一種富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白的製備方法
2023-12-05 16:02:21 2
專利名稱：一種富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白的製備方法
技術領域：
一種富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白的製備方法，屬於農產品加工和生化分離領域。
背景技術：
隨著人們對生物活性肽生理功能認識的不斷深入，通過酶水解獲得生理活性肽已成為目前食品學家、保健食品生產廠家和製藥公司倍加關注的話題。大豆是全世界應用最廣泛的植物蛋白質資源，具有較高的蛋白質含量和胺基酸消化率。大豆多肽是大豆蛋白經蛋白酶作用後，再經過特殊處理而得到的蛋白質水解物，其胺基酸組成幾乎與大豆蛋白質完全一樣，更容易被人體吸收，具有比大豆蛋白質、胺基酸更高的營養價值。大豆蛋白水解物是多種肽分子的混合物，以及少量游離胺基酸、糖類和無機鹽。這些肽通常由3～6個胺基酸組成，平均肽鏈長度為3.2～3.5，分子量分布以低於1000Da的為主，主要出現在300～700Da範圍內。大豆肽具有多種生理功能，包括易消化、易吸收、降膽固醇、降血壓、促進脂肪代謝和抗肥胖、增強運動員肌肉和恢復疲勞、促進礦物質吸收、抗氧化、促進雙歧桿菌和乳酸菌增殖等。
具有增強免疫功能的活性肽稱作免疫活性肽，目前研究較多的主要是乳源性活性肽。酪蛋白酶解產物的水解度對其免疫調節活性有重要影響，水解度與免疫活性間並非直線相關，只有水解度適宜的酶解產物才具有較高免疫活性。不同水解度的酶解產物不僅免疫調節活性高低不同，甚至是完全不同的免疫抑制或免疫促進作用。同一種酶解產物對小鼠脾淋巴細胞增殖呈現一定的濃度效應，每種產物都有其最適作用濃度。不同水解度酪蛋白酶解產物的免疫調節活性不同與其肽段組成特性密切相關。應用現代分離技術可以從牛乳酪蛋白和人乳酪蛋白的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶水解產物中得到一種三肽和一種六肽，它們都具有在極低劑量下激活巨噬細胞吞噬功能的作用。牛酪蛋白經胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶水解產生的酪蛋白C末端序列可以誘發大鼠淋巴細胞大量增生。此外，肌肉蛋白，特別是其中的肌球蛋白、原肌球蛋白和膠原蛋白，含有具有免疫促進能力的活性肽片斷，可以通過蛋白酶K的酶解來釋放這些活性肽。獲得具有免疫調節功能生物活性肽是大豆生物活性組分開發的重要組成部分。研究表明，大豆肽與其母蛋白相比能顯著增強大鼠肺泡巨噬細胞吞噬綿羊紅細胞的功能，且大豆肽的作用優於酪蛋白肽。楊小軍等人發現，大豆蛋白酶解物能顯著促進大鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力、刺激外周血淋巴細胞轉化、提高腸腔sIgA水平，而且大豆蛋白酶解物的作用優於麵筋蛋白酶解物。潘翠玲等也發現，大豆蛋白酶解物和酪蛋白酶解物均能不同程度地刺激經PHA誘導的10日齡仔豬外周血淋巴細胞的轉化，且大豆蛋白酶解物的促淋巴細胞轉化作用最強。Masuda等研究發現，與酪蛋白相比大豆肽能顯著增強肌肉損傷Wistar大鼠的免疫功能。肽的生物學活性與酶解產物的肽段組成、肽段長短、胺基酸序列，尤其是末端胺基酸種類、以及胺基酸組成等物理化學特性息息相關。免疫活性肽發揮其功能的生理機制目前還不很清楚，有待於進一步深入研究，但一般情況下，帶正電荷的肽具有較強的免疫調節活性。
