組織工程支架的製作方法

2023-11-06 23:22:37 1

專利名稱：組織工程支架的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於組織工程的支架的生產方法和組合物。更具體地說，本發明涉及控制多孔聚合物支架的孔結構。
背景組織工程包括利用活細胞生產用於組織替換的生物替代品。然而，為了使組織工程能實際使用，必須生產出允許組織生長的支架，所述組織生長近似於天然組織生長。
業已採用了若干技術來生產組織工程支架，並取得了不同程度的成功。例如，業已發現，由生物可降解聚合物組成的多孔支架廣泛應用於若干組織類型的工程中(Hutmacher，D.W.，″Scaffolds in tissueengineering bone and cartilage″Biomaterials 212529 2000；Chaignaud，B.E.等人，″The history of tissue engineering usingsynthetic biodegradable polymer scaffolds and cells″InAtala，A.，Mooney，D.J.，eds.Synthetic biodegradable polymer scaffolds.Boston，MABirkhauser，1997，pp.1-14)。各種組織工程策略將支架材料用作三-維基材，所述基材或者用於體外細胞接種，然後是移植(基於細胞的方法)；或者作為傳導和誘導的基材，用於體內直接移植(傳導方法)(Murphy，W.L.和Mooney，D.J.，″Controlled delivery ofinductive proteins，plasmid，proteins DNA and cells from tissueengineering matrices″J Periodontal Res 34413 1999)。這些方案成功的程度部分取決於支架體系的內部結構。許多應用要求在支架體系之內高度地互相連接的大孔結構，以便促進神經和纖維血管的向內生長，增進細胞接種的均勻性，並促進接種細胞和由鄰近體內位置遷移來的細胞的遷移。
支架建立於骨架上。骨架有助於調節支架材料的互連性和孔徑大小。在支架形成之後，骨架必須除去。上面所述形成組織工程支架的現行方法的困難包括最終產品的一致性問題，難於控制支架的互連性和孔徑大小，以及在形成支架之後除去骨架材料的問題。
目前所需的是形成功能性組織工程支架的經濟方法，所述支架的生產是容易且廉價的，使支架互連性和孔徑大小具有一致性，並且在形成支架之後能夠容易地除去骨架材料。
發明概述本發明涉及用於組織工程的支架的生產方法和組合物。更具體地說，本發明涉及控制多孔聚合物支架的孔結構。
本發明的實施方案總地涉及用於生產多孔材料的方法和組合物，所述多孔材料包括但不局限於組織工程支架。更特別地，本發明的實施方案涉及用於生產大孔的生物可降解組織工程支架的組合物和方法，所述支架具有受控的孔互連性和孔隙率，並且易於生產。更確切地說，本發明的實施方案涉及改進生物可降解聚合物的加工處理方法以控制孔徑大小和孔互連程度的組合物和方法。
可以預期的是，孔通過可融合的顆粒的融合相連接(並且形狀和大小確定)，所述顆粒包括但不局限於晶體和非晶體材料。在一實施方案中，可融合顆粒或粒子包含鹽孔隙原(porogen)(例如鹽晶體)。融合步驟預期可以在形成三維聚合物支架之前進行。本發明的實施方案不局限於任何特定的鹽。任何鹽都可以使用。儘管本發明的實施方案不局限於任何特定的鹽，可以用於本發明的合適鹽的例子是氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。在本發明的優選實施方案中，使用氯化鈉。
本發明的鹽晶體可從市場上購得(例如，Mallinkrodt，Paris，Kentucky)。鹽晶體可以不同的直徑範圍購買，並且例如可以過篩，從而獲得希望的大小。
可以預期的是，本發明的鹽晶體經受處理條件(例如溼度)一定時間，使鹽晶體能夠部分地融合在一起。本發明的實施方案既不局限於任何特定的百分溼度，也不局限於任何特定的時間長度，以及任何特定的融合程度。例如，在一實施方案中，鹽晶體暴露於50％-100％的溼度中。在另一實施方案中，鹽晶體暴露於75％-99％的溼度中。在另一實施方案中，鹽晶體暴露於92％-98％的溼度中。同樣地，在一實施方案中，鹽晶體暴露於溼氣中10分鐘至48小時。在另一實施方案中，鹽晶體暴露於溼氣中12-36小時。在另一實施方案中，鹽晶體暴露於溼氣中18-30小時。在另一實施方案中，鹽晶體暴露於溼氣中22-26小時。
預期到除溼度以外的處理條件。例如，可用酸和鹼以及有機溶劑來融合孔隙原(例如鹽晶體)。
本發明的實施方案不局限於任何融合程度。本領域普通技術人員應當認識特定目的所需的融合程度將根據所培養細胞的種類以及所需互連性程度和孔徑大小而改變。在下文中將描述產生不同融合水平的條件。
在本發明的一實施方案中，打算將生物可降解或非-生物可降解的聚合物注入鹽晶格中。在另一實施方案中，預期非-生物可降解的聚合物是熱塑性塑料。另外，還打算使生物可降解或非-生物可降解的聚合物溶解於溶劑中以易化注入。本發明的實施方案不局限於任何特定的生物可降解或非-生物可降解的聚合物或溶劑。本發明的實施方案預期多種生物可降解或非-生物可降解的聚合物-溶劑組合，只要生物相容性聚合物-溶劑組合不溶解融合的鹽晶格。例如，預期的聚合物包括但不局限於任何聚酯(包括聚(α-羥基酯)，聚醚(包括聚環氧乙烷)，聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。在一實施方案中，打算將熱塑性塑料用作原料。在另一實施方案中，打算將非生物可降解的聚合物用於形成支架。在優選的實施方案中，由於其生物相容性、變成天然代謝物的可控生物可降解性以及先前用作大孔組織工程支架體系，因此選擇共聚物聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)。根據其溶解聚合物的特性和其不是孔隙原(例如鹽晶體)的溶劑的特性，選擇所使用的聚合物溶劑。另外，打算與不溶解聚合物支架的任何溶劑一起除去融合的顆粒組分(例如鹽骨架)。在優選的實施方案中，溶劑是水。
