一種Exendin-4融合蛋白及其製備方法與用途與流程
2023-11-12 06:29:20
本發明屬於基因工程藥物領域，具體涉及一種長效Exendin-4融合蛋白及其製備方法和用途。
背景技術：
糖尿病是一種慢性終身性疾病，目前認為是由遺傳和後天生活習慣導致，已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛生問題。
臨床以高血糖為主要標誌，糖尿病分為1型糖尿病和2型糖尿病。糖尿病是由於胰島素分泌缺陷或胰島素作用缺陷導致血糖升高。1型糖尿病因胰島β細胞的免疫性破壞造成胰島素分泌缺乏，依賴外源性胰島素補充；而2型糖尿病發病的重要機制為胰島素抵抗和胰島β細胞分泌胰島素相對不足所致，胰島β細胞量顯著減少，殘存的胰島β細胞功能顯著異常，因此，保護β細胞量和改善β細胞功能對2型糖尿病的治療尤為關鍵。
目前2型糖尿病的治療主要以口服降糖藥為主，有磺脲類藥物如格列本脲、格列齊特、格列吡嗪等、二甲雙胍、α-糖苷酶抑制劑、胰島素等。長期使用這些藥物治療會產生藥物耐受，無法長期控制血糖和細胞功能的紊亂。因此，研發一種更加安全、有效的針對糖尿病發病機制的新型藥物尤為重要。
早在上世紀60年代，麥金太爾(Mclntyre)和埃爾裡克(Elrick)等人就發現口服葡萄糖對胰島素分泌的促進作用明顯高於靜脈注射，這種額外效應被稱為「腸促胰島素效應」。此後研究進一步證實，這種效應所產生的胰島素佔進食後胰島素總量的50％以上。正常人進餐後，腸促胰島素分泌，進而引起胰島素分泌以維持正常血糖水平。在1970年發現控制胰島素分泌的激素——腸促胰島素，腸促胰島素是人體內一種腸源性激素，在進食後，該類激素可促進胰島素分泌，發揮葡萄糖依賴性降糖作用。腸促胰島素主要包括葡萄糖依賴性促胰島素激素(GIP)和胰高血糖素樣-1(GLP-1)。小腸上端分泌的GIP和小腸下部分分泌的GLP-1都是控制胰島素分泌的激素，它們通過影響血漿胰島素水平來控制飯後血糖水平，其作用是由相應的特異性受體介導。小腸上端的GIP分泌到血液中的量較多，它促進胰島素的分泌，但是患糖尿病後GIP作用減弱。小腸下端分泌的GLP-1較GIP具有更強的促胰島素分泌的作用，特點是在進餐後馬上分泌，增加胰島素分泌及生物合成，降低胰高血糖素分泌，有效的減低血糖；能夠減弱胃腸道蠕動，延緩胃排空速度，增加飽腹感，降低食慾和減少食物攝入減輕體重；直接降低血糖；降低三醯甘油、游離脂肪酸；降低血壓；保護心血管等。GLP-1的分泌是血糖依賴性促胰島素分泌，不會增加低血糖風險等GIP所不具有的生理作用，從而顯示 出GLP-1延緩糖尿病進展及減少糖尿病心血管併發症的潛力。
GLP-1具有保護β細胞的作用，GLP-1可作用於胰島β細胞，促進胰島素基因的轉錄、胰島素的合成和分泌，並且還可以刺激胰島β細胞的增值和分化，增加胰島β細胞數量，抑制胰島β細胞凋亡，改善胰島素敏感性，增加葡萄糖的利用。此外，GLP-1還可以作用於α細胞，抑制α細胞分泌胰高血糖素的釋放，從而抑制肝臟葡萄糖生成，調節營養素代謝和營養素清除。
GLP-1是胰高血糖素肽家族的成員，是由胰高血糖素原基因表達，位於17號染色體上,是一種腸促胰島素，由37個胺基酸組成的肽鏈。GLP-1基因表達於胰腺α細胞、小腸神經內分泌L細胞和下丘腦。主要由迴腸、結腸中的L細胞合成。GLP-1有兩種形式：GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)醯胺，GLP-1約80％的循環活性來自GLP-1(7-36)。
然而，天然的GLP-1在體內很快被二肽基肽酶4(DPP-4)降解，DPP-4切斷自N端的Ala8-Glu9間位點，降解生成的片段GLP-1(9～36)是GLP-1受體拮抗劑，使得GLP-1與其受體的親和力降至原來的1％，使GLP-1的半衰期僅1～2分鐘左右，必須持續靜脈滴注或持續皮下注射才能產生療效，這大大限制了GLP-1的臨床應用。
