刺激氧化氮生產的含有多酚和l－精氨酸的製品的製作方法

2023-12-05 19:30:36 2

>時間(分)％A％B流速(mL/min)092.57.5101092.57.5403091.58.54014588.022.04015024.086.04015524.086.0501800100.050實施例16低聚物餾分的純化方法A．通過半製備反相HPLC純化將得自實施例15、方法A、B和D的矢車菊苷配質進一步分離得到試驗量的低聚物。裝備有可變波長的檢測器、具有1mL注射迴路的Rheodyne7010注射閥門的HewlettPackard1050HPLC系統連接了PharmaciaFRAC-100餾分收集器。在連接了Phenomenex10μODSUltracarb_(60×10mm)保護柱的PhenomenexUltracarb_10μODS柱(250×22.5mm)中進行分離。流動相組成為A=水；B=甲醇，使用以下線性梯度條件(時間，％A)；(0,85)，(60,50)，(90,0)和(110,0)，流速5mL/min。通過餾分收集，每隔一段時間或手工收集獨立峰或選擇色譜區域以進一步通過MADLY-OF/MS和NKr進行評價。注射裝載量範圍為25-100mg物質。在圖6A中顯示了代表性的洗脫曲線。方法B．修改的半製備HPLC將得自實施例15、方法A、B和D的矢車菊苷配質進一步分離得到試驗量的相似低聚物或進行進一步結構性鑑定和闡明(如實施例15、18、19和20)。SupelcosilLC-Si5μ柱(250×10mm)與SupelcosilLC-Si5μ保護柱(20×2mm)連接。在室溫下，以3.0mL/min的流速進行分離。流動相組成為A=二氯甲烷，B=甲醇和C=乙酸-水(1∶1)。使用以下線性梯度條件(時間，％A,％B)；(0,82,14)，(22,74,21)，(60,74,21)，(60,74,50,4)和(6l,82,14)，接著柱再平衡7分鐘。注射體積為60μL含有12mg的富集五聚體。採用在280nm的紫外光檢測成分。在圖6B中顯示了代表性的洗脫曲線。實施例17氧化氮合酶活性的評估使用的Medium200的培養介質(CascadeBiologicsInc.)補充了LowSerumGrowthSupplement(CascadeBiologicsInc.)和20％的胎牛血清(DAP)。進行評估的可可矢車菊苷配質為表兒茶素單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和七聚體。對可可矢車菊苷配質的亞硝酸鹽的含量進行評估。在使用最大濃度時(100μg/mL)，沒有檢測到亞硝酸比。人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)在原代培養階段，購自CascadeBiologicsInc.(波蘭)。細胞在75cm2的瓶中補充了LowSerumGrowthSupplement(LSGS)和20％的胎牛血清(FCS)的介質中培養。所述細胞經過一周的成熟後接著在37℃及5％二氧化碳氣氛下採用牛胰島素-EDTA處理(2mL/瓶)。添加3mLFCS米中和牛胰島素。在1200轉/分下將細胞懸浮液離心10分鐘並將細胞顆粒再次懸浮在上述的培養介質中。通過測量在所述培養介質中的亞硝酸鹽濃度來評估氧化氮合酶的活性。使用第2至13代之間的HUVEC。在24格培養板中，在濃度為5×105細胞mL的含有LSGS(300μL/格)和20％CS的Medium200中培養細胞。