在優選的實施方案中，本發明涉及一種方法，該方法包括a)提供i)大量顆粒(例如可融合的微粒)，所述顆粒包含鹽晶體，和ii)包含聚合物的溶液(例如溶解或懸浮於溶劑中的聚合物)；b)使所述顆粒暴露於一定條件使所述鹽晶體融合在一起，從而產生骨架(或晶格)，所述骨架包含框架和在所述融合鹽晶體之間的自由空間；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進行處理，以致使所述聚合物形成連續或半-連續的支架(即，對所述溶液進行處理以致使聚合物從溶液中出來並硬化)；和e)從所述支架中除去所述的融合鹽晶體(所得的支架具有由在該方法中使用的融合鹽晶體的自由空間限定的孔)。優選的是，大於75％並且在某些實施方案中甚至大於95％的自由空間在步驟c)中被填充。步驟(d)的優選處理方式包括使聚合物溶劑蒸發。步驟(e)的優選除去方式包括溶解所述融合鹽晶體。步驟(b)的優選條件包括使所述鹽晶體暴露於約90％至約100％之間的相對溼度中約8-約28小時。
另外也優選的是，所採用的聚合物是生物相容的和/或生物可降解的。在一個所述的實施方案中，本發明涉及一種方法，該方法包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含鹽晶體，和ii)包含生物相容性聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露於使所述鹽晶體融合至一起的足夠的溼度條件下，從而產生骨架，所述骨架包含框架和在所述融合鹽晶體之間的自由空間；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進行處理，以致使所述聚合物形成支架；和e)從所述支架中除去所述融合鹽晶體(最終的支架也具有孔)。
當然，本發明也涉及根據上述方法生產的支架(以物質的組合物形式)。在一實施方案中，所述支架在步驟(e)之後包含細胞。
在一實施方案中，本發明的支架打算用於細胞和組織的培養。本發明實施方案的這種支架不局限於特定的細胞或組織類型。任何非-造血的和造血的組織或細胞類型均能夠在本發明的組織工程支架上進行培養。在一實施方案中，本發明涉及在本發明的組織工程支架上使肌肉和神經細胞和組織進行生長。
除在神經系統應用中是至關重要的以外，在要求感覺控制的其它組織，如功能性骨骼肌，心臟和腎組織中，神經組織的向內生長也可能是至關重要的。纖維血管組織向內生長促進物質運輸出入正在發育的組織，並且對於大塊組織(即骨，肝，骨骼肌等等)的工程特別重要，在所述大塊組織中，細胞沒有用於氧和營養素獲取和代謝廢物排洩的通路。此外，均勻的細胞接種和輕易的細胞遷移，對於增進在傳導性、誘導性和基於細胞的組織工程方法中產生的組織的均一性是十分重要的。
在其它的實施方案中，本發明打算在沒有事先將細胞或組織添加至支架中的情況下將支架移植入生物體中。在一實施方案中，植入支架，並使細胞從周圍組織遷移入支架中。在另一實施方案中，將支架設計成促進期望的細胞類型遷移並阻礙不希望細胞類型的遷移。例如，通過控制支架的孔隙率和孔徑大小或通過對用於構建支架的材料的選擇，而調節細胞類型遷移。在本發明中，支架的孔隙率和孔徑大小將通過對所述鹽的顆粒大小和在其上將構建支架的骨架構建期間所述鹽顆粒所暴露的時間長度和百分溼度的選擇來控制。
在另一實施方案中，本發明打算將支架設計成能使細胞誘導遷移入支架。例如，將支架設計成在移植之後能將細胞因子釋放入周圍環境中。細胞因子的釋放將導致特定細胞類型遷移入支架。在另一實施方案中，支架將質粒DNA釋放入局部環境中，由此使大量細胞在局部位置發生轉染。
本發明涉及這樣的實施方案，其中支架的孔隙率和孔徑大小通過構建骨架中所用的鹽粒大小，用來融合鹽粒的百分溼度以及允許所述鹽粒融合的時間長度來控制。在另一實施方案中，本發明打算控制孔的形狀和方向。例如用長方形、正方形、球形或橢圓形鹽顆粒(和在某些實施方案中，各形狀鹽顆粒的混合物)來控制孔的形狀和方向。在另一發明中，本發明打算利用除水以外的溶劑來形成鹽骨架。例如，可以預期的溶劑如酸、鹼和有機溶劑。另外還可以預期的是，在聚合物骨架聚合之後用這些溶劑來溶解骨架。在另一實施方案中，作為形成鹽骨架的方法，打算對鹽顆粒進行加熱，使鹽顆粒經受壓力以及經受電場或磁場。在另一實施方案中，在融合期間使顆粒骨架經受定向的機械力、電力或磁力，以控制孔方向和孔徑大小。
在另一實施方案中，本發明打算將例如藥物、生長因子、肽、抗體、抗生素、寡核苷酸、多核苷酸等等引入聚合物骨架中。儘管本發明不局限於任何特定的機理，但據信，引入的物質將從骨架中濾出並進入局部環境中，在其中，它們將有助於細胞趨化性，細胞轉染，對抗疾病和感染等等。在本發明的一實施方案中，組織工程支架的生產方法預期將涉及四個步驟1)生產起孔隙原作用的鹽骨架，2)將聚合物溶液引入鹽骨架中，3)使聚合物硬化成聚合物基質，和4)從聚合物基質中除去孔隙原，留下組織工程支架。在一實施方案中，聚合物是生物可降解的。
本發明的實施方案涉及一方法，該方法包括a)提供i)鹽晶體和ii)生物可降解的聚合物，b)使所述鹽晶體暴露於使所述鹽晶體融合在一起的條件下，以產生框架和自由空間，c)使所述生物可降解的聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和d)從所述支架中除去所述框架。
本發明的實施方案還打算利用氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂鹽晶體以製備框架。
本發明的實施方案包括將聚酯、聚醚、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)用作生產支架的生物可降解的聚合物。另外，本發明的實施方案還預期的是，聚酯為聚(α-羥基酯)且聚醚為聚環氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)。在一實施方案中，生物可降解的聚合物是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
但本發明並不局限於特定的聚合物或聚合物源。本發明涉及均聚物、共聚物和/或聚合物的混合物。在一實施方案中，聚合物源是比濃對數粘度約1.6的聚(L-乳酸)(PLLA)。在另一實施方案中，聚合物是比濃對數粘度約0.5-0.6的聚(D，L-乳酸-共聚-羥基乙酸)(PLGA)。在另一實施方案中，聚合物是分子量約103,000的聚(d，l-乳酸)(PDLLA)。所述聚合物可從市場上得到，並且可以購自BoehringerIngelheim(Ingelheim，Germany)和/或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。在特定的實施方案中，聚合物是比濃對數粘度為0.78的85∶15聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)共聚物。另外，在不經進一步提純的情況下使用這些聚合物。