Mercier等人利用等電聚焦技術，從乳清蛋白的胰蛋白酶解物中分離出帶正電荷的肽組分，通過體外細胞培養實驗證明，該組分對小鼠脾淋巴細胞的增殖功能明顯提高。Yoshikawa和Takahashi應用高效液相色譜技術從大豆蛋白的胰蛋白酶酶解物中得到一個肽鏈順序為His-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg的六肽，這種肽能刺激巨噬細胞和多核白細胞的吞噬作用，具有免疫調節功能。進一步酶解六肽，又獲得了具有同樣免疫調節作用的、一級結構為Gln-Arg-Pro-Arg的四肽。這兩種肽在中性溶液中都帶正電荷。
Pouliot等人研究了用膜分離方法富集乳清蛋白酶解物中的肽。他們發現，當溶液的pH在鹼性範圍時，帶正電荷的肽將有選擇性地優先通過膜，而帶負電荷的肽則被膜選擇性地截留。Bargrman等人應用電膜分離方法富集酪蛋白水解物中帶正電荷的生物活性肽。當跨膜電壓為20伏，膜切割分子量為25000Da時，肽的透過速率可達2.5克/m2.h。
上述方法都著重於對大豆蛋白的酶水解產物進行分離，雖然它們都能達到富集帶正電荷組分的目的，但受到設備處理量的限制，產量較小，無法滿足大批量生產的需要。而在酶水解之前對原料進行物理方法或化學方法處理，得到富集帶正電荷組分的水解大豆蛋白產品，其效率要比上述方法大得多。目前還未見有關這方面方法的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種通過大豆蛋白原料預處理而製備富集帶正電荷組分的水解大豆蛋白的方法。
本發明的技術方案上述目的可以通過以全脂大豆粉、脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白或大豆分離蛋白為原料，大豆蛋白原料進行水分調節後，採用物理方法或化學方法預處理，使其中的可溶性蛋白質變性後成為不溶性蛋白質，然後通過離心或過濾，將這部分不溶性蛋白質與可溶性蛋白質分離開而得到。在本發明工藝過程中，帶正電荷的胺基酸殘基富集在不溶性蛋白質中，而帶負電荷的胺基酸殘基富集在可溶性蛋白質中。蛋白質變性可以採用物理方式，物理方法處理包括加熱、微波、高壓或冷凍處理；最常用的是在一定水分條件下進行加熱處理，水分含量20％-90％，加熱溫度85-120℃，加熱時間10-60分鐘。也可以採用化學方式，化學方法處理包括酸、鹼或含水有機溶劑處理；最常用的是在一定溫度下用碳原子數為1-4的醇溶液進行處理，醇溶液質量濃度為60％-90％，處理溫度20-80℃，固液比1∶2-1∶20，處理時間15-120分鐘。用後一種方法進行蛋白質變性時，通常需要結合過濾和烘乾操作，將醇溶液去除。
變性處理後的物料以一定的固液比懸浮於液體介質中，調節溫度和pH值，攪拌，實現可溶性蛋白質組分的提取。可溶性蛋白質提取所用液體介質為水、鹽溶液或含水有機溶劑，固液比為1∶5-1∶20，pH值為6-9，提取溫度為20℃-70℃，提取時間為15-120分鐘；所述鹽溶液中鹽的濃度不大於0.5％；所述含水有機溶劑中的有機溶劑是碳原子數為1-4的低級醇或低級酮，其中有機溶劑質量濃度為10％-90％。提取結束時進行過濾、離心或沉降方式將液體介質連同可溶性蛋白質組分分離除去，得到固相的不溶性大豆蛋白和液相的可溶性大豆蛋白。
不溶性大豆蛋白在酶水解前通常需要用膠體磨或類似的高速剪切裝置處理。從膠體磨或剪切裝置出來的物料顆粒度大大降低。為了利於蛋白質水解，上述磨碎的不溶性大豆蛋白一般需要加適量水進行加熱處理，加熱溫度為85-120℃，加熱時間為5-60分鐘。
酶水解一般在帶有攪拌裝置的、可控制溫度的容器中進行。酶水解裝置同時還需要配備pH測定裝置以及定量加鹼液裝置。酶水解時不溶性大豆蛋白的濃度一般為2％-15％，控制溫度在30-70℃，調節體系的pH在中性或鹼性範圍後，根據需要加入一定量的中性蛋白酶或鹼性蛋白酶開始酶水解。在水解過程中需要不斷向反應體系加入鹼溶液以維持pH恆定。控制水解度DH為15％-20％。
