牙鮃紅細胞外膜蛋白的製備方法
2023-12-05 18:00:01 1
專利名稱：牙鮃紅細胞外膜蛋白的製備方法
技術領域：
本發明涉及魚類紅細胞的採集處理和紅細胞外膜蛋白製備技術領域。
背景技術：
牙鮃在我國俗稱牙片、偏口，品種優良，生長快速，肉質鮮美，是我國優 良的海水魚類增養殖品種之一。目前隨著牙鮃養殖業的發展，養殖規模的擴大， 養殖牙鮃各種病害頻繁爆發，造成了巨大的經濟損失。魚類具備一個相對完善 的免疫系統，可通過特異性和非特異性免疫來防禦各種病原的侵襲。外周血細
胞是魚類非特異性免疫防禦體系中的重要防線之一"2。但是有關魚類紅細胞免疫 功能以及紅細胞免疫分子的研究尚未見明確報導，對於牙鮃紅細胞外膜蛋白的 製備技術仍屬空白。
目前針對魚類紅細胞免疫功能和紅細胞外膜蛋白的研究，存在以下幾個問
題
1. 魚類紅細胞的免疫功能沒有引起研究人員的重視
一般認為，紅細胞的主要功能是攜帶02和0)2，但是1981年Siegel提出了"紅 細胞免疫系統的新概念，促進了紅細胞免疫研究發展3。這些工作在人類以及其 他哺乳類和鳥類中開展最多，但在魚類中有關紅細胞免疫的報導很少，認識不 夠。
2. 有關魚類紅細胞免疫機理的研究基礎薄弱
對於魚類紅細胞免疫功能的作用機理尚不了解，參與免疫反應的重要分子 和作用方式也未査明，缺乏對紅細胞免疫分子的深入分析和鑑定，無從下手開 展研究。
3. 有關魚類紅細胞外膜蛋白的製備未見報導
目前有關細胞膜蛋白的研究多集中於高等脊椎動物，而有關低等的魚類細 胞膜的研究還未見報導4。 參考文獻
1.周永燦，邢玉娜，馮全英.魚類血細胞研究進展.海南大學學報(自然 科學版)，2003, 21 (2): 171-176。2. 邢婧，戰文斌，曾曉華等.牙鮃(屍ar^ic力^^s o"race^)紅細胞單克 隆抗體與五種養殖魚類血細胞的交叉反應.海洋與湖沼，2005 36(2): 123-129。
3. Siegel I， Liu T L， Gleicher N. The red—cell immune system. Lancet. 1981 12; 2 (8246):556-9。
4. 張領兵，倫豔妮，於樂洋等SDS-聚丙烯醯氨凝膠電泳與液質聯用技術分 離和鑑定小鼠巨噬細胞膜蛋白.中國生物工程雜誌，2007, 27 (4): 77_82。
發明內容
本方法的主要原理根據外周血不同類型細胞的密度不同，選用合適比重 的分離液將紅細胞從外周血細胞中分離出來獲得單組分，從而排除其他細胞 的影響。利用添加了蛋白酶抑制劑的低滲溶液溶脹紅細胞獲得細胞膜組分，再 通過溫和的膜蛋白裂解液以及冰浴渦旋攪拌的方式，將膜蛋白成分提取出來。
本發明是在經過實驗摸索優化實驗條件和流程，建立了牙鮃紅細胞外膜蛋 白的製備技術，技術方案如下
(1) 用5 mL —次性無菌注射器分別從4條體K 20 cm左右的實驗牙鮃的尾 靜脈取血，採用阿氏抗凝劑與牙鮃外周血1:1 1.5混合。收集抗凝血冰盒中暫 存。
(2) 利用比重為1.08 1.09的淋巴細胞分離液分離牙鮃外周血中的紅細胞。 將抗凝血用O. 1 M PBS緩衝液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按l: 2比例混合，於 4"C條件K3000 rpm水平離心15 min。離心後外周血細胞分為4層，小心吸走上 層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉澱用O. 1 M PBS緩衝液4'C離心 洗滌3次，去除上清液。
(3) 向紅細胞沉澱中加入20倍體積的低滲緩衝液，置於4。C條件下30 min， 使紅細胞充分溶脹破膜。4。C條件下，12000 rpm離心15 min收集牙鮃紅細胞膜 沉澱。
(4) 向紅細胞膜沉澱中加入10 15 mL低滲緩衝液，用漩渦混合器將紅細胞 膜沉澱打散，4'C條件下12000 rpm， 15 min離心，得到經洗滌的紅細胞膜沉澱。 重複上述洗滌步驟2 4次。
(5) 向牙鮃紅細胞膜沉澱中加入2 3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過 夜，以充分裂解牙鮃紅細胞膜。裂解過程於冰浴中進行。(6)裂解後所得溶液於4"下，12000 rpm離心30 min，上清液即為牙鮃紅 細胞膜蛋白提取液。分裝後於-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒 檢測牙鮃細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
本製備方法相比與現有文獻中描述的方法程序更為簡單，效率更好，既保 證了膜蛋閂製備的高效性，乂保持il莫蛋白的生物活性。
圖1.分離牙鮃紅細胞；利用1. 08-1. 09的淋巴細胞分離液分離外周血細胞 中的紅細胞，從上到下分別為分離液、淋巴細胞層、血漿層、紅細胞層。