根據GLP-1和GLP-1受體在治療糖尿病中的作用靶點，學者們研究開發了三類藥物：(1)GLP-1類似物，讓其既保有GLP-1的功效，又能抵抗降解；(2)GLP-1受體激動劑；(3)GLP-1降解酶抑制劑(DPP-4抑制劑)，使體內自身分泌的GLP-1不被降解。目前，這三方面的研究都已經取得了一定的進展。
Exendin-4是一種胰高血糖素樣肽1(GLP-1)類似物，是從希腊毒蜥蜴唾液中分離的一種多肽激素，含39個胺基酸的多肽分子，其胺基酸序列與GLP-1有53％同源性。Exendin-4的二級結構主要分為三部分：(1)N端1～8位胺基酸殘基形成一段不規則的捲曲。該區域高度保守，只有Gly2與GLP-1的Ala2不同，可拮抗DPP-4的降解作用，所以半衰期較GLP-1更長；(2)中間9～30位胺基酸殘基構成規則的α螺旋，此區域相反電荷側鏈的胺基酸在同一側面上相互交替的排列，其α螺旋比GLP-1更穩定；(3)C端31～39位胺基酸殘基是GLP-1所沒有的序列，這幾位胺基酸殘基折回到α螺旋上，以Trp25為中心形成一個「Trp-Cage」。隨後的研究表明，Exendin-4在哺乳動物內具有與GLP-1相同的生理功能，它們作用於同一受體。Exendin-4能以葡萄糖濃度依賴方式分泌胰島素降低血糖水平，刺激胰島β細胞再生，誘導前胰島基因的轉錄，促進胰島素的成熟和分泌；還可以抑制餐後胰高血糖素的產生，延遲胃排空，抑制食慾等。因為GLP-1無論是口服還是皮下注射，都易被DPP-4迅速降解，半衰期僅有1～2分鐘，限制了其在臨床上的應用，而Exendin-4半衰期卻長達幾個小時，因此在糖尿病治療方面有廣闊的前景。
雖然Exendin-4在哺乳動物內具有與GLP-1相同的生理功能，且不易被DPP-4水解，使得其具有較長的半衰期，但病人仍需每天注射兩次，導致病人的依從性較差。因此，基於Exendin-4開發出長效藥物是目前糖尿病治療領域研究的熱點。
隨著生物技術的飛速發展，延長藥物在體內的半衰期並阻止其被快速清除已成為近年來的研究熱點。已建立的提高藥物半衰期的技術包括化學修飾、微囊化、糖基化、抗蛋白酶突變體、蛋白質融合等，許多長效蛋白藥物已經研製成功並且應用於臨床治療。
為了延長藥物在體內的半衰期，免疫球蛋白IgG的Fc片段應用最為廣泛。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，半衰期約為20～30天。其穩定性好的原因主要是由於IgG的Fc片段可與新生Fc受體結合，避免IgG進入溶酶體中被降解，以pH依賴的方式結合後再循環有關。因此，IgG的Fc片段被用來與活性蛋白連接構成融合蛋白，以提高活性蛋白體內半衰期，達到長效目的。但IgG1、IgG2和IgG3的Fc片段能通過經典途徑活化補體，產生補體依賴性細胞毒作用(CDC)；並可與巨噬細胞、NK細胞表面的Fc受體結合，發揮調理作用及抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。Fc片段介導的CDC和ADCC活性對於延長藥物半衰期的作用毫無意義，並可能導致不良反應的產生。與其他型的IgG相比，IgG4的Fc片段具有最低的補體結合活性和FcR結合活性。但為了避免CDC和ADCC活性的出現，仍需要對其Fc片段進行突變得到IgG4Fc突變體。而如何進行突變既能明顯延長目標蛋白的體內半衰期，提高融合蛋白的穩定性，又能使獲得的融合蛋白儘量減少CDC和ADCC活性，也是解決該問題的核心要點。
同時，目前已上市的Fc融合蛋白往往採用一個目的蛋白與IgG的Fc片段融合，這樣會降低目的蛋白的體外活性，尤其是自身分子量較小的多肽。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是現有的含Exendin-4多肽的融合蛋白的穩定性還不夠好以及安全性不足的問題。本發明解決技術問題的方案是提供一種新的含Exendin-4多肽的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白的結構為：從氮端起依次含有Exendin-4、連接肽、Exendin-4、連接肽、IgG4的Fc段突變體。即本發明含Exendin-4多肽的融合蛋白的結構從氮端起為Ex-4-連接肽-Ex-4-連接肽-IgG4的Fc段突變體。