蛋白質的水解度與加入鹼溶液的濃度和體積成正比，水解度可以按照下面的公式計算DH%=BNb11Mp1htot100%]]>式中B-消耗鹼液體積(ml)；Nb-鹼液濃度(mol/L)；α-α胺基酸的解離度，Mp-底物中蛋白質的含量(g/kg)htot-單位質量蛋白中肽鍵總數(mmol/g)，大豆蛋白htot＝7.75mmol/g。
當達到要求的水解度後向反應體系中加入鹽酸使pH達到4.5終止酶水解。離心、上清液通過微孔膜過濾得到濾液即為富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白溶液。
帶正電荷組分的含量可以採用離子交換層析法測定取上述水解大豆蛋白溶液1ml上陽離子型離子交換層析柱(SP Sephadex C25)，開始用pH4.0，0.01mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液充分洗脫，此時被洗脫的為帶負電荷組分；將洗脫液換為含0.25mol/L NaCl的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液繼續洗脫後再將洗脫液換為含0.5mol/LNaCl的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液，被洗脫的為帶正電荷組分。計算洗脫液為0.01mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液、含0.25mol/L NaCl的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液、以及含0.5mol/L NaCl的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液時洗脫曲線下的峰面積，分別計為A，B和C，帶正電荷組分的比例＝(B+C)/(A+B+C)。
本發明的有益效果本發明提出通過對大豆蛋白原料在酶水解之前進行物理方法或化學方法處理，再進行常規的酶水解反應，得到富集帶正電荷組分的水解大豆蛋白產品，其效率要比不進行預處理直接酶水解所得產品大得多。產品帶正電荷組分的含量比對照例提高40％-60％以上。本發明對處理設備要求不高，能滿足大批量生產的需要。
具體實施例方式
實施例1本實施例為對照例。取市售大豆分離蛋白，本例中為吉林不二蛋白公司生產的金龜1100型大豆分離蛋白，在其中加入適量水，將固形物含量調節到6％，加少量酸或鹼使pH達到7，在滅菌鍋中於105℃條件下加熱15分鐘，冷卻後加入鹼性蛋白酶在50℃下水解，用pH-stat法控制水解度DH＝20％。加酸調節體系pH4.5終止酶水解。離心分離，上清液微孔膜過濾。取1ml清液上陽離子型離子層析柱洗脫，根據峰面積測得產品中帶正電荷組分比例為28.60％。
在說明書中前述的工藝條件範圍內變動各種參數，均能實現產品帶正電荷組分的含量比對照例高得多的效果。為了便於與對照例比較，僅列以下兩例，但決不局限於該兩例。
實施例2取低變性脫脂大豆粉，粉碎後加適量水，將其水分含量調節到30％，放入蒸鍋中在100℃溫度下加熱20分鐘，冷卻至室溫，加入大豆粉15倍的去離子水，室溫下攪拌60分鐘後進行離心分離。離心所得沉澱物中加入適量水，將固形物含量調節到6％，加少量鹼使pH達到7，在滅菌鍋中於105℃條件下加熱15分鐘，冷卻後加入鹼性蛋白酶在50℃下水解，用pH-stat法控制水解度DH＝20％。加酸調節體系pH4.5終止酶水解。離心分離，上清液微孔膜過濾。取1ml清液上陽離子型離子層析柱洗脫，根據峰面積測得產品中帶正電荷組分比例為40.32％。產品帶正電荷組分的含量比對照例提高40％以上。
