改善，降低實驗動物血糖。說明芒果苷元是PTP1B的新型抑制劑，可作為潛在的先導化合物，在製備治療胰島素抵抗相關抗糖尿病和肥胖症等代謝症候群、腫瘤和其他與PTP1B相關疾病的藥物中應用。
文檔編號A61P3/10GK101669934SQ20091018418
公開日2010年3月17日 申請日期2009年8月21日 優先權日2009年8月21日
發明者何鳳霞, 吳冬冬, 平 周, 昊 張, 豔 張, 張辰宇, 琛 徐, 佳 李, 李金波, 鄧小達 申請人:南京大學