在37℃及5％二氧化碳氣氛下經過24小時至48小時的誘導期，將所述細胞集中使用(2.5×106細胞)。棄去介質並加入新鮮的介質。將可可矢車菊苷配質單體和低聚物以100μg/mL、10μg/mL或1μg/mL(最終濃度)加入所述培養介質中。對照物含有培養的細胞但不含矢車菊苷配質。參比物包括乙醯膽鹼、離子黴素、(以進入的鈣作為NO合酶刺激物)、脂糖(NO合酶誘導物)和N-甲基-L-精氨酸乙酯(NO合酶的抑制劑)。使用這些參比物是為了證實在內皮NO合成的亞硝酸鹽的生產。根據Griess反應，通過測量培養介質上清液中的亞硝酸鹽(NO2)濃度來評估NO的生產。簡而言之，在室溫下將50μL的條件介質(conditionalmedium)採用150μL的Griess試劑(1％磺胺的30％乙酸溶液-0.1％N-(1-萘基)-乙二胺二氫氯化物的60％的乙酸溶液)溫育2mins。採用LabsystemsMCC/340Multiskan測定在540nm的吸光度。使用亞硝酸鈉作為標準物測定亞硝酸鹽的濃度並使用Δsoft2.12軟體進行分析。所述無細胞介質和100μg/mL的矢車菊苷配質沒有檢測到的亞硝酸鹽濃度。原始數據1顯示可可矢車菊苷配質在通過HUVEC的氧化氮生產中的作用(13個試驗)1結果表示為微摩爾亞硝酸鹽/106細胞/48小時在48小時的誘導期中未刺激的HUVEC生產2.6±0.3μm的NO。10μm的乙醯膽鹼在通過HUVEC促進氧化氮生產中沒有作用。相反，離子黴素(1μm)和脂糖(100ng/mL)引起明顯的氧化氮生產。當往培育介質中加入N-甲基-L-精氨酸時這些通過HUVEC的氧化氮的生產將受到抑制。所述可可矢車菊苷配質二聚體、五聚體和七聚體引發了從HUVEC的劑量相依性的NO的生產。在最高濃度的試驗中(即100μg/mL)觀察到最大的產量。所述矢車菊苷配質單體、三聚體和四聚體也同樣引起明顯的生產但只是在100μg/mL的濃度產生。考慮到使用的最高劑量，各種矢車菊苷配質的效力如下二聚體＞三聚體＞七聚體=五聚體=四聚體＞單體。實施例18豚鼠上的氧化氮相依性的高血壓將豚鼠(體重大約400g，雄性和雌性)注射40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。在其頸動脈上挖一小洞以通過Gould壓力傳感器(P500型)監控動脈血壓。六個可可矢車菊苷配質中的每一個以濃度為1、3、10和25mg/kg通過頸靜脈進行靜脈注射。或者將血壓記錄在多種描記器中。在初步試驗中(2種動物)，我們測定不能使用100mg/kg的劑量，因為含有賦形劑的DMSO將直接影響平均動脈血壓。而當使用25mg/kg劑量的可可矢車菊苷配質(15±5％)時沒有注意到明顯的含有賦形劑的DMSO的作用。觀察供給1、3、10或25mg/kg的可可矢車菊苷配質對於麻醉的豚鼠的動脈血壓的作用。在靜脈注射中，矢車菊苷配質單體和二聚體降低了大約20％的血壓，即與單獨注射溶劑(15±5％,n=5)沒有明顯區別。相反，可可矢車菊苷配質三聚體、五聚體和六聚體(10mg/kg)明顯地促進了動脈血壓的降低，即對於可可矢車菊苷配質、四聚體和六聚體至多為62.85％。考慮到使用的最高劑量，各種矢車菊苷配質的效力如下六聚體=四聚體＞五聚體＞三聚體。表5原始數據可可萃取物對麻醉豚鼠的動脈血壓的作用(6個試驗)1結果以對照平均動脈血壓％表示。