具有神經保護作用的7－羥基表雄酮的製作方法

2023-12-05 19:58:36

專利名稱：具有神經保護作用的7－羥基表雄酮的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類用於保護神經細胞免於死亡的7-羥基類固醇化合物的用途，因此它可用於治療和預防如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、非痴呆性認知損傷(Cognitive Impairment No Dementia)(CIND)、中風、腦外傷、脊髓損傷和周圍神經損傷等疾病或其後遺症。而且它也可用於增強認知功能。
在體內，脫氫表雄酮的7α-羥基化代謝產物的產生於1959年在尿中被發現，並被鑑定為7α-羥基DHEA[J J Schneider，M L Lewbart，RecentProgr.Horm.Res.15(1959)201-230；L Starka et al，Clin.Chim.Acta.7(1961)309-316]]。此後報導了來自人的許多器官，包括成人肝和胎肝、睪丸、副睪、皮膚、乳腺組織、前列腺、脂肪基質細胞和扁桃腺等組織製品中3β-羥類固醇底物(包括DHEA和表雄酮-EPIA)的廣泛7α-羥基化。在大鼠肝和大量的小鼠組織和器官中，DHEA在7位的羥基化也得到驗證。所有這些研究中，7α-羥基-DHEA是迄今為止所產生的最主要的代謝物。事實上，Doostzadeh等[Steroids 63(1998)608-614]已報導通過小鼠肝微粒體生成7α-DHEA的速度比7β-DHEA快15倍。
而且表明EPIA，DHEA和孕烯醇酮在大鼠腦中也可快速廣泛地轉化為它們相應的7α-羥基代謝物[J M Guiraud et al，Steroids 34(1979)241-248；M Warner et al，Endocrinology 124(1989)2699-2706；Y Akwaet al，Biochem.J.288(1992)959-964]]。
WO97/37664公開了包括7α-羥基取代類固醇在內的一類特定化合物在治療神經、免疫或內分泌失調方面的用途。在WO97/37664中建議可用這些化合物進行治療的疾病包括阿爾茲海默氏病。但由於該病的作用機制是假設腦中缺少7α-羥基取代的類固醇而引起的，因此WO97/37664中所建議的治療更改為用7α-羥基取代的類固醇來替代缺少的化合物。因此，WO97/37664描述的程序是治療已有的疾病，而不是預防疾病或通過阻止神經元的進一步損傷來防止疾病的惡化。所以WO97/37664並沒有描述一種神經保護作用。也沒有建議這些化合物可用於防止由意外或創傷事件如中風而引起的損傷。
目前我們很驚訝地發現7-羥基表雄酮，無論α、β或混合物，均可用於防止由中風、腦外傷、蛛網膜下出血或心臟分流手術導致的大腦缺血等事件所引起的急性和慢性神經損傷。
對於長時間組織缺氧或缺血，可能會或不會造成低血糖，但都會產生不同程度的神經損傷。
典型地，在心臟病發作時會發生缺血情況，但此時造成的損傷基本上局限在心臟組織，而且已經研發了可靠的治療方法。對於本發明，我們考慮的是腦部更長時間的缺血，如中風病人或頭損傷病人的缺血。缺血的嚴重程度取決於中風或損傷的程度，但一致的是它們都產生腦部損傷，這是本發明強調的情況。
本領域中已知的各種神經保護製劑都嘗試用來減緩腦損傷問題，但就目前而言，所有已知的製劑都有不利的副作用。例如，MK801(dizocilpinemaleate)是一種非常簡單的分子，可以對缺血病人提供一定程度的神經保護作用。但MK801也具有一定的「神經恐慌效應」(Martindale)，以及不利的運動作用。神經保護作用在《腦研究》755(1997)36-46(Pringle，A.K.，等)中有詳細介紹，其作為參考結合在此處。這些作者在早期文章中也介紹了海蝸牛毒素的神經保護作用，但儘管該化合物具有神經保護作用，在體內卻觀察到其不利的副作用。
