Melan－a肽類似物－病毒樣顆粒偶聯物的製作方法

2023-12-05 06:20:51 4

專利名稱：Melan－a肽類似物－病毒樣顆粒偶聯物的製作方法
相關申請的交叉引用本申請要求2003年3月26日申請的美國臨時申請No.60/457,348的優先權，其全部內容在此引用作為參考。
背景技術：
發明領域本發明涉及疫苗學、免疫學和醫學領域。本發明提供用於增強針對MelanA肽類似物的免疫應答的組合物和方法，該MelanA肽類似物通過結合，優選通過將免疫刺激物，特別是免疫刺激性核酸，更具體而言是含有至少一種非甲基化CpG序列的寡核苷酸，包裝到病毒樣顆粒(VLP)內，而與病毒樣顆粒(VLP)偶聯、融合或以其他方式附著。本發明能用來誘發強烈、持續的T細胞應答，尤其可用於腫瘤的治療。
相關技術免疫系統的本質建立在兩個不同的基礎支柱上一個是特異性或獲得性免疫，其特徵在於相對較慢的應答動力學和記憶能力；另一個是非特異性或先天免疫，其顯示快速的應答動力學，但缺乏記憶。
已經明確，單獨施用純化蛋白質通常不足以引起強烈的免疫應答；分離的抗原通常必須與被稱為佐劑的輔助物質一起施用。施用的抗原在這些佐劑內受到保護而免遭快速降解，佐劑導致長時間釋放低水平抗原。
與分離的蛋白質不同，在不用任何佐劑、有及沒有T細胞輔助的情況下，病毒能誘導快速、有效的免疫應答(Bachmann Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。許多病毒展示一種準晶體表面，其表面顯示規則的表位陣列，可有效地將表位特異性免疫球蛋白交聯在B細胞上(Bachmann Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。病毒結構甚至與自身免疫病中抗-抗體的產生有關，是對病原體的自然應答的一部分(參見Fehr，T.，et al.，J.Exp.Med.1851785-1792(1997))。因此，病毒顆粒上以有序且重複陣列組織起來的抗原具有高度的免疫原性，因為它們能夠直接激活B細胞，並誘導細胞毒性T細胞應答的產生，後者是免疫系統的另一個重要武器。
作為抗原的病毒顆粒與其分離的成分相比表現出兩個優點(1)由於具有高度重複的表面結構，它們能夠直接激活B細胞，產生高抗體滴度和長期的B細胞記憶；(2)病毒顆粒，而不是可溶性蛋白質，具有誘發細胞毒性T細胞應答的能力，即使這些病毒是非感染性的且不使用佐劑。
另外，例如在細菌和大多數非脊椎動物中存在的富含非甲基化CG基序(CpG)的DNA，在體外及體內對B細胞、樹突細胞和其它APC都顯示強刺激活性。儘管細菌DNA在許多脊椎動物種之間是免疫刺激性的，但是各自的CpG基序可能不同。實際上，刺激小鼠免疫細胞的CpG基序可能不一定刺激人免疫細胞，反之亦然。另外，免疫刺激性CpG-寡脫氧核苷酸也誘發嚴重的副作用，在小鼠中引起髓外血細胞形成伴脾大和淋巴結病(Sparwasser et al.，J.Immunol.(1999)，1622368-74和實施例18)。
最近疫苗接種策略已經取得顯著進展，但是現有策略仍然需要改進。特別是，本領域仍然需要研製新的改進的疫苗，該疫苗在不普遍激活APC和其它細胞的情況下，與天然病原體一樣有效地引起強CTL免疫應答和抗病原體保護。
黑素瘤是黑色素細胞或黑色素細胞相關痣細胞引起的攻擊性且通常轉移性的腫瘤。黑素瘤佔全部皮膚癌的約3％，對於婦女，世界上黑素瘤的增長超過除肺癌以外的其它所有腫瘤。甚至在黑素瘤明顯位於皮膚上時，仍有高達30％的患者發展為全身轉移，並且大多數將死亡。在過去十年中，已經發展了免疫治療和基因治療作為治療黑素瘤的新的、有前途的方法，例如，在使用或不使用佐劑的情況下用MelanA/MART-1肽治療黑素瘤患者。這些策略通常獲得有限的成功。而且，大多數研究不是用MHCI類多聚體直接測定離體CTL應答，而是使用CTL培養物，並刺激它們幾周時間，之後才能夠最終測定MelanA特異性CTL應答。通常，肽本身不是免疫原性的，具有極短的半衰期。
另外一種免疫治療方法是向樹突細胞中加載MelanA/MART-1肽，或者用MelanA/MART-1-RNA轉染樹突細胞，並且重新注射給患者。這種方法的缺點是要從每一個體患者中純化自體樹突細胞並將其與細胞因子在體外孵育數天。這是非常精細的，因為為了具有免疫原性而不是可使T細胞不再對腫瘤應答的耐受原性，樹突細胞必須保持正確的成熟狀態。
Dudley，M.E.(Science.2002 Oct 25；298(5594)850-4)的另外一種方法是從患者的自體腫瘤物質中分離MelanA-特異性T細胞，體外培養和擴增，並且重新注射給供體。如上述方法一樣，需要為每名個體患者分別製備特異性的疫苗，因此不是最有效的治療方法。
因此，對於癌症，特別是黑素瘤的免疫治療新策略的發展而言，有效黑素瘤疫苗的表徵至關重要。
發明概述本發明基於以下的發現特定人MelanA肽類似物當結合到具有內在重複組織結構的核心顆粒時，特別是分別結合到包裝有免疫刺激物(ISS)如DNA寡核苷酸的病毒樣顆粒(VLP)和VLP亞單位時，是誘導特異性抗體的強免疫原。本發明進一步基於以下的發現免疫刺激物如DNA寡核苷酸能夠包裝到VLP內，使其免疫原性增強。出乎意料的是，VLP內的核酸和寡核苷酸分別能夠用免疫刺激物和含有CpG基序的DNA-寡核苷酸來特異替換。令人吃驚的是，這些包裝的免疫刺激物，特別是免疫刺激性核酸，如含非甲基化CpG的寡核苷酸，保留了其免疫刺激能力，但是不會廣泛激活先天免疫系統。含有根據本發明的VLP和免疫刺激物，特別是CpG-VLP的組合物，免疫原性顯著強於不含CpG的對應物，並且誘發更強的B細胞和T細胞應答。另外，針對VLP和MelanA肽類似物的T細胞應答尤其集中於Th1型。因此，附著於載有CpG的VLP上的人MelanA肽類似物可能是用於對抗腫瘤的預防性或治療性接種的理想疫苗。
在第一個實施方案中，本發明提供一般且優選地用於增強動物中的免疫應答的組合物，該組合物包含病毒樣顆粒，免疫刺激物，優選免疫刺激性核酸，更優選含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一種抗原或抗原決定簇，其中所述免疫刺激物、核酸或寡核苷酸與病毒樣顆粒偶聯、融合或以其他方式附著，或被病毒樣顆粒包封，即與之結合，並且其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。
在本發明的一個優選實施方案中，免疫刺激性核酸，特別是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通過磷酸骨架的硫代磷酸修飾而穩定化。在另一個優選實施方案中，免疫刺激性核酸，特別是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通過消化VLP內的RNA同時添加含有所選CpG的DNA寡核苷酸，而被包裝到VLP內。在一個同樣優選的實施方案中，可將VLP解裝配，之後在CpG存在下重裝配。
在一個進一步優選的實施方案中，免疫刺激性核酸不含CpG基序，但是顯示免疫刺激活性。這些核酸在WO 01/22972中有描述。其中所述的所有序列都在此引用作為參考。
在一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。同樣優選地，病毒樣顆粒不含脂蛋白包膜。優選地，重組病毒樣顆粒包含或者由下列成分組成B型肝炎病毒、BK病毒或其它人多瘤病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾瓦克病毒或人乳頭瘤病毒、RNA-噬菌體、Qβ-噬菌體、GA-噬菌體、fr-噬菌體和Ty的重組蛋白。在一個具體實施方案中，病毒樣顆粒包含或者由一種或多種不同的B型肝炎病毒核心(衣殼)蛋白(HBcAg)組成。在一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含RNA-噬菌體的重組蛋白或其片段。優選的RNA-噬菌體是Qβ-噬菌體、AP 205-噬菌體、GA-噬菌體、fr-噬菌體。
在一個具體實施方案中，抗原包含或者由細胞毒性T細胞表位組成。在一個相關實施方案中，病毒樣顆粒包含B型肝炎病毒核心蛋白，細胞毒性T細胞表位與該B型肝炎病毒核心蛋白的C端融合。在一個實施方案中，它們通過亮氨酸連接序列融合。在一個特別優選的實施方案中，所述抗原是適於誘發針對癌細胞的免疫應答的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種增強人或其它動物種中的免疫應答的方法，包括向該動物體內導入一種組合物，該組合物包含病毒樣顆粒，免疫刺激物，優選免疫刺激性核酸，更優選含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一種抗原或抗原決定簇，其中該免疫刺激物，優選核酸，更優選寡核苷酸，與該病毒樣顆粒結合(即偶聯、附著或包封)，並且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，並且其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物與所述病毒樣顆粒結合。
在本發明的另一個實施方案中，所述組合物通過皮下、肌肉內、鼻內、皮內、靜脈內或直接導入淋巴結內而導入動物體內。在一個同樣優選的實施方案中，在希望對其接種的腫瘤或局部病毒灶附近局部施用這種免疫增強組合物。
在本發明的一個優選方面，所述免疫應答是T細胞應答，並且針對抗原的T細胞應答增強。在一個具體實施方案中，該T細胞應答是細胞毒性T細胞應答，並且針對MelanA肽的細胞毒性T細胞應答增強。
本發明也涉及一種疫苗，其包含免疫有效量的本發明的免疫增強組合物，以及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。在一個優選實施方案中，該疫苗進一步包含至少一種佐劑。本發明還提供一種免疫和/或治療動物的方法，包括對動物施以免疫有效量的本發明公開的疫苗。
在本發明的一個優選實施方案中，含有免疫刺激物的VLP，優選含有免疫刺激性核酸的VLP，更優選含有非甲基化CpG的寡核苷酸VLP，用於接種動物，一般且優選地接種人，以分別對抗黑素瘤或MelanA肽。這種修飾過的VLP一般且優選地可以用來針對腫瘤接種。這種接種可以是用於預防或治療目的，或者同時用於這兩種目的。
注射途徑優選的是皮下或肌肉內途徑，但是也可以通過真皮內、鼻內、靜脈內或直接導入淋巴結內來給予含CpG的VLP。在一個同樣優選的實施方案中，在希望對其接種的腫瘤或局部病毒灶附近局部施用與含CpG的MelanA肽類似物偶聯的或游離的VLP。
應當理解，以上的概述和下面的詳述只是代表性和說明性的，旨在進一步說明要求保護的本發明。
附圖簡述

圖1顯示Qb-MelanA VLP的SDS-PAGE分析。如實施例20所述，MelanA-肽與Qb VLP偶聯。終產物與樣品緩衝液混合，在還原條件下在16％ NovexTris-甘氨酸凝膠上分離，125V，1.5小時。通過將凝膠浸泡在考馬斯藍溶液中染色分離的蛋白質。用50％甲醇，8％乙酸洗滌凝膠除去背景染色。分子量標準(P 77085，New England BioLabs，Beverly，USA)用作Qb-MelanA遷移速度的參照(泳道1)。加樣14μg單獨的Qb(泳道2)或SMPH衍化的Qb(泳道3)，用來與下列8μg各種終產物比較Qb-MelanA 16-35(泳道4)、Qb-MelanA 16-35A/L(泳道5)、Qb-MelanA 26-35(泳道6)和Qb-MelanA 26-35A/L(泳道7)。
圖2A顯示ISS處理的人PBMC的上清液中釋放的IFNα。PBMC從血沉棕黃層獲得，並且與5倍稀釋的所示ISS一起孵育18小時。術語G10用於指寡核苷酸G10-PO，術語G3用於指寡核苷酸G3-6。收集上清液，使用PBL Biomedical Laboratories提供的一組抗體，通過ELISA測定IFNα。
圖2B顯示用ISS處理的人CD8+PBMC上CD69的上調。PBMC從血沉棕黃層獲得，並且與5倍稀釋的所示ISS一起孵育18小時。洗滌細胞，與抗CD8-FITC、抗CD19-PE和抗CD69-APC(均獲自BDPharMingen)在冰上孵育20分鐘。洗滌後，使用CellQuest軟體在FACSCalibur上分析細胞。
圖3顯示用包裝有poly(IC)、G3-6或G6的Qbx33免疫小鼠後的病毒滴度。C57B16小鼠通過注射以下成分免疫100μg Qbx33，100μg包裝有poly(IC)並與p33偶聯的Qb VLP(Qb-pIC-33，也被稱為QbxZnxpolyICxp33GGC)，90μg包裝有G3-6的Qbx33(Qbx33/G3-6)，或90μg包裝有G6的Qbx33(Qbx33/G6)。8天後，用1.5×106噬斑形成單位的攜帶LCMV-p33表位的痘苗病毒攻擊小鼠。5天後，殺死小鼠，取出卵巢。由卵巢製備單細胞懸液，以連續稀釋加至BCS40細胞中。1天後，細胞層用含有50％乙醇、2％甲醛、0.8％NaCl和0.5％結晶紫的溶液染色，並計數病毒噬斑。
發明詳述除非另外定義，此處使用的所有科技術語與本發明所屬領域技術人員通常理解的含義相同。儘管在本發明的實施與試驗中可以使用與此處所述相似或相當的任何材料與方法，但是下文描述了優選的材料與方法。
1.定義胺基酸接頭本說明書中的「胺基酸接頭」，也被稱為「接頭」，用來連接抗原或抗原決定簇和第二附著位點，或者更優選地，該接頭已經包含或含有第二附著位點，該附著位點一般(但不是一定)是一個胺基酸殘基，優選半胱氨酸殘基。然而，如此處所用的術語「胺基酸接頭」並非意味著這種胺基酸接頭只由胺基酸殘基組成，儘管由胺基酸殘基組成的胺基酸接頭是本發明的一個優選實施方案。胺基酸接頭的胺基酸殘基優選地由本領域公知的天然存在的胺基酸或非天然胺基酸、所有L-或所有D-胺基酸或其混合物組成。然而，本發明也包括含有帶巰基或半胱氨酸殘基的分子的胺基酸接頭。該分子優選地含有C1-C6烷基、環烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分。然而，除了胺基酸接頭外，本發明範圍內也包括優選含有C1-C6烷基、環烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分且不含任何胺基酸的接頭。抗原或抗原決定簇或任選地第二附著位點與胺基酸接頭的連接優選地是通過至少一個共價鍵，更優選地是通過至少一個肽鍵。
動物如此處所用的術語「動物」包括，例如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠、小鼠、哺乳動物、鳥類、爬行動物、魚、昆蟲和蜘蛛類動物。
抗體如此處所用的術語「抗體」是指能夠結合表位或抗原決定簇的分子。該術語包括整個抗體及其抗原結合性片段，包括單鏈抗體。最優選地，這些抗體是人抗原結合性抗體片段，包括但不限於Fab、Fab』和F(ab』)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。這些抗體可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優選地，這些抗體是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的抗體。如此處所用的「人」抗體包括含有人免疫球蛋白的胺基酸序列的抗體，包括分離自人免疫球蛋白文庫的抗體，或者來自不表達內源性免疫球蛋白而表達一種或多種人免疫球蛋白的轉基因動物的抗體，如Kucherlapati等人申請的美國專利No.5,939,598所述。
抗原如此處所用的術語「抗原」是指如果被MHC分子呈遞時能夠被抗體或T細胞受體(TCR)結合的分子。如此處所用的術語「抗原」也包括T細胞表位。抗原還能夠被免疫系統識別，以及/或者能夠誘導體液免疫應答和/或細胞免疫應答，導致B和/或T淋巴細胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有或連接於T輔助細胞表位(Th細胞表位)，並且包含於佐劑中。一個抗原可能包含一個或多個表位(B和T表位)。上述特異性反應是指抗原優選地通常以高選擇性方式與其相應的抗體或TCR反應，而不與可能由其它抗原誘導的許多其它抗體或TCR反應。如此處所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混合物。
如此處所用的「腫瘤抗原」是指與腫瘤或癌症相關並且能夠引發免疫應答的化合物，如肽。特別是，該化合物在MHC分子中呈遞時能夠引發免疫應答。腫瘤抗原能夠由癌細胞通過如下方法製備製備癌細胞的粗提物，如Cohen et al.，Cancer Research，541055(1994)所述；部分純化抗原；利用重組技術或從頭合成已知抗原。腫瘤抗原包括是整個腫瘤或癌症多肽或是其抗原性部分的抗原。這些抗原可以分離或者重組製備或通過本領域公知的其它任何方法製備。癌症或腫瘤包括但不限於膽管癌；腦癌；乳腺癌；宮頸癌；絨毛膜癌；結腸癌；子宮內膜癌；食道癌；胃癌；上皮內癌；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小細胞和非小細胞癌)；黑素瘤；神經母細胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤；皮膚癌；睪丸癌；甲狀腺癌；腎癌，以及其它癌和肉瘤。
抗原決定簇如此處所用的術語「抗原決定簇」是指可被B或T淋巴細胞特異性識別的抗原的部分。B淋巴細胞通過產生抗體響應外源抗原決定簇，而T淋巴細胞是細胞免疫的介質。因此，抗原決定簇或表位是可被抗體識別或者(在MHC中)可被T細胞受體識別的抗原的那些部分。
抗原呈遞細胞如此處所用的術語「抗原呈遞細胞」是指具有免疫刺激能力的一群不均一的白細胞或骨髓來源的細胞。例如，這些細胞能夠產生可與MHC分子結合而能夠被T細胞識別的肽。該術語與術語「佐細胞」同義，包括如朗罕氏細胞、交錯突細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突細胞。在某些條件下，上皮細胞、內皮細胞和其它非骨髓來源的細胞也可以作為抗原呈遞細胞。
連接(association)如此處所用的術語「連接」當用於第一和第二附著位點時，是指第一附著位點與第二附著位點優選地通過至少一個非肽鍵的結合。連接的性質可以是共價、離子、疏水、極性的或其任意組合，優選地，連接的性質是共價的，更優選地，連接是通過至少一個，優選一個非肽鍵。如此處所用的術語「連接」當用於第一和第二附著位點時，不僅包括第一附著位點和第二附著位點直接結合或連接形成本發明的組合物，另外且優選地，還包括第一附著位點和第二附著位點間接連接或結合產生本發明的組合物，一般且優選地使用異雙功能交聯劑進行這種間接連接或結合。
第一附著位點如此處所用的短語「第一附著位點」是指通常且優選地包含於病毒樣顆粒內的非天然或天然來源的一種組件，通常且優選地包含於本發明的MelanA肽類似物內的第二附著位點可與之連接。第一附著位點可以是蛋白質、多肽、胺基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、螢光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺醯氟)或其組合，或其化學反應基。第一附著位點通常且優選地位於病毒樣顆粒的表面上。病毒樣顆粒表面上存在多個第一附著位點，一般呈重複構型。優選地，第一附著位點是胺基酸或其化學反應基。
第二附著位點如此處所用的短語「第二附著位點」是指與本發明的MelanA肽類似物連接，通常且優選地包含於後者之內的組件，位於病毒樣顆粒表面上的第一附著位點可與之連接。本發明的MelanA肽類似物的第二附著位點可以是蛋白質、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、螢光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺醯氟)或其組合，或其化學反應基。本發明的MelanA肽類似物上存在至少一個第二附著位點。因此，術語「具有至少一個第二附著位點的MelanA肽類似物」是指至少含有本發明的MelanA肽類似物和該第二附著位點的抗原或抗原性構建體。然而，特別是對於非天然來源的第二附著位點，(即本發明的MelanA肽類似物內非天然存在)的第二附著位點，這些抗原或抗原性構建體含有「胺基酸接頭」。
結合(bound)如此處所用的術語「結合」是指這樣的結合它可以是共價的，例如通過化學偶聯，或者是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。共價鍵可能是，例如酯、醚、磷酯、醯胺、肽、亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等。術語「結合」比諸如「偶聯」、「融合」、「連接」和「附著」的術語更廣義，並且包括後面這些。而且，對於與病毒樣顆粒結合的免疫刺激物，術語「結合」也包括免疫刺激物的包封或部分包封。因此，對於與病毒樣顆粒結合的免疫刺激物，術語「結合」比諸如「偶聯」、「融合」、「包封」、「包裝」和「附著」的術語更廣義，並且包括後面這些。例如，免疫刺激物，如含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以被VLP包封，而不存在實際上的結合，不管是共價的還是非共價的。
外殼蛋白如此處所用的術語「外殼蛋白」是指能夠摻入噬菌體或RNA-噬菌體的衣殼裝配體內的噬菌體或RNA-噬菌體的蛋白質。然而，當指RNA-噬菌體的外殼蛋白基因的具體基因產物時，使用術語「CP」。例如，RNA-噬菌體Qβ的外殼蛋白基因的具體基因產物被稱為「Qβ CP」，而噬菌體Qβ的「外殼蛋白」包含「Qβ CP」以及A1蛋白。噬菌體Qβ的衣殼主要由Qβ CP組成，含有少量A1蛋白。同樣，VLP Qβ外殼蛋白主要含有Qβ CP，以及少量A1蛋白。
偶聯如此處所用的術語「偶聯」是指通過共價鍵或通過非共價相互作用而附著。對於抗原與病毒樣顆粒的偶聯，術語「偶聯」優選地指通過共價鍵附著。此外，對於抗原與病毒樣顆粒的偶聯，術語「偶聯」優選地指通過至少一個非肽鍵分別連接和附著。本領域技術人員常用的偶聯生物活性物質的任何方法都可用於本發明。
融合如此處所用的術語「融合」是指不同來源的胺基酸序列通過其編碼核苷酸序列的框內組合而組合在一條多肽鏈中。除了與末端之一融合外，術語「融合」顯然還包括內部融合，即不同來源的序列插入一條多肽鏈內。
CpG如此處所用的術語「CpG」是指含有至少一個非甲基化胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸(例如「CpG DNA」或含有胞嘧啶及隨後的鳥嘌呤、並通過磷酸酯鍵連接的DNA)，它能刺激/激活脊椎動物細胞，例如對該細胞具有促細胞分裂作用，或誘導或提高該細胞的細胞因子表達。例如，CpG可用於激活B細胞、NK細胞和抗原呈遞細胞，如單核細胞、樹突細胞和巨噬細胞，以及T細胞。CpG也可包括核苷酸類似物，如含有磷酸硫酯鍵的類似物，並且可以是雙鏈或單鏈的。通常雙鏈分子在體內更穩定，而單鏈分子免疫活性更高。
表位如此處所用的術語「表位」是指在動物、優選哺乳動物、最優選在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽的部分。如此處所用的「免疫原性表位」被定義為通過本領域公知的任何方法測定，能夠在動物中引發抗體應答或誘發T細胞應答的多肽的一部分(參見，例如Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。如此處所用的術語「抗原性表位」被定義為蛋白質的一部分，通過本領域公知的任何方法測定，抗體能夠將它的抗原與該部分免疫特異性結合。免疫特異性結合不包括非特異性結合，但是不一定排除與其它抗原的交叉反應性。抗原性表位不需要必須是免疫原性的。抗原性表位也可以是T細胞表位，在這種情況下它們能被MHC分子內的T細胞受體免疫特異性地結合。
一個表位可以以該表位特有的空間構象包含3個胺基酸。一個表位通常由至少約5個這樣的胺基酸組成，更常見地由至少約8-10個這樣的胺基酸組成。如果表位是一種有機分子，它可以象硝基苯基一樣小。優選的表位是本發明的MelanA-肽類似物。
免疫應答如此處所用的術語「免疫應答」是指導致B和/或T淋巴細胞激活或增殖的體液免疫應答和/或細胞免疫應答。然而，在某些情況下，免疫應答可能是低強度的，只有在使用至少一種本發明的物質時才能檢測到。「免疫原性的」是指一種試劑，它用來刺激活生物的免疫系統，使得免疫系統的一種或多種功能增強，並且針對該免疫原性試劑。「免疫原性多肽」是這樣一種多肽，無論它是單獨的還是與載體相連接，使用還是不使用佐劑，它都能引發細胞和/或體液免疫應答。
免疫如此處所用的術語「免疫」或相關術語是指提供產生針對靶抗原或表位的實質性免疫應答(包括抗體和/或細胞免疫，如效應CTL)的能力。這些術語不要求產生完全免疫，而是產生實質性高於基線的免疫應答。例如，如果在使用本發明的方法後哺乳動物產生針對靶抗原的細胞和/或體液免疫應答，則可認為該動物針對該靶抗原進行了免疫。
免疫刺激性核酸如此處所用的術語免疫刺激性核酸是指能夠誘發和/或增強免疫應答的核酸。如此處所用的免疫刺激性核酸包括核糖核酸，特別是脫氧核糖核酸。優選地，免疫刺激性核酸包含至少一個CpG基序，如CG二核苷酸，其中C未甲基化。CG二核苷酸可以是迴文序列的一部分，或者可以包含於一種非迴文序列內。如上所述的不含CpG基序的免疫刺激性核酸包括，例如，缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有帶有甲基化CG二核苷酸的CG基序的核酸。如此處所用的術語「免疫刺激性核酸」也指含有修飾鹼基如4-溴-胞嘧啶的核酸。
免疫刺激物如此處所用的術語「免疫刺激物」是指能夠誘發和/或增強免疫應答的物質。如此處所用的免疫刺激物包括但不限於toll樣受體激活物和誘導細胞因子分泌的物質。Toll樣受體激活物包括但不限於免疫刺激性核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑並喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激性有機物，如紫杉醇。
如此處所用的術語「天然人Melan A肽」或「正常人Melan A肽」是指包含、或者基本由、或者由下列胺基酸序列組成的肽代表正常人MelanA蛋白質序列胺基酸位點26-35的胺基酸序列EAAGIGILTV(SEQ ID NO78)，或代表正常人MelanA蛋白質序列胺基酸位點27-35的AAGIGILTV(SEQ ID NO79)。
如此處所用的術語「MelanA肽類似物」或「人MelanA肽類似物」或「人黑素瘤MelanA肽類似物」被定義為相應正常MelanA肽的胺基酸序列改變了至少一個胺基酸或胺基酸衍生物的肽，其中這種改變可包括胺基酸置換和/或缺失和/或插入或其組合。在本發明的一個優選實施方案中，如此處所用的術語「MelanA肽類似物」被定義為相應正常MelanA肽的胺基酸序列(SEQ ID NO91)改變了三個、優選兩個、更優選一個胺基酸或胺基酸衍生物的肽，其中這種改變可包括胺基酸置換和/或缺失和/或插入或其組合。在本發明的一個進一步優選的實施方案中，如此處所用的術語「MelanA肽類似物」被定義為相應正常MelanA肽的胺基酸序列改變三個、優選兩個、更優選一個胺基酸或胺基酸衍生物的肽，其中這種改變可包括胺基酸置換和/或缺失和/或插入或其組合，並且其中這種改變位於正常人MelanA蛋白質序列(SEQ ID NO91)的位點26、27、28和/或35處，並且其中這種改變優選地是胺基酸置換。術語「MelanA肽類似物」、「人MelanA肽類似物」、「人黑素瘤MelanA肽類似物」和「人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物」可以互換使用。
天然來源如此處所用的術語「天然來源」是指其全部或部分不是合成的，而是天然存在或產生的。
非天然的如此處所用時，該術語通常是指並非來自天然，更具體而言，該術語是指來自人工。
非天然來源如此處所用的術語「非天然來源」通常是指合成的或者並非來自天然；更具體而言，該術語是指來自人工。
有序且重複的抗原或抗原決定簇陣列如此處所用的術語「有序且重複的抗原或抗原決定簇陣列」通常是指抗原或抗原決定簇的重複模式，其特徵在於抗原或抗原決定簇分別相對於核心顆粒和病毒樣顆粒一般且優選地均勻空間排列。在本發明的一個實施方案中，這種重複模式可以是一種幾何模式。合適的有序且重複的抗原或抗原決定簇陣列的典型和優選實例具有嚴格重複的抗原或抗原決定簇類結晶排列，優選間隔0.5-30納米，更優選3-15納米，更優選3-8納米。
寡核苷酸如此處所用的術語「寡核苷酸」或「寡聚體」是指一種核酸序列，其包含2個或更多的核苷酸，通常至少約6個核苷酸到約100,000個核苷酸，優選約6個到約2000個核苷酸，更優選約6個到約300個核苷酸，更優選約20個到約300個核苷酸，更優選地約20個到約100個核苷酸。術語「寡核苷酸」或「寡聚體」也指包含超過100個到約2000個核苷酸、優選超過100個到約1000個核苷酸、更優選超過100個到約500個核苷酸的核酸序列。「寡核苷酸」通常也指任何一種聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，它可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。「寡核苷酸」包括但不限於單鏈和雙鏈DNA，是單鏈區和雙鏈區的混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，是單鏈區和雙鏈區的混合物的RNA，包含DNA和RNA的雜合分子，其中的DNA和RNA可以是單鏈的，或者更一般而言是雙鏈的，或是單鏈區和雙鏈區的混合物。另外，「寡核苷酸」還指包含RNA或DNA或既含RNA又含DNA的三鏈區。此外，寡核苷酸也可以是合成的、基因組的或重組的，例如λ-DNA、粘粒DNA、人工細菌染色體、酵母人工染色體和絲狀噬菌體，如M13。在本發明的一個非常優選的實施方案中，寡核苷酸是合成寡核苷酸。
術語「寡核苷酸」也包括含有一個或多個修飾鹼基的DNA或RNA，和為了穩定性或其它原因而含有修飾骨架的DNA或RNA。例如，合適的核苷酸修飾/類似物包括肽核酸、肌苷、三苯甲基鹼基、硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、5-硝基吲哚脫氧呋喃核糖基、5-甲基脫氧胞嘧啶和5，6-二氫-5，6-二羥基脫氧胸苷。已經對DNA和RNA進行了多種修飾；因此，「寡核苷酸」包括在自然界中常見的多核苷酸的化學、酶或代謝修飾形式，以及病毒和細胞特有的DNA和RNA的化學形式。其它核苷酸類似物/修飾對於本領域技術人員是顯而易見的。
包裝如此處所用的術語「包裝」是指免疫刺激物，優選免疫刺激性核酸，與VLP有關的狀態。如此處所用的術語「包裝」包括結合，其可以是共價的，例如化學偶聯，或者是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。共價鍵可以是，例如酯、醚、磷酯、醯胺、肽、醯亞胺、碳-硫鍵如硫醚鍵、碳-磷鍵等。該術語也包括物質的包封或部分包封。術語「包裝」包括如「偶聯」、「包封」和「附著」等術語。例如，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苷酸可以被VLP包封，而不需存在實際上的結合，不管是共價的還是非共價的。具體而言，在優選實施方案中，如果免疫刺激性核酸是免疫刺激物，則術語「包裝」是指處於包裝狀態的免疫刺激性核酸不能被DNase或RNase水解。在優選實施方案中，免疫刺激性核酸包裝於VLP衣殼內，最優選地以非共價方式包裝。
本發明的組合物可選地可以與藥學可接受的載體組合。如此處所用的術語「藥學可接受的載體」是指適於對人或其它動物施用的一種或多種相容的固體或液體填料、稀釋劑或封裝物。術語「載體」是指天然或合成的有機或無機成分，活性成分與之結合而利於應用。
肽如此處所用的術語「肽」，特別是對於人黑素瘤MelanA肽或正常人Melan A肽來說，是指由單體(胺基酸)通過醯胺鍵(也被稱為肽鍵)通常且優選地線性連接組成的分子。它是指胺基酸分子鏈，而不是指特定長度的產物。
有機分子如此處所用的術語「有機分子」是指天然或合成來源的任何化學實體。具體而言，如此處所用的術語「有機分子」包括例如選自下列的任何一種分子天然或合成來源的核苷酸、脂類、碳水化合物、多糖、脂多糖、類固醇、生物鹼、萜和脂肪酸。術語「有機分子」具體包括諸如菸鹼、古柯鹼、海洛因的分子或濫用藥品中所含的其它藥理學活性分子。有機分子通常含有或經修飾後含有使它能夠與根據本發明的病毒樣顆粒偶聯、結合或以其它方法附著的化學官能團。
多肽如此處所用的術語「多肽」是指由單體(胺基酸)通過醯胺鍵(也被稱為肽鍵)線性連接組成的分子，是指胺基酸分子鏈，而不是指特定長度的產物。因此，多肽的定義內包括肽、寡肽和蛋白質。該術語也指多肽的表達後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化等。重組或衍生的多肽不一定由指定的核酸序列翻譯而來。也可以用任何方法產生，包括化學合成。
「增強」免疫應答的物質是指這樣一種物質與不添加該物質時測得的同一免疫應答相比，添加該物質時觀察到更高或增強或偏離的免疫應答。
優選地，「增強」免疫應答的物質在此是指(i)與不添加該物質時測得的MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的頻率相比，MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的頻率提高的物質，或(ii)與不添加該物質時測得的MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的功能性相比，MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的功能性偏離，優選提高的物質，或(iii)與不添加該物質時測得的MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的增殖、凋亡或對腫瘤組織的尋靶(homing)相比，MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的表型偏離，例如產生的T細胞能夠提高增殖、減少凋亡或更有效地對腫瘤組織尋靶的物質。
MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的頻率通過MHC I類/肽複合物如四聚體或多聚體染色來測定，優選如Speiser，DE.et al.Eur J Immunol.2002，Vol.32，731-741所述的四聚體染色，而MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的功能性通過細胞因子釋放來測定，如細胞內染色、細胞因子捕獲測定、Elispot、ELISA，優選如Speiser，DE.et al.Eur J Immunol.2002，Vol.32，731-741所述的Elispot。而且，MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的功能性也可以通過在如Valmori，D.et al.J.Immunol.1998，161，6956-6962所述的鉻或銪釋放試驗中測定MelanA-特異的，優選地天然人MelanA肽特異的或人黑素瘤MelanA肽類似物特異的溶細胞性CD8+T細胞應答來測定。MelanA-特異性，優選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細胞的表型利用針對諸如細胞激活標記、細胞分化標記、尋靶標記、趨化因子和細胞因子受體、共刺激受體、死亡受體、殺傷激活或抑制受體、整聯蛋白等細胞表面或細胞內蛋白質的抗體、抗凋亡蛋白的表達和衰老標記的缺乏來測定，優選利用如Speiser，DE.et al.Eur J Immunol.2002，Vol.32，731-741所述的細胞激活標記。
有效量如此處所用的術語「有效量」是指達到希望的生物學效應所必需的量或足以達到希望的生物學效應的量。組合物的有效量是能夠達到這種選擇的結果的量，此含量可由本領域技術人員常規確定。例如，治療免疫系統缺陷的有效量是引起免疫系統激活、從而在接觸抗原後產生抗原特異性免疫應答所必需的量。該術語也與「足量」同義。
用於任何特定用途的有效量可能根據如下因素而變化所治療的疾病或狀況、施用的具體組合物、患者個頭和/或疾病或狀況的嚴重程度。本領域技術人員能夠根據經驗確定本發明的具體組合物的有效量，而不需要過多的實驗。
自身抗原如此處所用的術語「自身抗原」是指由宿主基因組或DNA編碼的蛋白質，宿主基因組或DNA編碼的蛋白質或RNA產生的產物被定義為自身的。優選地，如此處所用的術語「自身抗原」是指人基因組或DNA編碼的蛋白質，人基因組或DNA編碼的蛋白質或RNA產生的產物被定義為自身的。本發明的含有自身抗原的組合物、藥物組合物和疫苗當對宿主施用時尤其能夠打破對自身抗原的耐受。在上下文中，「打破對自身抗原的耐受」是指當對宿主施用本發明的含有自身抗原的組合物、藥物組合物和疫苗時，如此處所定義的增強對自身抗原特異的免疫應答，優選地增強B或T細胞應答。另外，由兩種或幾種自身分子組合產生的或者代表自身分子一部分的蛋白質，以及含有高度同源性(＞95％，優選＞97％，更優選＞99％)的上述兩種自身分子的蛋白質，也可以被認為是自身的。
治療(treatment)如此處所用的術語「治療」是指預防和/或治療。例如，當用於傳染病時，該術語是指提高受試者對病原體感染的抗性，或者換句話說，降低受試者感染病原體或表現感染所致病症的可能性的預防性處理，以及患者感染後的抗感染治療，例如減輕或消除感染或阻止其惡化。
疫苗如此處所用的術語「疫苗」是指含有本發明的組合物，並且是能夠對動物施用的形式的製劑。一般而言，疫苗包含常用的鹽水或緩衝水溶液介質，本發明的組合物懸浮或溶解於其中。以這種形式，本發明的組合物能夠方便地用來預防、改善或治療疾病。在導入宿主後，疫苗能夠引起免疫應答，包括但不限於抗體、細胞因子的產生和/或細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細胞、樹突細胞的激活和/或其它細胞應答。
可選地，本發明的疫苗還包含佐劑，與本發明的化合物相比，佐劑可能佔一小部分或大部分。如此處所用的術語「佐劑」是指免疫應答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產生一種儲存站(depot)的物質，與本發明的疫苗組合時能夠產生更強的免疫應答。有多種佐劑可以使用。實例包括弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁和修飾的胞壁醯二肽。如此處所用的術語「佐劑」也指通常特異性的免疫應答刺激劑，當與本發明的疫苗組合時能夠產生更強且通常特異性的免疫應答。實例包括但不限於GM-CSF、IL-2、IL-12、IFNα。本領域技術人員知道更多的例子。
病毒樣顆粒如此處所用時的術語「病毒樣顆粒」是指類似於病毒顆粒但是未證明其具有致病性的結構。一般而言，根據本發明的病毒樣顆粒不攜帶編碼病毒樣顆粒蛋白質的遺傳信息。病毒樣顆粒通常缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。病毒樣顆粒通常也能通過異源表達大量生產，且易於純化。某些病毒樣顆粒可能含有與其基因組不同的核酸。如上所述，根據本發明的病毒樣顆粒是非複製性和非感染性的，因為它缺乏病毒基因組的全部或一部分，特別是病毒基因組的複製性和傳染性部分。根據本發明的病毒樣顆粒可能含有與其基因組不同的核酸。根據本發明的病毒樣顆粒的一個典型且優選的實施方案是病毒衣殼，如相應病毒、噬菌體或RNA-噬菌體的病毒衣殼。術語「病毒衣殼」或「衣殼」在此可以互換使用，是指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配體。一般且優選地，病毒蛋白質亞單位分別裝配為病毒衣殼和衣殼，它具有固有重複組織的結構，其中這種結構一般是球形或管狀。例如，RNA-噬菌體或HBcAg的衣殼是二十面體對稱的球形。如此處所用的術語「衣殼樣結構」是指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配體，它類似於如上所述的衣殼形態，但是不同於典型的對稱裝配體，而保持足夠程度的秩序和重複性。
噬菌體的病毒樣顆粒如此處所用的術語「噬菌體的病毒樣顆粒」是指類似於噬菌體結構的病毒樣顆粒，它是非複製性和非感染性的，至少缺乏編碼噬菌體複製機制的基因，一般也缺乏編碼負責病毒附著於或進入宿主的蛋白質的基因。然而，該定義也應當包括其中上述基因仍然存在但是無活性的噬菌體病毒樣顆粒，於是也產生非複製性和非感染性的噬菌體病毒樣顆粒。
RNA噬菌體外殼蛋白的VLP由RNA噬菌體外殼蛋白的180個亞單位自裝配而成、可選地含有宿主RNA的衣殼結構，被稱為「RNA噬菌體外殼蛋白的VLP」。一個具體例子是Qβ外殼蛋白的VLP。在此具體情況中，Qβ外殼蛋白的VLP可能僅僅由Qβ CP亞單位(SEQ IDNo 10)裝配而成，該Qβ CP亞單位通過表達含有如TAA終止密碼子的Qβ CP基因產生，該終止密碼子通過抑制阻止較長A1蛋白的表達，參見Kozlovska，T.M.et al.，Intervirology 399-15(1996))，或者在衣殼裝配體中還含有A1蛋白亞單位(SEQ IDNo 11)。通讀過程效率低，導致在VLP中只有極少量的A1蛋白。曾經用包裝的ISS和偶聯的抗原的不同組合進行了大量實施例。當使用僅由Qβ CP亞單位裝配成的Qβ外殼蛋白的VLP或在衣殼中還含有A1蛋白亞單位的Qβ外殼蛋白的VLP時，未觀察到偶聯效率和包裝的差異。而且，也未觀察到這些Qβ VLP製劑之間有免疫應答的差異。因此，為了清楚起見，在實施例描述中，術語「Qβ VLP」用於僅由Qβ CP亞單位裝配成的Qβ外殼蛋白的VLP或在衣殼中還含有A1蛋白亞單位的Qβ外殼蛋白的VLP。
如此處所用的術語「病毒顆粒」是指病毒的形態學形狀。某些病毒類型含有被蛋白質衣殼圍繞的基因組；其它一些具有附加結構(例如包膜、尾等)。
無包膜病毒顆粒由圍繞並保護病毒基因組的蛋白質衣殼組成。包膜病毒也具有圍繞病毒遺傳物質的衣殼結構，另外還有圍繞該衣殼的脂雙層包膜。在本發明的一個優選實施方案中，VLP沒有脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一個進一步優選的實施方案中，VLP完全不含包膜。
一種術語「一種」在本公開內容中使用時，除非另外說明，是指「至少一種」或「一種或一種以上」。