另外也不打算將本發明局限於特定的溶劑。在一實施方案中，溶劑是二噁烷(D)。在另一實施方案中，溶劑是二噁烷和水(D/W)的溶液。在另一實施方案中，溶劑是四氫呋喃(THF)。在另一實施方案中，溶劑是N，N-二甲基甲醯胺(DMF)。在另一實施方案中，溶劑是吡啶。在另一實施方案中，溶劑是甲醇。在另一實施方案中，溶劑是丙酮。在另一實施方案中，溶劑是氯仿。
本發明的實施方案涉及一方法，該方法包括a)提供i)鹽晶體和ii)生物可降解的聚合物，b)使所述鹽晶體暴露於使所述鹽晶體融合在一起的溼度下，以產生框架和自由空間，c)使所述生物可降解的聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和，d)從所述支架中除去所述框架。
本發明的實施方案還打算用於鹽晶體融合的溼度處於約90％和100％之間。在一實施方案中，使孔隙原暴露至溼氣中小於24小時，更優選小於10小時。在一實施方案中，，本發明還打算使鹽晶體暴露於溼氣中約20-28小時。另外，本發明的實施方案還涉及使支架形成條件包含氣體發泡。另外，本發明的實施方案還涉及使支架形成條件包含溶劑澆鑄。
本發明的實施方案涉及由下述方法生產的支架a)提供i)鹽晶體和ii)聚合物，b)使所述鹽晶體暴露至所述鹽晶體融合在一起的條件下，以產生框架和自由空間，c)使所述生物可降解的聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和，d)從所述支架中除去所述框架。
本發明的實施方案預期鹽晶體是氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。在其它的實施方案中，本發明預期支架由聚合物製成，所述聚合物選自聚酯、聚醚、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。在一實施方案中，聚合物是生物可降解的。
在另外的實施方案中，本發明預期，支架的聚合物選自聚(α-羥基酯)，聚醚聚環氧乙烷或聚乙二醇。
本發明的實施方案涉及由下述方法生產的支架a)提供i)鹽晶體和ii)聚合物，b)使所述鹽晶體暴露至所述鹽晶體融合在一起的溼度下，以產生框架和自由空間，c)使所述聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和d)從所述支架中除去所述框架。在一實施方案中，溼度在約90％和100％之間。在另一實施方案中，使鹽晶體暴露於溼氣中約20-28小時。
本發明的實施方案涉及通過氣體發泡和溶劑澆鑄而生產的支架。
本發明的實施方案涉及由本發明的實施方案製得的支架，其中支架還包含細胞。本發明並不局限於細胞來源。例如，細胞可以為任意多細胞生物體的細胞。在一實施方案中，細胞選自植物和動物。在另一實施方案中，細胞為哺乳動物的。在另一實施方案中，細胞為人類的。
本發明的一實施方案涉及一種方法，該方法包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露至所述孔隙原融合在一起的條件下，以產生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述骨架和溶液進行壓縮，以便形成固態物質；e)使所述固態物質暴露至高壓氣體；f)使氣體壓力減至環境壓力；和g)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。在另一實施方案中，所述方法預期在100和2000psi之間進行壓縮。在另一實施方案中，所述方法預期氣體壓力在400和1200psi之間。在另一實施方案中，所述方法打算固態物質為半-固體。


圖1a和1b示出了通過在95％溼度下進行a)12小時或b)24小時處理而融合的鹽晶體的NaCl基質橫截面的電子顯微照片。
圖2a，2b，2c，2d和2e示出了利用鹽融合法製得的溶劑澆濤組織工程支架橫截面的電子顯微照片。一小時的鹽融合將在孔壁(A，C)中形成低密度的孔(31±10微米直徑)，而24小時的融合處理將在孔壁(B，D)中形成高密度的更大孔(78±21微米)。另外，24小時鹽融合的支架還示出了有輪廓的孔壁，其中厚的環直接與互連的孔(B，D)鄰接，在更高放大率(E)時這將特別明顯。
圖3a和3b示出了通過在富含溶劑(約95％溼度)氣氛中固相擴散而進行的鹽融合過程。(A)在融合之前，鹽顆粒間具有小區域的接觸以及在邊緣和稜角處尖銳的半徑。(B)在暴露於95％溼度之中24小時之後，在接觸點附近的擴散在顆粒之間形成厚的鹽橋，並且在每個鹽顆粒的邊緣和稜角處使曲率半徑增加。
圖4示出了在溶劑澆鑄/顆粒濾出方法中，在添加聚合物之前鹽晶體邊緣曲率半徑的增加。根據融合0、12和24小時的鹽晶體的電子顯微照片測量半徑。基於ANOVA，隨後進行組平均值之間的對比(Bonferroni t檢驗)，0-12小時平均邊緣半徑改變不顯著(p＞0.05)，然而，12-24小時的改變卻極其明顯(p＜0.001)。
圖5a，5b，5c和5d示出了利用鹽融合法製得的氣體發泡的組織工程支架橫截面的電子顯微照片。一小時的鹽融合將在孔壁(A，C)中形成一些很小的孔，其類似於溶劑澆鑄支架中的那些。24小時鹽融合的支架顯示出無組織的孔結構，其中鄰接的孔似乎彼此進入(B，D)。
圖6a和6b示出了經受不同時間鹽融合、且通過溶劑澆鑄(a)或氣體發泡(b)製得的支架的壓縮模量。數值表示平均值和標準偏差(n＝4)，並且*表示相對於對照有統計學上顯著的差異(p＜0.05)。
定義為了更好地理解本發明，提供如下定義。
「生物相容性聚合物」應該定義為與生物學體系相容(即無毒性)的合成或天然材料。
「生物可降解的生物相容性聚合物」應該定義為當暴露或置於生物學體系中時將發生降解(即分解)的生物相容性聚合物。降解速率不以任何方式受本發明實施方案的限制，並且可以是快速的(例如可以在幾分鐘之內發生降解)或慢速的(例如降解可以發生若干小時，若干天，若干周或若干月)。
「鹽晶體」和「鹽孔隙原」是用於本發明實施方案中的鹽晶體，用以形成構建聚合物組織工程支架的骨架。
「融合(fusion)」應該定義為匯合併連接結合在一起。在本發明的一實施方案中，鹽晶體通過在局部環境或氣氛中的溼氣並且有時通過加熱而融合在一起。在另一實施方案中，本發明還打算，通過酸、鹼或有機溶劑而使孔隙原(例如鹽晶體)融合。
「可融合的顆粒」應該定義為當暴露至導致顆粒熔融的條件時融合在一起的顆粒，以便當除去導致所述熔融的條件時，所述顆粒基本上彼此連接並具有引入融合顆粒基質內的自由空間。通過顆粒最長的度量，可融合顆粒約為0.02mm至5mm。可融合顆粒由如上所述發生反應的任何物質構成。可以一起使用多於一種類型的可融合顆粒。