體外和體內結果的對比結果顯示出具有以下的可可矢車菊苷配質效力NO生產(100μg/mL)二聚體＞三聚體＞六聚體=五聚體=四聚體＞單體NO生產(10μg/mL)五聚體、四聚體和二聚體(不良誘導)高血壓六聚體=四聚體＞五聚體＞三聚體＞二聚體=單體。除了二聚體外，在更低劑量時促使NO生產的七聚體或四聚體對於降低動脈血壓是最有效的。這些結果表明可可矢車菊苷配質可在體外及體內促使NO生產。實施例19將得自紐西蘭白兔的主動脈環放在20mL的有機浴中。對於單劑量的(10-5M)可可矢車菊苷配質和乙醯膽鹼(Ach)內皮相依性舒張(EDR)採用預感染(pre-contracted)可可矢車菊苷配質的降腎上腺素(NE)(10-5M)的平行環進行說明。試驗的可可矢車菊苷配質為單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體。其中只有五聚體、六聚體和七聚體表現出血管舒張活性。對於試驗的兩種可可矢車菊苷配質混合物，只有含有五聚體至十聚體(結合物2)的一種顯示出明顯的EDR，而另一種含有單體至四聚體混合物(結合物1)對於血管緊張沒有作用。隨後使用結合物2和五聚體證明劑量相依性的血管舒張(10-8至10-5M)。將環與這些可可矢車菊苷配質(10-5M)一起培育30』並再次與Ach和可可矢車菊苷配質(10-7至10-4M)一起試驗。可可矢車菊苷配質和Ach劇烈地引起所述組織與這些可可矢車菊苷配質的培育對EDR的削弱。對於Ach預培育後的最大舒張為49±5％；對五聚體培育後為2±1.4％；對結合物2培育後為0.8±0.8％；對五聚體預培育為46.5±4.5％；培育後為6.8±3.2％；對於結合物2預培育為54.3±7％；培育後為1.7±1.1％,n=5。與兩種可可矢車菊苷配質(即廢棄的EDR)一起培育的作用通過將所述組織與L-精氨酸(10-4M)培育30』部分恢復(最大舒張，對於AchL-精氨酸培育後為21.5±6％；經過結合物2，L-精氨酸培育後為13.7±2.6％；對於五聚體經過五聚體、L-精氨酸培育後為18.3±5.8％；對於結合物2經過結合物2、L-精氨酸培育後為5.5±2.8％,n=5)。這些結果表明對於NO合酶的酶作用物的損耗也應考慮在這個作用中。以上結果顯示在表6至9中。表6可可矢車菊苷配質在兔主動脈環的作用的初始試驗表7對可可矢車菊苷配質的激烈暴露引起的劑量反應表8與可可矢車菊苷配質和L-精氨酸培育的作用表9以上的發現說明只有三聚體以上的可可矢車菊苷配質具有引起血管舒張的能力並且可可矢車菊苷配質具有對於血管緊張不連續的作用，這不象是與其抗氧活性有關。其它對於本領域的技術人員來說明顯的改變和修改是在本發明的範圍和所指之內的。除了在以下的權利要求書中所闡述的那些之外，本發明不受限制。權利要求1．食品，所述食品含有能有效促使攝取了所述食品的哺乳動物生理上氧化氮生產的增加的結合量的至少一種可可多酚和L-精氨酸。2．食品，所述食品含有(ⅰ)選自可可、堅果或它們的混合物的矢車菊苷配質，其中所述矢車菊苷配質的量為至少大約200毫克/100克的食品，和(ⅱ)L-精氨酸，其中所述L-精氨酸的量為每100克食品至少大約0.9克。3．權利要求2的食品，其中所述L-精氨酸為每100克食品至少大約1.2克。4．權利要求2的食品，其中所述L-精氨酸為每100克食品至少大約1.6克。5．權利要求2的食品，其中所述矢車菊苷配質為每100克食品至少大約300毫克。6．權利要求3的食品，其中所述矢車菊苷配質為每100克食品至少大約300毫克。7．權利要求5的食品，其中所述L-精氨酸為每100克食品至少大約1.6克。8．