其中，人IgG4的Fc段突變體的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示。突變位置具體為Ser228Pro/Phe234Ala/Leu235Ala/△Lys447，這些突變能有效降低IgG4Fc片段的ADCC和CDC效應。
SEQ ID No.1：
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。
其中，上述的Exendin-4多肽的胺基酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.2：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。
上述融合蛋白為2個Exendin-4-連接肽與人IgG4Fc突變體重組而成。融合蛋白之間的連接肽需要具有足夠的長度和較好的柔性，以保證連接的2個分子能正確摺疊，保證其生物學活性。一般採用5-25個胺基酸的柔性肽段。可使用本領域常用的連接肽。
比如，上述的連接肽的胺基酸序列可如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3：GGGGSGGGGSGGGGS。
進一步的，上述的融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.4：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。
更進一步的，上述的融合蛋白還在氮端包含有信號肽。
同時，本發明還提供了編碼上述的融合蛋白的核酸。
進一步，上述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.5或其簡併序列所示。
SEQ ID No.5：
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCAGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT。
本發明還提供了含有權利要求7所述核苷酸序列的基因載體。
本發明還提供了含有權利要求8所述基因載體的宿主細胞。
本發明還提供了上述的融合蛋白、或上述核苷酸序列、或上述基因載體在製備糖尿病或肥胖症的藥物的用途。
其中，上述的糖尿病為1型糖尿病或2型糖尿病。
此外，本發明還提供了一種治療糖尿病或肥胖症的藥物，該藥物是以上述的融合蛋白為主要活性成分製備而成。即含有上述融合蛋白及藥學上可接受的輔料。
其中，上述藥物還可以包含其他的治療糖尿病或者肥胖症的藥物。
其中，上述的糖尿病為1型糖尿病或2型糖尿病。
為了更好的實施本發明，本發明還提供了一種製備上述融合蛋白的方法。該方法包括以下步驟：將編碼融合蛋白的基因可操作地裝入表達載體，將表達載體轉入宿主，宿主培養增殖後即從宿主和/或其培養上清液分離純化得到含Exendin-4的融合蛋白。
其中，上述融合蛋白的製備方法中所述的表達載體為真核質粒表達載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
其中，上述融合蛋白的製備方法中所述的宿主為真核細胞。
其中，上述融合蛋白的製備方法中所述的分離純化方法為將大規模培養宿主的上清液用Protein A親和層析柱進行純化，再過SP柱層析得到含Exendin-4的融合蛋白。
顯然，上述方法中的表達載體可使用常用的真核表達載體、各種基因工程常用的宿主細胞，分離純化方法也可以參考使用現有的常用方法以獲得較純的本發明含Exendin-4的融合蛋白。而將編碼融合蛋白的基因可操作地裝入表達載體，以及將表達載體轉入宿主，則可以參照各種基因工程手冊和具體使用的載體與宿主細胞的說明進行。