本領域技術人員應當清楚，本發明的某些實施方案涉及重組核酸技術的應用，如克隆、聚合酶鏈反應、DNA和RNA的純化、重組蛋白在原核和真核細胞中的表達等。這些方法是本領域技術人員公知的，在出版的實驗室方法手冊中常見(例如，Sambrook，J.et al.，eds.，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2nd.edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.et al.，eds.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John H.Wiley Sons，Inc.(1997))。應用組織培養細胞系進行的基本實驗室技術(Celis，J.，ed.，CELL BIOLOGY，AcademicPress，2nd edition，(1998))和基於抗體的技術(Harlow，E.and Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to ProteinPurification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，″Protein Purification Principles and Practice，″3rd ed.，Springer-Verlag，New York(1994))在文獻中也有大量描述，這些文獻均在此引用作為參考。
2.增強免疫應答的組合物和方法本發明提供增強動物對一種或多種抗原的免疫應答的組合物和方法。本發明的組合物包含、或者基本由、或者由下列成分組成病毒樣顆粒，至少一種免疫刺激物，優選免疫刺激性核酸，更優選含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一種抗原或抗原決定簇，其中該免疫刺激物、免疫刺激性核酸或寡核苷酸與該病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。而且，本發明能夠使技術人員方便地構建這種組合物，以用於多種治療和/或預防目的，包括例如癌症的預防和/或治療。
本申請書中的病毒樣顆粒是指類似於病毒顆粒但是沒有致病性的結構。病毒樣顆粒通常缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。另外，病毒樣顆粒也能夠通過異源表達大量產生，並且易於純化。
在一個優選實施方案中，所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。本領域技術人員能夠利用重組DNA技術和可公開獲得的病毒編碼序列製備VLP。例如，為了使用可購得的杆狀病毒載體在杆狀病毒表達載體中表達，可以將病毒包膜或核心蛋白的編碼序列構建在病毒啟動子的調節控制下，並對序列進行適當修飾，以使編碼序列與調節序列功能連接。例如，也可以為了在細菌表達載體中表達而構建病毒包膜或核心蛋白的編碼序列。
VLP的例子包括但不限於B型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、諾瓦克病毒的衣殼蛋白，逆轉錄病毒GAG蛋白，逆轉錄轉座子Ty蛋白p1，B型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、人多瘤病毒、BK病毒(BKV)、RNA噬菌體、Ty、fr-噬菌體、GA-噬菌體、AP 205-噬菌體、特別是Qβ-噬菌體的表面蛋白。
本領域技術人員應當理解，本發明的VLP不限於任何一種具體形式。該顆粒能夠化學合成或通過生物學方法製備，可以是天然的或非天然的。例如，這種實施方案包括病毒樣顆粒或其重組形式。
在一個更特別的實施方案中，VLP可以包含或者由下列成分組成輪狀病毒的重組多肽；諾瓦克病毒的重組多肽；甲病毒的重組多肽；可形成細菌菌毛或菌毛樣結構的重組蛋白；口蹄疫病毒的重組多肽；麻疹病毒的重組多肽；辛德畢斯病毒的重組多肽；逆轉錄病毒的重組多肽；B型肝炎病毒的重組多肽(例如HBcAg)；菸草花葉病毒的重組多肽；禽獸棚病毒的重組多肽；人乳頭瘤病毒的重組多肽；多瘤病毒的重組多肽，特別是人多瘤病毒的重組多肽，特別是BK病毒的重組多肽；噬菌體的重組多肽，RNA噬菌體的重組多肽；Ty的重組多肽；fr-噬菌體的重組多肽，GA-噬菌體的重組多肽，AP 205-噬菌體的重組多肽，特別是Qβ-噬菌體的重組多肽。該病毒樣顆粒還可以包含或者由這些多肽的一個或多個片段以及這些多肽的變體組成。多肽的變體與其野生型對應物在胺基酸水平上可以例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同。
在一個優選實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由、或者由RNA-噬菌體的重組蛋白或其片段組成。優選地，RNA-噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；1)噬菌體PP7；和m)噬菌體AP205。
在本發明的另一個優選實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA-噬菌體Qβ或RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，重組蛋白包含、或基本由、或由RNA噬菌體的外殼蛋白組成。
因此，形成衣殼或VLP的RNA-噬菌體外殼蛋白，或者適於自裝配為衣殼或VLP的噬菌體外殼蛋白的片段，是本發明的進一步優選的實施方案。例如，噬菌體Qβ外殼蛋白能夠在大腸桿菌中重組表達。而且，這些蛋白質在表達後自發構成衣殼。另外，這些衣殼也能形成具有固有重複組織的結構。
能夠用來製備本發明的組合物的噬菌體外殼蛋白的具體優選實例包括如下RNA噬菌體的外殼蛋白噬菌體Qβ(SEQ ID NO10；PIR資料庫，登錄號VCBPQβ，指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登錄號AAA16663，指Qβ A1蛋白)，噬菌體R17(PIR登錄號VCBPR7)，噬菌體fr(SEQ ID NO13；PIR登錄號VCBPFR)，噬菌體GA(SEQ ID NO14；GenBank登錄號NP-040754)，噬菌體SP(GenBank登錄號CAA30374，指SP CP，和登錄號NP 695026，指SP A1蛋白)，噬菌體MS2(PIR登錄號VCBPM2)，噬菌體M11(GenBank登錄號AAC06250)，噬菌體MX1(GenBank登錄號AAC14699)，噬菌體NL95(GenBank登錄號AAC14704)，噬菌體f2(GenBank登錄號P03611)，噬菌體PP7(SEQ ID NO19)和噬菌體AP205(SEQ ID NO31)。此外，噬菌體Qβ的A1蛋白或從C端丟失多達100、150或180個胺基酸的C端截短形式也可以摻入到Qβ外殼蛋白的衣殼裝配體中。為了確保衣殼形成，衣殼裝配體中Qβ A1蛋白相對於Qβ CP的百分比通常受到限制。噬菌體外殼蛋白的其它一些具體實例在WO02/056905的第45和46頁有描述，該專利在此引用作為參考。RNA噬菌體，特別是本發明的Qβ的進一步優選的病毒樣顆粒在WO 02/056905中公開，該專利在此全文引用作為參考。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、基本由、或由RNA噬菌體的突變外殼蛋白、優選上述RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成。在另一個優選實施方案中，RNA噬菌體的突變外殼蛋白已通過置換除去至少一個賴氨酸殘基、或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾；此外，RNA噬菌體的突變外殼蛋白也可以通過刪除至少一個賴氨酸殘基、或通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而修飾。至少一個賴氨酸殘基的缺失、置換或添加能夠改變偶聯的程度，即RNA噬菌體VLP每個亞單位上的人黑素瘤MelanA肽類似物的量，以匹配並適應疫苗的需要。在本發明的一個優選實施方案中，每個亞單位上平均有至少1.0個人黑素瘤MelanA肽類似物與RNA噬菌體的VLP連接。該值計算為RNA噬菌體VLP的所有亞單位或單體的平均值。在本發明的一個進一步優選的實施方案中，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2.0個人黑素瘤MelanA肽類似物與RNA噬菌體的VLP連接，計算為RNA噬菌體VLP的所有亞單位或單體的偶聯平均值。
在另一個優選實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體Qβ的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、或基本由、或由下列成分組成具有SEQ ID NO10的胺基酸序列的外殼蛋白，或具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的胺基酸序列的外殼蛋白的混合物，或SEQ ID NO11的突變體，其中N端甲硫氨酸優選地被切除。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由、或由Qβ的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、或基本由、或由突變Qβ外殼蛋白組成。在另一個優選實施方案中，這些突變外殼蛋白通過置換去除至少一個賴氨酸殘基或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾。此外，這些突變外殼蛋白也可以通過刪除至少一個賴氨酸殘基或通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾。
有4個賴氨酸殘基暴露於Qβ外殼蛋白的衣殼表面。本發明也可以使用以精氨酸置換暴露賴氨酸殘基的Qβ突變體。因此在本發明的實施中可以使用下列Qβ外殼蛋白突變體和突變QβVLP「Qβ-240」(Lys13-Arg；SEQ ID NO20)，「Qβ-243」(Asn 10-Lys；SEQ ID NO21)，「Qβ-250」(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO22)，「Qβ-251」(SEQ IDNO23)和「Qβ-259」(Lys 2-Arg，Lys 16-Arg；SEQ ID NO24)。因此，在本發明的進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由、或由突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白組成，包括具有選自下列的胺基酸序列的蛋白質a)SEQ ID NO20的胺基酸序列；b)SEQ ID NO21的胺基酸序列；c)SEQ ID NO22的胺基酸序列；d)SEQ ID NO23的胺基酸序列；e)SEQ ID NO24的胺基酸序列。上述Qβ外殼蛋白、突變Qβ外殼蛋白VLP和衣殼的構建、表達和純化分別在WO02/056905中公開。具體參照上述申請的實施例18。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由Qβ的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、基本由、或由上述Qβ突變體之一和相應A1蛋白的混合物組成。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。
AP205基因組由成熟蛋白、外殼蛋白、複製酶和在有關噬菌體中不存在的兩個開放閱讀框組成；一種裂解基因和開放閱讀框在成熟基因的翻譯中起作用(Klovins，J.，et al.，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205外殼蛋白能夠由質粒pAP283-58(SEQ ID NO30)表達，該質粒是pQb10(Kozlovska，T.M.，et al.，Gene 137133-37(1993))的衍生物，含有一個AP205核糖體結合位點。此外，也可以將AP205外殼蛋白克隆到pQb185內，使之位於載體中核糖體結合位點的下遊。這兩種方法都導致蛋白質的表達和衣殼的形成，如WO 04/007538所述，在此完整引用作為參考。載體pQb10和pQb185是由pGEM載體衍生的載體，克隆的基因在這些載體中的表達受trp啟動子控制(Kozlovska，T.M.，et al.，Gene 137133-37(1993))。質粒pAP283-58(SEQ ID NO30)在如下序列中包含一個推斷的AP205核糖體結合位點，該序列位於AP205外殼蛋白的XbaI位點下遊和ATG起始密碼子的直接上遊tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO30的鹼基77-133)。載體pQb185在XbaI位點下遊和起始密碼子上遊包含一個SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO61)，SD序列以下劃線標出)。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段組成。
本發明的這一優選實施方案因而包含可構成衣殼的AP205外殼蛋白。這些蛋白質是重組表達的或是從天然來源製備的。電子顯微鏡檢查(EM)和免疫擴散證實，在細菌中產生的AP205外殼蛋白自發形成衣殼。在EM中可見，AP205外殼蛋白(SEQ ID NO31)形成的衣殼與AP205 RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼的結構特徵幾乎無法辨別。AP205 VLP具有高度免疫原性，能夠與抗原和/或抗原決定簇連接，而產生以重複方式定向展示抗原和/或抗原決定簇的疫苗構建體。能夠產生針對這樣展示的抗原的高滴度，這表明結合的抗原和/或抗原決定簇能夠與抗體分子相互作用，並且具有免疫原性。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段組成。
AP205 VLP的可裝配突變形式，包括胺基酸5處的脯氨酸被置換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白(SEQ ID NO32)，也可以在本發明的實施中使用，並且產生本發明的一個進一步優選的實施方案。這些VLP、來自天然來源的AP205 VLP或AP205病毒顆粒可以與抗原結合，而產生根據本發明的有序且重複的抗原陣列。
AP205 P5-T突變外殼蛋白能夠由質粒pAP281-32(SEQ ID NO33)表達，該質粒由pQb185直接衍生而來，其中含有突變AP205外殼蛋白基因代替Qβ外殼蛋白基因。用表達AP205外殼蛋白的載體轉染用來表達AP205外殼蛋白的大腸桿菌。
分別表達外殼蛋白和突變外殼蛋白、導致自裝配為VLP的方法在WO 04/007538中描述，在此完整引用作為參考。合適的大腸桿菌株包括但不限於大腸桿菌K802、JM 109、RR1。合適的載體和菌株及其組合可以通過如下方法確定通過SDS-PAGE分別檢測外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達，並且可選地首先通過凝膠過濾純化衣殼，隨後通過免疫擴散試驗(Ouchterlony試驗)或電子顯微鏡檢查(Kozlovska，T.M.et al.，Gene 137133-137(1993))對其進行檢測，來檢測衣殼的形成和裝配。
由載體pAP283-58和pAP281-32表達的AP205外殼蛋白由於在大腸桿菌細胞質中加工，可能缺乏起始甲硫氨酸。AP205 VLP的切割、未切割形式或其混合物是本發明的進一步優選的實施方案。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段和RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段的混合物組成。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或重組突變外殼蛋白的片段組成。
在本發明的實施中也可以使用能夠分別裝配為VLP和衣殼的重組AP205外殼蛋白片段。可以通過內部刪除或分別在外殼蛋白和突變外殼蛋白的末端刪除而產生這些片段。向外殼蛋白和突變外殼蛋白序列中插入抗原序列或抗原序列與外殼蛋白和突變外殼蛋白序列融合(與VLP裝配相容)，是本發明的進一步的實施方案，分別產生嵌合AP205外殼蛋白和顆粒。插入、缺失以及與外殼蛋白序列融合的結果，以及是否與VLP裝配相容，能夠通過電子顯微鏡檢查來確定。
由上述AP205外殼蛋白、外殼蛋白片段和嵌合外殼蛋白形成的顆粒能夠分離為純化形式，分離方法是組合使用通過沉澱的分級分離步驟和通過凝膠過濾的純化步驟，例如使用Sepharose CL-4B、SepharoseCL-2B、Sepharose CL-6B柱及其組合，如WO 04/007538所述，在此完整引用作為參考。分離病毒樣顆粒的其它方法在本領域公知，可以用來分離噬菌體AP205的病毒樣顆粒(VLP)。例如，美國專利No.4,918,166描述了利用超速離心分離酵母逆轉錄轉座子Ty的VLP，在此完整引用作為參考。
幾種RNA噬菌體的晶體結構已經測定(Golmohammadi，R.et al.，Structure 4543-554(1996))。利用這些信息，本領域技術人員能夠容易地鑑定表面暴露的殘基，從而能夠修飾噬菌體外殼蛋白，使得能夠插入一個或多個反應性胺基酸殘基。因此，本領域技術人員能夠容易地產生並鑑定能夠在本發明實施中使用的噬菌體包被蛋白的修飾形式。因此，也可以用形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質變體(例如噬菌體Qβ、噬菌體R17、噬菌體fr、噬菌體GA、噬菌體SP和噬菌體MS2的外殼蛋白)製備本發明的組合物和疫苗組合物。WO 02/056905在第50頁第33行到第52頁第29行描述了修飾的RNA噬菌體以及形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質變體和N端和C端截短突變體的其它可能的實例，以及分別製備適合本發明使用的這些組合物和疫苗組合物的方法。
因此，本發明包括由可形成衣殼或VLP的蛋白質製備的組合物和疫苗組合物，由各種蛋白質亞單位和VLP或衣殼製備這些組合物的方法，製備這些蛋白質亞單位的方法，編碼這些亞單位的核酸分子，和利用本發明的這些組合物接種和/或在個體中引發免疫應答的方法。
在本發明的另一個優選實施方案中，VLP缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一個進一步優選的實施方案中，VLP完全不含包膜。
缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜，特別是完全缺少包膜，產生結構和組成更加明確的病毒樣顆粒。這些更加明確的病毒樣顆粒可以使副作用減至最小。而且，缺少含脂蛋白的包膜，或者特別是完全缺少包膜，使得病毒樣顆粒內摻入潛在毒性分子和熱原的可能性消失或減至最小。
在一個實施方案中，本發明提供含有病毒樣顆粒的本發明的疫苗組合物，其中優選地所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。優選地，該病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段，優選RNA噬菌體外殼蛋白組成。此外，本發明的疫苗組合物的病毒樣顆粒的重組蛋白包含、或基本由、或者由RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中該RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(k)噬菌體f2；(l)噬菌體PP7；和(m)噬菌體AP205。
在一個優選實施方案中，所述RNA噬菌體的突變外殼蛋白已經通過除去、或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾。在另一個優選實施方案中，所述RNA噬菌體的突變外殼蛋白已通過刪除至少一個賴氨酸殘基、或通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而修飾。在一個優選實施方案中，該病毒樣顆粒包含RNA噬菌體Qβ、RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白或其片段。
如前所述，本發明包括病毒樣顆粒或其重組形式。本領域技術人員了解如何製備這些顆粒並將其與抗原附著。本發明的進一步優選的實施方案在實施例部分描述。
在一個實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由BK病毒(BKV)的重組蛋白或其片段組成，其中所述重組蛋白包含、或基本由、或由具有SEQ ID NO12的胺基酸序列的蛋白質組成。BK病毒(BKV)是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，屬於乳多空病毒科多瘤病毒亞科。VP1是BKV的主要的衣殼蛋白。VP1含有362個胺基酸(SEQ ID NO12，Gene Bank登錄號AAA46882)，大小為42kDa。當在大腸桿菌、昆蟲細胞或酵母中產生時，VP1自發形成衣殼結構(Salunke D.M.，etal.，Cell 46(6)895-904(1986)；Sasnauskas，K.，et al.，Biol.Chem.380(3)381-6(1999)；Sasnauskas，K.，et al.，3rd International Workshop″Virus-like particles as vaccines″Berlin，September 26-29(2001)；Touze，A.，et al.，J Gen Virol.82(Pt 12)3005-9(2001)。該衣殼被組織為72VP1五聚體，形成二十面體結構。衣殼的直徑約為45nm。
在一個實施方案中，本發明的組合物中使用的顆粒由修飾後除去或減少了游離半胱氨酸殘基數量的B型肝炎衣殼(核心)蛋白(HBcAg)或HBcAg片段構成。Zhou等人(J.Virol.665393-5398(1992))證實，修飾後除去天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg保留結合併形成多聚體結構的能力。因此，適於在本發明的組合物中使用的核心顆粒包括那些包含修飾HBcAg或其片段的顆粒，其中一個或多個天然存在的半胱氨酸殘基已被刪除或被替換為另一種胺基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。
HBcAg是通過加工B型肝炎核心抗原前體蛋白產生的蛋白質。HBcAg的一些同種型已經被鑑定，本領域技術人員能夠容易地獲得其胺基酸序列。例如，具有SEQ ID NO16所示胺基酸序列的HBcAg蛋白長度為185個胺基酸，是通過加工212個胺基酸的B型肝炎核心抗原前體蛋白而產生的。這種加工導致從B型肝炎核心抗原前體蛋白的N端除去29個胺基酸。類似地，長度為185個胺基酸的HBcAg蛋白通過加工214個胺基酸的B型肝炎核心抗原前體蛋白而產生。
在優選實施方案中，用HBcAg的加工形式(即已經除去B型肝炎核心抗原前體蛋白的N端前導序列的HBcAg)製備本發明的疫苗組合物。
另外，在不發生加工的條件下製備HBcAg時，HBcAg通常以「加工的」形式表達。例如，細菌系統，如大腸桿菌，通常不會除去在真核細胞中正常表達的蛋白質的前導序列，也被稱為「信號肽」。因此，當利用將蛋白質表達定向於細胞質的大腸桿菌表達系統來產生本發明的HBcAg時，這些蛋白質通常表達為不含B型肝炎核心抗原前體蛋白N端前導序列的形式。
可用於本發明的B型肝炎病毒樣顆粒的製備在下列專利中公開，例如WO 00/32227、特別是其實施例17-19和21-24，以及WO01/85208、特別是其實施例17-19、21-24、31和41，和WO 02/056905。最後一個申請中具體參照實施例23、24、31和51。全部這三篇文獻在此均明確引用作為參考。
本發明也包括經修飾後缺失或置換了一個或多個其它半胱氨酸殘基的HBcAg變體。因此，本發明的疫苗組合物包括包含如下HBcAg的組合物，其中SEQ ID NO16所示胺基酸序列中不含的半胱氨酸殘基已經被刪除。
本領域公知，游離半胱氨酸殘基可能參與一些化學副反應。這些副反應包括二硫交換，與例如在與其它物質聯合治療中注射或形成的化學物質或代謝物反應，或暴露於紫外線後的直接氧化以及與核苷酸的反應。因而可能產生毒性加合物，特別是考慮到HBcAg具有結合核酸的強烈傾向。毒性加合物將會以多種形式分布，它們單個可能以低濃度存在，但在一起時則達到毒性水平。
如上所述，在疫苗組合物中使用經修飾除去天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg的一個優點是，當抗原或抗原決定簇附著時，毒性物質能夠結合的位點在數量上減少或者完全消失。
適用於實施本發明的一些天然存在的HBcAg變體已經被鑑定。例如，Yuan等人(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了在對應於SEQID NO25位點97的位點處異亮氨酸殘基被置換為亮氨酸殘基或苯丙氨酸殘基的變體。一些HBcAg變體以及幾種B型肝炎核心抗原前體變體的胺基酸序列公開於GenBank報告AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301(SEQ ID NO26)、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520(SEQ ID NO27)、P03153、AF110999和M95589，其公開內容均在此引用作為參考。上述B型肝炎核心抗原前體變體的序列進一步公開在WO01/85208中，申請WO 01/85208的SEQ ID NOs89-138中。這些HBcAg變體在胺基酸序列的多個位點處不同，包括對應於SEQ ID NO28中位點12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183處胺基酸殘基的胺基酸殘基。WO 01/98333、WO 00/177158和WO 00/214478中描述了適於在本發明的組合物中使用、並且可以根據本說明書公開內容進一步修飾的其它HBcAg變體。
適用於本發明的HBcAg可以來源於任何生物，只要它們能夠包封或偶聯或附著於、特別是能夠包裝含非甲基化CpG的寡核苷酸，並誘發免疫應答。
如上所述，一般將加工的HbcAg(即缺乏前導序列的)用於本發明的疫苗組合物中。本發明包括使用上述變異HBcAg的疫苗組合物，以及應用這些組合物的方法。
本發明的範圍內進一步包括能夠連接形成二聚或多聚結構的其它HBcAg變體。因此，本發明進一步包括如下疫苗組合物，其包含HBcAg多肽，該HBcAg多肽包含或由與任何一種野生型胺基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的胺基酸序列組成，以及必要時加工除去N端前導序列的這些蛋白質的形式。
一種多肽的胺基酸序列是否具有與野生型胺基酸序列之一或其亞部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的胺基酸序列，可以利用公知的電腦程式如Bestfit程序來常規確定。當利用Bestfit或其它任何序列比對程序來確定一種具體序列與參照胺基酸序列是否如95％相同時，參數設置為使得在參照胺基酸序列的全長上計算百分同一性，並且允許同源性缺口達參照序列中胺基酸殘基總數的5％。
上述HBcAg變體和前體的胺基酸序列彼此相對相似。因此，HBcAg變體中位於對應於SEQ ID NO28特定位點的位點處的胺基酸殘基，是指SEQ ID NO28所示胺基酸序列中該位點處的胺基酸殘基。在感染哺乳動物的B型肝炎病毒之間，這些HBcAg變體之間的同源性絕大部分足夠高，因此本領域技術人員不難檢查如SEQ ID NO28所示的胺基酸序列，以及特定HBcAg變體的胺基酸序列，並確定「相應的」胺基酸殘基。此外，SEQ ID NO27所示HBcAg胺基酸序列，其顯示來源於感染土撥鼠的病毒的HBcAg的胺基酸序列，與含有SEQID NO28所示胺基酸序列的HBcAg有足夠的同源性，顯然在SEQ IDNO27中，相當於在SEQ ID NO28的胺基酸殘基155與156之間插入了3個胺基酸殘基。
本發明也包括包含感染鳥類的B型肝炎病毒HBcAg變體的疫苗組合物，以及包含這些HBcAg變體的片段的疫苗組合物。本領域技術人員會理解，在添加到本發明的疫苗組合物中之前，這些多肽中天然存在的1、2、3個或更多的半胱氨酸殘基可以被置換為另一種胺基酸殘基或者缺失。
如上所述，去除游離半胱氨酸殘基減少了毒性成分能夠與HBcAg結合的位點數，也除去了該HBcAg或相鄰HBcAg分子的賴氨酸和半胱氨酸殘基交聯的位點。因此，在本發明的另一個實施方案中，B型肝炎病毒衣殼蛋白的一個或多個半胱氨酸殘基缺失或被替換為另一種胺基酸殘基。HBcAg-Lys變體的表達與純化在WO 02/056905的實施例24中有描述，不含游離半胱氨酸殘基且含有插入的賴氨酸殘基的HBcAg的構建在WO 02/056905的實施例31中有描述。
在其它實施方案中，本發明的組合物和疫苗組合物分別含有已經除去C端區(例如SEQ ID NO28的胺基酸殘基145-185或150-185)的HBcAg。適於在本發明的實施中使用的其它修飾HBcAg包括C端截短突變體。合適的截短突變體包括已經從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35個胺基酸的HBcAg。
適於在本發明的實施中使用的HBcAg還包括N端截短突變體。合適的截短突變體包括已經從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸的修飾HBcAg。
適於在本發明的實施中使用的HBcAg還包括N端和C端截短突變體。合適的截短突變體包括已經從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸並且從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35個胺基酸的HBcAg。
本發明還包括分別包含HBcAg多肽的組合物和疫苗組合物，該多肽包含、或基本由、或由與上述截短突變體至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的胺基酸序列組成。
在本發明的某些實施方案中，向HBcAg多肽內引入賴氨酸殘基，以介導本發明的MelanA肽類似物與HBcAg的VLP的結合。在優選實施方案中，用一種HBcAg製備本發明的組合物，該HBcAg包含或由SEQ ID NO28的胺基酸1-144或1-149、1-185組成，對其進行修飾使得對應於位點79和80的胺基酸被置換為含Gly-Gly-Lys-Gly-Gly胺基酸序列的肽(SEQ ID NO18)，產生含有SEQ ID NO29所示序列的HBcAg多肽。這些組合物尤其可用於抗原決定簇與HBcAg的VLP相偶聯的實施方案中。在進一步優選的實施方案中，SEQ ID NO28的位點48和107處的半胱氨酸殘基突變為絲氨酸。本發明還包括包含相應多肽的組合物，該多肽含有上述任何一種B型肝炎核心抗原前體變體所示的胺基酸序列，還含有上述胺基酸改變。本發明的範圍內還包括能夠連接形成衣殼或VLP並且含有上述胺基酸改變的其它HBcAg變體。因此，本發明進一步包括如下組合物和疫苗組合物，它們分別包含HBcAg多肽，該HBcAg多肽包含或由與任何一種野生型胺基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的胺基酸序列組成，以及必要時加工除去N端前導序列和通過上述胺基酸改變修飾的這些蛋白質的變化形式。
本發明的組合物或疫苗組合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由胺基酸序列不同的多種HBcAg組成。例如，可以製備包含「野生型」HBcAg和一個或多個胺基酸殘基已經改變(例如缺失、插入或置換)的修飾HBcAg的疫苗組合物。本發明優選的疫苗組合物是呈現高度有序且重複的抗原陣列的組合物，其中所述抗原是人黑素瘤MelanA肽類似物。
如上所述，本發明部分基於以下的意外發現免疫刺激物，優選免疫刺激性核酸，更優選DNA寡核苷酸，或者poly(IC)，能夠包裝到VLP內。出乎意料的是，VLP內的核酸可被特異性地置換為免疫刺激物，優選免疫刺激性核酸，更優選含有CpG基序或poly(IC)的DNA-寡核苷酸。例如，CpG-VLP比不含CpG的對應物免疫原性更高、引發特異性更高的效應，並且誘發增強的B和T細胞應答。針對與VLP偶聯、融合或以其他方式附著的抗原的免疫應答與針對VLP本身的免疫應答相似地增強。另外，針對VLP和抗原兩者的T細胞應答都特別集中在Th1型。而且，包裝的核酸和CpG分別受到保護而免遭降解，即它們更加穩定。而且，來自先天免疫系統的細胞的非特異性激活被大大降低。
先天免疫系統能夠識別微生物病原體所共有的固定分子模式。最近的研究揭示，這種識別是誘發有效免疫應答的一個關鍵步驟。微生物產物增強免疫應答的主要機制是刺激APC，特別是樹突細胞，從而產生促炎細胞因子，並且表達高水平的T細胞共同刺激分子。這些激活的樹突細胞隨後啟動初次T細胞應答，並且決定T細胞介導的效應功能的類型。
兩類核酸，即1)含有免疫刺激序列、特別是特定側翼鹼基內的非甲基化CpG二核苷酸(稱為CpG基序)的細菌DNA，2)由多種病毒類型合成的雙鏈RNA，是能增強免疫應答的微生物成分的重要成員。合成雙鏈(ds)RNA，如聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly IC)，能夠誘導樹突細胞產生促炎細胞因子並表達高水平的共刺激分子。
Tokunaga和Yamamoto等人的一系列研究表明，細菌DNA或合成寡脫氧核苷酸誘導人PBMC和小鼠脾細胞產生I型幹擾素(IFN)(Yamamoto et al.，Springer Semin Immunopathol.2211-19綜述)。最初合成Poly IC作為I型IFN的一種強誘導劑，但它也能誘導其它細胞因子如IL-12。
優選的核糖核酸包括聚肌苷酸-聚胞苷酸雙鏈RNA(poly IC)。核糖核酸及其修飾及其製備方法在Levy，H.B.(Methods Enzymol.1981，78242-251)、DeClercq，E(Methods Enzymol.1981，78227-236)和Torrence，P.F.(Methods Enzymol 1981；78326-331)以及其中的參考文獻中有描述。進一步優選的核糖核酸包括肌苷酸和胞苷酸的多核苷酸，如兩條鏈形成雙鏈RNA的poly(IC)。核糖核酸可以從生物中分離。核糖核酸也包括其它合成核糖核酸，特別是合成的poly(IC)寡核苷酸，它們通過磷酸二酯骨架的修飾、特別是通過硫代磷酸修飾而對核酸酶具有抗性。在另一個實施方案中，用脫氧核糖代替poly(IC)的核糖骨架。本領域技術人員了解合成寡核苷酸的合成方法。
在本發明的另一個優選實施方案中，包括可激活toll樣受體(TLR)的分子。迄今為止已知10種人toll樣受體。它們被多種配體激活。TLR2被肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸和酵母聚糖和巨噬細胞活化脂肽MALP-2激活；TLR3被雙鏈RNA如poly(IC)激活；TLR4被脂多糖、脂磷壁酸和紫杉醇和熱休克蛋白如熱休克蛋白HSP-60和Gp96激活；TLR5被細菌鞭毛、特別是鞭毛蛋白激活；TLR6被肽聚糖激活；TLR7被咪喹莫特和咪唑並喹啉化合物如R418、羅唑利賓和溴匹立明激活；TLR9被細菌DNA、特別是CpG DNA激活。TLR1、TLR8和TLR10的配體迄今為止還不清楚。然而，最近的報告表明，相同的受體能夠與不同的配體反應，並且存在其它受體。以上所列配體並非窮舉，本領域技術人員知道其它配體。
優選地，含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列5』X1X2CGX3X4 3』，其中X1、X2、X3、X4是任意一種核苷酸。另外，該寡核苷酸可以包含約6個到約100,000個核苷酸，優選約6個到約2000個核苷酸，更優選約20個到約2000個核苷酸，更優選地包含約20個到約300個核苷酸。另外，該寡核苷酸也可以包含超過100個到約2000個核苷酸，優選超過100個到約1000個核苷酸，更優選超過100個到約500個核苷酸。
在一個優選實施方案中，含CpG的寡核苷酸在磷酸骨架上含有一個或多個硫代磷酸修飾。例如，本發明的範圍內包括其中有一個或多個磷酸骨架修飾或者全部磷酸骨架都被修飾的含CpG的寡核苷酸，以及其中一個、多個或全部核苷酸磷酸骨架修飾為硫代磷酸修飾的含CpG的寡核苷酸。因此，在一個優選實施方案中，核苷酸X1、X2、X3和X4至少之一含有磷酸骨架修飾。
在本發明的另外一個非常優選的實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO2)；在此一般縮寫為G3-6)，(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO3)；在此一般縮寫為G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO4)；在此一般縮寫為G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)；在此一般縮寫為G6-6)，(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)；在此一般縮寫為G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)；在此一般縮寫為G8-8)，(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO8)；在此一般縮寫為G9-9)，(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO9)；在此一般縮寫為G6)，(i)tccatgacgttcctgaataat((SEQ ID NO34)；在此一般縮寫為CyCpGpt)，(j)TCCATGACGTTCCTGAATAAT((SEQ ID NO35)；在此一般縮寫為CyCpG)，(k)tccatgacgttcctgacgtt((SEQ ID NO36)；在此一般縮寫為B-CpGpt)，(l)TCCATGACGTTCCTGACGTT((SEQ ID NO37)；在此一般縮寫為B-CpG)，(m)ggggtcaacgttgaggggg((SEQ ID NO38)；在此一般縮寫為NKCpGpt)，(n)GGGGTCAACGTTGA GGGGG((SEQ ID NO39)；在此一般縮寫為NKCpG)，(o)attattcaggaacgtcatgga((SEQ ID NO40)；在此一般縮寫為CyCpG-rev-pt)， (p)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般縮寫為g10gacga-PO(G10-PO))， (q)gggggggggggacgatcgtcgggggggggg((SEQ ID NO42)；在此一般縮寫為g10gacga-PS(G10-PS))，(r)CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT((SEQ ID NO43)；在此一般縮寫為(CpG)20OpA)，(s)TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCG((SEQ IDNO44)；在此一般縮寫為Cy(CpG)20)， (t)TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAA GACAGCAT((SEQ ID NO45)；在此一般縮寫為Cy(CpG)20-OpA)， (u)TCCATGACGTTCCTGAATAATAAATGCATGTCAAAGACAGCAT((SEQ ID NO46)；在此一般縮寫為CyOpA)， (v)TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTT CCTGAATAAT((SEQ ID NO47)；在此一般縮寫為CyCyCy)， (w)TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTGGATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCC((SEQ ID NO48)；在此一般縮寫為Cy150-1)，和(x)CTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATTCATGACTTCCTGAATAATTCCATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAAAATTCCA ATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC(SEQ ID NO49)，在此一般縮寫為dsCyCpG-253(互補鏈未示出)。上述SEQ ID NO34至SEQ ID NO49序列中的小寫字母表示通過硫代磷酸酯鍵連接的脫氧核苷酸，而大寫字母表示通過磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸。
在本發明的再一個非常優選的實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有核酸序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ IDNO41)；在此一般縮寫為g10gacga-PO或G10-PO)。