因此本發明在於7-羥基表雄酮(7-羥基-EPIA)用於生產保護急性或慢性神經損傷的藥劑的用途。
該化合物可用分子式(I)表示 7α和7β互為異構體，分別是 本發明也包含這些化合物的前體及在體內代謝產生這些化合物的物質的用途。
α和β異構體可單獨或混合使用。如果混合使用，可以以任意比例使用。但由於7β異構體具有更高的活性，因此是優選存在的。
眾所周知，本發明中的化合物從母體類固醇開始，可通過各種方法進行製備。例如，可通過上述所列參考文獻中的方法進行製備，這樣可得到7β和相應的7α化合物的混合物，然後可通過已知的技術分離該混合物。
作為實施例，在用傳統方法保護DHEA的3β-羥基和17-酮基後，可通過烯丙基的氧化作用來得到7α和/或7β-羥基EPIA。然後產物用可溶性金屬化合物催化劑(如氫化鈉)進行還原，並對3β-羥基和17-酮基去保護。如果需要，然後可用傳統方法，如柱層析，分離7α-羥基和7β羥基差向異構體，而且可通過結晶純化7α-和7β-羥基EPIA。
作為選擇，7α-和7β-羥基-EPIA可通過以下列出的反應路線進行製備 在該反應路線中，DHEA(II)乙醯化得到相應的式(III)的乙酸酯，然後其與乙二醇反應，得到式(IV)的縮酮。然後縮酮(IV)如實施例3所述進行氧化，得到相應的7-酮基化合物(V)，然後該化合物進行脫乙醯化，得到式(VI)的化合物。該化合物還原得到式(VII)的7-羥基-17-縮酮基-EPIA，然後它用酸處理來除去縮酮基而得到7-羥基-EPIA，最後通過層析法分離成7β-和7α-異構體，得到7α-羥基-EPIA(IX)和7β-羥基-EPIA(X)。
本發明中的化合物可用於治療可能有缺血危險，特別是中風或頭損傷危險的病人，或治療可能會發展為神經退化性疾病的病人，如阿爾茲海默氏病或CIND，可能由慢性閾下腦缺血或減少神經元能量產生而促使發病，這種情況常在老化的大腦中觀察到。在這種情況下，預防藥是很有用的。而且應注意到，即使在缺血情況發生後，使用本發明中的化合物也是有用的，但推薦儘早用藥，以儘可能避免神經元的惡化。在有些情況下，特別是在病人仍處於缺血危險中時，可以使用重複的劑量。
為了儘早得到期望的效果，用藥的合適方式一般是注射。因此，靜脈注射是特別優選的，但在有些情況下，優選的用藥方式是直接將化合物注射到腦脊髓液中。
本發明中化合物的劑量可根據很多因素進行改變，包括年齡、體重和病人病況、及用藥方式、頻率和途徑。但一般推薦的劑量是從0.01到50mg/kg體重，更優選的是從0.05到20mg/kg體重的劑量。可以一次的劑量或分開的劑量進行用藥。
本發明通過下面無限制的實施例進一步描述，其中實施例1到20描述的是本發明中化合物的製備，實施例21和22描述的是它們的活性。在實施例1到20中，羅馬數字代表上述反應路線中的分子式。
如前所述進行實驗性缺氧操作(Pringle等，1996；1997)。簡要來說，將培養物轉移到含有5μg/ml螢光排斥染料碘化丙錠(PI)的無血清培養基(SFM-75％MEM，補加1mM穀氨醯胺和4.5mg/ml葡萄糖的25％HBSS)中。成象前培養物在SFM中平衡60分鐘。然後用裝有一套若丹明濾光片的Leica倒置顯微鏡檢測PI螢光。該步驟中任何可檢測到PI螢光的培養物在以後的實驗中捨棄。將培養物轉移到已用95％N2/5％CO2飽和的SFM(+PI)中來誘導缺氧。然後將培養皿(無蓋)封口成密閉室，其中的空氣已在密閉前通過以10L/min的速度連續鼓氣10分鐘用95％N2/5％CO2飽和了。然後在培養箱中放170分鐘(因此缺氧總時間為180分鐘)。在缺氧階段的最後時刻，將培養物放回到含PI的含氧量正常的SFM中，再將其放回培養箱中維持24小時。