本發明提供的含Exendin-4的融合蛋白是由Exendin-4與特定突變的人免疫球蛋白IgG4 的Fc片段突變體融合而成。該融合蛋白具有更好的穩定性和更長的半衰期，同時具有更低的毒副作用。本發明融合蛋白能用於I型、II型糖尿病以及肥胖症的治療，有明顯長效化特徵，保留了Exendin-4生物學活性，能夠通過血糖依賴的胰島素分泌改善血糖水平控制，不會造成低血糖的危險；抑制胰高血糖素分泌；減輕胃排空率；減少體重以及增加飽腹感，延長其在血清中的半衰期。同時該融合蛋白具有針對Exendin-4進行了突變的Fc片段，能夠最大程度降低天然IgG Fc所帶來的CDC和ADCC效應，從而降低藥物的不良反應，因此具有很高的臨床應用價值。
附圖說明
圖1真核表達載體pAAV2-neo的圖譜。
圖2雙酶切鑑定電泳圖譜(1％瓊脂糖電泳)。1：1Kb Ladder；2：pAAV2-E4F4(Kpn I+Bgl II)。
圖3RT-PCR擴增IgG4Fc DNA片段的電泳圖譜(1％瓊脂糖電泳)。1：1kb DNA ladder maker；2：CHO；3：CHO-E4F4；4：陽性對照(pAAV2-E4F4)。
圖4E4F4融合蛋白的12％SDS-PAGE電泳圖譜。1：蛋白分子量標準；2：E4F4非還原型；3：E4F4還原型。
圖5E4F4融合蛋白的體外活性測定結果。
圖6E4F4融合蛋白對飲食誘導的肥胖小鼠體重及攝食量的影響。A：肥胖小鼠體重；B：肥胖小鼠攝食量。
圖7E4F4融合蛋白對飲食誘導的肥胖小鼠胰島素耐量及曲線下面積的影響。A：肥胖小鼠胰島素耐量；B：肥胖小鼠胰島素耐量的曲線下面積。
圖8E4F4融合蛋白對飲食誘導的肥胖小鼠葡萄糖耐量及曲線下面積的影響。A：肥胖小鼠葡萄糖耐量；B：肥胖小鼠葡萄糖耐量的曲線下面積。
圖9E4F4融合蛋白對血漿中胰島素含量的影響。
圖10E4F4融合蛋白在大鼠體內的藥物代謝動力學。
具體實施方式
以下通過具體實施方式結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明。
本發明的目的在於提供一種含Exendin-4的融合蛋白。該融合蛋白是由Exendin-4與人免疫球蛋白IgG4的Fc片段突變體融合而成。該融合蛋白具有更好的穩定性和更長的半衰期，能夠明顯促進胰島素的分泌，並且提高機體對胰島素的敏感性，同時具有減輕體重的作用。
由於Exendin-4的分子量小，能被腎臟快速清除，需要每天注射兩次以維持其治療效果， 在臨床上受到一定的限制，為了更好的發揮概要的療效，因此本發明利用Exendin-4與人免疫球蛋白IgG4的Fc片段突變體融合延長其半衰期。與現有技術中一個目的蛋白與IgG融合不同，這樣降低了蛋白的活性，有效劑量變大，不良反應風險提高。本發明中，有兩個Exendin-4蛋白與IgG4融合，延長融合蛋白在體內的半衰期，同時維持Exendin-4的活性。
本發明提供一種用於治療糖尿病和肥胖症的融合蛋白，所述融合蛋白為2個Exendin-4-連接肽與人IgG4Fc突變體重組而成。
其中，連接肽為一組由胺基酸組成的無二級結構的柔性肽段，其胺基酸的個數不大於25個。
常用的連接肽的胺基酸序列如SEQ ID No.2所示。
IgG4Fc突變體採用點突變將Fc段中與補體和FcR結合的位點突變，即Ser228Pro/Phe234Ala/Leu235Ala/△Lys447。具體來說，將第228位絲氨酸(Ser)突變為脯氨酸(Pro)，第234位的苯丙氨酸(Phe)突變為丙氨酸(Ala)，第235的亮氨酸(Leu)突變為丙氨酸(Ala)；同時，為了保證C-末端的均一性，缺失第447位的賴氨酸(Lys)。
融合蛋白之間的連接肽因具有足夠的長度和較好的柔性，以保證連接的2個分子能正確摺疊，保證其生物學活性。一般採用5-25個胺基酸的柔性肽段。
本發明的融合蛋白全長為Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-IgG4Fc突變體，胺基酸序列如SEQ ID No.4所示。該融合蛋白以下簡稱為rhE4F4融合蛋白。
顯然，在上述公開的本發明內容的指導下，本領域技術人員使用本領域常規的分子生物學技術和免疫學技術足以能夠實施本發明。