含CpG的寡核苷酸也可以是重組的、基因組的、合成的、cDNA、質粒衍生的和單鏈或雙鏈的。為在本發明中應用，可以利用本領域公知的多種方法之一從頭合成核酸。例如，β-氰乙基亞磷醯胺法(Beaucage，S.L.and Caruthers，M.H.，Tet.Let.221859(1981)；核苷H-磷酸法(Garegg et al.，Tet.Let.274051-4054(1986)；Froehler et al.，Nucl.Acid.Res.145399-5407(1986)；Garegg et al.，Tet.Let.274055-4058(1986)；Gaffney et al.，Tet.Let.292619-2622(1988))。這些化學法可以用可購得的多種自動寡核苷酸合成儀進行。此外，CpG也可以在質粒中大規模產生(參見Sambrook，T.et al.，《分子克隆實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)，它在對受試者施用後降解為寡核苷酸。可以利用已知技術，如使用限制性內切酶、外切核酸酶或內切核酸酶，由現有的核酸序列(例如基因組或cDNA序列)製備寡核苷酸。
免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以用本領域已知的任何一種方法與VLP結合，只要該組合物能夠增強動物中的免疫應答。例如，寡核苷酸可以共價或非共價結合。另外，VLP也可以完全或部分地包封免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸。優選地，免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸能夠結合於VLP位點，如寡核苷酸結合位點(天然或非天然存在的)、DNA結合位點或RNA結合位點。在另一個實施方案中，VLP位點包含富含精氨酸的重複序列或富含賴氨酸的重複序列。
本發明組合物的一個具體用途是為了增強對抗原的特異性免疫應答而激活樹突細胞。可以用離體(ex vivo)或體內技術增強免疫應答。離體技術可以用於自體或異源細胞，但優選地用於自體細胞。在優選實施方案中，樹突細胞從外周血或骨髓中分離，但是也可以從任何樹突細胞來源中分離。為了癌症免疫治療而對樹突細胞的離體操作在本領域的幾篇參考文獻中已有描述，包括Engleman，E.G.，Cytotechnology 251(1997)；Van Schooten，W.et al.，MolecularMedicine Today，June，255(1997)；Steinman，R.M.，ExperimentalHematology 24849(1996)；Gluckman，J.C.，Cytokines，Cellular andMolecular Therapy 3187(1997)。
也可以利用體內方法將樹突細胞接觸本發明的組合物。為了實現這一點，將CpG與可選地偶聯、融合或以其他方式附著到抗原上的VLP組合，直接給予需要免疫治療的患者。在一些實施方案中，優選地在腫瘤局部區域施用VLP/CpG，這可以用本領域公知的任何一種方法來實現，例如直接向腫瘤內注射。
本發明的一個優選實施方案是提供用於增強動物中的免疫應答的組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或所述抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，並且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述迴文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，並且其中所述迴文序列在其3』端和5』端側翼為兩個以上、11個以下的鳥苷，或者更優選8-10個鳥苷，或者最優選10個鳥苷。
我們發現，本發明的免疫刺激物，即含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述迴文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，並且其中所述迴文序列在其3』端和5』端側翼為兩個以上、11個以下的鳥苷，更優選8-10個鳥苷，或者最優選10個鳥苷，在體外刺激免疫細胞方面特別有效。
在本發明的一個優選實施方案中，所述迴文序列是、或者包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO1)組成，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少3個、至多10個鳥苷，並且所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。在另一個實施方案中，所述迴文序列在其5』端側翼為至少3個、至多10個鳥苷，並且所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO2)；在此一般縮寫為G3-6)，(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO3)；在此一般縮寫為G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO4)；在此一般縮寫為G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)；在此一般縮寫為G6-6)，(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)；在此一般縮寫為G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)；在此一般縮寫為G8-8)，(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO8)；在此一般縮寫為G9-9)，(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO9)；在此一般縮寫為G6)，和 (i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般縮寫為G10-PO)。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述迴文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，並且其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少4個、至多10個鳥苷，並且所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
在本發明的另一個優選實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO3)；在此一般縮寫為G4-6)，(b)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO4)；在此一般縮寫為G5-6)， (c)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)；在此一般縮寫為G6-6)，(d)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)；在此一般縮寫為G7-7)，(e)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)；在此一般縮寫為G8-8)，(f)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO8)；在此一般縮寫為G9-9)；和 (g)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般縮寫為G10-PO)。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述迴文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，並且其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少5個、至多8個鳥苷，並且所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
實驗數據表明，對於本發明優選的免疫刺激物，即側翼為鳥苷、含非甲基化CpG的回文寡核苷酸，其中該迴文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，並且該迴文序列在其3′端和5′端側為不到11個或不到10個鳥苷，如果迴文序列側翼的鳥苷較少，則更容易被包裝到VLP內。然而，減少迴文序列側翼的鳥苷數量會降低對血細胞的體外刺激。因此，可包裝性的代價是本發明所述免疫刺激物的生物活性降低。因此優選實施方案是可包裝性與生物活性之間的折衷。
在本發明的另一個優選實施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO4)，在此一般縮寫為G5-6)； (b)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)，在此一般縮寫為G6-6)；(c)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)，在此一般縮寫為G7-7)； (d)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)，在此一般縮寫為G8-8)；和 (e)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般縮寫為G10-PO)。
在本發明的一個優選實施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQID NO7的核酸序列，即該免疫刺激物是G8-8，或者具有SEQ ID NO41的核酸序列，即該免疫刺激物是G10-PO。
在本發明的一個非常優選的實施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQ ID NO41的核酸序列，即該免疫刺激物是G10-PO。因此，在一個非常優選的實施方案中，本發明提供一種增強動物中免疫應答的組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，並且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是迴文序列的一部分，其中所述迴文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，並且其中所述迴文序列在其3』端和5』端側翼為10個鳥苷。
如上所述，用來包裝到VLP內的最佳序列是可包裝性與生物活性之間的折衷。考慮到這一點，G8-8免疫刺激物是優選的，G10-PO免疫刺激物是本發明的非常優選的實施方案，因為它們具有高度的生物活性，同時仍然可以相當好地被包裝。
本發明的組合物進一步包含與病毒樣顆粒結合的本發明的人黑素瘤MelanA肽類似物。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，至少一個MelanA肽類似物與該病毒樣顆粒融合。如上所述，VLP一般由至少一種可裝配為VLP的亞單位組成。因此，在本發明的一個進一步優選的實施方案中，MelanA肽類似物與病毒樣顆粒的或能夠摻入VLP內的蛋白質的至少一個亞單位融合，產生嵌合的VLP-亞單位-抗原融合體。
MelanA肽類似物的融合可以如下實現插入VLP亞單位序列內，或與VLP亞單位或能夠摻入VLP內的蛋白質的N端或C端融合。在下文中，當提到肽與VLP亞單位的融合蛋白時，包括該肽與亞單位序列任一端的融合或向亞單位序列內的內部插入。
也可以通過向VLP亞單位變體內插入MelanA肽類似物序列實現融合，其中亞單位序列的一部分缺失，故被稱為截短突變體。截短突變體可以在N端或C端或內部缺失VLP亞單位的部分序列。例如，胺基酸殘基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有內部缺失的截短突變體。抗原或抗原決定簇與截短突變體VLP-亞單位的N端或C端的融合也產生本發明的實施方案。同樣，表位向VLP亞單位序列內的融合也可以通過置換來實現，例如對於特定VLP HBcAg，用外源表位代替胺基酸79-81。因此，如下文所說的融合可以如下實現向VLP亞單位的序列中插入MelanA肽類似物序列，用MelanA肽類似物置換VLP亞單位序列的一部分，或者利用缺失、置換或插入的組合。
嵌合MelanA肽類似物-VLP亞單位通常能夠自裝配為VLP。展示與亞單位融合的表位的VLP在此也被稱為嵌合VLP。如上所述，病毒樣顆粒包含或者由至少一種VLP亞單位組成。在本發明的另一實施方案中，病毒樣顆粒包含或由嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位(即不與抗原融合的VLP亞單位)的混合物組成，產生所謂的鑲嵌顆粒。這可能有利於確保VLP的形成和裝配。在這些實施方案中，嵌合VLP-亞單位的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
為了與VLP亞單位序列的任一端融合，或者為了向VLP亞單位序列內部插入這種肽序列，可以向肽或表位序列的任一端添加側翼胺基酸殘基。在添加到待融合肽上的側翼序列中，甘氨酸和絲氨酸殘基是特別有用的胺基酸。甘氨酸殘基提供額外的柔性，這可降低外源序列與VLP亞單位序列融合中潛在的去穩定作用。
在本發明的一個具體實施方案中，VLP是一種B型肝炎核心抗原VLP。與HBcAg N端的融合蛋白(Neyrinck，S.et al.，Nature Med.51157-1163(1999))或向所謂的主要免疫顯性區(MIR)中的插入已經有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，WO01/98333)，也是本發明的優選實施方案。在MIR中存在缺失的天然存在的HBcAg變體也已經有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，在此完整引用作為參考)，與N端或C端的融合，以及與野生型HBcAg相比在對應於缺失位點的MIR位點處的插入，也是本發明的實施方案。與C端的融合也已經有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本領域技術人員可以容易地找到如何利用經典分子生物學技術構建融合蛋白的指南(Sambrook，J.et al.，eds.，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho et al.，Gene 7751(1989))。編碼HBcAg和HBcAg融合蛋白並且可用於表達HBcAg和HBcAg融合蛋白的載體和質粒已經有描述(Pumpens，P. Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.et al.，Nature Med.51157-1163(1999))，可以在本發明的實施中使用。優化自裝配效率和展示欲插入HBcAg MIR內的表位的一個重要因素是插入位點的選擇，以及插入時將要從MIR內HBcAg序列上刪除的胺基酸數量(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 421635；U.S.6,231,864)，或者換句話說，HBcAg的哪些胺基酸將被置換為新的表位。例如，已經報導了用外源表位置換HBcAg胺基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 421635；US 6,231,864)。HBcAg含有一個長精氨酸尾(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology4498-114(2001))，該精氨酸尾不是衣殼裝配所必需的，並能夠結合核酸(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺乏該精氨酸尾的HBcAg都是本發明的實施方案。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP。RNA噬菌體的主要外殼蛋白在細菌、特別是在大腸桿菌中表達後自發裝配為VLP。可用來製備本發明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體例子包括諸如噬菌體Qβ(SEQ ID NO10，PIR資料庫，登錄號VCBPQβ，指QβCP；和SEQ ID NO11，登錄號AAA16663，指Qβ A1蛋白)和噬菌體fr(SEQ ID NO13，PIR登錄號VCBPFR)的RNA噬菌體的外殼蛋白。
在另一個優選實施方案中，至少一個MelanA肽類似物與一個Qβ外殼蛋白融合。已經描述了如下融合蛋白構建體，其中表位與Qβ A1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白內(Kozlovska，T.M.et al.，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白是通過UGA終止密碼子處的抑制產生的，長度為329個胺基酸，或者如果考慮N端甲硫氨酸的切除，為328個胺基酸。丙氨酸(Qβ CP基因編碼的第二個胺基酸)之前N端甲硫氨酸的切除在大腸桿菌中常常發生，Qβ外殼蛋白的N端就是如此。位於UGA琥珀密碼子3』方向的A1基因的一部分編碼長度為195個胺基酸的CP延伸。在CP延伸的位點72與73之間插入至少一個MelanA肽類似物產生了本發明另外的實施方案(Kozlovska，T.M.et al.，Intervirology 399-15(1996))。MelanA肽類似物在C端截短的Qβ A1蛋白C端處的融合產生了本發明的進一步優選的實施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))描述了表位在位點19處截短的Qβ CP延伸的C端處融合的Qβ A1蛋白融合。
如Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))所述，展示融合表位的顆粒的裝配可能需要存在A1蛋白-MelanA-肽類似物融合蛋白和野生型CP，以形成鑲嵌顆粒。然而，本發明的範圍內也包括下述實施方案其包含僅由與至少一個MelanA-肽類似物融合的VLP亞單位組成的病毒樣顆粒，特別是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP。
鑲嵌顆粒的製備可以用數種方法實現。Kozlovska，et al.，Intervirology 399-15(1996)描述了3種方法，它們均可在本發明的實施中使用。第一種方法，通過在大腸桿菌菌株中表達在CP與CP延伸之間含有一個UGA終止密碼子的編碼Qβ A1融合蛋白的質粒，介導融合表位在VLP上的有效展示，該大腸桿菌菌株攜帶編碼克隆UGA抑制性tRNA的質粒，使UGA密碼子翻譯為Trp(pISM3001質粒(Smiley B.K.，et al.，Gene 13433-40(1993))。另一種方法，將CP基因終止密碼子修飾為UAA，並與表達A1蛋白-抗原融合體的第二種質粒共轉化。該第二種質粒編碼不同的抗生素抗性，並且其複製起點與第一種質粒相容(Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology 399-15(1996))。第三種方法，CP和A1蛋白-抗原融合體以雙順反子的形式編碼，與啟動子如Trp啟動子有效連接，如Kozlovska，et al.，Intervirology 399-15(1996)的圖1所示。
在另外一個實施方案中，MelanA肽類似物插入在frCP的胺基酸2與3之間(切割的CP的編號，其中N端甲硫氨酸已經切除)，從而產生MelanA肽類似物-fr CP融合蛋白。用於構建和表達可自裝配為VLP的fr CP融合蛋白並且可用於本發明實施的載體和表達系統已經有報導(Pushko P.，et al.，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一個具體實施方案中，MelanA肽類似物序列插入在fr CP缺失變體內胺基酸2之後，該變體中fr CP的殘基3和4缺失。
表位在RNA噬菌體MS-2外殼蛋白的N端突起β-髮夾中的融合，以及隨後融合表位在RNA噬菌體MS-2的自裝配VLP上的呈遞，也已經有描述(WO 92/13081)，本發明的MelanA肽類似物通過插入或置換到MS-2RNA噬菌體的外殼蛋白內的融合也屬於本發明的範圍內。
在本發明的另一個實施方案中，本發明的MelanA肽類似物與乳頭瘤病毒的衣殼蛋白融合。在一個更特別的實施方案中，本發明的MelanA肽類似物與1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1融合。用於構建及在杆狀病毒/昆蟲細胞系統內表達BPV-1融合蛋白的載體和表達系統已經有描述(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用本發明的MelanA肽類似物置換BLV-1L1的胺基酸130-136產生BPV-1L1-MelanA肽類似物融合蛋白，這是本發明的一個優選實施方案。在杆狀病毒載體中的克隆以及在杆狀病毒感染的Sf9細胞中的表達已經有描述，可在本發明的實施中使用(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA962373-2378(1999)，WO 00/23955)。展示融合的本發明MelanA肽類似物的裝配顆粒可以用多種方法進行純化，如凝膠過濾或蔗糖梯度超速離心(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。
在本發明的另一個實施方案中，本發明的MelanA肽類似物與能夠摻入Ty VLP內的Ty蛋白融合。在一個更特別的實施方案中，本發明的MelanA肽類似物與TYA基因編碼的p1或衣殼蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))。酵母逆轉錄轉座子Ty1、2、3、4已經從釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)中分離，而逆轉錄轉座子Tf1已經從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombae)中分離(Boeke，J.D.and Sandmeyer，S.B.，″Yeast Transposable elements，″in The molecularand Cellular Biology of the Yeast SaccharomycesGenome dynamics，Protein Synthesis，and Energetics，p.193，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1991))。逆轉錄轉座子Ty1和2與植物和動物因子的copia類別有關，而Ty3屬於逆轉錄轉座子的gypsy家族，它與植物和動物逆轉錄病毒有關。在Ty1逆轉錄轉座子中，p1蛋白(也稱為Gag或衣殼蛋白)的長度為440個胺基酸。p1在VLP的成熟過程中在位點408處被切割，產生p2蛋白，p2蛋白是VLP的必要組分。
與p1融合的融合蛋白和用於在酵母中表達該融合蛋白的載體已經有描述(Adams，S.E.，et al.，Nature 32968-70(1987))。例如，通過向pMA5620質粒的BamHI位點內插入編碼MelanA肽類似物的序列，本發明的MelanA肽類似物可與p1融合。將編碼外源表位的序列克隆到pMA5620載體內導致融合蛋白的表達，該融合蛋白包含Ty1-15的p1的胺基酸1-381，其C端與外源表位的N端融合。同樣，本發明的MelanA肽類似物的N端融合，或向p1序列內的內部插入，或p 1序列一部分的置換，也屬於本發明的範圍內。具體而言，將本發明的MelanA肽類似物插入Ty序列內Ty蛋白p1的胺基酸30-31、67-68、113-114和132-133之間(EP0677111)產生本發明的優選實施方案。
適用於本發明的MelanA或MelanA肽類似物融合的其它VLP有，例如逆轉錄病毒樣顆粒(WO9630523)、HIV2Gag(Kang，Y.C.，et al.，Biol.Chem.380353-364(1999))、豇豆花葉病毒(Taylor，K.M.，et al.，Biol.Chem.380387-392(1999))、細小病毒VP2VLP(Rueda，P.，et al.，Virology 26389-99(1999))、HBsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。
適於實施本發明的嵌合VLP的實例也包括Intervirology 391(1996)中所描述的那些。預計可用於本發明的VLP的其它實例有HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、菸草花葉病毒。也製備了SV40、多瘤病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、輪狀病毒和諾瓦克病毒的病毒樣顆粒，這些VLP的嵌合VLP也屬於本發明的範圍內。
如上所述，包含通過插入病毒樣顆粒構建單體序列內而與病毒樣顆粒融合的抗原的實施方案，也屬於本發明的範圍內。有些情況下，抗原可以插入到包含缺失的病毒樣顆粒構建單體形式中。在這些情況下，如果沒有插入抗原，病毒樣顆粒構建單體可能不能形成病毒樣結構。
有時，可以應用重組DNA技術使異源蛋白質與VLP蛋白相融合(Kratz，P.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961915(1999))。例如，本發明包括與本發明的抗原(或其部分，優選至少10、20或50個胺基酸)重組融合或化學偶聯(包括共價和非共價偶聯)的VLP，產生融合蛋白或偶聯物。這種融合不一定必須是直接融合，也可以通過接頭序列發生。更一般而言，當使用與病毒樣顆粒融合、偶聯或以其它方式附著的表位作為根據本發明的抗原時，一般在該表位的一端或兩端添加間隔或接頭序列。這些接頭序列優選地包含可被蛋白酶體、內體的蛋白酶或細胞的其它囊狀區室識別的序列。
一種偶聯方法是通過肽鍵偶聯，其中偶聯物可以是連續的多肽，即融合蛋白。對於根據本發明的融合蛋白，不同的肽或多肽在框內彼此連接，形成一條連續多肽。因此，該融合蛋白的第一部分包含抗原或免疫原，該融合蛋白的第二部分在第一部分的N端或C端包含VLP。或者，本發明也可以向VLP的內部插入，在抗原兩端任選地帶有連接序列。
當用HBcAg作為VLP時，優選地抗原與HBcAg顆粒的C端連接。展示C端融合MHC I類限制的、來源於淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)糖蛋白的肽p33的B型肝炎核心抗原(HBcAg)可能是並且通常用作模型抗原(HBcAg-p33)。長度為185個胺基酸的野生型HBc蛋白裝配為高度結構化的顆粒，該顆粒由180個亞單位組成，表現為幾何二十面體。文獻中很好地證明了HBcAg和其它VLP在不同位點處接納相對較大的外源序列插入，而保留形成結構化衣殼的能力的這種柔性。這使得HBc VLP成為設計非複製性疫苗的有力候選者。
可以向融合蛋白的抗原與配體之間插入一個柔性的接頭序列(例如，含聚甘氨酸/聚絲氨酸的序列，如[Gly4Ser]2(Huston et al.，Meth.Enzymol 20346-88(1991)))。也可以構建融合蛋白使之含有一個「表位標籤」，該標籤使融合蛋白能夠結合一種抗體(例如單克隆抗體)，例如用於標記或純化目的。表位標籤的一個實例是Glu-Glu-Phe三肽，它可被單克隆抗體YL1/2識別。
本發明也涉及含有編碼VLP的序列和編碼MelanA肽類似物的序列的嵌合DNA。例如，該DNA可以在杆狀病毒轉化的昆蟲細胞中、在酵母或在細菌中表達。對表達系統沒有任何限制，常規應用可以有大量選擇。優選使用允許蛋白質大量表達的系統。由於細菌表達系統的效率高，通常優選該系統。適合在本發明範圍內使用的細菌表達系統的一個實例是Clarke et al.，J.Gen.Virol.711109-1117(1990)；Borisova et al.，J.Virol.673696-3701(1993)；Studier et al.，MethodsEnzymol.18560-89(1990)所述的系統。合適的酵母表達系統的一個例子是Emr.Methods Enzymol.185231-3(1990)所述的系統；以前用於製備衣殼蛋白的杆狀病毒系統也是適用的。可以使用組成型或誘導型表達系統。通過對可以使用的表達系統的選擇和可能的修飾，可能控制所獲蛋白質的形式。
在本發明的一個具體實施方案中，希望增強對其免疫應答的抗原與B型肝炎病毒衣殼(核心)蛋白(HBcAg)在框內偶聯、融合或以其它方式附著。然而，本領域所有人員都應當清楚，在本發明的融合蛋白構建體中也可以使用其它病毒樣顆粒。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，所述至少一種MelanA肽類似物通過至少一個共價鍵與病毒樣顆粒結合。優選地，至少一種MelanA肽類似物通過至少一個共價鍵與病毒樣顆粒結合，該共價鍵是非肽鍵，分別產生有序且重複的陣列和MelanA肽類似物-VLP偶聯物。這種MelanA肽類似物陣列和偶聯物一般且優選地分別具有重複且有序的結構，因為至少一種MelanA肽類似物以定向方式與VLP結合。優選地，等於及超過120個、更優選等於及超過180個、更優選超過270個、更優選等於及超過360個本發明的MelanA肽與VLP結合。所述至少一種MelanA肽類似物與VLP的定向及明確的結合和附著確保了重複且有序的MelanA肽類似物-VLP陣列和偶聯物的分別形成，這在下文中將是顯而易見的。而且，VLP固有的典型高度重複且組織化的結構有助於以高度有序且重複的方式展示MelanA肽類似物，分別產生高度組織化且重複的MelanA肽類似物-VLP陣列和偶聯物。
因此，本發明優選的偶聯物和陣列與現有技術中偶聯物的不同在於高度組織化的結構、大小和抗原在陣列表面上的重複性。本發明優選的實施方案還允許該顆粒在保證VLP正確摺疊和裝配的表達宿主中表達，然後抗原，即至少一種本發明的MelanA肽類似物，進一步與之偶聯。
本發明公開了本發明的MelanA肽類似物與VLP結合或連接的方法。如上所述，在本發明的一個方面，通過化學交聯，一般且優選地通過使用異雙功能交聯劑，將至少一種本發明的MelanA肽類似物與VLP結合。有幾種異雙功能交聯劑在本領域公知。在優選實施方案中，異雙功能交聯劑含有能夠與優選的第一附著位點(即VLP或至少一個VLP亞單位的賴氨酸殘基的側鏈氨基)反應的一個官能團，和能夠與優選的第二附著位點(即與本發明的MelanA肽類似物融合的、並且可選地也可通過還原用於反應的半胱氨酸殘基)反應的另一個官能團。該方法的第一步，一般被稱為衍生化，是VLP與交聯劑反應。反應產物是活化的VLP，也被稱為活化載體。第二步，使用常用方法如凝膠過濾或透析除去未反應的交聯劑。第三步，本發明的MelanA肽類似物與活化的VLP反應，該步驟一般被稱為偶聯步驟。未反應的MelanA肽類似物可選地可在第四步除去，例如通過透析。有幾種異雙功能交聯劑在本領域公知。其中包括優選的交聯劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可從Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)獲得的其它交聯劑，其含有一個對氨基有反應性的官能團和一個對半胱氨酸殘基有反應性的官能團。上述交聯劑均導致硫醚鍵的形成。適用於實施本發明的另一類交聯劑的特徵在於偶聯時在MelanA肽類似物與VLP之間引入二硫鍵。屬於這一類的優選交聯劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交聯劑衍化VLP的程度可受不同實驗條件的影響，如反應雙方各自的濃度、一種試劑相對於另一種的過量、pH、溫度和離子強度。偶聯程度，即每個VLP亞單位上抗原或抗原決定簇的量，可通過改變上述實驗條件來調節，以滿足疫苗的要求。
抗原或抗原決定簇與VLP的一種特別有利的結合方法是VLP表面的賴氨酸殘基與本發明的MelanA肽類似物上的半胱氨酸殘基連接。在某些實施方案中，含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點或作為其一部分的胺基酸接頭與本發明的MelanA肽類似物的融合、偶聯、附著或結合，可能是與VLP偶聯所必需的。含有所述胺基酸接頭的這些構建體也可以利用本領域公知的簡單肽合成方法獲得。
因此，在本發明的一個進一步優選的實施方案中，抗原或抗原決定簇進一步包含胺基酸接頭，其中優選地該胺基酸接頭包含或由第二附著位點組成。
柔性的胺基酸接頭通常是有利的。胺基酸接頭的例子選自(a)CGG；(b)N-端γ1-接頭；(c)N-端γ3-接頭；(d)Ig鉸鏈區；(e)N-端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO62)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ1-接頭；(m)C-端γ3-接頭；(n)C-端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(SEQ ID NO63)。
胺基酸接頭的其它實例包括免疫球蛋白的鉸鏈區、甘氨酸絲氨酸接頭(GGGGS)n(SEQ ID NO64)和甘氨酸接頭(G)n，它們均還含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點，並且可選地含有另外的甘氨酸殘基。這類胺基酸接頭的典型優選實例是N-端γ1CGDKTHTSPP(SEQ IDNO65)；C-端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO66)；N-端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO67)；C-端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO68)；N-端甘氨酸接頭GCGGGG(SEQ ID NO69)；C-端甘氨酸接頭GGGGCG(SEQ ID NO70)；C-端甘氨酸-賴氨酸接頭GGKKGC(SEQ ID NO71)；N-端甘氨酸-賴氨酸接頭CGKKGG(SEQ ID NO72)。
當疏水性抗原或抗原決定簇與VLP結合時，特別適於本發明實施的其它胺基酸接頭有作為N-端接頭的CGKKGG(SEQ ID NO73)或CGDEGG(SEQ ID NO74)，或者作為C-端接頭的GGKKGC(SEQID NO75)和GGEDGC(SEQ ID NO76)。對於C-端接頭，末端半胱氨酸可選地被C端醯胺化。
可用於本發明的其它接頭有允許從VLP上釋放抗原性肽，即人黑素瘤MelanA肽類似物的胺基酸序列。這些接頭的實例在Toes RE etal.J Exp Med.2001 Jul 2；194(1)1-12中有描述。而且，可以使用用於蛋白酶體切割的PAProC-a預測算法(Nussbaum AK，et al.Immunogenetics.2001 Mar；53(2)87-94)來預測上述允許從VLP上釋放抗原性肽，即人黑素瘤MelanA肽類似物的胺基酸序列。
在本發明的優選實施方案中，優選肽C-端的GGCG(SEQ ID NO77)、GGC或GGC-NH2(「NH2」表示醯胺化)接頭或肽N-端的CGG作為胺基酸接頭。甘氨酸殘基通常插入大胺基酸與作為第二附著位點的半胱氨酸之間，以避免較大胺基酸在偶聯反應中的可能的空間位阻。在本發明的最優選的實施方案中，胺基酸接頭GGC-NH2與本發明的MelanA肽類似物的C-端融合。
添加到本發明的MelanA肽類似物上的半胱氨酸殘基必須是還原狀態，才能與活化的VLP上的異雙功能交聯劑反應，即必須有游離半胱氨酸或含有游離巰基的半胱氨酸殘基。當作為結合位點的半胱氨酸殘基是氧化形式時，例如，如果它形成二硫鍵，則需要用例如DTT、TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。如WO 02/05690所述，低濃度還原劑適於偶聯，技術人員應當知道，較高濃度還原劑抑制偶聯反應，在這種情況下必須在偶聯前除去還原劑，或者降低其濃度，例如通過透析、凝膠過濾或反相HPLC。
根據上述優選方法，利用異雙功能交聯劑使本發明的MelanA肽類似物與VLP結合，可使本發明的MelanA肽類似物與VLP以定向方式偶聯。本發明的MelanA肽類似物與VLP結合的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS將本發明的MelanA肽類似物與VLP交聯的方法。另外一些方法使用同雙功能交聯劑，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或含有對VLP的胺基或羧基具有反應性的官能團的其它公知的同雙功能交聯劑，將本發明的MelanA肽類似物附著於VLP。
VLP與本發明的MelanA肽類似物結合的其它方法包括將VLP生物素化、並且將本發明的MelanA肽類似物表達為鏈親和素-融合蛋白的方法，或本發明的MelanA肽類似物和VLP均被生物素化的方法，如WO 00/23955所述。在這種情況下，可以通過調節本發明的MelanA肽類似物與鏈親和素的比例，首先使本發明的MelanA肽類似物與鏈親和素或親和素結合，並且使得仍有自由結合位點可與下一步添加的VLP結合。或者，所有成分也可以混合在「一鍋」反應中。存在受體和配體的可溶形式、並且能夠與VLP或本發明的MelanA肽類似物交聯的其它配體-受體對也可以用作結合本發明的MelanA肽類似物與VLP的結合劑。或者，配體或受體可以與本發明的MelanA肽類似物融合，從而介導與分別化學結合或融合於該受體或配體的VLP的結合。也可以通過插入或置換實現融合。
如前所述，在本發明的一個優選實施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP，在一個更優選的實施方案中，VLP是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP。
如果空間上允許，一個或幾個抗原分子，即一個或幾個抗原或抗原決定簇，能夠附著於RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼或VLP的一個亞單位上，優選地通過RNA噬菌體VLP的暴露賴氨酸殘基附著。RNA噬菌體外殼蛋白的VLP，特別是Qβ外殼蛋白VLP的一個特殊特徵是每個亞單位能夠偶聯幾個抗原。這能夠產生密集的抗原陣列。
在本發明的一個優選實施方案中，所述至少一種本發明的MelanA肽類似物與病毒樣顆粒的結合和附著分別是通過病毒樣顆粒的至少一個第一附著位點與本發明的MelanA肽類似物的至少一個第二附著位點之間的相互作用和連接實現的。
Qβ外殼蛋白的VLP或衣殼在其表面展示數量確定的賴氨酸殘基，具有確定的拓撲學，有3個賴氨酸殘基指向衣殼內部，並與RNA相互作用，另外4個賴氨酸殘基暴露於衣殼外面。這些明確的特性有利於抗原附著於顆粒外部，而不是賴氨酸殘基與RNA相互作用的顆粒內部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的VLP在其表面也有數量確定的賴氨酸殘基，這些賴氨酸殘基有確定的拓撲學。
在本發明的進一步優選的實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，並且/或者第二附著位點包含巰基或半胱氨酸殘基。在本發明的一個非常優選的實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，並且第二附著位點是半胱氨酸殘基。
在本發明的一個非常優選的實施方案中，本發明的MelanA肽類似物通過半胱氨酸殘基與RNA噬菌體外殼蛋白VLP的賴氨酸殘基結合，特別是與Qβ外殼蛋白的VLP結合。
來源於RNA噬菌體的VLP的另一個優點是它們在細菌中的高表達量，這允許以較低的成本生產大量的物質。
如上所述，本發明的偶聯物和陣列分別與現有技術中偶聯物的不同在於高度組織化的結構、大小以及抗原在陣列表面上的重複性。而且，用VLP作為載體可以分別形成具有不同抗原密度的龐大的抗原陣列和偶聯物。特別是，使用RNA噬菌體的VLP，尤其是使用RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP，能夠獲得極高的表位密度。具體而言，將肽(例如WO2004/016282所述的人Aβ1-6肽)與Qβ外殼蛋白的VLP偶聯，能夠獲得每個亞單位1.5個以上表位的密度。具有高表位密度的RNA噬菌體外殼蛋白VLP組合物的製備可以根據本申請的教導來實現。在本發明的優選實施方案中，當本發明的MelanA肽類似物與Qβ外殼蛋白的VLP偶聯時，每個亞單位上本發明的MelanA肽類似物的平均數量為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高是優選的。
如此處定義的第二附著位點可以是本發明的MelanA肽類似物天然存在或非天然存在的。如果本發明的MelanA肽類似物上沒有合適的天然存在的第二附著位點，則必須為該抗原構建非天然的第二附著位點。
如上所述，有4個賴氨酸殘基暴露於Qβ外殼蛋白的VLP表面。這些殘基一般在與交聯劑分子反應時被衍化。如果不是所有的暴露賴氨酸殘基都能與抗原偶聯，則已經與交聯劑反應的賴氨酸殘基在衍化步驟後ε-氨基連接交聯劑分子。這使得一個或幾個正電荷丟失，這可能不利於VLP的可溶性和穩定性。通過用精氨酸代替一些賴氨酸殘基，如在下文所述的Qβ外殼蛋白突變體中的那樣，我們防止了正電荷的過多丟失，因為精氨酸殘基不與交聯劑反應。而且，用精氨酸置換賴氨酸殘基可產生更明確的抗原陣列，因為有更少的位點可以與抗原反應。