權利要求2的食品，其中所述矢車菊苷配質為可可矢車菊苷配質。9．權利要求2的食品，其中所述矢車菊苷配質為可可矢車菊苷配質和堅果矢車菊苷配質。10．權利要求2的食品，其中所述矢車菊苷配質為堅果矢車菊苷配質。11．權利要求1、2、8、9或10的食品，其中所述L-精氨酸通過至少一種選自堅果、豆科植物、種子和明膠的食物成分提供。12．權利要求11的食品，其中所述含有L-精氨酸的成分為堅果、豆科植物或種子的果仁、殼、糊或粉形式。13．權利要求12的食品，其中所述堅果選自花生、胡桃、杏仁、榛子、美國山核桃、腰果和澳洲堅果；其中所述豆科植物為大豆；和其中所述種子選自向日葵子、芝麻仁、亞麻子和南瓜子。14．權利要求8或9的食品，其中所述可可矢車菊苷配質由至少一種可可成分提供。15．權利要求14的食品，其中所述可可成分為烘烤的可可碎仁或它們的餾分、巧克力漿，部分脫脂的可可固體、全脫脂的可可固體或它們的混合物。16．權利要求1、2、8、9或10的食品，其中所述食品為糖果、調味品、烘焙物品、穀物類長麵包、麥片長麵包、飲料混合物、飲料或寵物的食物。17．權利要求1、2、8或9的食品，其中所述可可矢車菊苷配質由可可萃取物提供。18．權利要求17的食品，其中所述可可萃取物以至少每100克食品大約25毫克的量存在。19．權利要求16的食品，其中所述食品為非巧克力食品。20．權利要求19的食品，其中所述非巧克力食品為花生類食品。21．權利要求16的食品，其中所述食品為巧克力食品。22．權利要求1或2的食品，其中所述巧克力食品為每100克的巧克力食品含有至少大約200毫克的總矢車菊苷配質和每100克的巧克力食品含有至少大約0.9克L-精氨酸的巧克力糖果。23．權利要求21的食品，其中所述巧克力糖果包括深色巧克力。24．權利要求2l的食品，其中所述巧克力糖果包括牛奶巧克力。25．權利要求16的食品，其中所述食品包括含殼堅果、磨碎的堅果殼或它們的混合物。26．含有可可和堅果矢車菊苷配質、L-精氨酸和藥物可接受的載體的藥物組合物，其中所述矢車菊苷配質和L-精氨酸以當所述組合物被哺乳動物攝取後能有效地提供心血管益處的結合量加入。27．含有可可和堅果矢車菊苷配質、L-精氨酸和藥物可接受的載體的藥物組合物，其中所述矢車菊苷配質和L-精氨酸以當所述組合物被哺乳動物攝取後能有效作為氧化氮或氧化氮合酶調節劑的結合量加入。28．權利要求26或27的組合物，其中所述矢車菊苷配質為以每單位劑量10毫克至大約5克的量存在的矢車菊苷配質和其中所述L-精氨酸以單位劑量大約100毫克至大約30克的量存在。29．權利要求28的組合物，其中所述矢車菊苷配質為25毫克至3克和所述L-精氨酸為0.5克至10克。30．權利要求26或27的組合物，其中所述可可矢車菊苷配質為五聚體至九聚體。全文摘要含有結合了L－精氨酸的可可和/或堅果矢車菊苷配質的食品和藥物有效地促進攝取了這些產品的哺乳動物生理上氧化氮生產的增加。優選的食品是糖果、特別是含有堅果的深色或牛奶巧克力。所述矢車菊苷配質可為天然或合成的;並可通過食品成分如由發酵不足的豆和堅果殼製備的巧克力漿和/或可可固體提供。L－精氨酸可為天然或合成的,並可通過食品成分如果仁、堅果仁糊和/成堅果粉、種子、種子仁和/或種子粉或明膠提供。有益健康的作用包括,例如降低血壓、抵抗心血管疾病和抗癌症活性。文檔編號A23G1/56GK1300189SQ99806076公開日2001年6月20日申請日期1999年3月12日優先權日1998年3月12日發明者K·A·舍沃,H·H·施米茨,L·J·小羅曼蔡克申請人:馬爾斯公司