以下則通過實施例進行更進一步的詳細說明。
實施例一E4F4融合蛋白的設計及重組表達載體的構建
融合蛋白序列設計，將突變人IgG4Fc片段((aa.99-327)融合於兩個Exendin-4片段的C-端。同時，為了實現融合蛋白的分泌表達，在N-端加上小鼠信號肽序列，得到最終的融合蛋白為：ssmIg-Ex-4-(G4S)3-Ex-4-(G4S)3-human mutant IgG4Fc(aa.99-327)。
含信號肽的融合蛋白序列如下(SEQ ID No.6)：
MGWSCIILFLVATATGVHSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。
對應的編碼核苷酸序列如下(SEQ ID No.7)所示：
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCAGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA。
採用全基因合成的方法得到含小鼠信號肽的E4F4融合蛋白的DNA片段(SEQ ID No.7)(上海英駿公司)，將合成的片段直接插入表達載體pAAV2-neo，其質粒圖譜見圖1。重組克隆經進行Bgl II和Kpn I雙酶切鑑定，切出1100bp左右的片段，見圖2。經上海英駿公司測序驗證與設計序列一致。
實施例二CHO穩定表達株(CHO-E4F4細胞)篩選及鑑定
取10μg大量製備的實施例1中的pAAV2-E4F4質粒，採用脂質體Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen公司)轉染CHO細胞(購自美國ATCC公司)。通過ELISA檢測培養上清中融合蛋白的表達情況，經四輪篩選後，優選出高表達E4F4細胞，將穩定表達的細胞命名為CHO-E4F4細胞。
抽提CHO-E4F4細胞的RNA，用RT-PCR鑑定插入片段的轉錄情況。結果如圖3所示， CHO-E4F4為正確的重組表達E4F4的穩定細胞株。
實施例三rhE4F4融合蛋白的製備
大規模培養CHO-E4F4細胞，上清液經Protein A Sepharose F.F.(購自美國GE公司)親和層析柱進行純化，純化得到蛋白的電泳圖譜見圖4，純度可達到90％以上。
具體步驟如下：
(1)表達上清液預處理：用1M的NaOH將上清液緩慢調節pH至7.2，在4℃下4000rpm離心10min，收集上清。
(2)離心上清經Protein A Sepharose F.F.親和層析柱，用0.1M檸檬酸緩衝液(pH3.0)將融合蛋白洗下，洗下的融合蛋白用1M的NaOH調節pH至7.2。
(3)將得到的rhE4F4融合蛋白經10mM磷酸緩衝液透析，-20℃保存。
實施例四rhE4F4融合蛋白體外生物學活性測定
採用cAMP酶聯測定法來檢測rhE4F4融合蛋白的體外生物學活性。所選用的cAMP檢測試劑盒為美國R&D公司產品，操作方法也按照試劑盒說明書進行，細胞係為大鼠胰島瘤RIN-5F細胞(購自美國ATCC公司)，細胞的傳代培養按照常規方法進行，陽性對照品為Exendin-4(購自美國Sigma公司)。
rhE4F4融合蛋白體外生物學活性測定方法如下：
(1)在96孔板中接種RIN/5F細胞1.2×104細胞/孔，將接種好的96孔板先放於室溫1hr，再放於37℃，5％C02中培養72hr。
(2)樣品稀釋：用樣品稀釋液把各樣品稀釋到1μg/ml的起始濃度；從起始濃度做等3倍稀釋，共12個稀釋度，每個梯度3個復孔，同時設定樣品稀釋液和1×DMEMH為對照孔。
(3)棄去96孔板中上清，各取稀釋好的樣品100μl加到96孔板中，於37℃，5％C02中培養0.5hr。
(4)cAMP的提取：R&D的cAMP檢測試劑盒裂解細胞提取cAMP，取出96孔板，棄上清，用PBS洗3遍；加入試劑盒中的1×裂解液，凍融3次。
(5)cAMP含量測定：混合復孔中的裂解液，取100μl用RD的cAMP檢測試劑盒檢測cAMP含量。