按前述方法(Pringle等.，1996；1997)用Apple IIsi計算機運行NIHImage 1.60或Macintosh G4/400計算機運行OpenLab 2.1(Improvision)對神經元損傷進行評估。圖像用單色相機拍攝，並保存在光碟中以備脫機分析。在加入藥品之前拍攝光透射圖像，而在24小時缺氧後的恢復期結束時拍攝PI螢光圖像。CA1細胞層的範圍可從透射圖像中確定。而CA1中的PI螢光區域可用NIH Image或Openlab中的密度分割功能進行計算。神經元損傷以PI螢光高於背景的CA1的百分比來表示。
類固醇化合物是通過製造最初的溶在乙醇中的1mg/ml溶液並進一步在SFM中稀釋製得的。在缺氧之前、缺氧之中及缺氧之後的恢復期將化合物加入到培養物中45分鐘。對照實驗由只用載質處理的培養物構成。結果實驗1進行最初的實驗是用來確定7αOH-EPIA和7βOH-EPIA在100nM的高濃度下是否具有神經保護作用。缺氧在25.5±6.4％的CA1中產生損傷。如下面的表1所示，在缺氧之前、之中及之後，7αOH-EPIA和7βOH-EPIA均可顯著降低這種損傷。
表1
實驗2已確定70H-EPIA的α和β異構體均具有神經保護作用，我們推測這種作用具有濃度依賴性。對照組缺氧對31.9±4.7％的CA1造成神經損傷。7αOH-EPIA在100nM具有顯著的保護作用。在10nM可觀察到輕微的神經損傷，但並不是統計意義上顯著降低量，並且在1nM沒有作用。相反，7βOH-EPIA在10nM和100nM均具有顯著的神經保護作用，但在濃度降低到1nM時活性喪失(見表2)。
表2
實施例8大鼠全腦缺血實驗(4血管閉塞法)通過4血管閉塞法(4VO)在雄性Wistar大鼠(250-280g)中誘導腦缺血。兩個椎動脈在戊巴比妥麻醉(60mg/kg腹腔注射)下通過電烙術進行閉塞。然後允許動物在自由進水但無食物的情況下恢復24小時。第二天頸動脈在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露在2％氟烷中，並用微脈管鉗閉塞10分鐘。隨後，鬆開二隻鉗子，並檢查二個動脈以進行立刻的再灌注。在手術時和隨後的3小時中，通過用連有溫度計的恆溫控制的電熱毯來維持其正常體溫(37.5±0.5℃)。對於對照組，假手術動物的兩個椎動脈在戊巴比妥麻醉下被電烙，兩個普通的頸動脈在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露於氟烷但第二天不被夾緊。傷口用利多卡因膠處理，然後進行縫合。動物在環境溫度30℃的情況下保持在加熱燈下直至恢復意識。
共研究了7組動物1.(n＝8)類固醇化合物，7β-OH EPIA(0.1mg/kg，通過尾靜脈注射，共注射3次分別在誘導缺血前15分鐘、缺血中及再灌注後5分鐘)；2.(n＝8)類固醇，7β-OH EPIA(0.3mg/kg，如1所述靜脈注射3次)；3.(n＝8)類固醇，7β-OH EPIA(1mg/kg，如1所述靜脈注射3次)；4.(n＝8)NBQX(二鈉鹽，因為有更多的可溶水)作為參照物和陽性對照(TOCRIS，德國，30mg/kg，如1所述腹膜注射3次)；5.(n＝8)標準載質(0.9％NaCl，含100μl乙醇)，如1所述靜脈注射3次)；6.(n＝8)單獨缺血；7.(n＝8)假手術對照組。
NBQX是2，3-二羥基-6-硝基-7-氨磺醯基-苯並(F)喹喔啉，並已知具有神經保護作用[Gill，R.，Nordholm，L.，Lodge D.TheneuroprotectiVe action of 2，3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline(NBQX)in a rat focal ischaemia model.BrainRes.580，35-43，1992]。