因此，在本申請公開的下列Qβ外殼蛋白突變體和突變QβVLP中，用精氨酸替換了暴露的賴氨酸殘基Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ IDNO20)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO22)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO24)。克隆了這些構建體，表達了蛋白質，純化了VLP，並用於與本發明的MelanA肽類似物偶聯。也構建了Qβ-251(SEQ ID NO23)，在本申請中能夠找到如何表達、純化和偶聯Qβ-251外殼蛋白VLP的指南。
在另一個實施方案中，我們公開了含有一個額外賴氨酸殘基的Qβ突變外殼蛋白，它適用於獲得更高密度的抗原陣列。克隆該突變Qβ外殼蛋白Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO21)，表達蛋白質，分離並純化衣殼或VLP，表明該額外賴氨酸殘基的引入與亞單位自裝配為衣殼或VLP相容。因此，可以用Qβ外殼蛋白突變體的VLP分別製備MelanA肽類似物陣列和偶聯物。抗原與VLP、特別是與RNA噬菌體外殼蛋白VLP附著的一種特別優選的方法是將RNA噬菌體外殼蛋白VLP表面的賴氨酸殘基與添加於抗原中的半胱氨酸殘基連接。為了使半胱氨酸殘基能夠有效地作為第二附著位點，必須有一個巰基能用來偶聯。因此，半胱氨酸殘基必須是還原狀態，即，必須有游離半胱氨酸或含有游離巰基的半胱氨酸殘基。如果作為第二附著位點的半胱氨酸殘基是氧化形式，例如，如果它形成二硫鍵，則需要使用如DTT、TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。必須為每種抗原調節還原劑的濃度和還原劑超過抗原的摩爾數。必要時需要檢測滴定範圍，從低至10μM或更低到可達10-20mM或更高的還原劑濃度，並評價抗原與載體的偶聯。儘管如WO 02/056905所述，低濃度還原劑適於偶聯反應，較高濃度抑制偶聯反應，但是本領域技術人員應當知道，在這種情況下必須除去還原劑或降低其濃度，例如通過透析、凝膠過濾或反相HPLC來實現。有利地，透析或平衡緩衝液的pH低於7，優選6。必須檢測低pH緩衝液與抗原活性或穩定性的相容性。
通過選擇交聯劑和其它反應條件，能夠調節RNA噬菌體外殼蛋白VLP上的表位密度。例如，交聯劑Sulfo-GMBS和SMPH一般能夠獲得高表位密度。高濃度反應物正面影響衍生化，可以通過控制反應條件來控制與RNA噬菌體外殼蛋白VLP偶聯、特別是與Qβ外殼蛋白VLP偶聯的抗原數量。
在設計非天然的第二附著位點之前，必須選擇融合、插入或通常構建的位置。第二附著位點的位置選擇例如可以以抗原的晶體結構為基礎。抗原的這種晶體結構可以提供關於分子C端或N端的可用性(例如取決於它們的溶劑可及性)或關於適於作為第二附著位點的殘基(如半胱氨酸殘基)暴露於溶劑的信息。如Fab片段那樣，暴露的二硫鍵也可以是第二附著位點的來源，因為通過用例如2-巰基乙胺、TCEP、β-巰基乙醇或DTT溫和還原，通常可以將它們轉化為單個半胱氨酸殘基。選擇不影響抗原免疫原性的溫和還原條件。如果用自身抗原免疫旨在抑制該自身抗原與其天然配體的相互作用，通常添加第二附著位點以產生針對與天然配體相互作用的位點的抗體。因此，第二附著位點的位置選擇要避免第二附著位點或含有它的任何胺基酸接頭引起的空間位阻。在其它一些實施方案中，希望有針對一個位點的抗體應答，該位點不同於自身抗原與其天然配體的相互作用位點。在這些實施方案中，可選擇第二附著位點，以防止產生針對自身抗原與其天然配體的相互作用位點的抗體。
選擇第二附著位點位置的其它標準包括抗原的寡聚狀態，寡聚位點，輔因子的存在，以及揭示抗原結構和序列中位點的實驗證據的可獲得性，在該位點對該抗原的修飾與自身抗原的功能相容，或者適於產生可識別自身抗原的抗體。
在非常優選的實施方案中，本發明的MelanA肽類似物包含添加的單一的第二附著位點或單一的反應性附著位點，該位點分別能夠與核心顆粒和VLP或VLP亞單位上的第一附著位點連接。這進一步確保至少有一個、但一般是一個以上、優選超過10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450個本發明的MelanA肽類似物分別與核心顆粒和VLP明確且均一地結合和連接。因此，抗原上含有單一的第二附著位點或單一的反應性附著位點確保了類型單一且均勻的結合和連接，分別產生高度有序且重複的陣列。例如，如果分別通過賴氨酸-(作為第一附著位點)和半胱氨酸-(作為第二附著位點)相互作用來實現結合和連接，根據本發明的這一優選實施方案，確保了每個抗原只有一個半胱氨酸殘基能夠分別與VLP和核心顆粒的第一附著位點結合和連接，而無論該半胱氨酸殘基是抗原上天然存在的還是非天然存在的。
在某些實施方案中，向本發明的MelanA肽類似物上構建第二附著位點需要根據本發明的公開內容融合含有適於作為第二附著位點的胺基酸的胺基酸接頭。因此，在本發明的一個優選實施方案中，胺基酸接頭通過至少一個共價鍵與本發明的MelanA肽類似物結合。優選地，該胺基酸接頭包含或由第二附著位點組成。在一個進一步優選的實施方案中，胺基酸接頭包含巰基或半胱氨酸殘基。在另一個優選實施方案中，該胺基酸接頭是半胱氨酸。一些選擇胺基酸接頭的標準以及根據本發明的胺基酸接頭的進一步優選實施方案在上文中已經提及。
在本發明的另一個具體實施方案中，附著位點選擇為與HBcAg框內融合的賴氨酸或半胱氨酸殘基。在一個優選實施方案中，抗原通過三亮氨酸接頭與HBcAg的C端融合。
當抗原或抗原決定簇通過賴氨酸殘基與VLP連接時，有利的是置換或刪除一個或多個天然存在的賴氨酸殘基，以及HBcAg變體中存在的其它賴氨酸殘基。
在許多情況下，當天然存在的賴氨酸殘基被去除時，向HBcAg內引入另一個賴氨酸作為抗原或抗原決定簇的附著位點。插入賴氨酸殘基的方法在本領域公知。也可以在不除去已有賴氨酸殘基的情況下添加賴氨酸殘基。
已經證明HBcAg的C端可引導該蛋白質的核定位(Eckhardt，et al.，J.Virol.65575-582(1991))。而且也認為該蛋白質的這一區域使HBcAg具有結合核酸的能力。
如上所述，適於在本發明的實施中使用的HBcAg還包括N端截短突變體。合適的截短突變體包括已經從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸的修飾HBcAg。然而，在組成病毒樣顆粒的亞單位序列內含有內部缺失的病毒樣顆粒變體也適用於本發明，只要它們與病毒樣顆粒的有序或顆粒狀結構相容。例如，HBcAg序列內的內部缺失是適宜的(Preikschat，P.，et al.，J.Gen.Virol.801777-1788(1999))。
適於在本發明的實施中使用的其它HBcAg包括N端和C端截短突變體。合適的截短突變體包括已經從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15和17個胺基酸、並從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48個胺基酸的HBcAg。
本發明的疫苗組合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由胺基酸序列不同的多種HBcAg組成。例如，可以製備包含「野生型」HBcAg和其中一個或多個胺基酸殘基已經改變(例如缺失、插入或置換)的修飾HBcAg的疫苗組合物。然而在大多數應用中，只使用一種類型的HBcAg。
在一個優選實施方案中，病毒樣顆粒包含至少一個第一附著位點，且抗原或抗原決定簇包含至少一個第二附著位點。優選地，該第一附著位點包含或優選由氨基或賴氨酸殘基組成。該第二附著位點優選選自(a)所述抗原或抗原決定簇中非天然存在的附著位點；和(b)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點。再更優選地，該第二附著位點包含或者優選地由巰基或半胱氨酸殘基組成。在一個優選實施方案中，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒的結合是通過第一附著位點和第二附著位點的連接實現的，其中優選地這種連接是通過至少一個非肽鍵實現的，並且其中優選地，抗原或抗原決定簇和病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重複的抗原陣列。在一個實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，第二附著位點是半胱氨酸殘基。在另一個實施方案中，第一附著位點是氨基，第二附著位點是巰基。
在本發明的一個具體實施方案中，抗原，在此特別指黑素瘤MelanA肽類似物，包含一種或多種細胞毒性T細胞表位、Th細胞表位或這兩種表位的組合。因此，在一個實施方案中，抗原或抗原決定簇包含一種、兩種或多種細胞毒性T細胞表位。在另一個實施方案中，抗原或抗原決定簇包含一種、兩種或多種Th細胞表位。在另一個實施方案中，抗原或抗原決定簇包含一種、兩種或多種細胞毒性T細胞表位和一種、兩種或多種Th細胞表位。
天然MelanA/Mart-1表位，例如MelanA/Mart-126-35表位，只與人HLA-2低親和力結合。因此，接種後天然MelanA表位和肽的分別體內呈遞可能是一個限制因素。如果分別與VLP結合、偶聯或融合的Melan A表位和肽用於接種，這特別重要，因為在這些條件下，MelanA肽通過交叉呈遞攜帶HLA分子。但是，交叉呈遞的過程不象傳統抗原呈遞途徑那樣有效，MelanA肽對HLA的親和力甚至更重要。因此，對於基於VLP的接種，非常優選地是使用可與HLA相對高親和力結合的MelanA肽類似物。同樣，使用可被宿主的天然T細胞所有組成成分(repertoire)以較高親和力識別的MelanA肽類似物也可能是有利的。一般來說，在適當位點含有錨定殘基從而允許與MHC分子有效結合的MelanA表位和肽類似物分別是優選的。
因此，本發明的另一個方面和本發明的一個非常優選的實施方案提供一種增強動物中免疫應答的組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；和(b)免疫刺激物，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述組合物進一步包含至少一種抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，並且其中至少一種抗原或抗原決定簇包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，並且其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物與所述病毒樣顆粒結合。
在本發明的一個優選實施方案中，MelanA肽類似物能夠允許與MHC分子有效結合。因此，MelanA肽類似物的使用特別能夠允許引入這種導致改善與MHC分子結合的錨定殘基。如果天然和正常的MelanA肽類似物分別不含這種錨定殘基，或者只是不含次於新引入的錨定殘基的錨定殘基，以分別代替天然和正常的錨定殘基，引入導致改善與MHC分子結合的錨定殘基是特別有利的。
產生MelanA肽類似物的正常人MelanA肽的修飾，優選這些錨定殘基的引入，如下實現(i)誘導突變(例如化學誘導、照射或本領域技術人員公知的其它方法)，然後篩選與MHC的結合改善的修飾肽，或者(ii)篩選與MHC的結合改善的修飾肽，這種改善是由於在蛋白質合成的任何水平上發生的天然突變引起的，包括但不限於在蛋白質表達的DNA、轉錄、RNA或翻譯水平上發生的突變，或者(iii)使用本領域技術人員公知的經典的肽合成法，進行系統或隨機胺基酸交換、缺失、置換或插入。這些錨定殘基的鑑定一般且優選地使用如Rammensee et al.in Immunogenetics 50213-219(1999)所述的SYFPEITHI資料庫來實現。SYFPEITHI資料庫允許計算選擇的任何肽的HLA結合效率，並且能夠利用該程序在HLA結合效率方面對肽進行優化。此外，優選肽類似物的鑑定也能夠通過MHC-肽結合測定來實現，包括但不限於突變細胞系中T細胞活化或識別或MHC上調的全細胞測定，MHC-四聚體-肽結合測定，使用標記肽的競爭性結合測定，表面等離共振測定，這些都是本領域技術人員公知的。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，MelanA肽類似物的特徵在於相對於相應的正常MelanA肽有兩個，更優選一個胺基酸置換。
在本發明的另一個優選實施方案中，MelanA肽類似物受到保護而免遭蛋白酶或肽酶介導的降解。使用受到保護而免遭蛋白酶或肽酶降解的MelanA肽類似物導致在對患者施用該肽後肽的體內穩定性提高，並且/或者在存在蛋白酶或肽酶的貯存過程中肽的穩定性提高。這種穩定性提高的後果是人黑素瘤MelanA肽類似物在MHC上更有效的、延長的呈遞，從而提高特異性T細胞應答的刺激。
優選地，通過將選擇的天然人MelanA肽的胺基酸殘基置換為如Blanchet et al，J.Immunol.1675852-5861(2001)和此處引用的參考文獻所舉例說明的非天然胺基酸衍生物，保護人MelanA肽類似物。這克服了通常由於以下事實造成的限制分別與天然和正常的MelanA肽相比，化學修飾的MelanA肽和MelanA肽類似物可能不被T細胞同樣好地識別。
在另一個優選實施方案中，所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物組成，該肽類似物具有選自但不限於下列的胺基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)，(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)，(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)，(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)，(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)，(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)，(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)，(h)GHGHSYTTAE ELAGIGILTV(SEQ ID NO51)，(i)SYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO52)，和(j)ELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO53)。在一個非常優選的實施方案中，所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物組成，該肽類似物具有選自但不限於下列的胺基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)，(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)，(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)，(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)，(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)，(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)，和(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)。這些肽類似物以及它們的合成已經被Valmori at al.，J.Immunol.1601750-1758(1998)描述。這些肽類似物顯示被針對天然黑素瘤肽的5個不同細胞毒性T細胞克隆的相對識別和靶細胞裂解提高。
在本發明的一個非常優選的實施方案中，人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)組成。如整個實施例部分所述，這一非常優選的實施方案在HLA-A2轉基因小鼠中誘導功能性MelanA-特異性CD8+T細胞的擴增，代表HLA-結合與TCR-識別之間良好的折衷(參見Valmori at al.，J.Immunol.1601750-1758(1998))。
在本發明的一個進一步優選的實施方案中，帶有第二附著位點的人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有選自但不限於下列的胺基酸序列(a)CGHGHSYTTAE EAAGIGILTV(SEQ ID NO54)；在此一般縮寫為16-35，(b)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；在此一般縮寫為MelanA 16-35A/L)，(c)CGGEAAGIGILTV(SEQ IDNO56)；在此一般縮寫為MelanA 26-35，(d)CGGELAGIGILTV(SEQID NO57)；在此一般縮寫為MelanA 26-35A/L)，(e)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO58)；在此一般縮寫為MelanA 20-40A/L)，(f)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；在此一般縮寫為MelamA 26-40A/L)，(g)ELAGIGILTVGGC(SEQ IDNO60)；在此一般縮寫為MelanA 26-35-C A/L)，(h)CSPKSLELAGIGILTV(SEQ ID NO92)；在此一般縮寫為CSPKSL-MelanA 26-35A/L；和(i)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQ IDNO93)；在此一般縮寫為MelanA 26-40-C A/L。在本發明的一個非常優選的實施方案中，帶有第二附著位點的人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有選自下列的胺基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；在此一般縮寫為MelanA 16-35A/L)，(b)CGGELAGIGILTV(SEQ ID NO57)；在此一般縮寫為MelanA 26-35A/L)，(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQID NO58)；在此一般縮寫為MelanA 20-40A/L)，(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；在此一般縮寫為MelanA26-40A/L)，(e)ELAGIGILTVGGC(SEQ ID NO60)；在此一般縮寫為MelanA 26-35-C A/L)。
在本發明的另一個非常優選的實施方案中，帶有第二附著位點的人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有胺基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)(MelanA 16-35A/L)。如實施例21所述，含有這種非常優選的實施方案的本發明的疫苗組合物，即QβMelanA 16-35A/L疫苗，被樹突細胞加工。
在本發明的另一個實施方案中，與病毒樣顆粒偶聯、融合或以其它方式附著的本發明的MelanA肽類似物是T細胞表位，該表位是細胞毒性的或是Th細胞表位。在一個進一步優選的實施方案中，所述抗原是至少兩種相似或不同的、優選不同的表位的組合，其中所述至少兩種表位直接連接或通過連接序列連接。這些表位優選地選自對於黑素瘤所述的細胞毒性和Th細胞表位(gp100、酪氨酸酶、MAGE家族或NY-ESO-1)。
因此，在本發明的一個進一步優選的實施方案中，所述抗原包含或進一步包含細胞毒性T細胞表位、Th細胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接結合或者通過連接序列結合，並且其中優選地所述細胞毒性T細胞表位是病毒或腫瘤細胞毒性T細胞表位。
優選的細胞毒性T細胞表位有MelanA表位(16-36 A/L)(25-36A/L)；酪氨酸酶表位(1-9)和(368-376)(Panelli，M.C.et al.，J.Immunol.，2000，164，495-504)；Gp100表位(154-162)，(209-217(T210M))，(280-288)和(280-288(A288V))和(457-466)(Nielsen，M.B.et al.，2000.J Immunol.，164(4).，2287-96和Linette，G P.et al.J Immunol，2000，164，3402-3412和Skipper，J.C.，Int.J.Cancer，1999，82，669-677和Pass，H.A.，et al.，Cancer J Sci Am.，1998，4，316-323)；TRP2表位(180-188)(288-296)(455-463)(Sun，Y.et al.，Int.J Cancer，2000，87(3)，399-404和Parkhurst，M.R.et al.，Cancer Res.，1998，58，4895-8901和Harada，M.，et al.，Cancer Res.，2001，61，1089-1094))；NY-ESO-1表位157-165(Chen，J.L.，et al.，J.Immunol，2000，165，948-955)；和MAGE-A表位(248V9)(Graff-Dubois，S.，et al.，2002，J.Immunol，169，575-580)。
一個優選的細胞毒性T細胞表位組合是組合(25-36A/L)，酪氨酸酶(368-376)，Gp100(209-217(T210M))和(457-466)，和NY-ESO-1(157-165)。
優選的Th細胞表位有Mage-3表位(281-295)，(141-155)和(146-160)(Kobayashi，H.，et al.，Cabcer Res.，2001，61，4773-4778)；酪氨酸酶表位(188-208)，(193-203)(Kobayashi H.，et al.，Immunogenetics，1998，47，398-403)；GP 100表位(44-59)；和NY-ESO-1表位(115-132)，(121-138)，(139-156)，(119-143)和(134-148)(Zarour，H.M.，et al.，Cancer Res.，2002，62，213-218)。
優選的細胞毒性和Th細胞表位的組合有MelanA表位(1-118A/L)(SEQ ID NO94)；NY-ESO-1表位115-165；或MelanA(25-36A7L)、gp100(209-217(T210M)、Mage-3(146-160)和gap100(44-59)的組合。
同樣應當理解，本發明範圍內也包括鑲嵌病毒樣顆粒，例如由分別與不同抗原和表位附著的亞單位組成的病毒樣顆粒。本發明的這種組合物可以如下獲得例如，用兩種相容的質粒轉化大腸桿菌，這兩種質粒分別編碼與不同抗原和表位融合的組成病毒樣顆粒的亞單位。在此情況中，鑲嵌病毒樣顆粒在細胞中直接裝配或者在細胞裂解後裝配。而且，通過將不同抗原和表位的混合物與分離的病毒樣顆粒附著，也可以獲得本發明的這種組合物。
本發明的MelanA肽類似物，特別是所述表位，可以被合成或重組表達，並且與病毒樣顆粒偶聯，或利用重組DNA技術與病毒樣顆粒融合。抗原與病毒樣顆粒附著的典型方法公開在WO 00/32227、WO 01/85208和WO 02/056905中，其公開內容在此完整地引用作為參考。
本發明也提供一種製備用於增強動物中免疫應答的組合物的方法，該組合物包含VLP和與VLP結合的免疫刺激物、優選含非甲基化CpG的寡核苷酸，該方法包括將VLP分別與免疫刺激物和寡核苷酸孵育，添加RNase，並純化該組合物。優選地，該方法進一步包括抗原或抗原決定簇與該病毒樣顆粒結合的步驟，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在一個優選實施方案中，在病毒樣顆粒與免疫刺激物孵育之前，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合。在另一個優選實施方案中，在純化該組合物後，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合。在一個同樣優選的實施方案中，該方法包括將VLP與RNase一起孵育，分別添加免疫刺激物和寡核苷酸，並純化該組合物。優選地，該方法進一步包括結合抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒的步驟，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在一個優選實施方案中，在病毒樣顆粒與RNase孵育之前，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合。在另一個優選實施方案中，在純化該組合物後，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合。在一個實施方案中，VLP在細菌表達系統中產生。在另一個實施方案中，RNase是RNase A。
本發明進一步提供一種製備用於增強動物中免疫應答的組合物的方法，該組合物包含與免疫刺激物、優選與含非甲基化CpG的寡核苷酸結合的VLP，該方法包括解裝配VLP，分別添加免疫刺激物和寡核苷酸，以及重裝配VLP。該方法可進一步包括除去解裝配的VLP的核酸，以及/或者在重裝配後純化該組合物。優選地，該方法進一步包括將抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合的步驟，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在一個優選實施方案中，在解裝配病毒樣顆粒之前，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合。在另一個優選實施方案中，在重裝配病毒樣顆粒之後，優選地在純化該組合物之後，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合。
本發明也提供可用於預防和/或緩解疾病或狀況的疫苗組合物。本發明的疫苗組合物包含、或者由免疫有效量的本發明的免疫增強組合物以及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑組成。該疫苗可選地也可含有佐劑。
因此，在一個優選實施方案中，本發明提供一種疫苗，該疫苗包含免疫有效量的本發明的免疫應答增強組合物，以及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，其中該組合物含有(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中該抗原或抗原決定簇與該病毒樣顆粒結合，並且其中該免疫刺激物與該病毒樣顆粒結合，並且其中該抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。優選地，該疫苗進一步含有佐劑。
本發明還提供用來預防和/或緩解動物疾病或狀況的接種方法。在一個實施方案中，本發明提供用於預防多種動物物種，特別是哺乳動物，如人、猴、牛、狗、貓、馬、豬等，優選人的癌症的疫苗。該疫苗可以設計為治療所有類型的癌症，優選黑素瘤。
眾所周知，使用蛋白質或病毒進行的同源引發-加強(prime-boost)接種策略大多數通常是不成功的。先前存在的抗體在重新遇到抗原時，被認為幹擾記憶應答的誘導。令我們吃驚的是，在同源引發-加強接種程序中，RNA噬菌體來源的VLP，特別是來源於Qβ的VLP，非常有效地誘導記憶CD8+T細胞應答。相反，如實施例26所述，活痘苗病毒免疫在誘導初次CD8+T細胞應答方面無效，而用牛痘進行同源加強幾乎不引起記憶CD8+T細胞的擴增。
因此，在另一方面，本發明提供一種免疫或治療動物的方法，該方法包括通過施用免疫有效量的本發明的疫苗而在動物中引發T細胞應答。優選地，該方法進一步包括加強動物中的免疫應答的步驟，其中優選地這種加強是通過施用免疫有效量的本發明的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現的，其中更優選地，所述異種疫苗是DNA疫苗、肽疫苗、重組病毒或樹突細胞疫苗。
另外，在另一方面，本發明進一步提供一種免疫或治療動物的方法，該方法包括在動物中引發T細胞應答以及加強動物中的T細胞應答的步驟，其中這種加強是通過施用免疫有效量的本發明的疫苗來實現的。優選地，這種引發是通過施用免疫有效量的本發明的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現的，其中更優選地，所述異種疫苗是DNA疫苗、肽疫苗、重組病毒或樹突細胞疫苗。
而且，在另一方面，本發明進一步提供一種組合物，該組合物含有病毒樣顆粒、至少一種免疫刺激物和至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原包含細胞毒性T細胞表位、Th細胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接結合或者通過連接序列結合，並且其中優選地所述細胞毒性T細胞表位是病毒或腫瘤細胞毒性T細胞表位。
在另一方面，本發明提供一種通常且優選地用於增強動物中的免疫應答的組合物，該組合物含有(a)病毒樣顆粒；(b)免疫刺激物；其中該免疫刺激物(b)與該病毒樣顆粒(a)結合；和(c)抗原，其中該抗原與所述病毒樣顆粒(a)混合，並且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。如此處所用的術語「混合」是指一起添加的兩種或多種物質、成分或組分的組合，它們彼此不是化學結合，並且能夠分開。混合抗原與病毒樣顆粒的方法在WO 04/000351中有描述，該專利在此全文引用作為參考。
本領域技術人員應當理解，當對動物施用本發明的組合物時，該組合物中可以含有鹽、緩衝劑、佐劑或希望用來提高組合物效力的其它物質。在大量資料中提供了適於製備藥物組合物的材料的實例，包括Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack PublishingCo.，(1990))。
根據宿主物種的不同，可以用不同佐劑來增強免疫應答，包括但不限於弗氏(完全及不完全)佐劑，無機凝膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂，多聚醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油狀乳劑、匙孔戚血藍蛋白、二硝基酚，以及可能用於人的佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。這些佐劑是本領域公知的。可與本發明的組合物一起施用的其它佐劑包括但不限於單磷酸脂免疫調節劑、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、鋁鹽、MF-59和病毒體佐劑技術。佐劑也可包括這些物質的混合物。
如果接受個體能夠耐受本發明的組合物的施用，則稱該組合物是「藥理學可接受的」。而且，本發明的組合物以「治療有效量」施用(即產生希望的生理學效果的量)。
本發明的組合物可以通過本領域公知的多種方法施用。選擇的具體方式當然取決於所選擇的具體組合物、所治療疾病的嚴重程度和達到治療效果所需的劑量。一般來說，本發明的方法可以用醫學上可接受的任何給藥方式實施，即，產生有效水平的活性化合物而不會引起臨床上不可接受的副作用的任何方式。這些給藥方式包括口服、直腸、腸胃外、腦池內、陰道內、腹膜內、局部(通過粉末、軟膏、液滴或透皮帖劑)、面頰或口或鼻噴霧。如此處使用的術語「腸胃外」是指包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下和關節內注射和輸液在內的給藥方式。本發明的組合物也可以直接注射到淋巴結中。
用於給藥的組合物成分包括無菌水(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和注射用有機酯如油酸乙酯。可以利用載體或封閉性包衣來提高皮膚通透性並提高抗原吸收。
聯合給藥可以同時(例如作為混合物，或分開但同時或共同給藥)或相繼施用。這包括組合藥劑作為治療混合物一起施用的形式，以及組合藥劑分開但同時施用的方法，例如通過不同的靜脈輸入同一個體中。「聯合」給藥還包括先給予這些化合物或藥劑之一，隨後再給予第二種。
劑量水平取決於給藥方式、患者狀況和載體/佐劑製劑的質量。典型用量為每名患者約0.1μg至約20mg。優選的量是每名患者至少約1μg至約1mg，更優選至少約10μg至約400μg。優選多次給藥以對患者進行免疫，給藥方案是本領域中適合所述患者的標準方案。
該組合物可以方便地製成單位劑量形式，可以按製藥領域公知的任何方法製備。這些方法包括將本發明的組合物與構成一種或多種輔助成分的載體相結合的步驟。這些組合物通常按如下製備將本發明的組合物均勻、密切地與一種液體載體、細碎的固體載體或這兩種載體混合，然後在必要時使產品成形。
適於口服的組合物可以是分散的單位形式，如膠囊、片劑或錠劑，每個單位含有預定量的本發明的組合物。其它形式的組合物包括在水溶液或非水液體中的懸液，如糖漿、酏劑或乳劑。
其它給藥系統包括定時釋放、延時釋放或緩釋給藥系統。這些系統可以避免重複施用上述本發明的組合物，從而大大方便了患者和醫生。有多種類型的釋放給藥系統可以應用，這些是本領域技術人員公知的。
本發明的其它實施方案包括製備本發明的組合物的方法，和利用所述組合物治療癌症和變態反應的方法。
通過下列實施例和所附權利要求書，本發明的其它方面和實施方案將是顯而易見的。
下列實施例只是說明性的，並非限制如所附權利要求書所限定的本發明的範圍。本領域技術人員應當理解，在不背離本發明的精神和範圍的情況下，可以對本發明的方法進行多種修改和變化。因此，本發明覆蓋對本發明的這些修改和變化，只要它們屬於所附權利要求及其等同物的範圍。
本文提到的所有專利和公開文獻均明確地完整引用作為參考。
實施例1p33-HBcAg VLP的產生SEQ ID NO15給出了含有來自LCMV的肽p33的HBcAg的DNA序列。p33-HBcAg VLP如下產生含有B型肝炎病毒完整病毒基因組的B型肝炎克隆pEco63購自ATCC。將編碼HBcAg的基因導入表達載體pkk223.3(Pharmacia)的EcoRI/HindIII限制酶切位點內，置於強tac啟動子的控制下。通過標準PCR方法，將來源於淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)的p33肽(KAVYNFATM)(SEQ ID NO80)與HBcAg的C端(1-185)通過一個三亮氨酸接頭融合。用該質粒轉染為了良好表達而選擇的大腸桿菌K802克隆，培養細胞，並將其重懸浮於5ml裂解緩衝液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA，0.25％ Tween-20，pH7.0)中。添加200μl溶菌酶溶液(20mg/ml)。超聲處理後，添加4μl Benzonase和10mM MgCl2，懸液在室溫下孵育30分鐘，在4℃下以15000rpm離心15分鐘，保留上清液。
然後，向上清液中添加20％(w/v)(0.2g/ml裂解液)硫酸銨。在冰上孵育30分鐘，並在4℃下以20,000rpm離心15分鐘後，棄去上清液，將沉澱重懸浮於2-3ml PBS中。將20ml PBS溶液上SephacrylS-400凝膠過濾柱(Amersham Pharmacia Biotechnology AG)，將級分加樣到SDS-PAGE凝膠上，合併含有純化p33-VLP衣殼的級分。將合併的級分上羥磷灰石柱。收集流出液(含有純化的p33-VLP衣殼)，並將其加樣到還原SDS-PAGE凝膠上進行單體分子量分析。電子顯微鏡檢查按照標準程序進行。
p33-VLP的結構通過電子顯微鏡檢查和SDS-PAGE來分析。將重組產生的HBcAg野生型VLP(由HBcAg[aa 1-185]單體組成)和p33-VLP上Sephacryl S-400凝膠過濾柱(Amersham PharmaciaBioteclmology AG)進行純化。合併的級分上羥磷灰石柱。收集流出液(含有純化的p33-VLP)，並將其加樣到還原SDS-PAGE凝膠上進行單體分子量分析。
在整個說明書中，術語p33-HBcAg VLP、HBcAg-p33 VLP、p33-VLP和HBc33可以互換使用。
實施例2GA VLP的克隆、表達和純化使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas)，通過反轉錄及隨後的PCR擴增步驟，從GA噬菌體中擴增GA噬菌體外殼蛋白的cDNA。該cDNA用NcoI和HindIII酶切，克隆到預先用相同的酶酶切的載體pQβ185中，產生帶有GA cDNA的質粒355.24。插入的cDNA的序列通過DNA測序來檢查。
用質粒355.24轉化大腸桿菌JM109。基本如對於QβVLP所述進行表達。用單菌落接種含20mg/L氨苄青黴素的LB培養基，在不振搖的情況下放置過夜。次日將該接種物轉移到含有添加了1％酪蛋白胺基酸、0.2％葡萄糖和20mg/L氨苄青黴素的M9培養基的較大搖瓶中，在振搖下孵育14-20小時。
GA VLP基本如對於QβVLP所述分離。裂解細胞，澄清後的裂解液上Sepharose CL-4B柱(Amersham Pharmacia)。洗脫液經硫酸銨沉澱濃縮，並上Sepharose CL-6B柱(Amersham Pharmacia)再次層析。最後一步是在蔗糖梯度(20-50％ w/v)或CsCl上超速離心。分離的VLP然後用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0透析。
實施例3螢光素標記的含CpG的寡核苷酸可被包裝於BKV、HBcAg和Qβ-VLP內在酵母中產生的VLP含有少量RNA，該RNA可被容易地消化，因此通過VLP與RNase A一起孵育而除去。高活性RNase A酶的分子量約為14kDa，它小得足以進入VLP，從而除去不需要的核糖核酸。重組產生的BKV VLP(SEQ ID NO12)在PBS緩衝液pH7.2中濃縮為1mg/ml，並且在存在或不存在RNase A(200μg/ml，RocheDiagnostics Ltd，Switzerland)的條件下37℃孵育3小時。在RNase A消化後，向BKV VLP中添加75nmol/ml 5′-螢光素標記的硫代磷酸CpG-FAM寡核苷酸(來自SEQ ID NO34的寡核苷酸)，並在37℃下孵育3小時。隨後BKV VLP在37℃下用DNaseI消化3小時(40u/mlAMPD1，Sigma，Divison of Fluka AG，Switzerland)，或者不經DNaseI消化即加樣。向樣品中加入6倍濃縮的DNA加樣緩衝液(10mM TrispH7.5，10％v/v甘油，0.4％橘黃G)，在65伏電壓下在0.8％非變性tris-乙酸pH7.5瓊脂糖凝膠中電泳1小時。用溴化乙錠染色後檢測核酸，而在不含溴化乙錠時，紫外線激發使CpG-FAM中的螢光素標記產生螢光。
BKV VLP(15μg)在對照孵育後或在RNase A消化並且隨後與雙鏈(ds)DNA(246bp)(SEQ ID NO17)孵育後，通過非變性0.8％瓊脂糖凝膠電泳經溴化乙錠或考馬斯藍染色進行分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1未處理的BKV VLP；2RNase A處理的BKV VLP；3RNase A處理並與dsDNA一起孵育的BKV VLP；泳道MGene Ruler1kb DNA分子量片段(MBI Fermentas GmbH，Heidelberg，Germany)。
BKV VLP(15μg)在對照孵育後或在RNase A消化並且隨後與CpG-寡核苷酸(含有磷酸或硫代磷酸酯(pt)骨架)孵育後，通過非變性0.8％瓊脂糖凝膠電泳經溴化乙錠或考馬斯藍染色進行分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1BKV VLP貯存液(PBS/50％甘油)；2未處理的BKV VLP(PBS緩衝液)；3RNase A處理的BKV VLP；4RNaseA處理的BKV VLP，透析後；5RNase A處理的與CpG-寡核苷酸孵育的BKV VLP；6RNase A處理的與CpG(pt)-寡聚體孵育的BKVVLP；7RNase A處理的與CpG(pt)-寡聚體孵育的BKV VLP，透析後；泳道MGene Ruler 1 kb DNA分子量片段(MBI Fermentas GmbH，Heidelberg，Germany)。
RNase A消化使VLP的遷移改變，這在考馬斯藍染色的瓊脂糖凝膠上可見，這可能是由於RNA缺乏負電荷所致。添加CpG-寡核苷酸恢復了BKV VLP的遷移，並且產生與未處理的VLP中存在的RNA帶同樣遷移的螢光帶。這清楚地表明，CpG-FAM寡核苷酸已經被包裝於VLP內。
實施例4大的雙鏈寡核苷酸可被包裝於BKV VLP內為了導入雙鏈(ds)核苷酸序列，向RNase A處理過的重組BKVVLP(實施例3)中添加50μg/ml(ds)DNA片段(長246bp，dsDNA，SEQID NO17)，並在37℃下孵育3小時。向樣品中加入6倍濃縮的DNA加樣緩衝液(10mM Tris pH8.0，10％v/v甘油，0.4％橘黃G)，在65伏電壓下在0.8％非變性tris-乙酸pH8.0瓊脂糖凝膠中電泳1小時。在對照孵育後或在RNase A消化並且隨後與(ds)DNA孵育後，將BKVVLP(15μg)加樣到非變性0.8％瓊脂糖凝膠電泳中，經溴化乙錠或考馬斯藍染色進行分析，以檢測RNA/DNA或蛋白質的存在。在溴化乙錠存在下，包裝的DNA分子顯現為與考馬斯藍顯色的VLP帶同樣遷移的一條帶。