E4F4融合蛋白的體外生物學活性測定見圖5，Exendin-4的ED50為3.79ng/ml，rhE4F4融合蛋白的ED50為2.74ng/ml。結果表明，IgG4Fc片段的融合併不影響Exendin-4的活性，即激活GLP-1受體(GLPR)的能力。
實施例五rhE4F4融合蛋白的初步藥效學研究
建立小鼠飲食誘導的肥胖模型(DIO)研究E4F4融合蛋白體內的對小鼠糖尿病模型的治療效果。
實驗方法：選擇體重為40～45g的C57/B6雄性小鼠(購自北京維通利華公司)，隨機分成3組：生理鹽水組(NS組)和E4F4融合蛋白組(E4F4組)用高脂飼料餵養8周形成肥胖，胰島素抵抗和血糖升高的症狀，再開始對小鼠進行治療。而正常組小鼠同期不飼餵高脂飼料。
治療方式為生理鹽水組(NS組)和E4F4融合蛋白組(E4F4組)均為皮下給藥，rhE4F4融合蛋白組為一周給藥一次1.8mg/kg。然後每天稱三組的體重和攝食量。
治療後14天，對小鼠進行胰島素耐量和葡萄糖耐量的檢測，然後處死小鼠後，眼眶靜脈取血，分離血清，負80度冰箱保存。
胰島素耐量(ITT)的檢測，檢測前將小鼠禁食4小時(自由飲水)，然後對小鼠腹腔注射0.5U/kg的胰島素，分別在注射胰島素後0、30、60、120min四個時間點進行尾尖採血，測定血糖含量。
葡萄糖耐量(IPGTT)檢測，檢測前將小鼠禁食16小時(自由飲水)，然後對小鼠腹腔注射2g/kg的葡萄糖溶液，分別在注射葡萄糖0、30、60、120min四個時間點進行尾尖採血，測定血糖含量。
實驗結果：各組小鼠體重及攝食量的變化見圖6，結果顯示，rhE4F4融合蛋白組，即一周給藥1次E4F4融合蛋白能夠明顯抑制小鼠體重的增長；並且rhE4F4融合蛋白組與NS組相比都有非常顯著的統計學差異(P<0.001)；每天對小鼠攝食量進行稱量，與NS組相比，rhE4F4融合蛋白組對小鼠攝食量有一定的抑制作用。
小鼠胰島素耐量檢測如圖7所示，小鼠治療周期結束時，將小鼠禁食4小時，對小鼠腹腔注射0.5U/kg的胰島素，分別在0、30、60、120min四個時間點對血糖進行檢測。實驗結果顯示，與NS組相比，rhE4F4融合蛋白組能夠明顯改善胰島素耐量情況，rhE4F4融合蛋白組的曲線下面積(AUC)與NS組的曲線下面積(AUC)也具有非常顯著的統計差異(P<0.001)。
小鼠葡萄糖耐量檢測如圖7所示，小鼠治療周期結束時，將小鼠禁食16小時，對小鼠腹腔注射2g/kg的葡萄糖，分別在0、30、60、120min四個時間點對血糖進行檢測；實驗結果顯示，在30min時，rhE4F4融合蛋白組分泌的胰島素能夠明顯控制葡萄糖的含量，提高DIO小鼠的葡萄糖耐量；在30、60、120min三個時間點時，rhE4F4融合蛋白組與NS組相比也有具有非常顯著的統計差異(P<0.001)；rhE4F4融合蛋白組的曲線下面積(AUC)與NS組的曲線下面積(AUC)也具有非常顯著的統計差異(P<0.001)。
DIO小鼠治療前後胰島素含量結果如圖9，結果顯示，與NS組相比，rhE4F4融合蛋白組DIO小鼠治療後，胰島素含量明顯降低，具有非常顯著的統計差異(P<0.001)。
實施例六rhE4F4融合蛋白的體內初步藥代學研究
選擇8周齡的SD雄性大鼠(購自四川大學動物實驗中心)，隨機分成3組：Exendin-4組、rhE4F4融合蛋白組和NS組，每組3隻，分別注射Exendin-4:100μg/kg、rhE4F4融合蛋白:450μg/kg和生理鹽水，檢測42天內Exendin-4含量的變化，在不同的時間點0、1、2、4、6、14、21、28、35、42天取血，採用Exendin-4檢測試劑盒(購自美國phoenix pharmaceuticals公司)檢測血清中Exendin-4的含量。
在取樣的各個時間點中，NS組的血清中一直未檢測出Exendin-4；Exendin-4組的血清在第1天和第2天能檢測到少量Exendin-4，其後時間點檢測不到。而rhE4F4融合蛋白組的血清在Exendin-4含量一直可持續檢測到35天(如圖9所示)，經計算rhE4F4融合蛋白在體內的半衰期t1/2為6.6天。