實施例3取全脂大豆粉，加入質量濃度為65％的乙醇水溶液，固液比為1∶5，攪拌均勻後放入溫度為50℃的水浴中加熱60分鐘，冷卻至室溫後離心分離去除上清液，沉澱物在室溫下放置24小時後再在80℃烘箱中去除殘餘酒精。經過醇處理的物料粉碎，隨後加入15倍的去離子水，室溫下攪拌60分鐘後進行離心分離。離心所得沉澱物中加入適量水，將固形物含量調節到6％，加少量鹼使pH達到7，在滅菌鍋中於105℃條件下加熱15分鐘，冷卻後加入中性蛋白酶在50℃下水解，用pH-stat法控制水解度DH＝20％。加酸調節體系pH4.5終止酶水解。離心分離，上清液微孔膜過濾。取1ml清液上陽離子型離子層析柱洗脫，根據峰面積測得產品中帶正電荷組分比例為46.21％。產品帶正電荷組分的含量比對照例提高60％以上。
權利要求
1.一種富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白的製備方法，其特徵是所述方法包括以下步驟1)以全脂大豆粉、脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白或大豆分離蛋白為原料；2)將原料進行水分調節後，採用物理方法或化學方法使原料中的可溶性蛋白質轉變成為不溶性蛋白質，物理方法處理在一定水分條件下進行加熱處理，水分含量20％-90％，加熱溫度85-120℃，加熱時間10-60分鐘；化學方法處理在一定溫度下用碳原子數為1-4的醇溶液進行處理，醇溶液質量濃度為60％-90％，固液比1∶2-1∶20，處理溫度20-80℃，處理時間15-120分鐘；3)將步驟2)處理後的物料以一定的固液比懸浮於液體介質中，調節溫度和pH，攪拌，進行可溶性蛋白質組分的提取；通過離心、過濾或沉降方式將液體介質連同可溶性蛋白質組分分離除去；4)加熱處理將得到的不溶性大豆蛋白加適量水進行加熱處理，加熱溫度為85-120℃，加熱時間為5-60分鐘；5)酶水解不溶性大豆蛋白的濃度為2％-15％，控制溫度在30-70℃，調節體系的pH在中性或鹼性範圍後，根據需要加入一定量的中性蛋白酶或鹼性蛋白酶進行水解，在水解過程中需要不斷向反應體系加入鹼溶液以維持pH恆定，控制水解度DH為15％-25％；6)酶解結束加酸終止反應，離心分離，上清液通過微孔膜過濾得到富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白溶液。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是所述物理方法處理包括加熱、微波、高壓或冷凍處理；所述化學方法處理包括酸、鹼或含水有機溶劑處理。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是所述的可溶性蛋白質提取所用液體介質為水、鹽溶液或含水有機溶劑，固液比為1∶5-1∶20，pH值為6-9，提取溫度為20℃-70℃，提取時間為15-120分鐘；所述鹽溶液中鹽的濃度不大於0.5％；所述含水有機溶劑中的有機溶劑是碳原子數為1-4的低級醇或低級酮，其中有機溶劑質量濃度為10％-90％。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是所用酶為中性蛋白酶或鹼性蛋白酶。
全文摘要
一種富含帶正電荷組分的水解大豆蛋白的製備方法，屬於農產品加工和生化分離領域。本發明提出通過對大豆蛋白原料在酶水解之前進行物理方法或化學方法處理，再進行常規的酶水解反應，得到富集帶正電荷組分的水解大豆蛋白產品。其效率要比不進行預處理直接酶水解所得產品大得多，產品帶正電荷組分的含量比對照例提高40％－60％以上。本發明對處理設備要求不高，能滿足大批量生產的需要。
文檔編號A23J3/30GK1726799SQ200510041280
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月28日 優先權日2005年7月28日
發明者華欲飛, 國明明, 黃文凱 申請人:江南大學