對於基質，「半連續」應該定義為這樣的基質，其具有與基質的其它部分是連續的(即在兩處或更多處連接的)基質部分，但其中並不要求所有基質部分與基質的其它部分是連續的(即僅一處連接)。
「溼度」和「相對溼度」應該定義為在鹽晶體的局部氣氛(空氣)中的水分。溼度測量與在該溫度和大氣壓力下空氣能夠保持的水蒸汽最大量相比，在所述氣氛中水蒸汽的量。用水蒸汽充分飽和的空氣的相對溼度為100％。
「組織培養」和「細胞培養」應該定義為在體外無菌條件下細胞的生長。
「支架」應該定義為在其上細胞可以生長的三維結構。
「基本上填充」應該定義為填充自由空間的區域至滿負載或近乎滿負載。在一實施方案中，基本上填充應當指大於約50％的自由空間被填充(例如被聚合物或聚合物溶液填充)。在另一實施方案中，基本上填充應當指大於約75％的自由空間被填充。在另一實施方案中，基本上填充應當指大於約90％的自由空間被填充。在另一實施方案中，基本上填充應當指大於約95％的自由空間被填充。
在此將「自由空間」定義為在本發明中實施的鹽晶體框架(例如，融合孔隙原)之間的區域。在此將「框架」定義為在內部有開放空間(即自由空間)的固態或半固態材料。
「傳導遷移」應該定義為在沒有利用細胞因子或已知或懷疑會誘導細胞遷移的其它生物活性劑(例如，肽或DNA)的情況下細胞遷移入支架中。
「誘導遷移」應該定義為在細胞因子或已知或懷疑會誘導細胞遷移的其它生物活性劑(例如肽或DNA)的幫助下細胞遷移入支架中。
在此「孔隙原」應該定義為通過使聚合物溶液分布遍及整個孔隙原之中，可用於在基質中形成孔的物質。所述聚合物(或聚合物溶液)的所述分布可以在孔隙原融合成為骨架之前或之後。所述孔隙原可以是但不是必須是結晶物質。
「溶劑」應該定義為使另一物質保持溶解狀態的液體或氣體(例如CO2)。在本發明的一實施方案中，溶劑應該是使聚合物保持溶解狀態的液體，包括但不局限於生物相容的(和生物可降解的)聚合物。另外也不打算將本發明局限於特定的溶劑。在一實施方案中，溶劑是二噁烷(D)。在另一實施方案中，溶劑是二噁烷和水(D/W)的溶液。在另一實施方案中，溶劑是四氫呋喃(THF)。在另一實施方案中，溶劑是N，N-二甲基甲醯胺(DMF)。在另一實施方案中，溶劑是吡啶。在另一實施方案中，溶劑是甲醇。在另一實施方案中，溶劑是丙酮。在另一實施方案中，溶劑是氯仿。在另一實施方案中，溶劑是液體如水，其用來溶解聚合物溶液被引入其中和其後聚合物硬化的融合鹽骨架。
在此「聚合物」定義為由重複(單體)單元或多體組成的大分子。在本發明的上下文中，將聚合物溶解或懸浮於合適的「溶劑」中，以形成「聚合物溶液」。在一實施方案中，通過除去溶劑使聚合物進行聚合。在另一實施方案中，除去溶劑簡單地造成從液態聚合物溶液至固態連續聚合物基質的相變。
「聚合」應該定義為形成多於一個單體的鏈。
在此，「聚合物溶液」應該定義為包含溶解或懸浮的聚合物(例如溶解或懸浮於溶劑中)的溶液。
在此「聚合物溶劑」應該定義為其中可以溶解聚合物但同時不會明顯地溶解用作孔隙原的物質的溶劑。
「熱塑性塑料」應該定義為當加熱至指定溫度以上時將熔融並且當冷卻至該溫度以下時將固化的一類聚合物。
在本發明中，「固態」應該是定義剛性量度的相對術語。術語「固態」應該包括術語「半固態」。半固體應該是保持可延展特性的固體。
發明總述本發明涉及用於組織工程的支架的生產方法和組合物。更具體地說，本發明涉及在各種條件下利用氯化鈉晶體及其他鹽來形成其上可以構建支架(包括但不局限於組織工程支架)的骨架。然而，本發明的方法不局限於利用結晶物質。另外，非晶態的物質預期也可以用於生產支架。與現有技術的方法相比，本發明的用於生產組織工程支架的新穎方法改善了孔隙率，互連性並且易於製造，而且還能夠更好地控制這些性質。
組織工程是在合成的、生物可降解的支架上由細胞生長新的結締組織或器官，從而生產出用於移植回至供體宿主的部分或完全功能性的組織或器官。在一實施方案中，該技術涉及由植入(而不是移植)而生長的器官，並因此沒有免疫排斥。在另一實施方案中，該技術涉及由供體移植細胞。在另一實施方案中，該技術涉及植入組織工程支架，使細胞在體內遷移入支架內。在某些實施方案中，可以預期的是，任何組織工程器官的起始點是收穫來自組織工程器官的未來接受者的少量組織。對於有些應用，這可以小至2mm的鑽孔活檢組織。
當在二維表面上生長時，細胞相互作用並自己組織成功能性組織的能力是有限的。相比之下，三維骨架使細胞能夠成長並組裝成更接近類似其體內相應物的組織。
在正常生長和發育中，身體利用特化的結締組織細胞以形成給各器官提供三維結構的「基質」或活基質。基質還提供附著位點並產生促進器官細胞成長發育成為有功能組織的生長因子。儘管基質的具體組分和構造對於各器官可以各不相同，但三維基質支持的基本原理可應用於體內絕大多數的器官。
簡言之，所述方法將從支架著手，根據需要進行成型，用活細胞對其接種，並用培養基和生長因子對其浸泡。當細胞繁殖時，它們將填充支架並生長成為三維組織，並且一旦植入體內，細胞將再現其預定的組織功能。血管附著至新的組織上，支架溶解，並且新生長的組織最終將融入其周圍環境。
在一實施方案中，器官特異性細胞可以在模擬體內環境的密閉生物反應體系中接種至三維支架上。例如，在皮膚組織工程中，細胞將附著、分裂、並分泌胞外基質蛋白質和生長因子，形成完全人類的功能性組織。
組織工程常常涉及幹細胞，這是在1992年首先被分離出的一種成熟前的細胞。根據它們在培養皿或體內接觸的生長因子，細胞將分化成特異性細胞類型，因此將幹細胞植入合適的位置可產生從骨至肌腱至軟骨的一切。
儘管本發明的實施方案不局限於特定的用途，但組織工程支架和組織工程可以用來再造許多組織和器官。一個例子是軟骨修復。每年發生約900,000例關節軟骨外傷損傷。在運動損傷及其他導致併發症的身體損傷之後，成人軟骨通常不會再生。另一例子是骨修復。僅在美國估計每年有800,000個患者因嚴重骨折而住院，其中一半患者需要切開骨折復位操作。相當大部分的這些骨折不能適當地癒合，因此需要輔助程序，如骨移植。其它骨折對於任何努力都是無響應的，但它們可能是組織工程的理想候選者。另一例子是皮膚傷口癒合。皮膚傷口不能適當地癒合在美國每年影響估計2,600,000個患者。這些傷口常常是其它病症如糖尿病、循環疾病和制動的併發症。這些傷口甚至在若干月或若干年之後還不癒合，因此將導致嚴重的且危及生命的併發症如感染。患病肢體常常需要截肢。
優選實施方案的詳細說明A.溶劑澆鑄和氣體發泡。