添加(ds)DNA恢復了BKV VLP的遷移，並且產生與考馬斯藍染色的VLP同樣遷移的DNA帶。這清楚地表明，(ds)DNA已經被包裝於BKV VLP內。
實施例5含CpG的寡核苷酸能夠被包裝於BKV VLP內為了導入免疫刺激性CpG-寡核苷酸，向RNase A處理過的重組BKV VLP(實施例3)中添加150nmol/ml具有磷酸二酯骨架的CpG-寡核苷酸CyCpG或具有硫代磷酸酯骨架的CyCpGpt，並在37℃下孵育3小時。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalindustriesInc.，Houston，USA)，將用於免疫小鼠的VLP製劑用PBS pH7.2充分透析(10,000倍稀釋)24小時，以除去RNase A和過量的CpG-寡核苷酸。向樣品中加入6倍濃縮的DNA加樣緩衝液(10mM Tris pH7.5，10％ v/v甘油，0.4％橘黃G)，在65伏電壓下在0.8％非變性tris-乙酸pH7.5瓊脂糖凝膠中電泳1小時。在對照孵育後或在RNase A消化並且隨後與CpG-寡核苷酸(具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架)孵育後，將BKV VLP(15μg)加樣到非變性0.8％瓊脂糖凝膠電泳中，經溴化乙錠或考馬斯藍染色進行分析，以檢測RNA/DNA或蛋白質的存在，以及透析後未結合的CpG-寡核苷酸的減少。未結合的CpG-寡核苷酸顯現為一條低分子量溴化乙錠染色帶。添加CpG-寡核苷酸恢復了BKV VLP的遷移，並且產生與考馬斯藍染色的VLP同樣遷移的DNA帶。這清楚地表明，CpG-寡核苷酸已經被包裝於BKV VLP內。
實施例6含CpG-寡核苷酸(磷酸骨架上有硫代磷酸修飾)的VLP誘發增強的Th1指導的免疫應答雌性BALB/C小鼠(每組3隻小鼠)皮下注射10μg含硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt(SEQ ID NO34)的BKV VLP。對照小鼠皮下注射溶於200μl PBS pH7.2中的10μg單獨的RNase處理的BKV VLP或與0.3nmol或20nmol硫代磷酸CpG-寡核苷酸混合的BKV VLP，或者不予處理。BKV VLP如實施例5所述製備，並且在免疫之前通過透析從未結合的CpG-寡核苷酸中充分純化。免疫後第14天，採血，測定對BKV VLP的IgG1和IgG2a抗體應答(見表1)。
表1用BKV VLP和硫代磷酸(pt)CpG-寡核苷酸免疫後第14天，小鼠對BKV VLP的IgG1和IgG2a OD50％抗體滴度。
與用相同量(0.3nmol)的與BKV VLP混合的CpG-寡核苷酸或用單獨的BKV VLP免疫相比，用RNase A處理的含硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt的BKV VLP免疫導致IgG1滴度降低和抗BKV VLPIgG2a滴度增加。用與20nmol硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt混合的BKV VLP免疫的小鼠顯示極低的IgG1滴度和高IgG2a滴度。與對照相比，IgG1滴度降低且IgG2a滴度升高，說明包裝於BKV VLP中的硫代磷酸CpG-寡核苷酸誘發了Th1細胞指導的免疫應答。表1清楚地顯示，相比與CpG-寡核苷酸簡單混合的BKV VLP，含有包裝於顆粒內的CpG-寡核苷酸的BKV VLP具有更好的效果。
實施例7免疫刺激性核酸能夠被包裝於含有與抗原融合的融合蛋白的HBcAg VLP內HBcAg VLP當通過表達B型肝炎核心抗原融合蛋白p33-HBcAg(HBc33)(見實施例1)或與肽P1A融合的融合蛋白(HBcP1A)而在大腸桿菌中產生時，它含有RNA，該RNA可被消化，因此通過VLP與RNase A孵育將其除去。
基因P1A編碼由肥大細胞瘤腫瘤細胞系P815表達的一種蛋白質。被稱為P1A肽的顯性CTL表位與MHCI類(Ld)結合，該複合物被特異性CTL克隆識別(Brndle et al.，1998，Eur.J.Immunol.284010-4019)。利用標準分子生物學技術，使用合適的引物，通過PCR進行肽P1A-1(LPYLGWLVF)(SEQ ID NO90)與HBcAg的C端(胺基酸185，參見實施例1)的融合。將一個三亮氨酸接頭克隆到HBcAg與肽序列之間。如實施例1所述進行表達。HBcAg與P1A的融合蛋白被稱為HBcP1A，當在大腸桿菌中表達時形成衣殼，可以按類似於實施例1所述的方法進行純化。
酶RNA水解重組產生的HBcAg-p33(HBc33)和HBcAg-P1A(HBcP1A)VLP在1×PBS緩衝液(KCl 0.2g/l，KH2PO40.2g/l，NaCl 8g/l，Na2HPO41.15g/l)pH7.4中以1.0mg/ml的濃度，在300μg/ml RNase A(Qiagen AG，Switzerland)存在下，在恆溫混勻器中以650rpm 37℃孵育3小時。
免疫刺激性核酸的包裝RNA用RNase A消化後，向HBcAg-p33VLP中補加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG、NKCpG、G10-PO(表2)。類似地，分別以130nmol/ml或1.2nmol/ml的濃度添加150mer單鏈Cy150-1和253mer雙鏈dsCyCpG-253，它們均含有多個拷貝的CpG基序，並在恆溫混勻器中37℃孵育3小時。通過將CyCpG的雙鏈多聚體克隆到pBluescript KS-的EcoRV位點內產生雙鏈CyCpG-253DNA。在大腸桿菌XL1-blue中產生並用Qiagen Endofree質粒Giga試劑盒分離獲得的質粒，用限制性內切核酸酶XhoI和XbaI消化，產生的限制酶切產物通過瓊脂糖電泳分離。253bp的插入片段通過電洗脫和乙醇沉澱分離。通過對兩條鏈進行測序檢驗其序列。
表2實施例中使用的免疫刺激性核酸的命名和序列小寫字母表示通過硫代磷酸酯鍵連接的脫氧核苷酸，而大寫字母表示通過磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸
DNase I處理包裝的HBcAg-p33 VLP隨後在37℃下用DNase I消化(5U/ml)3小時(DNase I，不含RNase，Fluka AG，Switzerland)，並用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，USA)用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液為200倍體積)24小時，以除去RNase A和過量的CpG-寡核苷酸。
Benzonase處理由於某些單鏈寡脫氧核苷酸對DNase I處理有部分抗性，利用Benzonase處理從製品中除去游離的寡核苷酸。在透析前添加100-120U/ml Benzonase(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)和5mM MgCl2，37℃孵育3小時。
透析使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical IndustriesInc.，Houston，US)，在小鼠免疫實驗中使用的包裝有免疫刺激性核酸的VLP製劑用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液為200倍體積)24小時，以除去添加的酶和游離的核酸。
包裝的分析包裝的免疫刺激性核酸的釋放向50μl衣殼溶液中加入1μl蛋白酶K(600U/ml，Roche，Mannheim，Germany)、3μl 10％SDS-溶液和6μl 10倍蛋白酶緩衝液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1MTris pH7.4)，隨後在37℃下孵育過夜。VLP在該條件下完全水解。在65℃下加熱20分鐘滅活蛋白酶K。向25μl衣殼中加入1μl RNaseA(Qiagen，100μg/ml，稀釋250倍)。2-30μg衣殼與1倍體積的2×加樣緩衝液(1×TBE，42％w/v尿素，12％w/v Ficoll，0.01％溴酚藍)混合，95℃加熱3分鐘，加樣到10％(對於約20nt長的寡核苷酸)或15％(對於＞40mer的核酸)TBE/尿素聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen)上。此外，樣品也可以與6×加樣染料(10mM Tris pH7.5，50mM EDTA，10％v/v甘油，0.4％橘黃G)一起加樣到1％瓊脂糖凝膠上。TBE/尿素凝膠用CYBRGold染色，瓊脂糖凝膠用溴化乙錠染色。
寡核苷酸B-CpG、NKCpG和G10-PO被包裝於HBc33內。利用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠分析被包裝於HBc33 VLP內的B-CpG。加樣到凝膠上的是50μg下列樣品1.未處理的HBc33VLP；2.RNase A處理的HBc33 VLP；3.RNase A處理並包裝有B-CpG的HBc33 VLP；4.RNase A處理、包裝有B-CpG並用DNase I處理的HBc33 VLP；5.RNase A處理、包裝有B-CpG、DNase I處理並透析的HBc33 VLP；6.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段。利用溴化乙錠染色的1.5％瓊脂糖凝膠分析從VLP中提取的包裝的B-CpG的量。加樣到凝膠上的是下列樣品1.0.5nmol B-CpG對照；2.0.5nmolB-CpG對照；3.酚/氯仿抽提後HBc33中的B-CpG oligo內容物；4.酚/氯仿抽提並且用RNase A處理後HBc33中的B-CpG oligo內容物；5.酚/氯仿抽提並且用DNase I處理後HBc33中的B-CpG oligo內容物；6.空；7.MBI Fermentas 100bp DNA標準分子量片段。
利用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠分析被包裝於HBc33VLP內的NKCpG。加樣到凝膠上的是15μg下列樣品1.未處理的HBc33 VLP；2.RNase A處理的HBc33 VLP；3.RNase A處理的且包裝有NKCpG的HBc33 VLP；4.RNase A處理、包裝有NKCpG、DNase I處理並且透析的HBc33 VLP；5.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段。利用CYBR Gold染色的15％ TBE/尿素凝膠分析從VLP中提取的包裝的NKCpG的量。加樣到凝膠上的是下列樣品1.蛋白酶K消化及RNase A處理後HBc33中的NKCpG oligo內容物；2.20pmol NKCpG對照；3.10pmol NKCpG對照；4.40pmol NKCpG對照。
利用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠分析被包裝於HBc33VLP內的g10gacga-PO。加樣到凝膠上的是15μg下列樣品1.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段；2.未處理的HBc33 VLP；3.RNase A處理的HBc33 VLP；4.RNase A處理的且包裝有g10gacga-PO的HBc33 VLP；5.RNase A處理、包裝有g10gacga-PO、Benzonase處理並透析的HBc33 VLP。
RNaseA處理後VLP中的RNA內容物極大地減少，而大多數衣殼以緩慢遷移的彌散帶(smear)遷移，這大概是由於除去了帶負電荷的RNA。與過量寡核苷酸一起孵育後的衣殼比RNaseA處理的衣殼含有更高含量的核酸，因此以與未處理的衣殼類似的速度遷移。另外用DNAse I或Benzonase處理能降解游離寡核苷酸，而包裝在衣殼內的寡核苷酸不被降解，清楚地顯示了寡核苷酸的包裝。在某些情況下，在DNase I/Benzonase處理並透析後，通過蛋白酶K消化證實寡核苷酸的包裝。利用上述方法從衣殼中釋放的寡核苷酸與用於包裝的寡核苷酸大小相同，這一發現清楚地證實了寡核苷酸的包裝。
大的單鏈寡核苷酸Cy150-1被包裝於HBc33內。Cy150-1含有7.5個重複的CyCpG，按照標準寡核苷酸合成方法(IBA，Gttingen，Germany)合成。包裝於HBc33VLP內的Cy150-1用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠進行分析。加樣到凝膠上的是15μg下列樣品1.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段；2.未處理的HBc33 VLP；3.RNase A處理的HBc33 VLP；4.RNase A處理的且包裝有Cy150-1的HBc33 VLP；5.RNase A處理、包裝有Cy150-1、DNaseI處理並透析的HBc33 VLP；6.RNase A處理、包裝有Cy150-1、DNaseI處理並透析的HBc33 VLP。從VLP中提取的包裝的Cy150-1的量用SYBR Gold染色的10％ TBE/尿素凝膠分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1.20pmol Cy150-1對照；2.10pmol Cy150-1對照；3.4pmolCy150-1對照；4.4μg HBc33在與1倍體積的TBE/尿素樣品緩衝液95℃孵育3分鐘後的Cy150-1 oligo內容物。衣殼中的RNA內容物在RNase A處理後極大減少，而大多數衣殼以緩慢遷移的彌散帶遷移。衣殼用4倍體積的水稀釋，並濃縮到1mg/ml。與過量的Cy150-1孵育後，衣殼含有大量核酸，因此以類似於未處理衣殼的速度遷移。另外用DNase I處理能降解游離的、未包裝的寡核苷酸，而衣殼內的寡核苷酸不被降解。在TBE/尿素加樣緩衝液中95℃加熱3分鐘從包裝的VLP中釋放出DNase I抗性的核酸，這表明存在150mer。
寡核苷酸NKCpGpt也被包裝於HBcP1A內。被包裝於HBcP1AVLP內的NKCpGpt用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠來分析。加樣到凝膠上的是15μg下列樣品1.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段；2.未處理的HBcP1A VLP；3.RNase A處理的HBcP1A VLP；4.RNase A處理的且包裝有NKCpGpt的HBcP1A VLP。RNase處理減少了核酸內容物，並使衣殼的遷移減慢。添加NKCpGpt恢復了衣殼中的核酸內容物並使遷移變快。
實施例8免疫刺激性核酸能夠被包裝到與抗原偶聯的HBcAg-wt內重組產生的HBcAg-wt VLP在與來自淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)的肽p33(CGG-KAVYNFATM)(SEQ ID NO81)偶聯後被包裝。為了偶聯，HBcAg-wt VLP(2mg/ml)在恆溫混勻器中用25×摩爾過量的SMPH(琥珀醯亞胺基-6-[(β-馬來醯亞氨基-丙醯氨基)己酸]，Pierce)25℃衍化1小時。使用MWCO 10,000kD透析膜，將衍化的VLP在4℃下用Mes緩衝液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)pH7.4透析2次各2小時。隨後在恆溫混勻器中25℃孵育2小時，在此期間VLP(50μM)與p33肽(250μM)的N端半胱氨酸偶聯。樣品用1×PBS pH7.4充分透析(MWCO 300,000)，以除去不需要的游離肽。
用SMPH衍化並與p33肽偶聯的HBcAg-wt VLP通過SDS-PAGE進行分析。樣品通過16％ SDS-PAGE經考馬斯藍染色進行分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1.NEB預染色的蛋白質標準，寬範圍(#7708S)，10μl；2.p33肽；3.SMPH衍化的HBcAg-wt VLP，透析前；4.SMPH衍化的HBcAg-wt VLP，透析後；5.與p33偶聯的HBcAg-wt VLP，上清液；6.與p33偶聯的HBcAg-wt VLP，沉澱。HBcAg-wt顯現為一條21kD蛋白帶。由於SMPH的分子量低，衍化產物僅僅略微增大，不能通過SDS-PAGE鑑別。單獨的肽顯現為一條3kD條帶，而被稱為HBx33的偶聯產物在約24kD處顯示第二條強條帶，佔總HBcAg-wt的50％以上。
酶RNA水解在RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)存在下，用4倍體積的H2O稀釋HBx33 VLP(0.5-1.0mg/ml，1×PBS緩衝液pH7.4)，使鹽濃度降低至0.2×PBS的終濃度，並在恆溫混勻器中以650rpm 37℃孵育3小時。
免疫刺激性核酸的包裝RNase A消化後，用Millipore Microcon或Centriplus濃縮器濃縮HBx33 VLP，然後添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt，在恆溫混勻器中在0.2×PBS pH7.4中37℃孵育3小時。隨後，反應混合物在37℃下用DNaseI(5U/ml)消化3小時(DNaseI，不含RNase，Fluka AG，Switzerland)。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，USA)，將用於免疫小鼠的VLP製劑用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液為200倍體積)24小時，以除去RNase A和過量的CpG-寡核苷酸。用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠分析被包裝於HBx33 VLP內的B-CpGpt。加樣到凝膠上的是50μg下列樣品1.未處理的HBx33VLP；2.RNase A處理的HBx33 VLP；3.RNase A處理且包裝有B-CpGpt的HBx33 VLP；4.RNase A處理、包裝有B-CpGpt並用DNaseI處理的HBx33 VLP；5.RNase A處理、包裝有B-CpGpt、DNase I處理並透析的HBx33 VLP；6.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段。顯示RNase處理減少了衣殼的核酸內容物，並且減慢了它們的遷移。添加B-CpGpt可恢復衣殼的核酸內容物並使其遷移加快。DNaseI僅消化游離寡核苷酸，而包裝的寡核苷酸在透析後仍保留在VLP中。
實施例9免疫刺激性核酸能夠被包裝於與抗原偶聯的Qβ VLP內p33肽與Qβ VLP的偶聯重組產生的RNA噬菌體Qb的病毒樣顆粒(Qβ VLP)不經處理即使用，或者在與含有N端CGG和/或C端GGC延伸(CGG-KAVYNFATM(SEQ ID NO81)和KAVYNFATM-GGC(SEQID NO82))的p33肽偶聯後使用。重組產生的Qβ VLP在25℃下用10倍摩爾過量的SMPH(Pierce)衍化0.5小時，隨後在4℃下用20mMHEPES，150mM NaCl，pH7.2透析，以除去未反應的SMPH。添加5倍摩爾過量的肽，並且在30％乙腈存在下在恆溫混勻器中25℃反應2小時。利用SDS-PAGE經考馬斯藍染色分析與Qb VLP偶聯的p33。加樣到凝膠上的是下列樣品(A)1.NEB預染色的蛋白質標準，寬範圍(#7708S)，10μl；2.Qb VLP，14μg；3.SMPH衍化的Qb VLP，透析後；4.與CGG-p33偶聯的Qb VLP，上清液。(B)1.NEB預染色的蛋白質標準，寬範圍(#7708S)，10μl；2.Qb VLP，10μg；3.與GGC-p33偶聯的Qb VLP，上清液。SDS-PAGE分析證明了由一個、兩個或三個與Qβ單體偶聯的肽組成的多偶聯帶。為了簡單起見，尤其在實施例部分中，將肽p33與Qβ VLP的偶聯產物稱為Qbx33。
當Qβ VLP通過表達噬菌體Qβ衣殼蛋白在大腸桿菌中產生時，它含有RNA，該RNA能被消化，因此通過VLP與RNase A孵育除去。
低離子強度和低Qβ濃度使RNase A水解Qβ VLP中的RNA在20mM Hepes/150mM NaCl緩衝液(HBS)pH7.4中濃度為1.0mg/ml的Qβ VLP，通過添加RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)直接消化，或者用4倍體積的H2O稀釋至終濃度為0.2×HBS，然後與RNase A(60μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)一起孵育。孵育在恆溫混勻器中以650rpm 37℃進行3小時。用溴化乙錠和考馬斯藍染色的1％瓊脂糖凝膠分析在低及高離子強度下RNase A對Qb VLP中RNA的水解。加樣到凝膠上的是下列樣品(A，B)1.MBIFermentas 1kb DNA標準分子量片段；2.未處理的Qb VLP；3.在1×HBS緩衝液pH7.2中用RNase A處理的Qb VLP。(C，D)1.MBIFermentas 1kb DNA標準分子量片段；2.未處理的Qb VLP；3.在0.2×HBS緩衝液pH7.2中用RNase A處理的Qb VLP。證實在1×HBS中只觀察到極弱的RNA內容物的減少，而在0.2×HBS中大多數RNA均水解。與之一致的是，向1×HBS中添加RNase A後衣殼的遷移不改變，而向0.2×HBS中添加RNase後遷移減慢。
低離子強度增加核酸在Qβ VLP中的包裝在0.2×HBS中RNase A消化後，用Millipore Microcon或Centriplus濃縮器將Qβ VLP濃縮至1mg/ml，其等份樣品用1×HBS或0.2×HBS透析。向Qβ VLP中添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG，在恆溫混勻器中37℃孵育3小時。隨後，在37℃下用Benzonase(100U/ml)消化Qβ VLP 3小時。利用1％瓊脂糖凝膠經溴化乙錠或考馬斯藍染色分析樣品。加樣到凝膠上的是下列樣品1.未處理的Qb VLP；2.RNase A處理的Qb VLP；3.RNase A處理、在0.2×HBS緩衝液pH7.2中包裝B-CpG並用Benzonase處理的Qb VLP；4.RNase A處理、在1×HBS緩衝液pH7.2中包裝B-CpG並用Benzonase處理的HBx33 VLP(見實施例12)。在1×HBS中只有極少量的寡核苷酸能被包裝，而在0.2×HBS中可檢測到強溴化乙錠染色帶，該條帶與衣殼的考馬斯藍染色位置重疊。
不同免疫刺激性核酸能夠被包裝於Qβ和Qbx33 VLP中在0.2×HBS中RNase A消化後，用Millipore Microcon或Centriplus濃縮器將Qβ VLP或Qbx33 VLP濃縮至1mg/ml，並添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt、g10gacga和253merdsCyCpG-253(表2)，並在恆溫混勻器中37℃孵育3小時。隨後，在37℃下用DNaseI(5U/ml)或Benzonase(100U/ml)消化Qβ VLP或Qbx33 VLP 3小時。利用1％瓊脂糖凝膠經溴化乙錠或考馬斯藍染色後分析樣品。
加樣到凝膠上的是50μg下列樣品1.未處理的Qbx33 VLP；2.RNase A處理的Qbx33 VLP；3.RNase A處理並包裝有B-CpGpt的Qbx33 VLP；4.RNase A處理、包裝有B-CpGpt、DNase I處理並透析的Qbx33 VLP；5.1kb MBI Fermentas DNA標準分子量片段。(C)顯示利用CYBR Gold染色的15％TBE/尿素凝膠對從VLP中提取的包裝oligo的量所進行的分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1.蛋白酶K消化和RNase A處理後2μg Qbx33 VLP中的B-CpGpt oligo內容物；2.20pmol B-CpGpt對照；3.10pmol B-CpGpt對照；4.5pmolB-CpGpt對照。
加樣到另一塊凝膠上的是15μg下列樣品1.MBI Fermentas 1kbDNA標準分子量片段；2.未處理的Qbx33 VLP；3.RNase A處理的Qbx33 VLP；4.RNase A處理並包裝有g10gacga-PO的Qbx33 VLP；5.RNase A處理、包裝有g10gacga-PO、Benzonase處理並透析的Qbx33VLP。
加樣到第三塊凝膠上的是15μg下列樣品1.MBI Fermentas 1kbDNA標準分子量片段；2.未處理的Qbx33 VLP；3.RNase A處理的Qbx33 VLP；4.RNase A處理、包裝有dsCyCpG-253並用DNaseI處理的Qbx33 VLP；5.RNase A處理、包裝有dsCyCpG-253、用DNaseI處理並透析的Qbx33 VLP。
不同的核酸B-CpGpt、g10gacga和253mer dsDNA能夠被包裝於Qbx33內。包裝的核酸對DNaseI消化有抗性，在透析過程中保持包裝狀態。通過蛋白酶K消化釋放核酸，隨後進行瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色，來證實B-CpGpt的包裝。
實施例10AP205的解裝配-純化-重裝配和免疫刺激性核酸的包裝A.AP205VLP的解裝配，以及由在不添加寡核苷酸的條件下能夠重裝配的材料重裝配解裝配40mg凍幹純化的AP205VLP(SEQ-ID80或81)溶解於4ml 6M GuHCl中，4℃孵育過夜。解裝配混合物以8000rpm離心(Eppendorf 5810R，固定角轉頭F34-6-38，在下列所有步驟中使用)。將沉澱溶解於7M尿素中，上清液用NET緩衝液(20mM Tris-HCl，pH7.8，5mM EDTA，150mM NaCl)透析3天，其中更換3次緩衝液。另外，也以連續方式透析4天。透析過的溶液以8000rpm離心20分鐘，將沉澱溶解於7M尿素中，上清液用硫酸銨(60％飽和)沉澱，並溶解於含有10mM DTT的7M尿素緩衝液中。合併溶解於7M尿素中的上述所有沉澱，用硫酸銨(60％飽和)沉澱，並且再溶解於含有10mMDTT的7M尿素緩衝液中。合併溶解於含有10mM DTT的7M尿素緩衝液中的物質，上Sephadex G75柱，該柱用含有10mM DTT的7M尿素緩衝液平衡並以2ml/h的流速洗脫。從柱上洗脫下一個峰。以3ml收集級分。合併含有AP205外殼蛋白的峰級分，用硫酸銨(60％飽和)沉澱。以8000rpm離心20分鐘分離沉澱。將沉澱溶解於7M尿素，10mM DTT中，上短Sepharose 4B柱(1.5×27cm Sepharose 4B，2ml/h，7M尿素，10mM DTT作為洗脫緩衝液)。從該柱上主要洗脫下一個峰，其含有一個小肩部。含有AP205外殼蛋白的級分通過SDS-PAGE鑑定，合併，除去肩部。獲得10.3ml樣品。通過分光光度法測定稀釋25倍的蛋白質等份，使用下列公式來估計蛋白質濃度(1.55×OD280-0.76×OD260)×體積。平均濃度為1nmol/ml VLP(2.6mg/ml)。280nm與260nm處的吸光度之比為0.12/0.105。
重裝配向樣品中加入1.1ml β-巰基乙醇，建立下列重裝配反應體系1ml AP205外殼蛋白，不含核酸1ml AP205外殼蛋白，rRNA(約200OD260單位，10nmol)9ml AP205外殼蛋白，CyCpG(370μl 225pmol/μl溶液，即83nmol)。
這些混合物用30ml含10％β-巰基乙醇的NET緩衝液透析1小時。不含核酸的混合物分開透析。然後以連續方式繼續透析3天，更換1l NET緩衝液。反應混合物隨後用水充分透析(更換5次緩衝液)，並凍幹。將其再溶解於水中，用電子顯微鏡(EM)分析。所有混合物均含有衣殼，表明AP205 VLP重裝配不依賴於可檢測的核酸的存在，如同利用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色所測定的。EM程序如下蛋白質懸液吸附到覆蓋碳-聚醋酸甲基乙烯脂(formvar)的網格上，用2％磷鎢酸(pH6.8)染色。用JEM 100C(JEOL，日本)電子顯微鏡以80kV的加速電壓檢查該網格。在Kodak電子成像膠片上進行照相記錄(負片)，在Kodak Polymax相紙上洗印負片獲得電子顯微照片。在CyCpG存在下重裝配的VLP通過Sepharose 4B柱(1×50cm)純化，用NET緩衝液洗脫(1ml/h)。級分通過Ouchterlony試驗分析，並合併含有VLP的級分。獲得8ml樣品，用水透析脫鹽，乾燥。衣殼產量為10mg。用0.6％瓊脂糖凝膠經溴化乙錠染色分析溶解物質，結果表明衣殼不含核酸。在重裝配步驟之後和充分透析之前採集的含CyCpG的重裝配反應樣品用0.6％瓊脂糖凝膠經溴化乙錠和考馬斯藍染色分析。能夠獲得遷移高度與完整的AP205 VLP相同並且能夠用溴化乙錠和考馬斯藍染色的一條帶，表明含有寡脫氧核苷酸的AP205 VLP已經被重裝配。重裝配程序後的充分透析步驟可能導致寡脫氧核苷酸擴散到VLP之外。值得注意的是，如利用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳所測定的，在不含可檢測的寡脫氧核苷酸的條件下，AP205VLP也能被重裝配。因此，在最初的VLP解裝配、從核酸中純化解裝配的外殼蛋白以及隨後VLP在寡脫氧核苷酸存在下重裝配後，寡脫氧核苷酸能夠與AP205 VLP成功結合。
B.使用在不添加寡核苷酸的條件下不能重裝配的解裝配材料重裝配AP205 VLP解裝配100mg純化並乾燥的重組AP205 VLP如上所述解裝配。所有步驟都基本如部分A的解裝配所述進行，只是使用8M尿素溶解硫酸銨沉澱步驟的沉澱物，並且省去了重裝配之前使用CL-4B柱的凝膠過濾步驟。通過光譜測定，使用部分A所述公式計算，合併的Sephadex G-75柱級分含有21mg蛋白質。樣品的280nm吸光度與260nm吸光度之比為0.16∶0.125。樣品稀釋50倍進行測定。
重裝配Sephadex G-75凝膠過濾純化步驟獲得的蛋白質製品用60％飽和的硫酸銨沉澱，獲得的沉澱物溶解於2ml 7M尿素，10mMDTT中。樣品用含10％β-巰基乙醇的8ml NET緩衝液稀釋，用40ml含10％β-巰基乙醇的NET緩衝液透析1小時。通過向透析袋內的蛋白質樣品中添加0.4ml CyCpG溶液(109nmol/ml)啟動重裝配。建立連續模式的透析，NET緩衝液用作洗脫液。繼續透析2天，在完成該透析步驟後採集樣品進行EM分析。透析過的重裝配溶液隨後用含50％v/v甘油的NET緩衝液透析，以實現濃縮。透析一天後更換一次緩衝液。透析繼續進行總共3天。
通過在Sepharose 4-B柱(1×60cm)上用NET緩衝液以1ml/h的流速進行凝膠過濾，來純化透析並濃縮的重裝配溶液。級分用Ouchterlony試驗檢測，並且對含衣殼的級分進行乾燥，將其重懸浮於水中，並在用20mM Hepes pH7.6平衡的4-B柱上重新層析。使用下列三個公式1.(183×OD230nm-75.8×OD260nm)×體積(ml)2.((OD235nm-OD280nm)/2.51)×體積3.((OD228.5nm-OD234.5nm)×0.37)×體積檢測到6-26mg重裝配VLP的蛋白質含量。
重裝配的AP205VLP通過如上所述的EM、瓊脂糖凝膠電泳和非還原條件下的SDS-PAGE進行分析。
解裝配材料的EM分析顯示，用鹽酸胍處理AP205VLP從根本上破壞了VLP的衣殼裝配。該解裝配材料與寡核苷酸的重裝配產生衣殼，衣殼通過凝膠過濾純化並進一步富集。獲得兩種大小的顆粒；在電子顯微照片上可見直徑約25nm的顆粒和較小的顆粒。沒有寡核苷酸時無法獲得重裝配。將重裝配的顆粒加樣到瓊脂糖電泳上，顯示重裝配的顆粒含有核酸。通過酚抽提提取核酸內容物，隨後將其加樣到瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠染色，顯示該顆粒含有用於重裝配的寡核苷酸。通過將該寡核苷酸樣品與從顆粒中提取的核酸物質從左到右加樣，確定包裝的寡核苷酸的特性。已經加樣了重裝配的AP205VLP並且已用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠再用考馬斯藍染色，顯示該顆粒的寡核苷酸內容物與蛋白質內容物共遷移，表明寡核苷酸已經被包裝到顆粒中。加樣到凝膠上的樣品是未處理的AP205 VLP，含有不同含量的與CyCpG重裝配並純化的AP205 VLP的3個樣品，未處理的Qβ VLP。
向SDS-PAGE凝膠上加樣重裝配的AP205 VLP，在不含還原劑的條件下電泳，證實重裝配的顆粒已經形成二硫鍵，如同未處理的AP205 VLP一樣。而且，二硫鍵模式也與未處理的顆粒相同。加樣到SDS凝膠上的樣品是蛋白質分子量標準，未處理的野生型Qβ，重裝配的野生型Qβ，未處理的AP205 VLP，重裝配的AP205 VLP。AP205VLP亞單位的分子量是14.0kDa，而Qβ亞單位的分子量為14.3kDa(這兩個分子量都是根據N端甲硫氨酸計算出來的)。
C.p33表位(序列H2N-KAVYNFATMGGC-COOH，含游離N端和C端(SEQ ID NO82))與同CyCpG重裝配的AP205 VLP的偶聯如部分B所述獲得的重裝配AP205 VLP，在20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中，以1.4mg/ml的濃度與5倍過量的由50mMDMSO貯存液稀釋而成的交聯劑SMPH在15℃下反應30分鐘。獲得的所謂衍化AP205 VLP用至少1000倍體積的20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.4緩衝液透析2次各2小時。衍化的AP205以1mg/ml的濃度與2.5倍或5倍過量的由20mM DMSO貯存液稀釋而成的肽在15℃下反應2小時。樣品隨後在液氮中驟凍用於貯存。
偶聯反應通過SDS-PAGE分析。加樣到凝膠上的是下列樣品蛋白質分子量標準；衍化的AP205 VLP(d)；與2.5倍過量的肽偶聯的AP205 VLP，上清液(s)；與2.5倍過量的肽偶聯的AP205 VLP，沉澱物(p)；與5倍過量的肽偶聯的AP205 VLP，上清液(s)；與5倍過量的肽偶聯的AP205 VLP，沉澱物(p)。偶聯反應的結果顯示，在偶聯反應中使用5倍過量的肽比使用2.5倍過量的肽能夠達到更高的偶聯程度。
實施例11VLP的RNA內容物的非酶水解和免疫刺激性核酸的包裝VLP核酸內容物的ZnSO4依賴的降解溶於20mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl中的5mg Qβ VLP(通過Bradfold分析測定)在SnakeSkin摺疊透析管(Pierce，貨號68035)中在4℃下用2000ml 50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2或2000ml 4mM HEPES，pH7.4，30mM NaCl透析2小時。每種透析緩衝液均更換一次，在4℃下再繼續透析16小時。透析過的溶液以14000rpm澄清10分鐘(Eppendorf 5417 R，固定角轉頭F45-30-11，在下列所有步驟中使用)，再次通過Bradfold分析測定蛋白質濃度。溶於50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mMMgCl2中的Qβ VLP用相應緩衝液稀釋至蛋白質終濃度為1mg/ml，而溶於4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl中的Qβ VLP用相應緩衝液稀釋至蛋白質終濃度為0.5mg/ml。這種含衣殼的溶液在4℃下以14000rpm再次離心10分鐘。上清液與加至2.5mM終濃度的ZnSO4添在Eppendorf恆溫混勻器裝置中以550rpm 60℃孵育24小時。24小時後溶液以14000rpm澄清10分鐘，棄去沉澱。ZnSO4依賴的核酸降解效率通過瓊脂糖凝膠電泳證實。上清液在4C下用5000ml 4mMHEPES pH7.4，30mM NaCl透析2小時。更換一次5000ml緩衝液，在4℃下繼續透析過夜。透析過的溶液在4℃下以14000rpm澄清10分鐘，棄去微小的沉澱物，上清液的蛋白質濃度通過Bradfold分析測定。以氯化銅/二氮雜菲/過氧化氫處理衣殼獲得類似的結果。本領域技術人員公知用於水解RNA的備選的非酶方法。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析ZnSO4處理的Qβ VLP從大腸桿菌中純化並用緩衝液1(50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2)或緩衝液2(4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl)透析的QβVLP在存在或不存在2.5mM硫酸鋅(ZnSO4)的條件下60℃孵育24小時。該處理後，等量指定樣品(5μg蛋白質)與加樣染料混合，加樣到0.8％瓊脂糖凝膠上。電泳後，凝膠用溴化乙錠染色。用ZnSO4處理VLP導致核酸內容物降解，而假處理的對照不受影響。
將寡脫氧核苷酸包裝於ZnSO4處理的VLP內寡脫氧核苷酸的包裝使用ZnSO4處理且透析過的Qβ衣殼，其蛋白質濃度(通過Bradfold分析測定)為0.4mg/ml-0.9mg/ml(分別對應於159nM和357.5nM的衣殼濃度)。加入相對於Qβ VLP衣殼300倍摩爾過量的寡脫氧核苷酸，在Eppendorf恆溫混勻器中以550rpm 37℃孵育3小時。3小時後反應液在4℃下以14000rpm離心10分鐘。上清液在MWCO 300000的Spectra/PorCE Dispo透析器(Spectrum，貨號135526)中在4℃下用5000ml 20mM HEPES pH7.4，150mM NaCl透析8小時。更換一次5000ml緩衝液，在4℃下繼續透析過夜。透析過的樣品的蛋白質濃度通過Bradfold分析測定。Qβ衣殼及其核酸內容物如實施例7和9所述分析。
寡脫氧核苷酸向ZnSO4處理的VLP內的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。以2.5mM硫酸鋅(+ZnSO4)處理的QβVLP用4mM HEPESpH7.4，30mM NaCl透析，並且與過量的寡脫氧核苷酸37℃孵育3小時(由於透析，ZnSO4的濃度降低106數量級，因此只在括號中標明)。在寡脫氧核苷酸存在下孵育後，等量的指定樣品(5μg蛋白質)與加樣染料混合，加樣到0.8％瓊脂糖凝膠上。電泳後，凝膠用溴化乙錠染色。與從大腸桿菌中純化的未處理的Qβ衣殼相比，向ZnSO4處理的Qβ VLP中添加寡脫氧核苷酸能夠恢復這樣處理的衣殼的電泳行為。
ZnSO4和寡脫氧核苷酸處理的Qβ VLP的核酸內容物通過Benzonase和蛋白酶K消化和聚丙烯醯胺TBE/尿素凝膠電泳來分析如上所述，將寡脫氧核苷酸包裝於ZnSO4處理的Qβ VLP內。按照使用說明用25μl Benzonase(Merck，貨號1.01694.0001)消化25μg該VLP。在熱滅活核酸酶後(80℃ 30分鐘)，按照使用說明用蛋白酶K(酶的終濃度為0.5mg/ml)處理VLP。3小時後，將Benzonase和蛋白酶K消化的等量2μg Qβ VLP與TBE-尿素樣品緩衝液混合，並加樣到15％聚丙烯醯胺TBE-尿素凝膠(Novex，Invitrogen，貨號EC6885)上。加於第2泳道的衣殼在緩衝液1(見上文)存在下用2.5mM ZnSO4處理，而加於第3泳道的衣殼在緩衝液2(見上文)存在下用2.5mM ZnSO4處理。將用於重裝配反應的1pmol、5pmol和10pmol寡脫氧核苷酸加樣到同一凝膠上(泳道4-6)作為定性及定量標準。作為對照，從大腸桿菌中純化的Qβ衣殼進行完全相同的處理，並在同一塊聚丙烯醯胺TBE-尿素凝膠上進行分析(泳道1)。完成電泳後，將凝膠固定，平衡至中性pH，用SYBR-Gold(Molecular Probes，貨號S-11494)染色。完整的Qβ VLP(從大腸桿菌中純化)不含與從ZnSO4和寡脫氧核苷酸處理的Qβ衣殼中提取的大小相似的核酸。另外，從後一種VLP中分離的核酸與重裝配反應中使用的寡脫氧核苷酸共遷移。該結果證實，所用的寡脫氧核苷酸被包裝於ZnSO4處理的Qβ衣殼內。
實施例12向VLP內包裝免疫刺激性核酸後抗原性肽的偶聯
RNaseA和ZnSO4介導的VLP核酸內容物的降解Qβ VLP如實施例9所述在低離子強度條件下(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)用RNaseA處理。類似地處理如實施例2、3、7、10所述的其它VLP，即GA、BKV、HBcAg和AP205。此外，Qβ VLP和AP205 VLP也在如實施例11所述的低離子強度條件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl pH7.4)下用ZnSO4處理。在Eppendorf恆溫混勻器中，溶於20mM Hepes pH7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH7.4中的AP205 VLP(1mg/ml)在50℃和550rpm下用2.5mM ZnSO4處理48小時。Qβ和AP205 VLP樣品如實施例11所述澄清，上清液在10,000 MWCO Spectra/Por透析管(Spectrum，貨號128 118)中在4℃下首先用2L 20mM Hepes，pH7.4透析2小時，然後在更換緩衝液後透析過夜。如實施例11所述，在透析後澄清樣品，通過Bradford分析測定上清液中的蛋白質濃度。