圖2.牙鮃紅細胞外膜蛋白電泳；利用SDS-PAGE電泳分析製備的牙鮃紅細 胞外膜蛋白組分。
圖3.根據BCA蛋白濃度測定試劑盒操作手冊和實驗中繪製的標準曲線可 以計算牙鮃紅細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
具體實施例方式
具體實施中使用的專用液配方
(1) 低滲緩衝液
5 mM PBS緩衝液(pH 7. 8) ， 0. 5 mM EDTA ， 1 u g/mL抑肽酶(Aprotinin)。
(2) 膜蛋白裂解液
50 mM Tris-HC1 (pH 7.8)， 150 raM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS， 1 mM苯甲基磺醯氟(PMSF)， 1 yg/mL Aprotinin, 1% NP 40， 0. 5%去氧膽酸 鈉，5 mM PBS， 0. 5 mM EDTA， 0.85%生理鹽水。
(3) 阿氏抗凝劑液
葡萄糖 2.05 g 檸檬酸鈉 0.8 g 檸檬酸 0.055 g 氯化鈉 0.42 g加蒸餾水至100 mL，加熱溶解後將pH值調到6. 1，經8磅(115。C)， 15分鐘的高壓滅菌後分裝。 實施例l
具體操作步驟為
(1) 用5 mL —次性無菌注射器分別從4條體長20 cm左右的實驗牙鮃的尾 靜脈取血，採用阿氏抗凝劑與牙軤外周血l:l混合。收集抗凝血冰盒中暫存。
(2) 利用比重為l. 08 1. 09的淋巴細胞分離液分離牙鮃外周血中的紅細胞。 將抗凝血用O. 1 M PBS緩衝液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按l: 2比例混合，於
64。C條件下3000 rpm水平離心15 min。離心後外周血細胞分為4層，小心吸走上 層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉澱用O. 1 M PBS緩衝液4。C離心 洗滌3次，去除上清液。
(3) 向紅細胞沉澱中加入20倍體積的低滲緩衝液，置於4"C條件下30 min， 使紅細胞充分溶脹破膜。4'C條件下，12000 rpm離心15 min收集牙鮃紅細胞膜 沉澱。
(4) 向紅細胞膜沉澱中加入IO mL低滲緩衝液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉 澱打散，4'C條件下12000 rpm， 15 min離心得到經洗滌的紅細胞膜沉澱，重複 這一洗滌3次。
(5) 向牙鮃紅細胞膜沉澱中加入2倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜， 以充分裂解牙鮃紅細胞膜。裂解過程於冰浴中進行。
(6) 裂解後所得溶液於4。C下，12000 rpm離心30 min，上清即為牙鮃紅細 胞膜蛋白提取液。分裝後於-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢 測牙鮃細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
樣品(體積吸收值(A62。)吸收值(A艦)
00. 1080. 055
10. 1120. 064
20. 1170. 075
陽性對照樣品40.1280. 105
80. 1470. 123
120. 1670. 154
160. 1890. 187
200. 2160. 228
膜蛋白提取液200.2190. 225
根據BCA蛋白濃度測定試劑盒操作手冊和實驗中繪製的標準曲線，計算牙 鮃紅細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度50.23 Pg/uL。 實施例2
具體操作步驟為(1) 用5 mL —次性無菌注射器分別從4條體長20 cm左右的實驗牙鮃的尾靜脈取血，採用阿氏抗凝劑與牙鮃外周血l: 1.5混合。收集抗凝血冰盒中暫存。
(2) 利用比重為l. 08 1. 09的淋巴細胞分離液分離牙鮃外周血中的紅細胞。將抗凝血用O. 1 M PBS緩衝液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按l: 2比例混合，於4。C條件下3000 rpm水平離心15 min。離心後外周血細胞分為4層，小心吸走h層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉澱用O. 1 M PBS緩衝液4。C離心洗滌3次，去除上清液。
(3) 向紅細胞沉澱中加入20倍休積的低滲緩衝液，置於4。C條件下30 min，使紅細胞充分溶脹破膜。4。C下，12000 rpm離心15 min收集牙鮃紅細胞膜沉澱。