傳統上，組織工程支架通過溶劑澆鑄法(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的製備和表徵″Polymer 351068，1994)和氣體發泡法(Harris，L.D.等人，″利用氣體發泡形成的開孔生物可降解基質″JBiomed Mater Res 42396，1998)製得。在溶劑澆鑄法(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的製備和表徵″Polymer 351068，1994)中，將聚合物溶解於合適的溶劑中，添加至含孔隙原的模具中並使孔隙原分散。然後，在環境條件下使溶劑從混合物中蒸發出，留下包含孔隙原的聚合物基質，然後可將孔隙原在合適的溶劑中濾出(leachedout)。在氣體發泡法中(Harris，L.D.等人，″利用氣體發泡形成的開孔生物可降解基質″J Biomed Mater Res 42396，1998)，聚合物顆粒與孔隙原顆粒混合，並將該混合物壓成散布有孔隙原的不連續聚合物的固體混合物。然後，使得到的粒料暴露於高壓二氧化碳氣體，並且在使壓力平衡一段時間之後，迅速釋放壓力，從而使所述混合物的聚合物組分產生熱力學不穩定性。所述不穩定性將使聚合物發泡，並且初始不連續的聚合物顆粒將融合在一起，從而形成在散布孔隙原顆粒周圍的連續聚合物基質，然後將孔隙原顆粒在溶劑中濾出。在這些方法的每一種方法中，在得到的支架中孔之間的互相連接程度分別由溶劑蒸發或聚合物發泡步驟期間孔隙原顆粒的互相連接來確定。由於在融合之前孔隙原分散在聚合物內部，因此，孔隙原顆粒之間的互相連接程度不能主動地控制，並且在最終支架產品中孔的互連性也未受到控制。
考慮到支架內部孔互連性的相當大的益處，在各種組織工程策略中，對孔隙原互連性的增強和控制將是十分重要的。本發明的某些實施方案解決了控制支架孔隙率和互連性的這些問題。在本發明的優選實施方案中，孔隙原不是分散的，而是融合從而產生一骨架(或晶格)並將聚合物溶液引至該骨架上和其中。
B.細胞培養並不打算使本發明受限於細胞來源。在一實施方案中，用於組織工程的細胞來自活檢。然後使來自活檢的細胞由外植體或膠原蛋白酶消化而培養，從而產生「細胞庫」。然後，在合適的生理條件下，在基質和支架上進一步對這些細胞進行培養，從而形成用於植入的組織工程構建構。該方法在組織培養裝置中進行以維持無菌環境。細胞的生物化學和物理活性可通過添加生長因子或細胞因子以及通過利用物理刺激而增強。在某些應用中，施加小物理負載的裝置刺激存在於支架中的細胞群成為通常與器官發生和組織修復有關的生物-化學和生物-物理活性。在合適條件下進一步組織培養之後，該構建物然後可植回最初從其上取下細胞的患者。該技術將消除對抗排異反應藥物的需要，這是因為組織工程組織由患者自己的細胞生長，因此，將作為患者身體的天然部分而被接受。
C.孔隙原融合在本發明的實施方案中，鹽晶體可通過暴露至某些條件(例如約95％溼度)而融合，從而增加溶劑澆鑄和氣體發泡PLG支架內的孔互連性。在溶劑澆鑄之前鹽基質的融合將在孔壁中形成洞孔，並且這些洞孔的直徑和球形度將隨鹽融合處理的增加而增加。鹽融合處理將使溶劑澆鑄支架的壓縮模量增加，這可能是由於孔壁中洞孔的鄰近形成厚的環形支柱的緣故。在各種組織工程應用中，增加的孔互連性可能是有用的，特別是那些要求密切的細胞-細胞接觸的應用(即神經和肌肉應用)。另外，由於鹽融合法不僅在溶劑澆鑄法而且在氣體發泡方法中均賦予了改善的孔互連性，因此該構思可應用於其它基於固體孔隙原的方法，以生產具有高度互連性的大孔或微孔材料體系。
在溶劑澆鑄，顆粒濾出方法中採用融合鹽模具將在支架中的孔壁之間形成洞孔。隨著鹽融合時間增加，在支架橫截面內的孔結構變得組織條理性下降。明顯缺乏有組織條理的孔結構是由於鹽融合試樣優異的互連性，這將減少組織化良好的、大部分關閉的孔的存在。當支架對切開時，許多孔由於其缺乏連續的孔壁，因此將變平。實際上，融合鹽基質增加的連續性在聚合物基質中將產生相應的不連續性，從而導致在孔之間的大通道和優異的互連性。另外，利用48小時或更長的鹽融合時間不能製備出完整的試樣。這進一步支持了鹽基質連續性和組織工程支架連續性之間的相反關係。利用鹽分散於其中的溶劑澆鑄顆粒濾出法的先前的研究不能夠控制根據本研究中所顯示出的孔壁中的洞孔的孔互連性(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的製備和表徵″Polymer 351068，1994；Kaufmann，P.M.等人，″Highlyporous polymer matrices as a three-dimensional culture system forhepatocytes″Cell Transplant 6463，1997；Murphy，W.L.等人，″連續骨樣礦物質在體外在多孔聚(丙交酯-共聚-乙交酯)支架內的生長″JBiomed Mater Res 5050，2000)。在近來的研究中，研究人員利用熱在溶劑澆鑄之前使聚合孔隙原顆粒融合在一起(Ma，P.X.和Choi，J.「具有良好限定互連球形孔網絡的生物可降解的聚合物支架」TissueEng 723，2001)。儘管利用加熱可以證明在若干組織工程應用中是有用的，但在此所述的局部溶解方法可持有更寬的適用性，這是因為其可在室溫融合若干類型的孔隙原顆粒(有機的和無機的)，以及其可能添加至包括生物活性誘導因子的處理技術(即氣體發泡/顆粒濾出)。
在氣體發泡之前，在PLG/NaCl混合物內NaCl晶體的融合對孔結構也具有顯著的影響。在24小時鹽融合(SF)、氣體發泡支架內的孔似乎直接互相進入，這意味著很高的互連性而沒有大大減小支架壓縮模量(例如，參見圖6b)。氣體發泡法先前已用來加工處理包含生物活性血管內皮生長因子的支架(Sheridan，M.等人，″Bioabsorbablepolymer scaffolds for tissue engineering capable of sustained growthfactor delivery″J Control Rel 6491，2000；Murphy，W.L.等人，″Sustained release of vascular endothelial growth factor frommineralized poly(lactide-co-glycolide) scaffolds for tissueengineering″Biomaterials 212521，2000)和包含編碼血小板衍生生長因子的質粒DNA的支架(Shea，L.D.等人，″DNA delivery frompolymer matrices for tissue engineering″Nat Biotech 17551，1999)以促進血管組織的向內生長。將本發明的新穎的鹽融合方法添加至氣體發泡法和溶劑澆鑄法，將在組織工程支架整個內部形成高度互相連接的血管供應。在支架體系內使血管向內生長達到最大深度是大塊組織工程策略中重大的目標，而本發明高度互連的孔結構對於最佳的血管組織向內生長是有利的。