將ISS包裝到RNaseA和ZnSO4處理的VLP內在RNA水解和透析後，Qβ和AP205 VLP(1-1.5mg/ml)與每mlVLP 130μl CpG寡核苷酸(NKCpG，G10-PO-參見表2；G3-6，G8-8-參見表3；在10mM Tris pH8中的1mM寡核苷酸貯存液)混合。樣品在恆溫搖床上以650rpm 37℃孵育3小時。隨後在透析前，在2mMMgCl2存在下，用125U Benzonase/ml VLP(Merck KGaA，Darmstadt，德國)處理樣品，並37℃孵育3小時。樣品在4℃下在300,000 MWCOSpectra/Por透析管(Spectrum，貨號131 447)中用20mM Hepes，pH7.4透析2小時，更換緩衝液後用相同緩衝液透析過夜。透析後，樣品如實施例11所述澄清，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析來測定。
免疫原性肽與包裝有ISS的VLP的偶聯包裝有ISS的Qβ VLP與含有C端GGC延伸(KAVYNFATM-GGC)(SEQ ID NO82)的p33肽偶聯，產生被稱為Qb-ISS-33 VLP的QβVLP。包裝的Qβ VLP在20mM Hepes，pH7.4中用10倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25℃下衍化0.5小時，然後在4℃下用20mM HEPES，pH7.4透析兩次各2小時，以除去未反應的SMPH。向透析過的衍化混合物中加入5倍摩爾過量的肽，使之在恆溫混勻器中25℃反應2小時。樣品在300,000 MWCO Spectra/Por透析管中用20mM Hepes，pH7.4在4℃下透析2小時，並在更換緩衝液後，用相同緩衝液透析過夜。透析後，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析來測定。肽p33與Qβ的偶聯在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠(Novex，Invitrogen，貨號EC64952)上通過SDS-PAGE分析，其中使用含有2％ SDS和β-巰基乙醇或DTT的樣品緩衝液。如實施例7所述，包裝在1％瓊脂糖凝膠上分析，並且在蛋白酶K消化後在TBE/尿素凝膠上分析。
對如上所述的包裝有G8-8寡核苷酸的AP205 VLP(1.24mg/ml)進行衍化，並且與含有N端C延伸的MelanA 16-35 A/L(cGHGHSYTTAE ELAGIGILTV)(SEQ ID NO55)偶聯，產生AP205-G8-8-MelanA VLP。AP205 VLP(包裝有G8-8)在20mM Hepes，pH7.4中用20倍摩爾過量的SMPH 25℃衍化0.5小時，然後在4℃下用20mM HEPES，pH7.4透析兩次，以除去未反應的SMPH。向透析過的衍化混合物中加入10倍摩爾過量的肽，使之在恆溫混勻器中25℃反應2小時。樣品在4℃下在10,000 MWCO透析管中用20mMHepes pH7.4透析2小時，並且在更換緩衝液後用相同的緩衝液透析過夜。透析後，樣品如實施例11所述澄清，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析來測定。肽MelanA 16-35 A/L與AP205的偶聯效率在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠上通過SDS-PAGE分析。包裝於AP205內的G8-8寡核苷酸利用1％瓊脂糖凝膠分析，並且如實施例7所述在蛋白酶K消化後利用TBE/尿素凝膠分析AP205-G8-8-MelanA16-35 A/L中G8-8寡核苷酸的量。
RNAseA和ZnSO4處理的Qβ VLP在與p33肽偶聯之前及之後與NKCpG的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳加以分析。含有NKCpG寡核苷酸並且隨後與p33肽偶聯的Qβ VLP被稱為Qb-NKCpG-33 VLP。在1％瓊脂糖凝膠上，在溴化乙錠染色的凝膠上可見的螢光帶與在考馬斯藍染色的凝膠上可見的蛋白帶共遷移，證明了包裝。因此，在包裝後，RNaseA和ZnSO4處理的Qβ VLP在與p33肽偶聯之前及之後都含有NKCpG寡核苷酸。p33肽的偶聯效率仍然保持，這可以根據在16％PAGE Tris-甘氨酸凝膠上進行SDS-PAGE分析後可見的多偶聯產物來判斷，這些產物顯現為比殘餘的不與肽反應的Qβ VLP亞單位單體遷移更慢的條帶。包裝效率可以根據TBE/尿素凝膠的分析，通過比較包裝的Qb-NKCpG-33泳道中的寡核苷酸信號與加樣到同一塊凝膠上的寡核苷酸標準的信號來估計。包裝的NKCpG的量為1-4nmol/100μg Qb-NKCpG-33 VLP。
G8-8寡核苷酸向Qβ VLP內的包裝以及隨後與p33肽的偶聯通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。含有G8-8寡核苷酸並且隨後與p33肽偶聯的Qβ VLP被稱為Qb-G8-8-33 VLP。包裝有G8-8的Qβ VLP的溴化乙錠染色在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上可以看到。溴化乙錠螢光帶與在隨後用考馬斯藍染色的同一塊凝膠上可見的Qβ VLP蛋白帶共遷移，證明了包裝。通過在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠上進行SDS-PAGE分析，估計偶聯效率為30％。Qb-G8-8-33 VLP的G8-8含量的分析在1％瓊脂糖凝膠上進行，其中包裝的寡核苷酸的量約為1nmol/100μg Qb-G8-8-33 VLP。
G8-8寡核苷酸向AP205 VLP內的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳分析。包裝有G8-8的AP205 VLP的染色在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上可見。在隨後用考馬斯藍染色的同一凝膠上檢測到的AP205VLP蛋白帶的共遷移證明了包裝。與MelanA 16-35A/L肽的偶聯效率可以根據在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠上進行的SDS-PAGE分析來估計，其中可見多偶聯帶，它們的遷移慢於殘餘的不與該肽反應的AP205 VLP單體亞單位。將偶聯效率與獲得的Qb-G8-8-33 VLP的偶聯效率相比較。與MelanA 16-35 A/L偶聯後對AP205 VLP的G8-8寡核苷酸內容物的分析可以在TBE/尿素凝膠電泳上看到。
實施例13向VLP內包裝側翼為鳥苷的免疫刺激性寡核苷酸Qbx33 VLP(與肽p33偶聯的Qβ VLP，參見實施例9)在如實施例9所述的低離子強度條件(20mM Hepes pH7.4)下用RNaseA處理，以水解Qbx33 VLP的RNA內容物。用20mM Hepes，pH7.4透析後，Qbx33 VLP與側翼為鳥苷的寡核苷酸(表2G10-PO；表3G3-6，G7-7，G8-8，G9-9或G6，來自在10mM Tris pH8中的1mM貯存液)混合，並如實施例12所述孵育。隨後，Qbx33 VLP用Benzonase處理，並在300,000 MWC0管中透析。含oligos G7-7、G8-8和G9-9的樣品充分透析3天，其中更換4次緩衝液，以除去游離的oligo。如實施例7所述，利用1％瓊脂糖凝膠、以及在蛋白酶K消化後利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。
表3.在實施例中使用的免疫刺激性核酸的序列
G3-6、G6、G8-8寡核苷酸在RNaseA處理的Qbx33 VLP中的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。在寡核苷酸包裝後，在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上可見比未處理的參照Qβ VLP遷移略慢的螢光帶，表明寡核苷酸的存在。該信號在Benzonase處理後仍然保留，表明寡核苷酸在Qbx33 VLP內的包裝。包裝效率可以根據TBE/尿素凝膠電泳來估計。包裝的G3-6寡核苷酸的量(約4nmol/100μg Qbx33 VLP)大大高於包裝的G8-8寡核苷酸的量(約1nmol/100μg Qbx33 VLP)。這表明包裝能力對位於CpG基序側翼的鳥苷核苷酸尾的長度的依賴性。
實施例14向VLP內包裝核糖核酸VLP核酸內容物的ZnSO4依賴的降解Qβ VLP在如實施例11所述的低離子強度條件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4處理。在Eppendorf恆溫混勻器中，在20mM Hepes pH7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH7.4中的AP205 VLP(1mg/ml)用2.5mM ZnSO4在50℃和550rpm下處理48小時。如實施例11所述澄清Qβ和AP205 VLP樣品，並如實施例12所述用20mM Hepes，pH7.4透析。
向ZnSO4處理的VLP內包裝Poly(IC)將免疫刺激性核糖核酸Poly(IC)(貨號27-4732-01，poly(I)·poly(C)，Pharmacia Biotech)溶解於PBS(Invitrogen，貨號14040)或水中，使濃度為4mg/ml(9μM)。Poly(IC)在60℃下孵育10分鐘，然後冷卻至37℃。將孵育的Poly(IC)以10倍摩爾過量加到ZnSO4處理的Qβ或AP205 VLP(1-1.5mg/ml)中，混合物在恆溫混勻器中以650rpm37℃孵育3小時。隨後在恆溫混勻器中以300rpm，在2mM MgCl2存在下與每ml VLP混合物125U Benzonase 37℃孵育3小時，來酶水解過量的游離Poly(IC)。Benzonase水解後，如實施例11所述澄清樣品，上清液在4℃下在300,000 MWCO Spectra/Por透析管(Spectrum，貨號131 447)中用2L 20mM Hepes，pH7.4透析2小時，並且在更換緩衝液後用相同緩衝液透析過夜。透析後，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析測定。
免疫原性肽與包裝有Poly(IC)的VLP的偶聯對包裝有Poly(IC)的QβVLP(1mg/ml)進行衍化，並且與如實施例12所述的p33肽(KAVYNFATM-GGC)(SEQ ID NO82)或MelanA肽(MelanA 16-35A/L CGHGHSYTTAEELAGIGILTV)(SEQ ID NO55)偶聯，分別得到Qb-pIC-33和Qb-pIC-MelanA VLP。為了與MelanA肽偶聯，包裝的QβVLP用2.1倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25℃下衍化0.5小時，然後在4℃下用20mM HEPES，pH7.4進行兩次透析步驟，以除去未反應的SMPH。加入2.1倍摩爾過量的肽，使之在恆溫混勻器中25℃反應1.5小時。樣品在300,000 MWCO Spectra/PorCE Dispo透析器中用20mM Hepes，pH7.2在4℃下透析3小時，並且在更換緩衝液後用相同緩衝液透析過夜。透析後，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析來測定。肽p33和肽MelanA與Qβ的偶聯通過在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠上進行的SDS-PAGE來分析。如實施例7所述，利用1％瓊脂糖凝膠，以及在蛋白酶K消化後利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。
Poly(IC)包裝到ZnSO4處理的Qβ VLP內以及與MelanA肽偶聯產生Qb-pIC-MelanA VLP通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上可見的螢光信號表明存在核酸，它與在考馬斯藍染色凝膠後可見的蛋白帶共遷移，證明了包裝。MelanA肽的偶聯效率通過在16％PAGE Tris-甘氨酸凝膠上進行的SDS-PAGE分析來估計。多偶聯產物顯現為比不與肽反應的Qβ VLP單體亞單位遷移慢的條帶。MelanA的偶聯效率與Qb-G8-8-33 VLP獲得的偶聯效率(實施例12)大體上相當，但是略低。向Qb-pIC-MelanA內的包裝效率可以根據TBE/尿素凝膠來估計；Qβ中Poly(IC)的包裝量約為25pmol，在MelanA偶聯後仍然相同。
對包裝有Poly(IC)的AP205VLP(1mg/ml)進行衍化，並且與含有N端C延伸的MelanA 16-35A/L(cGHGHSYTTAE ELAGIGILTV)(SEQ ID NO55)偶聯，產生AP205-G8-8-MelanA VLP。AP205 VLP在20mM Hepes，pH7.4中用20倍摩爾過量的SMPH在25℃下衍化0.5小時，然後用20mM HEPES，pH7.4在4℃下透析兩次，以除去未反應的SMPH。向透析過的衍化混合物中加入10倍摩爾過量的肽，使之在恆溫混勻器中25℃反應2小時。樣品在4℃下在10,000 MWCO透析管中用20mM Hepes pH7.4透析2小時，並且在更換緩衝液後用相同的緩衝液透析過夜。透析後，樣品如實施例11所述澄清，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析來測定。肽MelanA 16-35 A/L與AP205的偶聯效率通過在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠上進行的SDS-PAGE來分析。如實施例7所述，利用1％瓊脂糖凝膠，以及在蛋白酶K消化後利用TBE凝膠來分析Poly(IC)的包裝。
Poly(IC)向ZnSO4處理的AP205 VLP內的包裝以及與MelanA肽偶聯後的偶聯產物AP205-pIC-MelanA通過瓊脂糖凝膠電泳分析。經16％ PAGE Tris-甘氨酸凝膠電泳進行SDS-PAGE分析後，根據多偶聯產物的出現來估計MelanA肽的偶聯效率，這些偶聯產物顯示為比不與肽反應的AP205 VLP亞單位單體遷移更慢的條帶。包裝效率可以根據TBE凝膠來估計。
實施例15向HBcAg VLP內包裝側翼為鳥苷的免疫刺激性寡核苷酸HBcAg VLP在如實施例9所述的低離子強度條件(20mM HepespH 7.4)下用RNaseA處理，以水解VLP的RNA內容物。用20mMHepes，pH7.4透析後，VLP與側翼為鳥苷的寡核苷酸(表3；G3-6，G7-7，G8-8，G9-9，G10-PO或G6，在10mM Tris pH8中的1mM貯存液)混合，如實施例12所述孵育。然後用Benzonase處理VLP，並在300,000 MWCO管中透析。如實施例7所述，利用1％瓊脂糖凝膠、以及在蛋白酶K消化後利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。
實施例16向GA VLP內包裝側翼為鳥苷的免疫刺激性寡核苷酸GA VLP在如實施例9所述的低離子強度條件(20mM Hepes pH7.4)下用RNaseA處理，以水解VLP的RNA內容物。用20mM Hepes，pH 7.4透析後，VLP與側翼為鳥苷的寡核苷酸(表3；G3-6，G7-7，G8-8，G9-9，G10-PO或G6，在10mM Tris pH8中的1mM貯存液)混合，並如實施例12所述孵育。之後用Benzonase處理VLP，並在300,000 MWCO管中透析。如實施例7所述，利用1％瓊脂糖凝膠、以及在蛋白酶K消化後利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。
實施例17向HBcAg VLP內包裝核糖核酸HBcAg VLP在如實施例11所述的低離子強度條件(20mM HepespH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4處理，並且如實施例12所述用20mM Hepes，pH7.4透析。向HBcAg VLP(1-1.5mg/ml)中加入10倍摩爾過量的Poly(IC)，如實施例14所述在恆溫混勻器中以650rpm 37℃孵育3小時。隨後在恆溫混勻器中以300rpm，在2mM MgCl2存在下與每ml VLP混合物125U Benzonase 37℃孵育3小時，從而酶水解過量的游離Poly(IC)。樣品如實施例11所述在Benzonase水解後澄清，並且如實施例14所述透析。透析後，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析測定。將包裝有Poly(IC)的HBcAg VLP(1mg/ml)進行衍化並且與MelanA偶聯，如實施例14所述透析。
實施例18向GA VLP內包裝核糖核酸GA VLP在如實施例11所述的低離子強度條件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4處理，並且如實施例12所述用20mM Hepes，pH7.4透析。向GA VLP(1-1.5mg/ml)中加入10倍摩爾過量的Poly(IC)，如實施例14所述在恆溫混勻器中以650rpm 37℃孵育3小時。隨後在恆溫混勻器中以300rpm，在2mMMgCl2存在下與每ml VLP混合物125U Benzonase 37℃孵育3小時，從而酶水解過量的游離Poly(IC)。樣品如實施例11所述在Benzonase水解後澄清，並且如實施例14所述透析。透析後，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質濃度通過Bradford分析測定。將包裝有Poly(IC)的GA VLP(1mg/ml)進行衍化並與MelanA偶聯，如實施例14所述透析。
實施例19Qβ的解裝配、重裝配及寡脫氧核苷酸的包裝Qβ VLP的解裝配和重裝配解裝配在室溫及攪拌條件下，45mg Qβ VLP(2.5mg/ml，通過Bradford分析測定)在PBS(20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH7.5)中用10mM DTT還原15分鐘。加入氯化鎂至終濃度為700mM後在室溫和攪拌條件下進行15分鐘的第二次孵育，使包裹的宿主細胞RNA沉澱，並伴隨著VLP的分解。溶液在4℃下以4000rpm離心10分鐘(Eppendorf 5810R，下列所有步驟中均使用的固定角轉頭A-4-62)，以從溶液中分離沉澱的RNA。對含有釋放的二聚體Qβ外殼蛋白的上清液進行層析純化步驟。
通過陽離子交換層析和大小排阻層析對Qβ外殼蛋白的兩步純化法解裝配反應的上清液含有二聚體外殼蛋白、宿主細胞蛋白質和剩餘的宿主細胞RNA，將該上清液上SP-Sepharose FF柱(xk16/20；6ml；Amersham Bioscience)。在以5ml/min的流速在室溫下進行的層析過程中，監測260nm和280nm處的吸光度。層析柱用20mM磷酸鈉緩衝液pH7平衡；樣品用水1∶15稀釋，以將電導率調節為低於10mS/cm，以便實現外殼蛋白與該柱的適當結合。用達到20mM磷酸鈉/500mM氯化鈉的分步梯度對結合的外殼蛋白進行洗脫，以約25ml的級分體積收集蛋白質。該柱用0.5M NaOH再生。
第二步，將分離的Qβ外殼蛋白二聚體(從陽離子交換柱上洗脫下來的級分)上到(分兩次)用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉；pH6.5平衡的Sephacryl S-100HR柱上(xk26/60；320ml；Amersham Bioscience)。在室溫下以2.5ml/min的流速進行層析。監測260nm和280nm處的吸光度。以每份5ml收集級分。該柱用0.5M NaOH再生。
通過透析重裝配在寡脫氧核苷酸G8-8或G10-PO的存在下QβVLP的重裝配使用濃度為2mg/ml的純化Qβ外殼蛋白二聚體的貯存液。重裝配混合物中寡脫氧核苷酸的濃度為10μM。重裝配混合物中外殼蛋白二聚體的濃度為40μM(約1.13mg/ml)。向溶液中加入尿素和DTT的貯存液，使終濃度分別為1M尿素和5mM DTT。加入寡脫氧核苷酸作為最後的成分，並且加入H2O，使重裝配反應的終體積為3ml。該溶液在4℃下用1500ml含有20mM TrisHCl、150mM NaCl pH8.0的緩衝液透析72小時。透析後的重裝配混合物在4℃下以14000rpm離心10分鐘。棄去微量的沉澱，而上清液中含有重裝配且包裝的VLP。重裝配且包裝的VLP用離心過濾裝置(Millipore，UFV4BCC25，5K NMWL)濃縮至蛋白質終濃度為3mg/ml。蛋白質濃度通過Bradford分析來測定。
利用大小排阻層析純化重裝配且包裝的VLP將可達10mg的總蛋白質上到用20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4平衡的SepharoseTMCL-4B柱上(xk16/70，Amersham Biosciences)。在室溫下以0.4ml/min的流速進行層析。監測260nm和280nm處的吸光度。觀察到兩個峰，以0.5ml的級分體積收集，並且通過SDS-PAGE分析。通過非還原SDS-PAGE分析重裝配且純化的Qβ衣殼中的二硫鍵模式。5μg所述衣殼與不含還原劑的樣品緩衝液(含有SDS)混合，並加樣到16％Tris-甘氨酸凝膠上。電泳完成後，凝膠用考馬斯藍染色。與從大腸桿菌中純化的「完整」衣殼相比，重裝配的Qβ VLP展示相同的二硫鍵模式，具有對應於Qb外殼蛋白的二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體的條帶。用來自大腸桿菌的完整和高度純化的Qβ衣殼校準該柱顯示第一主峰的表觀分子量與Qβ衣殼相符。
通過滲濾重裝配(優化的方法)20ml純化外殼蛋白的貯存液(1.5mg/ml)與尿素、DTT、寡脫氧核苷酸G10-PO的貯存液和水混合。加入寡脫氧核苷酸作為最後的成分。該混合液的體積為30ml，各成分的終濃度為35μM二聚體外殼蛋白(對應於1mg/ml)、35μM寡脫氧核苷酸、1M尿素和2.5mM DTT。然後在正切流動過濾裝置中使用Pellicon XL膜柱(Biomax 5K，Millipore)，在室溫下用300ml 20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉，pH7.2滲濾該混合物。總流速設置為10ml/min，滲透流速設置為2.5ml/min。滲濾步驟結束後，向溶液中加入H2O2至終濃度為7mM，溶液進一步在室溫下孵育60分鐘，以加速形成的VLP中結構二硫鍵的形成。通過使用Pellicon XL膜柱(PLCMK 300K，Millipore)，用600ml 20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉，pH7.2進行第二次滲濾，來去除未摻入的寡脫氧核苷酸和外殼蛋白。
在寡脫氧核苷酸存在下重裝配的Qβ VLP的分析A)重裝配衣殼的流體動力學大小在寡脫氧核苷酸G8-8存在下重裝配的Qβ衣殼通過動態光散射(DLS)進行分析，並與從大腸桿菌中純化的完整Qβ VLP進行比較。重裝配的衣殼顯示與完整Qβ VLP相同的流體動力學大小(取決於質量和構象)。
B)重裝配的衣殼中二硫鍵的形成重裝配的Qβ VLP通過非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析，並與從大腸桿菌中純化的完整QβVLP進行比較。重裝配的衣殼顯示與完整Qβ VLP(如上所述)相似的帶型，存在二硫鍵連接的五聚體和六聚體形式的外殼蛋白。
C)通過變性聚丙烯醯胺TBE-尿素凝膠電泳對在寡脫氧核苷酸存在下重裝配的Qβ VLP的核酸內容物進行分析在2mM MgCl2存在下，含有G8-8寡脫氧核苷酸的重裝配的Qβ VLP(0.4mg/ml)與每mlQβ VLP 125 U benzonase一起37℃孵育2小時。隨後如實施例7所述，用蛋白酶K(PCR級，Roche Molecular Biochemicals，貨號1964364)處理經benzonase處理的Qβ VLP。反應液然後與TBE-尿素樣品緩衝液混合，並加樣到15％聚丙烯醯胺TBE-尿素凝膠上(Novex，Invitrogen，貨號EC6885)。將1pmol、5pmol和10pmol用於重裝配反應的寡脫氧核苷酸加樣到同一塊凝膠上，作為定性及定量標準。該凝膠用SYBR-Gold(Molecular Probes貨號S-11494)染色。SYBR-Gold染色顯示，重裝配的Qβ衣殼含有與重裝配反應中使用的寡脫氧核苷酸共遷移的核酸。在寡脫氧核苷酸存在下重裝配的Qβ VLP的核酸內容物對benzonase消化具有抗性，而且通過蛋白酶K消化從純化的顆粒中分離到寡脫氧核苷酸，將這些綜合起來，證明了寡脫氧核苷酸的包裝。
實施例20來源於MelanA黑素瘤抗原的肽與Qb的偶聯表4.化學合成下列MelanA肽部分
*A/L表示與原始野生型MelanA肽相比，丙氨酸變為賴氨酸**來自接頭序列的胺基酸用小寫字母表示
MelanA肽部分與Qb VLP的化學偶聯使用下列程序對於肽MelanA 16-35、MelanA 16-35A/L和MelanA 26-35-C A/L2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液與18.4μl 50mM SMPH(琥珀醯亞胺基-6-(β-馬來醯亞氨基丙醯氨基)己酸，Pierce)在DMSO中的溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液然後用2L 20mM Hepes，pH7.2在4℃下透析2次各2小時。2ml透析過的反應混合物然後與18.4μl 50mM肽貯存液(溶於DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合物然後在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯產物被稱為Qb-MelanA 16-35(SEQ ID NO54)、Qb-MelanA 16-35 A/L(SEQ ID NO55)和Qb-MelanA 26-35-C A/L(SEQ ID NO60)。對於MelanA 26-352ml 3.06mg/ml Qb衣殼蛋白在20mM Hepes，pH7.2中的溶液與75.3μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液然後在4℃下用2L 20mMHepes，pH7.2透析兩次各2小時。2ml透析過的反應混合物然後與37.7μl 50mM肽貯存液(溶於DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合物然後在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯產物被稱為Qb-MelanA 26-35。
對於MelanA 26-35A/L(SEQ ID NO57)2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液與37.7μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液然後在4℃下用2L 20mMHepes，pH7.2透析2次各2小時。2ml透析後的反應混合物然後與18.4μl 50mM肽貯存液(溶於DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合物然後在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯產物被稱為Qb-MelanA 26-35A/L。
對於MelanA 20-40A/L(SEQ ID NO58)2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液與18.4μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液然後在4℃下用2L 20mMHepes，pH7.2透析2次各2小時。2ml透析後的反應混合物然後與184μl 50mM肽貯存液(溶於DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合物然後在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯產物被稱為Qb-MelanA 20-40 A/L。
對於MelanA 26-40A/L(SEQ ID NO59)2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液與37.7μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液然後在4℃下用2升20mMHepes，pH7.2透析2次各小時。2ml透析後的反應混合物然後與184μl5mM肽貯存液(溶於DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合物然後在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯產物被稱為Qb-MelanA 26-40A/L。
偶聯效率通過SDS-PAGE分析來檢測。圖1顯示Qb-MelanA VLP的SDS-PAGE分析。MelanA-肽與Qb VLP偶聯。終產物與樣品緩衝液混合，並且在125V電壓和還原條件下在16％ Novex Tris-甘氨酸凝膠上分離1.5小時。通過將凝膠浸沒在考馬斯藍溶液中來染色分離的蛋白質。在50％甲醇、8％乙酸中洗滌凝膠以除去背景染色。分子量標準(P 77085，New England BioLabs，Beverly，USA)用作Qb-MelanA遷移速度的參照(泳道1)。加樣14μg單獨的Qb(泳道2)或用SMPH衍化的Qb(泳道3)，與8μg的下列各種終產物進行比較Qb-MelanA16-35(泳道4)，Qb-MelanA 16-35A/L(泳道5)，Qb-MelanA 26-35(泳道6)和Qb-MelanA 26-35A/L(泳道7)。
MelanA 16-35A/L肽含有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位MelanA26-35，進一步研究Qb-MelanA 16-35A/L在體外和體內的免疫原性。
實施例21Qβ MelanA 16-35A/L VLP被樹突細胞加工，並且在體外呈遞給T細胞MelanA-特異性T細胞的體外產生為了評價Qb-MelanA 16-35 A/L疫苗的免疫原性，在體外產生MelanA-特異性T細胞。如前所述(Salusto，F.et al.1994，J.Exp.Med.1791109)，從HLA-A2健康志願者中獲得未成熟的單核細胞來源的樹突細胞(DC)。在37℃下對DC(0.5×106/孔)進行模擬脈衝或用40μg/ml Qb-MelanA 16-35A/L脈衝2小時。為了提高MelanA-特異性CTL前體的頻率，通過磁力分選(Miltenyi Biotech)從PBMC中分離自體CD8T細胞。向抗原脈衝的DC中加入1×106/孔CD8T細胞。在第3天向細胞培養物中加入濃度為10U/ml的IL-2，到第12天提高到可達50U/ml。
如前所述(Romero，P.et al，1998，J.Exp.Med.1998，1881641)，通過用由載有MelanA 26-35肽的HLA-A2(HLA-A2-MelanA-PE)製得的藻紅蛋白(PE)-標記的四聚體染色，分析細胞系中MelanA-特異性CD8T細胞的擴增。細胞在室溫下用HLA-A2-MelanA 26-35-PE標記1小時，然後加入抗-CD8-FITC抗體(BD PharMingen，San Jose，USA)，在冰上保持30分鐘。洗滌後，利用CellQuest軟體在FACS Calibur上分析細胞。在前向散射和側向散射中獲得細胞，並且門控(gate)淋巴細胞。從該淋巴細胞群體中只選擇CD8陽性T細胞進行進一步分析。MelanA-特異性CD8+T細胞的量計算為HLA-A2-MelanA陽性細胞佔CD8+淋巴細胞的百分數。Qb-MelanA 16-35 A/L疫苗誘導MelanA26-35 A/L-特異性CTL(CD8 T細胞的9.7％)增殖，證明該疫苗被人DC有效吸收，被加工為CTL表位(MelanA 26-35 A/L)，並且被呈遞給T細胞。
如前所述(Knuth，A.1989，PNAS，862804)，MelanA CTL通過FACS分選法富集(FACSVantage，Becton Dickenson)，並且通過有限稀釋來克隆。選擇CTL克隆用HLA-A2-MelanA-PE四聚體進行正染色。CTL定期用植物凝集素活化的照射的異源PBMC再刺激。
CTL克隆的抗原識別的分析進行51Cr釋放試驗，來分析MelanA CTL克隆的功能活性。APC與10-6M MelanA 26-35 A/L肽一起孵育1.5小時，或者與10-6M流感M1肽孵育作為陰性對照。APC與Cr51孵育，以測定肽脈衝時放射性核苷酸的非特異性攝取。在充分洗滌以除去殘留的抗原和放射性後，104/孔APC與不同數量的MelanA特異性T細胞一起孵育5小時。收集上清液，按照下列公式計算MelanA特異性T細胞對呈遞MelanA的APC的特異性裂解％特異性裂解＝((cpm實驗-cpm自發)/(cpm最大-cpm自發))×100，其中cpm實驗是實驗樣品中測得的放射性計數，cpm自發是不加入T細胞而從51Cr脈衝的APC中獲得的計數，cpm最大是從用1％NP-40裂解的51Cr脈衝的APC中獲得的計數。
載有MelanA 26-35 A/L而不載有無關M1肽的APC被CTL有效裂解(70-85％特異性裂解)，這證實了CTL克隆的抗原特異性。
實施例22免疫刺激性序列(ISS)在體外激活人細胞的能力為了選擇將要裝入Qb-MelanA疫苗中的最佳ISS，檢測含有不同數量側翼G或雙鏈RNA如Poly(IC)的系列CpG上調人CD8 T細胞上的CD69以及誘導人PBMC分泌IFNα和IL-12的能力。
從血沉棕黃層中分離人PBMC，在含有10％ FCS的RPMI培養基中用所述ISS處理18小時。使用PBL Biomedical Laboratories提供的抗體組，通過ELISA測定上清液中的IFNα。PBMC周小鼠抗人CD8-FITC、小鼠抗人CD19-PE和抗人CD69-APC染色，並且通過流式細胞法分析。G10-PO是在誘導IFNα分泌方面最具活性的ISS(圖2A)。G9-9和G8-8比G10-PO活性略低，儘管它們也誘導高水平的IFNα分泌。減少其它寡核苷酸中的側翼G的數量導致IFNα分泌減少。Poly(IC)處理的PBMC不釋放任何IFNα，儘管Poly(IC)處理的來自PBMC的T細胞和B細胞上調CD69(圖2B)。Poly(IC)也誘導PBMC和單核細胞來源的DC分泌IL-12。
用G10-PO、G9-9和G8-8處理PBMC將CD8T細胞的細胞膜上的CD69上調到幾乎相似的程度。減少其它寡核苷酸中側翼G的數量(少於7個)降低了它們誘導IFNα分泌(圖2A)和上調T細胞上的CD69的能力(圖2B)。這些數據表明，G10-PO、G9-9和G8-8對人細胞有相似的高活性，因此它們能夠在Qb-MelanA疫苗中用作ISS。
實施例23G10-PO增強MelanA-特異性T細胞的體外擴增在存在或不存在G10-PO的條件下檢測了Qb-MelanA VLP誘導MelanA特異性CTL體外增殖的能力。未成熟的人單核細胞來源的DC(0.5×106/孔)如實施例21所述用Qb-MelanA 16-35 A/L或MelanA26-35A/L肽脈衝或模擬脈衝。人單核細胞來源的DC是toll樣受體-9(TLR-9)陰性的，因此不對CpG應答。人PBMC中存在的B細胞和類漿細胞DC是TLR-9陽性的，響應CpG處理產生細胞因子(IFNα、IL-12)。為了研究G10-PO對單核細胞來源的DC的抗原呈遞能力的作用，洗滌抗原脈衝的DC，並且在存在或不存在2μM G10-PO的條件下將其與1×106自體PBMC一起孵育2小時。向APC中加入通過磁力分選分離的自體CD8T細胞(1×106)，使用實施例21所述的細胞培養條件孵育12天。MelanA-特異性CTL通過HLA-A2-MelanA-PE四聚體染色和流式細胞分析來檢測。向Qb-MelanA-脈衝的DC中加入G10-PO提高了特異性CTL的頻率(從10％到14％)，這表明CpG刺激產生的細胞因子環境有利於CTL的體外擴增。
實施例24載有G3-6、G6、G10-PO或Poly(IC)的Qbx33 VLP誘導對抗p33-重組痘苗病毒攻擊的保護B6小鼠用單獨的Qbx33或載有G3-6或G6或Poly(IC)的Qbx33(參見實施例12和14)皮下免疫。8天後，小鼠用1.5×106pfu的表達LCMV-p33抗原的重組痘苗病毒進行攻擊。4天後，殺死小鼠，如前所述測定卵巢中的病毒滴度(Bachmann et al，Eur.J.Imunol.1994，242228)。如圖3所示，接受載有G3-6或G6或Poly(IC)的Qbx33疫苗的所有小鼠都受到對抗病毒攻擊的保護。相反，幼稚(naive)小鼠和用單獨的Qbx33免疫的小鼠未從卵巢中清除病毒。這些數據證明，單獨的VLP不足以誘導保護性CTL免疫應答，而載有CpG或Poly(IC)的VLP在引發幼稚CTL方面非常有效。
同樣，用載有G10-PO的Qbx33免疫小鼠引發了p33特異性CTL(6.2％+/-1.4％，相對於幼稚小鼠中的0.2％+/-0.1％)，並且誘導了對抗重組痘苗病毒攻擊的保護。
實施例25在HLA-A2轉基因小鼠中，Qβ MelanA 16-35A/L VLP被加工並且被人MHC I類等位基因HLA-A0201呈遞，並且誘導功能性MelanA-特異性CD8+T細胞的擴增HHD小鼠表達嵌合單鏈I類分子，該分子含有的人β2-微球蛋白共價連接到與Db α3域融合的A2 α1和α2域的N端(Firat，H.et al1999，Eur.J.Immunol.，293112)。HLA-A2轉基因在這些小鼠中的表達允許研究Qβ MelanA 16-35A/L VLP被加工並且被作為CTL表位MelanA 26-35呈遞以及在體內引發CTL的能力。此外，也能夠在體內研究佐劑作為ISS的作用。
HHD小鼠不予處理或者通過皮下注射100μg Qb-MelanA 16-35A/L或Qb-pIC-MelanA 16-35 A/L進行免疫。8天後分離脾細胞，將其重懸浮於FACS緩衝液(PBS，2％ FCS，5mM EDTA，pH8.2)，用HLA-A2-MelanA-PE標記的四聚體在室溫下染色30分鐘。第二步，加入大鼠抗小鼠CD8-APC(BD PharMingen，San Jose，USA)和抗小鼠Mel14-FITC(BD PharMingen，San Jose，USA)，4℃下保持30分鐘。洗滌後，在室溫下用BD-裂解溶液(BD Biosciences，San Jose，USA)裂解紅細胞10分鐘。最後，利用CellQuest軟體在FACS Calibur上分析脾細胞。首先，在前向散射和側向散射中獲得細胞，並且門控淋巴細胞。從該淋巴細胞群體中只選擇CD8陽性T細胞進行進一步分析。HLA-A2-MelanA-PE和Me114-FITC標記的細胞分別用FL2和FL1檢測器檢測。MelanA-特異性活化CD8+T細胞的量計算為HLA-A2-MelanA陽性Mel14陰性細胞佔總CD8+淋巴細胞的百分數。
流式細胞分析表明，Qb-pIC-MelanA 16-35 A/L誘導MelanA-特異性活化CD8+Mel14-T細胞的高得驚人的擴增(2.43％和0.73％)，其高於未處理的動物(0.22％和0.37％)。應當指出，只有當Qb-MelanA載有Poly(IC)時該疫苗的能力才顯著提高。
如上所述使用的人HLA-A2-MelanA四聚體不能非常有效地與小鼠MelanA-特異性T細胞結合，因為該蛋白質是嵌合蛋白。因此，我們可以假定在這些小鼠中有相當高程度的抗原特異性T細胞。
在一個類似的實驗中，我們通過用與CpG和IFA混合的肽接種分析了Qb-G10-MelanA 16-35 A/L在體內引發CTL的效率。HHD小鼠用200μg Qβ-G10-MelanA 16-35A/L免疫，或者用與20nmol CpG和弗氏不完全佐劑(IFA)混合的50μg MelanA 16-35A/L免疫，或者不予處理。8天後從脾臟中分離活淋巴細胞，對MelanA-特異性CD8+T細胞進行染色。在37℃下和FACS緩衝液中，用PE-標記的對於載有MelanA 26-35肽的嵌合HLA-A2α1α2Kbα3MHC I類分子特異的四聚體染色1.5小時。第二步，加入大鼠抗小鼠CD8-APC(BD PharMingen，San Jose，USA)和抗小鼠Mel14-FITC(BD PharMingen，San Jose，USA)，在4℃下保持30分鐘。最後，使用CellQuest軟體在FACS Calibur上分析脾細胞。
流式細胞分析顯示，Qβ-G10-MelanA 16-35A/L誘導MelanA-特異性活化CD8+Mel14-T細胞的擴增(18.2％)，其高於未處理的動物(2％)或接受與20nmol CpG和IFA混合的等摩爾量MelanA A/L 16-35的動物(2.0％)。應當指出，只有在Qb-MelanA載有G10-PO時該疫苗的能力才提高。
在一個類似的實驗方案中，用載有G8-8或G10-PO的Qb-MelanA16-35 A/L或Qb-MelanA 26-35 A/L免疫HHD小鼠誘導了HLA-A2-MelanA-陽性且Mel14陰性CD8T細胞的擴增。
這些發現綜合進來證明了載有ISS的Qb-肽疫苗非常有效地引發針對外源及自身抗原的CTL的能力。