7β-OH EPIA是本發明的化合物7β-羥基表雄酮。
將上述物質溶解在100μl乙醇中，最後用0.9％NaCl稀釋。
缺血後經過7天的生存期，所有動物用4％多聚甲醛穿心灌注固定。然後小心地除去腦並在相同的固定液中後固定2小時。腦在30％蔗糖中超低溫保護後，放到異戊烷中快速冷凍並保存在-80℃。將含有海馬結構的20微米低溫恆溫器部件用甲苯胺藍或Neuro Trace螢光進行Nissl染色。數據分析Nissl染色後，通過存活神經元的數量可評價缺血後海馬CA1區域神經損傷的嚴重程度。計算每組CA1區域中每400μm長度上形態學完整的神經元的平均數。用裝有20倍物鏡的光學顯微鏡對每隻動物的3-5個連續切片進行細胞計數，並對每個切片的400μm CA1區域進行6次計數。通過成對的Student’s t-測試對數據進行統計分析。數據以平均值±SEM來表示。結果和討論結果如附

圖1至3所示。
形態學完整的海馬CA1神經元在Nissl染色(甲苯胺藍或NeuroTrace，如圖2)後根據以下標準來體現清晰的神經元核周體形狀，帶有陽性標記的核仁的大核，在具有Nissl染色的核周圍的小細胞質區，表明具有完整的含核糖體的粗糙內質網，因此具有完整的蛋白合成系統。
全腦缺血10分鐘(輕度缺血)及7天的生存期導致海馬CA1區域錐體細胞的選擇性神經變性(圖1A-1C)。在假手術動物的CA1中，錐體細胞平均數目為121.5±4.3(設為100％)。因此，在全腦缺血10分鐘後，60％CA1神經元死亡(圖1B)。缺血並如實驗所述用載質(NaCl+100μl乙醇)進行靜脈注射的動物組神經元數目與單獨缺血動物組進行比較(圖1A，1B)。NBQX(30mg/kg，如實驗所述靜脈注射三次)與缺血組比較，CA1錐體細胞中表現出顯著的(p＝0.03)神經保護作用。與單獨缺血組比較，NBQX表現出47.5％的神經保護作用，而與假手術組動物相比較，保護作用為68.5％。NBQX引起的神經保護作用與Gill等，1992和Gill 1994的結果是一致的，表明我們實驗中所用的全腦缺血模式是有效的。7β-OH EPIA在全腦缺血10分鐘和7天生存期後，對海馬CA1錐體細胞具有濃度依賴性的神經保護作用(圖1A)。T-測試分析表明，7β-OH EPIA在濃度為0.1mg/kg(p＝0.01)和0.3mg/kg(p＝0.0008)時具有非常顯著的神經保護作用。與假手術組相比較，7β-OH EPIA對CA1錐體細胞分別表現出74.8％(0.1mg/kg)和83.9％(0.3mg/kg)的神經保護作用(圖1C)。但7β-OH EPIA在濃度為1.0mg/kg時僅表現出神經保護的趨勢，但作用不顯著。
在缺血之前、之中和之後用7β-OH EPIA進行靜脈注射的所有實驗中，我們從未觀察到動物的任何行為異常。
權利要求
1.生產用於保護急性或慢性神經損傷的藥劑的7-羥基表雄酮的用途。
2.權利要求1的用途，其中的7-羥基表雄酮是7α-羥基表雄酮。
3.權利要求1的用途，其中的7-羥基表雄酮是7β-羥基表雄酮。
4.權利要求1的用途，其中的7-羥基表雄酮是7α-羥基表雄酮和7β-羥基表雄酮的混合物。
5.前述任何一個權利要求的用途，其中的神經損傷是由中風或腦外傷引起的。
6.前述任何一個權利要求的用途，其中的神經損傷是由阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、非痴呆性認知損傷、脊髓損傷或周圍神經損傷引起的。
全文摘要
7－羥基表雄酮可用於保護急性或慢性神經損傷。
文檔編號A61K31/5685GK1440290SQ01812109
公開日2003年9月3日 申請日期2001年6月29日 優先權日2000年6月29日
發明者阿什利·克爾·普林格爾, 拉爾斯·埃裡克·森德斯特羅姆, 恩斯特·武爾費特 申請人:亨特-弗萊明有限公司