當暴露於潮溼環境中時，在所謂「結塊」的過程中相鄰鹽晶體將融合，這常常會形成巖鹽或不適當貯存的食鹽的大結塊(將抗-結塊劑如矽酸鈣添加至食鹽中，以防止結塊，其主要是通過吸收在包裝內的水分，否則這些水分會被吸入鹽顆粒的表面內)。在優選的實施方案中，本發明不打算利用抗結塊劑。在固態鹽晶格內原子的擴散速率通過吸收水的存在而增加。增加的擴散使得接觸的鹽顆粒的表面能夠結合，從而以類似於用於非-玻璃狀陶瓷材料固態燒結法的過程在顆粒之間形成橋連。由於在所述過程中，鹽顆粒的總表面積減少，從而降低表面能，因此單獨的顆粒將開始融合(Van Vlack，L.H.「Elements ofMaterials Science and Engineering，」第4版，Addison-WesleyPublishing Company，Reading，MA，PP.120 316，1980)。各鹽顆粒增加的球形度也是熱力學有利的，因為這也降低各顆粒的總表面能。
D.支架模製在鹽融合24小時之後，溶劑澆鑄支架具有明顯增加的壓縮模量，而氣體發泡支架卻沒有。對於溶劑澆鑄支架，PLG材料的更厚支柱在鹽顆粒的圓角和邊緣所空出的空間中形成，其形成更硬的結構，而PLG在支架中的體積分數不增加。隨著NaCl融合時間的增加，氣體發泡支架模量不發生類似的增加。這可能是由於在氣體發泡法中鹽融合期間存在著PLG顆粒的緣故。無庸置疑的是，甚至在兩種類型顆粒(NaCl和PLG)都存在的情況下，在相鄰NaCl晶體之間也會存在一些互相作用的空隙空間。由於擴散所造成的鹽表面的位移限於在可利用的空隙空間內的移動。支持所述情況的證據在圖5(b d)中是顯而易見的，其中支架由微多孔片材組成，而這在溶劑澆鑄支架中卻不存在，提示在NaCl融合過程期間，移動的鹽晶體表面被更小的PLG顆粒所妨礙並可能在其周圍流動。因此，儘管在相鄰鹽顆粒之間形成了橋連，但結晶表面的移動卻由於PLG顆粒的存在而受到約束。這可能阻止了鹽結構中空隙空間的生長，而其會導致在PLG支架中形成厚截面支柱，這就是對為什麼在氣體發泡支架中孔互連性增加而壓縮模量不增加的解釋。
E.舉例性的應用儘管不局限於任何特定的應用，但本發明實施方案的鹽融合方法可應用於神經和肌肉組織的工程，這是因為所述組織對孔互連性的依賴性所致。橋接神經組織缺損(軸突延伸)和功能性骨骼肌組織的形成(成肌細胞融合)中的再生過程是需要密切細胞-細胞相互作用的生理學過程的例子。利用各種天然和合成支架材料進行神經間隙橋連的策略甚至在間隙長度小於10毫米的情況下也只取得了適度的成功(Valentini，R.F.等人，″Collagen-and laminin-containing gels impedeperipheral nerve regeneration through semipermeable nerve guidancechannels″Exp Neurol 98350，1987；Aldini，N.N.等人，″Effectivenessof a bioabsorbable conduit in the repair of peripheral nerves″Biomaterials 17959，1996)，在許多情況下失敗的原因包括導管缺乏足夠的孔互連性以及不足的機械完整性。
利用多孔聚(乳酸-共聚-羥基乙酸)(Evans，G.R.D.等人，″Tissueengineered conduitsthe use of biodegradable poly(D，L-lactic-co-glycolic acid)scaffolds in peripheral nerveregeneration″InStark，G.E.，Horch，R.，Tanczos，E.，Eds.BiologicalMatrices and Tissue Reconstruction.BerlinSpringer，1998，pp.225-235)和聚(L-乳酸)(Evans，G.R.D.等人，″In vivo evaluation ofpoly(L-lactic acid)porous conduits for peripheral nerveregeneration″Biomaterials 201109，1999)支架用於神經再生的最近研究已在大鼠坐骨神經模型中在12毫米神經缺損中顯示出希望。將該基本構思延伸至更大的關鍵神經缺損要求控制孔互連性從而使血管能夠向內生長，避免在軸突延伸期間再生纖維的修剪並保證延伸軸突到達其靶器官。
為了促進成功的成肌細胞融合，增加且受控的孔互連性是必需的支架特徵。此外，在功能性肌肉類器官內細胞的存活是擴散限制性的(Dennis，R.G.和Kosnik，P.E.，″Excitability and isometric contractileproperties of mammalian skeletal muscle constructs engineered invitro″In Vitro Cell Dev Biol-Animal 36327，2000)，因此血管組織的向內生長對於增加功能性肌肉構建物的最大直徑以便增強可收縮性能是必要的。儘管不局限於任何特定的應用，但本發明的某些實施方案(例如鹽融合方法)特別適用於製備用於神經和肌肉應用的高度互相連接的支架。儘管本發明不局限於任何特定的理論，但據信，在促進三維細胞-細胞相互作用中孔互連性的重大優點有助於神經和肌肉組織在組織工程支架中的生長。
實驗下面實施例將用來解釋本發明的某些優選的實施方案和方面，但這些並不構成對本發明範圍的任何限定。
在下面的實驗中，應用下列縮略語eq(當量)、M(摩爾的)、μM(微摩爾的)、N(當量的)、mol(摩爾)、mmol(毫摩爾)、μmol(微摩爾)、nmol(毫微摩爾)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、L(升)、dl(分升)、ml(毫升)、μl(微升)、cm(釐米)、mm(毫米)、μm(微米)、nm(納米)、℃(攝氏度)、RDA(代表性差異分析)、nts(核苷酸)、kV(千伏)。
實施例1在本實施例中，生產NaCl框架和生物可降解聚合物支架。對鹽顆粒(Mallinkrodt，Paris，Kentucky)進行過篩以獲得一定大小範圍。使用約250-425微米直徑的NaCl晶體。