實施例26載有CpG的Qbx33能夠在用於誘導長期記憶CD8+T細胞應答的同源及異源引發-加強方案中使用小鼠用150μg Qbx33/NKCpG免疫，8天後經抗原特異性MHC/肽四聚體測定，p33特異性T細胞的頻率從幼稚小鼠中的0.4％+/-0.2％升高為免疫動物中的7.5％+/-2.2％。20天後，肽特異性CD8+T細胞群體降至1.6％+/-0.7％。第一次免疫30天後用150μg Qbx33/NKPS對這些小鼠進行第二次免疫能夠加強記憶T細胞應答至可達8.4％+/-1.9％特異性T細胞。該應答緩慢降低，但是能夠在第一次加強4個月後用150μg Qbx33/NKPS再次加強，達到23.8％+/-5.2％的T細胞水平。
當3隻小鼠用與20nmol NKPS和IFA混合的50μg p33肽引發時，到免疫後第8天只能誘導0.6％+/-0.4％的特異性CD8+T細胞。但是，這種低應答能夠在7周後用Qbx33/NKPS有效加強，達到28.5％+/-9.8％的水平。
用1×106噬斑形成單位的表達p33-肽的重組痘苗病毒免疫幾乎不能誘導任何T細胞應答(1.1％+/-0.5％)，但是在6個月後能夠用150μgQbx33/NKPS非常有效地加強，達到28.1+/-4.2％的T細胞水平。
這些結果表明，在異源以及同源引發加強方案中，載有CpG的Qb能夠非常有效地加強任何預先存在的T細胞應答。應當指出，Qb/NKPS甚至能夠加強用肽或重組病毒幾乎無法引發的T細胞應答。另外，當用Qbx33/NKPS誘導強T細胞應答時，我們能夠用免疫有效量的異種疫苗如單獨的p33肽、表達p33的重組病毒、或與VLP融合或偶聯的p33來加強這種應答。在後一種情況中，使用的VLP不是來源於RNA噬菌體Qb的VLP，而是例如HBcAg或來源於AP205的VLP。
序列表110賽託斯生物技術公司巴赫曼，馬丁馬諾勒夫，瓦尼阿麥亞林克，埃德溫普羅巴，卡爾施萬茨，卡特林120MelanA-肽類似物-載體偶聯物130PA058WO150US 60/457,3481512003-03-2616094170PatentIn version 3.2210121110212DNA213人工序列220
223寡核苷酸ISS4001gacgatcgtc 10210221119212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G3-64002ggggacgatc gtcgggggg 192103
21120212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G4-64003gggggacgat cgtcgggggg 20210421121212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G5-64004ggggggacga tcgtcggggg g21210521122212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G6-64005gggggggacg atcgtcgggg gg 22210621124212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G7-74006
ggggggggac gatcgtcggg gggg24210721126212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G8-84007ggggggggga cgatcgtcgg gggggg 26210821128212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G9-94008gggggggggg acgatcgtcg gggggggg28210921130212DNA213人工序列220
223寡核苷酸G64009ggggggcgac gacgatcgtc gtcggggggg 3021010211132212PRT213噬菌體Q-beta
40010Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr13021011211328212PRT213噬菌體Q-beta40011
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser130 135 140Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro Gly145 150 155 160Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu Val165 170 175
Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala Val180 185 190Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu Gly195 200 205Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr Phe210 215 220Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr Leu225 230 235 240Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu Gly245 250 255Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Lys260 265 270Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His Ala275 280 285Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly Ala290 295 300Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile Gln305 310 315 320Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala32521012211362212PRT
213BK病毒40012Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Cys Pro Gly Ala Ala Pro Lys1 5 10 15Lys Pro Lys Glu Pro Val Gln Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys Gly Gly20 25 30Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr Gly Val Asp Ala Ile Thr Glu Val35 40 45Glu Cys Phe Leu Asn Pro Glu Met Gly Asp Pro Asp Asp Asn Leu Arg50 55 60Gly Tyr Ser Gln His Leu Ser Ala Glu Asn Ala Phe Glu Ser Asp Ser65 70 75 80Pro Asp Arg Lys Met Leu Pro Cys Tyr Ser Thr Ala Arg Ile Pro Leu85 90 95Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr Cys Gly Asn Leu Leu Met Trp Glu100 105 110Ala Val Thr Val Lys Thr Glu Val Ile Gly Ile Thr Ser Met Leu Asn115 120 125Leu His Ala Gly Ser Gln Lys Val His Glu Asn Gly Gly Gly Lys Pro130 135 140Val Gln Gly Ser Asn Phe His Phe Phe Ala Val Gly Gly Asp Pro Leu145 150 155 160
Glu Met Gln Gly Val Leu Met Asn Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Gln Gly165 170 175Thr Ile Thr Pro Lys Asn Pro Thr Ala Gln Ser Gln Val Met Asn Thr180 185 190Asp His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Val Glu Cys195 200 205Trp Ile Pro Asp Pro Ser Arg Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr210 215 220Tyr Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Val Thr Asn Thr225 230 235 240Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Gln Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys245 250 255Ala Asp Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ala Asp Ile Cys Gly Leu Phe Thr260 265 270Asn Ser Ser Gly Thr Gln Gln Trp Arg Gly Leu Ala Arg Tyr Phe Lys275 280 285Ile Arg Leu Arg Lys Arg Ser Val Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe290 295 300Leu Leu Ser Asp Leu Ile Asn Arg Arg Thr Gln Lys Val Asp Gly Gln305 310 315 320Pro Met Tyr Gly Met Glu Ser Gln Val Glu Glu Val Arg Val Phe Asp325 330 335
Gly Thr Glu Gln Leu Pro Gly Asp Pro Asp Met Ile Arg Tyr Ile Asp340 345 350Arg Gln Gly Gln Leu Gln Thr Lys Met Val355 36021013211130212PRT213噬菌體fr40013Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr100 105 110Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125Ile Tyr13021014211130212PRT213噬菌體GA40014Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125
Tyr Ala13021015211594212DNA213人工序列220
223含有來自LCMV的p33的HBcAg220
221CDS222(1)..(594)40015atg gac att gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc48Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac96Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60ttg atg act cta gct acc tgg gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80tcc agg gat cta gta gtc aat tat gtt aat act aac atg ggt tta aag288Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95atc agg caa cta ttg tgg ttt cat ata tct tgc ctt act ttt gga aga336Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110gag act gta ctt gaa tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act384Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125cct cca gcc tat aga cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg432Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140gaa act act gtt gtt aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga480Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160aga act ccc tcg cct cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga528Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175aga tct caa tct cgg gaa tct caa tgt ctt ctc ctt aaa gct gtt tac576Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr180 185 190aac ttc gct acc atg taa594Asn Phe Ala Thr Met19521016211197212PRT213人工序列220
223含有來自LCMV的p33的HBcAg40016Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr180 185 190Asn Phe Ala Thr Met195
21017211246212DNA213人工序列220
223用於BKV包裝和穩定的dsDNA片段40017ggcggtggtg tcagatctac aatgatcgtc atcaccttgg tgatgctgaa gaagaaacag 60tacacatcca ttcatcatgg tgtggtggag gttgacgccg ctgtcacccc agaggagcgc 120cacctgtcca agatgcagca gaacggctac gaaaatccaa cctacaagtt ctttgagcag 180atgcagaacg ctagctatcc atacgatgtc cctgattacg cctaacgcga attcgccagc 240acagtg 246210182115212PRT213人工序列220
223GGKGG接頭40018Gly Gly Lys Gly Gly1 521019211128212PRT213噬菌體PP740019Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 12521020211132212PRT213噬菌體Q-beta40020Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr13021021211132212PRT213噬菌體Q-beta40021Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr13021022211132212PRT213噬菌體Q-beta40022Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr13021023211132212PRT213噬菌體Q-beta40023Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr13021024211132212PRT213噬菌體Q-beta40024Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Ash Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr13021025211184212PRT213B型肝炎病毒40025Met Asp Ile Asp Pro Tyr Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser1 5 10 15Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr20 25 30Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser35 40 45
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu50 55 60Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser65 70 75 80Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile85 90 95Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu100 105 110Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro115 120 125Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu130 135 140Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg145 150 155 160Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg165 170 175Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys18021026211213212PRT213B型肝炎病毒40026Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser195 200 205Arg Glu Ser Gln Cys21021027211188212PRT213B型肝炎病毒40027Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu1 5 10 15Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp20 25 30Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu50 55 60Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln65 70 75 80Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys85 90 95Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln100 105 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys180 18521028211185212PRT213B型肝炎病毒40028Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 18521029211152212PRT213B型肝炎病毒40029Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val145 150210302113635212DNA213人工序列220
223質粒pAP283-58
40030cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga 120ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt 180gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt 240taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg 300tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca 360atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg 420ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt 480ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata 540gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 600taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc 660atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 720taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 780agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg 840gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 900gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 960tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg1020ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta1080caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat1140ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc1200ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc1260accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta1320
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg1380ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg1440ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt1500attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt1560gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg1620ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa1680cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt1740gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag1800tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt1860gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga1920ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt1980tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta2040gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcecgg2100caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc2160cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt2220atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg2280gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg2340attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa2400cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa2460atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga2520tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg2580ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact2640
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 2700cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2760gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2820gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2880acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 2940gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3000agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3060tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3120agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 3180cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 3240gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca 3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct 3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 3540ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag 3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 363521031211131212PRT213人工序列220
223AP205外殼蛋白
40031Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala13021032211131212PRT213人工序列220
223AP205外殼蛋白40032Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130210332113607212DNA213人工序列
220
223質粒pAP281-3240033cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag 120acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc 300agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc 360agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac 420actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc 480gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat 540acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg 600tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt 660cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt 720caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc 780ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg 840gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca 900ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 960ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1020gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1080caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 1140ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 1200
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc1260ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat1320ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggacccc ctattggttt1380atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct1440tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc1500cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa1560agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg1620taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt1680tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg1740catacactat tctcagaatg acttggtggt acctaccagt cacagaaaag catcttacgg1800atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg1860ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca1920tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa1980acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa2040ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata2100aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat2160ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc2220cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata2280gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt2340actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga2400agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag2460cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa2520
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2580agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2640tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2700acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2760ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2820gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2880gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2940gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 3000tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 3060caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3120ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 3180gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag 3240cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 3300ttggccgatt cattaatgca gctgtggtgt catggtcggt gatcgccagg gtgccgacgc 3360gcatctcgac tgcatggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg 3420tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt 3480ctggataatg ttttttgcgg cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct 3540ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg 3600cggaatt36072103421121212DNA213人工序列
220
223CyCpGpt40034tccatgacgt tcctgaataa t212103521121212DNA213人工序列220
223CyCpG40035tccatgacgt tcctgaataa t212103621120212DNA213人工序列220
223B-CpGpt40036tccatgacgt tcctgacgtt 202103721120212DNA213人工序列220
223B-CpG40037tccatgacgt tcctgacgtt 20
2103821119212DNA213人工序列220
223NKCpGpt40038ggggtcaacg ttgaggggg192103921119212DNA213人工序列220
223NKCpG40039ggggtcaacg ttgaggggg192104021121212DNA213人工序列220
223CyCpG-rev-pt40040attattcagg aacgtcatgg a 212104121130212DNA213人工序列220
223g10gacga-PO(G10-PO)
40041gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 302104221130212DNA213人工序列220
223g10gacga-PS40042gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 302104321162212DNA213人工序列220
223(CPG)200pA40043cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg aaatgcatgt caaagacagc60at 622104421161212DNA213人工序列220
223Cy(CpG)2040044tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc60g61
2104521183212DNA213人工序列220
223Cy(CpG)20-OpA40045tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc60gaaatgcatg tcaaagacag cat832104621143212DNA213人工序列220
223CyOpA40046tccatgacgt tcctgaataa taaatgcatg tcaaagacag cat 432104721163212DNA213人工序列220
223CyCyCy40047tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat60aat 6321048211150212DNA213人工序列
220
223Cy150-140048tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat60aattggatga cgttggtgaa taattccatg acgttcctga ataattccat gacgttcctg 120aataattcca tgacgttcct gaataattcc15021049211253212DNA213人工序列220
223dsCyCpG-25340049ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcgattc atgacttcct gaataattcc60atgacgttgg tgaataattc catgacgttc ctgaataatt ccatgacgtt cctgaataat 120tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat 180aattccatga cgttcctgaa taattccatg acgttcctga aaattccaat caagcttatc 240gataccgtcg acc 2532105021110212PRT213人工序列220
223Melan A 26-35 A/L40050Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10
2105121120212PRT213人工序列220
223Melan A 16-35 A/L40051Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly1 5 10 15Ile Leu Thr Val202105221121212PRT213人工序列220
223MelanA 20-40 A/L40052Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10 15Ile Leu Gly Val Leu202105321114212PRT213人工序列220
223MelanA 26-40 A/L40053Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val1 5 102105421121212PRT213人工序列220
223MelanA 16-3540054Cys Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile1 5 10 15Gly Ile Leu Thr Val202105521121212PRT213人工序列220
223MelanA 16-35 A/L40055Cys Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile1 5 10 15Gly Ile Leu Thr Val20