(4) 向紅細胞膜沉澱中加入15 mL低滲緩衝液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉澱打散，4。C條件下12000 rpm， 15 min離心得紅細胞膜沉澱，再將紅細胞膜沉澱重複上述步驟洗滌2次，得到洗淨得紅細胞膜沉澱。
(5) 向牙鮃紅細胞膜沉澱中加入3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜，以充分裂解牙鮃紅細胞膜。裂解過程於冰浴中進行。
(6) 裂解後所得溶液於4'C下，12000 rpm離心30 min，上清即為牙鮃紅細胞膜蛋白提取液。分裝後於-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測牙鮃細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度為50. 23 u g/u L。
8
權利要求
1. 牙鮃紅細胞外膜蛋白的製備方法，其特徵在於操作步驟為(1)用5mL一次性無菌注射器分別從4條體長20cm左右的實驗牙鮃的尾靜脈取血，採用阿氏抗凝劑與牙鮃外周血1:1～1.5混合，收集抗凝血冰盒中暫存；(2)將抗凝血用0. 1M PBS緩衝液1:1稀釋，與比重為1.08～1.09的淋巴細胞分離液按12比例混合，於4℃條件下3000rpm水平離心15min；離心後外周血細胞分為4層，小心吸走上層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉澱用0.1M PBS緩衝液4℃離心洗滌3次，去除上清液；(3)向紅細胞沉澱中加入20倍體積的低滲緩衝液，置於4℃條件下30min，使紅細胞充分溶脹破膜，4℃條件下，12000rpm離心15min收集牙鮃紅細胞膜沉澱；(4)向紅細胞膜沉澱中加入10～15mL低滲緩衝液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉澱打散，4℃條件下12000rpm，15min離心，得到經洗滌的紅細胞膜沉澱，重複上述洗滌步驟2～4次；(5)向牙鮃紅細胞膜沉澱中加入2～3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜，以充分裂解牙鮃紅細胞膜，裂解過程於冰浴中進行；(6)裂解後所得溶液於4℃下，12000rpm離心30min，上清即為牙鮃紅細胞膜蛋白提取液，分裝後於-80℃冰箱中保存，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測牙鮃細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
2. 根據權利要求1所述牙鮃紅細胞外膜蛋白的製備方法，其特徵在於使用的專用液配方為(1) 低滲緩衝液5 mM pH 7. 8的PBS緩衝液，0. 5 mM EDTA ， 1 u g/mL抑肽酶；(2) 膜蛋白裂解液50 mM pH 7. 8的Tris-HC1, 150 mM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS，lmM苯甲基磺醯氟，1 ug/mL Aprotinin， 1% NP 40， 0. 5%去氧膽酸鈉，5 mMPBS, 0. 5 mM EDTA， 0. 85%生理鹽水；(3) 阿氏抗凝劑液葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，檸檬酸0.055 g，氯化鈉0.42 g，加蒸餾水至100 mL，加熱溶解後將pH值調到6. 1，經8磅(115。C)， 15分鐘的高壓滅菌後分裝。
3.根據權利要求l所述牙鮃紅細胞外膜蛋白的製備方法，其特徵在於操作步驟(4)中用低滲緩衝液重複洗滌步驟3次。
全文摘要
牙鮃紅細胞外膜蛋白的製備方法。從牙鮃的尾靜脈取血，採用阿氏抗凝劑與牙鮃外周血混合；將其用PBS緩衝液稀釋並與分離液混合，於4℃條件離心，將底層的紅細胞沉澱用PBS緩衝液4℃離心洗滌以去除上清液。加入低滲緩衝液，置於4℃下使紅細胞充分溶脹破膜。4℃條件下離心收集牙鮃紅細胞膜沉澱。加入低滲緩衝液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉澱打散，4℃條件下離心洗滌紅細胞膜沉澱。加入膜蛋白裂解液，攪拌以充分裂解牙鮃紅細胞膜，4℃下離心，上清即為牙鮃紅細胞膜蛋白提取液。分裝後於-80℃冰箱中保存。本發明的方法與現有技術相比更為簡單，效率更好，既保證了膜蛋白製備的高效性，又保持了膜蛋白的生物活性。
文檔編號C07K1/00GK101463071SQ20091001009
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月13日 優先權日2009年1月13日
發明者偉 張, 張振冬, 王淑芬, 鄒亞男 申請人:張振冬