利用NaCl作為顆粒孔隙原，通過溶劑澆鑄/顆粒濾出方法或氣體發泡/顆粒濾出方法製備多孔支架。基本上如Mikos，A.G.等人所述製備溶劑澆鑄支架(″聚(L-乳酸)泡沫材料的製備和表徵″Polymer 351068，1994；在此將其引入作為參考)。通過使NaCl晶體(直徑約250-425微米)經受95％溼度為期0-24小時，從而在溶劑澆鑄之前使NaCl晶體融合，而製備NaCl模子。使用保持在37℃的密閉的、水夾套細胞培養器(Forma Scientific，Inc.)形成用於NaCl晶體融合的95％溼度環境。
由Medisorb，Inc.(特性粘度(I.V.)＝0.78dl/g)和Boehringer-Ingelheim Inc.(I.V.＝1.5dl/g)獲得丙交酯∶乙交酯比為85∶15的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)粒料。將高比濃對數粘度PLG用於溶劑澆鑄方法中，以保證支架儘管其相對高的孔隙率(～97％)還會保持適當足夠的機械完整性。將PLG粒料溶解於氯仿中(Mallinkrodt，Paris，Kentucky)從而獲得10％(w/v)的溶液。然後，將聚合物溶液倒入如上所述其中鹽晶體已融合的含NaCl模子中。在溶劑蒸發之後，通過在蒸餾水中浸約48小時而除去鹽。
基本上如Harris，L.D.等人所述製備氣體發泡的支架(″Open porebiodegradable matrices formed with gas foaming″J Biomed MaterRes 42396，1998；在此將其引入作為參考)。通過使NaCl晶體(直徑約250-425微米)經受95％溼度為期0-24小時，從而在溶劑澆鑄之前使NaCl晶體融合，而製備NaCl模子。在95％溼度中處理之後，在進一步處理之前，在真空乾燥器中對試樣乾燥48小時。使用保持在37℃的密閉的、水夾套細胞培養器(Forma Scientific，Inc.)形成用於NaCl晶體融合的95％溼度環境。將(如上製得的)PLG粒料溶解於氯仿中。將與PLG混合的融合NaCl的框架裝載入鋁模具中(1.35cm直徑；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin)並利用CarverLaboratory Press(Fred S.Carver，Inc.，Menominee Falls，Wisconsin)在1500Psi下壓制1分鐘，從而獲得固態圓片(厚度約3.4mm)。然後，將該試樣暴露於高壓CO2氣體(800psi)24小時，從而用氣體飽和聚合物。然後通過使氣壓降至環境壓力而造成熱力學不穩定性。這將導致二氧化碳氣孔在聚合物基質內的成核和生長。然後，通過在蒸餾水中對基質浸濾48小時而從基質中除去NaCl顆粒。所有處理步驟均在室溫下進行。
支架是圓形片，其直徑約12毫米且厚度約為3毫米。在處理中，通過利用直徑約250-425微米的NaCl顆粒來控制孔大小範圍。利用固態聚合物已知的密度，測量的支架的聚合物質量，以及測量的支架的外部體積，來計算支架的總孔隙率。
實施例2在本實施例中，將對支架進行表徵。在95％溼度中溫育NaCl晶體導致晶體的融合，從而形成高度互相連接的NaCl基質(圖1a-b)。在溶劑澆鑄之前，將融合鹽模對切並成像，以觀察NaCl晶體融合的程度。此外，在製備之後通過冷凍斷裂將聚合物支架二等分。將碳塗層蒸發至各二等分鹽模和聚合物支架的表面上，並利用在20-30kV操作的Hitachi S-3200N SEM在高真空下使試樣成像。在添加在氯仿中的PLG(溶解澆鑄)之前鹽晶體的融合在支架內造成增加的孔互連性。象期望的那樣，在支架內的孔結構(圖2)類似於融合鹽基質的結構(圖1a-b)。在1小時鹽融合(SF)試樣的橫截面內的孔顯示出了在孔壁中具有間斷洞孔的限定的孔結構(圖2a，2c)，而24小時SF試樣所產生的支架的橫截面顯示出了組織條理性差得多的孔結構，並且在孔壁中洞孔的密度很大(圖2b，2d)。隨著融合時間的增加，孔徑尺寸將從1小時融合之後31±10微米的平均直徑明顯增加至24小時融合之後78±21微米(p＜0.05)。此外，在24小時SF支架中的孔壁顯示出厚度輪廓線，因此在鄰近孔壁中洞孔和沿著壁外徑的區域中，孔壁似乎更厚(圖2d)。更高放大率觀察在24小時SF支架內的孔壁進一步顯示出孔壁起伏狀的結構(圖2e)。鹽融合過程對支架的孔隙率沒有影響，並且對於每一鹽融合時間，溶劑澆鑄支架的計算的總孔隙率為97±1％。
對NaCl融合1小時和24小時之後形成的溶劑澆鑄支架的電子顯微照片的仔細觀察表明暴露至95％溼度中使鹽顆粒的結構產生若干重大的改變。除了在接觸點處顆粒間形成橋連以外，鹽的單獨顆粒中，邊緣和稜角的曲率半徑增加了(圖1a和1b)。這些改變由圖表示(圖3)。利用MicrosoftTMPaintTM軟體，根據電子顯微照片計算鹽晶體的曲率半徑。對各圖像的象素大小進行校準，並用鉛筆工具在結晶邊緣上標記相切點。然後用校準值和象素坐標來計算相切點之間的弦線長度，將其乘以(2/2，以便獲得晶體的曲率半徑。利用microsoft paint測量各洞孔主要的和次要的直徑軸，並取平均值，來確定孔壁中洞孔的直徑。在鹽的各顆粒的邊緣和稜角處曲率半徑的增加使各顆粒的球形度增加(圖4)，並因此使支架中每個所得的孔的球形度得以增加。晶體邊緣的平均曲率半徑從19±10微米增加至暴露至95％溼度12小時之後的32±15微米，然後增加至完整24小時暴露之後的62±18微米(圖4)。結果，在24小時融合之後，許多較小的晶體變成幾乎為球形。一個另外的結果是，在由各鹽晶體的稜角和邊緣所空出的空間中可以形成更厚的聚合物支柱，這可能會導致如上所述孔壁中的厚度輪廓線，並導致變化的機械性能。
在氣體發泡之前在PLG/NaCl粒料中鹽晶體的融合也導致孔結構的明顯變化。1小時SF試樣的橫截面(圖5a，5c)示出了類似於溶劑澆鑄1小時SF試樣的孔壁中的小洞孔。24小時鹽融合的試樣缺乏限定的孔結構，並且孔看來似乎簡單地彼此進入(圖5b，5d)。氣體發泡的SF支架沒有顯示出在溶劑澆鑄SF試樣中觀察到的在孔壁中的任何輪廓線。同樣，鹽融合過程對總支架孔隙率也沒有影響。對於各種鹽融合時間，氣體發泡支架的總孔隙率為94±1％。
鹽晶體融合24小時造成溶劑澆鑄支架的壓縮模量增加2倍(圖6a)。支架的壓縮模量利用MTS Bionix 100機械測試體系來測量。利用1mm/min的恆定變形速率，在壓盤之間對試樣進行壓縮。壓板的直徑為45毫米，因此將覆蓋支架的整個12毫米直徑的表面。將小的預載荷施加至各試樣上，以保證整個支架表面在測試之前與壓板接觸，並且在每次測試之前板間距等於所測試的支架的測量厚度。對未經鹽融合的支架以及各鹽融合時間的四個試樣的每一個測量壓縮模量。在圖中的值表示平均值和標準偏差。利用InStatTM軟體(2.01版)進行統計分析。在每個時間點，通過Student′s t-檢驗，將試驗模量與對照模量進行對比，從而揭示出壓縮模量的顯著差異。在鹽融合1小時或12小時之後，沒有觀察到明顯的模量改變。另外，當與對照支架相比較時，利用鹽融合處理的氣體發泡支架的壓縮模量存在統計學上顯著的減小(圖6b)。