2105621113212PRT213人工序列220
223MelanA 26-3540056Cys Gly Gly Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 102105721113212PRT213人工序列220
223MelanA 26-35 A/L40057Cys Gly Gly Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 102105821122212PRT213人工序列220
223MelanA 20-40 A/L40058Cys Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr1 5 10 15Val Ile Leu Gly Val Leu20
2105921118212PRT213人工序列220
223MelanA 26-40 A/L40059Cys Gly Gly Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly1 5 10 15Val Leu2106021113212PRT213人工序列220
223MelanA 26-35-C40060Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Gly Gly Cys1 5 102106121135212DNA213人工序列220
223載體pAb185的序列40061tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg 35
210622119212PRT213人工序列220
223N端甘氨酸絲氨酸接頭220
221重複222(1)..(1)223甘氨酸可以重複0至5次220
221重複222(3)..(3)223甘氨酸可以重複0至10次220
221重複222(4)..(4)223絲氨酸可以重複0至2次220
221重複222(5)..(9)223這些殘基可以重複0至3次作為一組40062Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 52106321110212PRT213人工序列220
223C端甘氨酸絲氨酸接頭
220
221重複222(1)..(1)223甘氨酸可以重複0至10次220
221重複222(2)..(2)223絲氨酸可以重複0至2次220
221重複222(3)..(7)223這些殘基可以重複0至3次作為一組220
221重複222(8)..(8)223甘氨酸可以重複0至8次220
221重複222(10)..(10)223甘氨酸可以重複0至5次40063Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10210642115212PRT213人工序列220
223甘氨酸絲氨酸接頭40064Gly Gly Gly Gly Ser
1 52106521110212PRT213人工序列220
223N-端gamma140065Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 102106621110212PRT213人工序列220
223C-端gamma 140066Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 102106721117212PRT213人工序列220
223N-端gamma 340067Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15
Pro2106821118212PRT213人工序列220
223C-端gamma 340068Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly210692116212PRT213人工序列220
223N-端甘氨酸接頭40069Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5210702116212PRT213人工序列220
223C-端甘氨酸接頭
40070Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5210712116212PRT213人工序列220
223C-端甘氨酸-賴氨酸接頭40071Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5210722116212PRT213人工序列220
223N-端甘氨酸-賴氨酸接頭40072Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5210732116212PRT213人工序列220
223N-端接頭140073
Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5210742116212PRT213人工序列220
223N-端接頭240074Cys Gly Asp Glu Gly Gly1 5210752116212PRT213人工序列220
223C-端接頭40075Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5210762116212PRT213人工序列220
223C-端接頭240076Gly Gly Glu Asp Gly Cys
1 5210772114212PRT213人工序列220
223C-端接頭340077Gly Gly Cys Gly12107821110212PRT213人類40078Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10210792119212PRT213人類40079Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5210802119212PRT213人類
40080Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met1 52108121112212PRT213人類40081Cys Gly Gly Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met1 5 102108221112212PRT213人類40082Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met Gly Gly Cys1 5 102108321118212PRT213人類40083Cys Gly Gly Gly Ser Glu Glu Ile Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala1 5 10 15Thr Leu21084
2119212PRT213人類40084Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5210852119212PRT213人類40085Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 52108621110212PRT213人類40086Glu Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 102108721110212PRT213人類40087Glu Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 1021088
21110212PRT213人類40088Tyr Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 102108921110212PRT213人類40089Phe Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10210902119212PRT213人類40090Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe1 521091211118212PRT213人類40091Met Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly1 5 10 15His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile
20 25 30Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys35 40 45Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val50 55 60Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln Glu Gly Phe Asp65 70 75 80His Arg Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu Lys Asn Cys Glu Pro Val85 90 95Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser100 105 110Pro Pro Pro Tyr Ser Pro1152109221116212PRT213人工序列220
223CSPKSL-MelanA 26-35 A/L40092Cys Ser Pro Lys Ser Leu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10 152109321118212PRT
213人工序列220
223MelanA 26-40-C A/L40093Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Gly1 5 10 15Gly Cys21094211118212PRT213人工序列220
223MelanA 1-118 A/L40094Met Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly1 5 10 15His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile20 25 30Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys35 40 45Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val50 55 60Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln Glu Gly Phe Asp65 70 75 80
His Arg Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu Lys Asn Cys Glu Pro Val85 90 95Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser100 105 110Pro Pro Pro Tyr Ser Pro11權利要求
1.一種組合物，其包含(a)病毒樣顆粒；和(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過至少一個共價鍵結合，其中優選地，所述共價鍵是非肽鍵。
3.根據權利要求1的組合物，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒融合。
4.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物能夠允許與MHC分子有效結合。
5.根據權利要求1-4中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物的特徵在於，相對於相應的正常MelanA肽，具有兩個、優選一個胺基酸置換。
6.根據權利要求1-4中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物受到保護而免遭蛋白酶或肽酶介導的降解。
7.根據權利要求1-4中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物具有選自下列的胺基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)；(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)；(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)；(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)；(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)；(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)；和(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)。
8.根據權利要求1-4中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)組成。
9.根據權利要求1-8中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒含有至少一個第一附著位點，並且其中所述抗原或抗原決定簇進一步含有至少一個選自下列的第二附著位點(a)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(b)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒的結合是通過所述第一附著位點與所述第二附著位點之間的連接實現的，其中優選地這種連接是通過至少一個非肽鍵。
10.根據權利要求9的組合物，其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重複的抗原陣列。
11.根據權利要求9或10的組合物，其中所述第一附著位點包含，或者優選地由氨基或賴氨酸殘基組成。
12.根據權利要求9-11中任一項的組合物，其中所述第二附著位點包含，或者優選地由巰基或半胱氨酸殘基組成。
13.根據權利要求9-12中任一項的組合物，其中所述第一附著位點是賴氨酸殘基，並且所述第二附著位點是半胱氨酸殘基。
14.根據權利要求9-13中任一項的組合物，其中所述第一附著位點是氨基，並且所述第二附著位點是巰基。
15.根據權利要求9-14中任一項的組合物，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有選自下列的胺基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；(b)CGGELAGIGILTV(SEQ ID NO57)；(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO58)；(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；(e)ELAGIGILTVGGC(SEQ ID NO60)；(f)CSPKSLELAGIGILTV(SEQ ID NO92)；和(g)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQ ID NO93)。
16.根據權利要求9-14中任一項的組合物，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有胺基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)。
17.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒缺乏含脂蛋白的包膜。
18.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒，其中優選地所述病毒樣顆粒選自(a)B型肝炎病毒的重組蛋白；(b)麻疹病毒的重組蛋白；(c)辛德畢斯病毒的重組蛋白；(d)輪狀病毒的重組蛋白；(e)口蹄疫病毒的重組蛋白；(f)逆轉錄病毒的重組蛋白；(g)諾瓦克病毒的重組蛋白；(h)人乳頭瘤病毒的重組蛋白；(i)BK病毒的重組蛋白；(j)噬菌體的重組蛋白；(k)RNA噬菌體的重組蛋白；(l)Ty的重組蛋白；和(m)(a)-(l)中任何一種重組蛋白的片段。
19.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒是B型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。
20.根據權利要求19的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物與所述B型肝炎病毒核心蛋白或所述BK病毒VP1蛋白的C端融合，優選地通過連接序列融合。
21.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段組成，其中優選地所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
22.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由噬菌體Qβ或噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。
23.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述免疫刺激物是toll樣受體激活物或細胞因子分泌誘導物，其中優選地該Toll樣受體激活物選自，或基本由下列成分組成(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑並喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有機分子；(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一種物質的任意混合物。
24.權利要求23的組合物，其中所述免疫刺激性核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)核糖核酸；(b)脫氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一種核酸的任意混合物。
25.權利要求24的組合物，其中所述核糖核酸是poly-(I:C)或其衍生物。
26.權利要求24的組合物，其中所述脫氧核糖核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
27.權利要求1-24和權利要求26中任一項的組合物，其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸。
28.權利要求27的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列5』X1X2CGX3X43』，其中X1、X2、X3和X4是任一種核苷酸。
29.權利要求28的組合物，其中所述核苷酸X1、X2、X3和X4中的至少一個含有磷酸骨架的修飾。
30.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含、或者基本由、或者由迴文序列組成。
31.權利要求27的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由選自下列的序列組成(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO35)；(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO37)；(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO39)；(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)；和(e)如表2所述的「dsCyCpG-253」(SEQ ID NO49)，其中優選地，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。
32.權利要求27的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO41)組成。
33.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述免疫刺激性核酸，更優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。
34.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒非共價結合。
35.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，與所述病毒樣顆粒非共價結合。
36.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述免疫刺激性核酸，更優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有約6個至約100,000個核苷酸，優選約6個至約2000個核苷酸，更優選約20個至約500個核苷酸，更優選約20個至約100個核苷酸。
37.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述免疫刺激性核酸，更優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，選自(a)重組寡核苷酸；(b)基因組寡核苷酸；(c)合成寡核苷酸；(d)質粒衍生的寡核苷酸；(e)單鏈寡核苷酸；和(f)雙鏈寡核苷酸。
38.權利要求30的組合物，其中所述迴文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO1)組成。
39.權利要求38的組合物，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少3個、至多10個鳥苷，並且其中所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
40.權利要求38的組合物，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少4個、至多10個鳥苷，並且其中所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
41.權利要求38的組合物，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少5個、至多10個鳥苷，並且其中所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
42.權利要求38的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO2)；(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO6)；(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO7)；(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO9)；和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)。
43.權利要求27或38的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQ ID NO7或SEQ ID NO41的核酸序列。
44.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述抗原包含細胞毒性T細胞表位、Th細胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接結合或者通過連接序列結合，並且其中優選地所述細胞毒性T細胞表位是病毒或腫瘤細胞毒性T細胞表位。
45.權利要求44的組合物，其中所述抗原包含至少一種細胞毒性T細胞表位和至少一種Th細胞表位的組合，並且其中所述組合是MelanA 1-118A/L(SEQ ID NO94)。
46.一種增強動物中免疫應答的方法，包括向該動物中導入一種組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結合，並且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。
47.權利要求46的方法，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過至少一個共價鍵結合，其中所述共價鍵是非肽鍵。
48.權利要求46的方法，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒融合。
49.權利要求46-48中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物能夠允許與MHC分子有效結合。
50.權利要求46-49中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物的特徵在於，相對於相應的正常MelanA肽有兩個，優選一個胺基酸置換。
51.權利要求46-50中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物受到保護而免遭蛋白酶或肽酶介導的降解。
52.權利要求46-51中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物具有選自下列的胺基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)；(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)；(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)；(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)；(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)；(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)；和(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)。
53.權利要求46-51中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)組成。
54.權利要求46-53中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒含有至少一個第一附著位點，並且其中所述抗原或抗原決定簇進一步含有至少一個選自下列的第二附著位點(a)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(b)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒的結合是通過所述第一附著位點與所述第二附著位點之間的連接實現的，其中優選地這種連接是通過至少一個非肽鍵。
55.權利要求54的方法，其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重複的抗原陣列。
56.根據權利要求54或55的方法，其中所述第一附著位點包含，或者優選地由氨基或賴氨酸殘基組成。
57.根據權利要求54-56中任一項的方法，其中所述第二附著位點包含，或者優選地由巰基或半胱氨酸殘基組成。
58.根據權利要求54-57中任一項的方法，其中所述第一附著位點是賴氨酸殘基，並且所述第二附著位點是半胱氨酸殘基。
59.根據權利要求54-58中任一項的方法，其中所述第一附著位點是氨基，並且所述第二附著位點是巰基。
60.根據權利要求54-59中任一項的方法，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有選自下列的胺基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；(b)CGGELAGIGILTV(SEQ ID NO57)；(c)CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL(SEQ ID NO58)；(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；和(e)ELAGIGILTVGGC(SEQ ID NO60)；(f)CSPKSLELAGIGILTV(SEQ ID NO92)；和(g)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQ ID NO93)。
61.根據權利要求54-59中任一項的方法，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有胺基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)。
62.根據權利要求46-61中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒，其中優選地所述病毒樣顆粒選自(a)B型肝炎病毒的重組蛋白；(b)麻疹病毒的重組蛋白；(c)辛德畢斯病毒的重組蛋白；(d)輪狀病毒的重組蛋白；(e)口蹄疫病毒的重組蛋白；(f)逆轉錄病毒的重組蛋白；(g)諾瓦克病毒的重組蛋白；(h)人乳頭瘤病毒的重組蛋白；(i)BK病毒的重組蛋白；(j)噬菌體的重組蛋白；(k)RNA噬菌體的重組蛋白；(l)Ty的重組蛋白；和(m)(a)-(l)中任何一種重組蛋白的片段。
63.根據權利要求46-62中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒是B型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP 1蛋白。
64.根據權利要求63的方法，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物與所述B型肝炎病毒核心蛋白或所述BK病毒VP 1蛋白的C端融合，優選地通過連接序列融合。
65.根據權利要求46-64中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的重組蛋白或其片段，其中優選地所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
66.根據權利要求46-65中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由噬菌體Qβ或噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。
67.根據權利要求46-66中任一項的方法，其中所述免疫刺激物是toll樣受體激活物或細胞因子分泌誘導物，其中優選地該Toll樣受體激活物選自，或基本由下列成分組成(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑並喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有機分子；(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一種物質的任意混合物。
68.權利要求67的方法，其中所述免疫刺激性核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)核糖核酸；(b)脫氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一種核酸的任意混合物。
69.權利要求68的方法，其中所述核糖核酸是poly-(I:C)或其衍生物。
70.權利要求68的方法，其中所述脫氧核糖核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
71.權利要求46-68和權利要求70中任一項的方法，其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸。
72.權利要求71的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有序列5』X1X2CGX3X43』，其中X1、X2、X3和X4是任一種核苷酸。
73.權利要求72的方法，其中所述核苷酸X1、X2、X3和X4中的至少一個含有磷酸骨架的修飾。
74.根據權利要求46-73中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含、或者基本由、或者由迴文序列組成。
75.權利要求71的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由選自下列的序列組成(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO35)；(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO37)；(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO39)；(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)；和(e)如表2所述的「dsCyCpG-253」(SEQ ID NO49)；其中優選地，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。
76.權利要求71的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是回文的，並且其中優選地，所述含非甲基化CpG的回文寡核苷酸包含，或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO41)組成。
77.根據權利要求46-76中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述免疫刺激性核酸，更優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。
78.根據權利要求46-77中任一項的方法，其中所述免疫刺激物，優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，與所述病毒樣顆粒非共價結合。
79.根據權利要求46-78中任一項的方法，其中所述免疫刺激物，優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，被所述病毒樣顆粒包裝，優選地包封。
80.根據權利要求46-79中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述免疫刺激性核酸，更優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有約6個至約100,000個核苷酸，並且優選地，其中所述免疫刺激性核酸，優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有20至100個核苷酸。
81.根據權利要求46-80中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優選所述免疫刺激性核酸，更優選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，選自(a)重組寡核苷酸；(b)基因組寡核苷酸；(c)合成寡核苷酸；(d)質粒衍生的寡核苷酸；(e)單鏈寡核苷酸；和(f)雙鏈寡核苷酸。
82.權利要求74的方法，其中所述迴文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO1)組成。
83.權利要求82的方法，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少3個、至多10個鳥苷，並且其中所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
84.權利要求82的方法，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少4個、至多10個鳥苷，並且其中所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
85.權利要求82的方法，其中所述迴文序列在其5』端側翼為至少5個、至多10個鳥苷，並且其中所述迴文序列在其3』端側翼為至少6個、至多10個鳥苷。
86.權利要求82的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO2)；(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO6)；(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO7)；(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO9)；和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)。
87.權利要求71或82的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQ ID NO7或SEQ ID NO41的核酸序列。
88.權利要求46-87中任一項的方法，其中所述抗原包含細胞毒性T細胞表位、Th細胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接連接或者通過連接序列連接，並且其中優選地所述細胞毒性T細胞表位是病毒或腫瘤細胞毒性T細胞表位。
89.權利要求46-87中任一項的方法，其中所述免疫應答是增強的B細胞應答或增強的T細胞應答，其中優選地所述T細胞應答是CTL應答或Th細胞應答，並且其中更優選地所述Th細胞應答是Th1細胞應答。
90.權利要求46-89中任一項的方法，其中所述動物是哺乳動物，並且其中優選地所述哺乳動物是人。
91.權利要求46-90中任一項的方法，其中所述組合物經皮下、肌肉內、靜脈內、鼻內或直接導入淋巴結內而導入所述動物內。
92.一種疫苗，其含有免疫有效量的權利要求1-45中任一項的組合物以及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，並且其中優選地所述疫苗進一步含有佐劑。
93.一種免疫或治療動物的方法，包括對該動物施用免疫有效量的權利要求92的疫苗。
94.權利要求93的方法，其中所述動物是哺乳動物，並且其中優選地所述哺乳動物是人。
95.一種免疫或治療動物的方法，包括通過施用免疫有效量的權利要求92的疫苗，而在所述動物中引發T細胞應答。
96.權利要求95的方法，其進一步包括加強所述動物中的免疫應答的步驟，其中優選地，這種加強是通過施用免疫有效量的權利要求92的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現的，其中更優選地，所述異種疫苗是DNA疫苗。
97.一種免疫或治療動物的方法，包括在所述動物中引發T細胞應答和加強所述動物中的T細胞應答的步驟，其中這種加強是通過施用免疫有效量的權利要求92的疫苗來實現的。
98.權利要求97的方法，其中所述引發是通過施用免疫有效量的權利要求92的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現的，其中更優選地，所述異種疫苗是DNA疫苗。
全文摘要
本發明涉及分子生物學、病毒學、免疫學和醫學領域。本發明提供修飾的病毒樣顆粒(VLP)，包括能夠載有免疫刺激物，特別是載有含非甲基化C和G(CpG)的DNA寡核苷酸的VLP，並且來源於MelanA的具體肽與之連接。這些CpG VLP比不含CpG的對應物具有顯著更強的免疫原性，並且誘導增強的B和T細胞應答。針對任選地與該VLP偶聯、融合或以其他方式附著的MelanA肽類似物的免疫應答與針對該VLP本身的免疫應答相似地增強。另外，針對MelanA肽類似物的T細胞應答特別集中在Th1型。因此，與載有CpG的VLP附著的抗原可能是用於針對變態反應、腫瘤和其它自體分子和慢性病毒病的預防性或治療性接種的理想疫苗。
文檔編號A61K39/00GK1764719SQ200480007906
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月25日 優先權日2003年3月26日
發明者馬丁·F·巴赫曼, 瓦尼阿·馬諾勒夫, 埃德溫·麥亞林克, 卡爾·G·普羅巴, 卡特林·施萬茨 申請人:賽託斯生物技術公司