實施例3在本實施例中，本發明的支架用來培養細胞。通過γ照射，環氧乙烷或冷殺菌劑對支架進行滅菌。如果需要的話利用任何必需的生長因子，在合適的培養基中，將細胞接種至支架上。細胞培養基可以藉助分批補料或藉助灌注的方法來更換。不論何時總是保持無菌。
實施例4在本實施例中，用本發明的支架將組織植入試驗受試者的體內。在其它的實施例中，在沒有組織或細胞的情況下支架用於直接植入，以使得細胞能夠從身體進行傳導性和誘導性遷移。從16隻小鼠取活組織檢查。從任何非造血組織或造血組織取活檢。活組織檢查取自所有試驗動物的同一組織源。本實施例可以根據所需在許多種組織類型上進行。通過膠原蛋白酶處理將細胞與基底膜和合胞體解離。將來自8隻小鼠的細胞在培養皿中進行培養。從另8隻老鼠得到的細胞在本發明的支架上進行培養。在約7-21天的培養之後，將細胞或帶有細胞的支架再植回至各小鼠身上。追蹤觀察表明，本發明的細胞/支架植入物中有血管陷入並且維持三維結構。追蹤觀察表明，在沒有本發明支架的情況下所培養的細胞散入宿主動物中，並且既沒有血管陷入，也沒有維持可識別的三維結構。在其中細胞從周圍組織遷移入支架的實施例中，追蹤觀察表明，支架中細胞的建立伴有循環血管的陷入。
正如由前述很明顯的是，本發明涉及用於生產組織工程支架的新穎的組合物和方法。這些新穎的組合物和方法能夠有效生產孔徑大小和互連性一致的生物相容的結構。
權利要求
1.一種方法，包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露於所述孔隙原融合在一起的條件下，以產生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進行處理，以使所述聚合物形成支架；和e)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(c)中填充大於75％的自由空間。
3.權利要求1的方法，其中所述孔隙原由鹽晶體組成。
4.權利要求3的方法，其中所述鹽晶體選自氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。
5.權利要求1的方法，其中在所述聚合物溶液中的所述聚合物選自聚酯、聚(α-羥基酯)、聚醚、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
6.權利要求5的方法，其中所述聚酯是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
7.權利要求5的方法，其中所述聚醚是聚環氧乙烷或聚乙二醇。
8.權利要求1的方法，其中所述步驟(d)的處理包括使聚合物溶劑蒸發。
9.權利要求1的方法，其中所述步驟(e)的除去包括溶解所述融合的鹽晶體。
10.權利要求1的方法，其中所述步驟(b)的條件包括使所述鹽晶體暴露於約90％和約100％之間的相對溼度中約8-約28小時。
11.權利要求1的方法，其中所述支架在步驟(e)之後包含細胞。
12.一種方法，包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含生物相容性聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露於所述孔隙原融合在一起的溼度下，以產生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進行處理，以使所述聚合物形成支架；和e)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。
13.權利要求12的方法，其中在步驟(c)中填充大於75％的自由空間。
14.權利要求12的方法，其中所述孔隙原包含鹽晶體。
15.權利要求14的方法，其中所述鹽晶體選自氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。
16.權利要求12的方法，其中在所述聚合物溶液中的所述聚合物選自聚酯、聚(α-羥基酯)、聚醚、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
17.權利要求16的方法，其中所述聚酯是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
18.權利要求16的方法，其中所述聚醚是聚環氧乙烷或聚乙二醇。
19.權利要求12的方法，其中所述步驟(d)的處理包括使聚合物溶劑蒸發。
20.權利要求12的方法，其中所述步驟(e)的除去包括溶解所述融合的鹽晶體。
21.權利要求12的方法，其中所述步驟(b)的條件包括使所述鹽晶體暴露於約90％和約100％之間的相對溼度中約8-約28小時。
22.權利要求12的方法，其中所述支架在步驟(e)之後包含細胞。
23.權利要求12的方法，其中所述步驟b)另外還包括將所述孔隙原暴露於正壓，以使所述融合孔隙原之間的所述自由空間得以控制。
24.一種方法，包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露於所述孔隙原融合在一起的條件下，以產生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述骨架和溶液進行壓縮，以形成固態物質；e)使所述固態物質暴露於高壓氣體；f)使氣體壓力減至環境壓力；和g)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。
25.權利要求24的方法，其中所述的壓縮在100和2000psi之間。
26.權利要求24的方法，其中所述的氣體壓力在400和1200psi之間。
27.權利要求24的方法，其中所述固態物質是半固體。
全文摘要
本發明涉及用於生產支架的方法和組合物，所述支架可用於包括組織工程在內的多種目的。更具體地說，本發明涉及利用融合晶體如融合的鹽晶體來形成骨架。與現有技術的方法相比，本發明支架的生產方法改善了孔隙率、互連性並且易於製備。
文檔編號A61L27/56GK1617669SQ02827998
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月31日 優先權日2002年1月2日
發明者W·L·莫菲, R·G·丹尼斯, D·J·穆尼 申請人:密西根大學董事會