核苷酸磷脂分子及脂質體及其製備方法和應用的製作方法
2023-11-08 03:21:27 1
專利名稱：核苷酸磷脂分子及脂質體及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物轉運載體技術領域，涉及一種用於核酸跨膜轉運的新型核苷酸磷
脂分子及其製備方法，還涉及該核苷酸磷脂分子所形成的脂質體及其製備方法和應用。
背景技術：
基於核酸的一些藥物和生物活性分子如異核苷、寡核苷酸、小幹擾RNA(siRNA)及 各種RNA、 DNA單鏈和雙鏈要想發揮其生物活性，必須能有效的解決其透過細胞膜的能力。 很多技術已經被用來提高這些化合物的細胞攝取，例如，高壓靜脈注射、脂質體和納米聚合 物等，但是這些方法都存在各自的短板而限制其發展。 目前在核酸類分子跨膜方面應用最廣泛的是脂質體載體，包括天然磷脂脂質體和 陽離子脂質體。天然磷脂含負電荷，對核酸類分子的攜帶能力差，需要繁瑣的處理和製劑設 備及工藝方能製成脂質體，雖然有成本優勢但是易用性差，且不可能作為轉染試劑使用。陽 離子脂質體雖然能高效地攜帶轉運核酸類分子，但其對細胞膜也會造成嚴重損傷，雖然使 用簡便，但細胞毒性決定了其只能在低濃度下用於轉染實驗，無法大規模用於藥物製劑。而 且作為高效轉染試劑的陽離子脂質體工藝為外國所把持，價格高昂。這一切，使得尋找高效 的電中性的脂質體載體成為極為必要的舉措。
發明內容
為了解決上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一類具有高效轉運
核酸類化合物透膜能力的磷脂脂質體及其製備方法和應用，包括方便地大量製備核苷酸磷
脂化合物並進一步形成脂質體的方法。 為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案 —種核苷酸磷脂分子，其具有如式(VIII)或式(IX)所示的兩親性結構
VIII IX
S卩，一個核苷結構的親水基團和一個脂肪醇或甘油脂的親脂基團，兩種基團由磷 脂連接構成一個核苷酸磷脂分子。 其中，所述核苷酸磷脂分子中所含鹼基，即式(VIII)和式(IX)中的Base基團，為 各種常見的天然嘌呤和嘧啶鹼基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等。
磷酸部分除結合親水及親脂基團的兩個羥基之外的第三個羥基，即式(VIII)和 式(IX)中的&基團，為長度在lnm以內，含12個碳原子以下的非離子型取代基，如甲基、 乙基、腈乙基、苄基等，也可以是非取代的氫原子。 所含的脂肪醇或甘油脂的親脂基團，即式(VIII)和式(IX)中的&基團，為長度在 10到18個碳原子的脂肪烴或醚類取代基，可以是飽和的或不飽和的，例如十六烷基、十八 烯基、聚乙二醇等。 本發明還提供所述核苷酸磷脂分子的製備方法，是亞磷醯化方法，其可以但不必 須經由一釜法策略製備。 所述一釜法策略使用能夠簡單大量獲得的試劑，在常溫條件下，8小時之內得到目 標化合物。該策略包括下列步驟 (a)在無水無氧條件下的亞磷醯化反應；通過三價亞磷醯試劑構建磷脂分子，尤
其是存在含有三價磷的亞磷脂化合物中間體； (b)反應完成後蒸乾溶劑，無需轉移的氧化反應； (c)氧化之後無需轉移、條件溫和的脫保護基反應。 進一步，所得化合物還可經由正相矽膠色譜方法純化。 本發明進一步提供所述核苷酸磷脂分子的應用，可將其用於製備脂質體，但不僅 僅局限於此一用途。 所述脂質體可以由本發明公開的核苷酸磷脂分子構成，或由本發明公開的核苷酸 磷脂分子和其他化合物混合構成。這些化合物可以是膽固醇、含陽離子的磷脂、大豆磷脂 等，但不僅僅局限於這一範圍。 上述由本發明公開的核苷酸磷脂分子構成，或由本發明公開的核苷酸磷脂分子和 其他化合物混合構成的空白脂質體可以攜帶核苷分子、核苷酸鏈、siRNA分子透過細胞膜。 所述的核苷分子是指天然核苷、經由化學修飾的核苷、異核苷；所述的核苷酸鏈是指各種天 然核苷酸鏈和經由化學修飾的核苷酸鏈，包括但不局限於單/雙鏈寡核苷酸、直鏈/環狀核 苷酸鏈、脫氧/非脫氧核苷酸形成的鏈；所述的siRNA分子是指化學合成的siRNA分子、經 由Dicer酶降解生產的siRNA分子和化學修飾的siRNA分子。 本發明進一步提供一種製備上述脂質體的方法，可以是通過製劑手段使核苷分 子、核苷酸鏈或siRNA分子包裹在脂質體內，也可以是將空白脂質體和上述分子簡單混合 後孵育形成可以透過細胞膜的結合物。 本發明還提供所述脂質體的用途，可以作為轉染試劑，攜帶基因分子透過細胞膜； 所述的基因分子指攜帶遺傳性息的DNA單鏈、RNA單鏈、DNA雙鏈、RNA雙鏈及其他可以用作 質粒轉染的DNA分子。 本發明可以實現以下優點提供了一類核苷和各種核酸的高效透膜載體，低細胞 毒性，體內可降解為內源性物質，且使用簡便；且該類載體經由一釜法完成的合成路線及簡
單的純化方法製備得到，具有相對低廉的製造成本。本發明涉及的磷脂脂質體，具有製備簡 單、效用良好、應用範圍廣泛等特點，是一類膜透性好的載體分子，可用於介導核苷酸類化 合物如siRNA、質粒的透膜。該種脂質體可以作為研究反義寡核苷酸與小幹擾RNA(siRNA) 機理的分子生物學工具，或一種通用的轉染試劑，同時也具有潛在的藥物開發前景。
圖1為代表性化合物B的合成路線； 圖2為代表性化合物B的核磁共振氫譜譜圖； 圖3為代表性化合物F的合成路線； 圖4為毛細管電泳評價脂質體對核酸鏈的親和力； 圖5為螢光法觀測脂質體內包合siRNA的情況及使用其進行細胞轉染的結果，其 中A表示HEK293細胞系轉染實驗；B表示BT474細胞系轉染實驗；C和D表示雷射共聚焦顯 微觀測脂質體_核酸複合物顆粒。
具體實施例方式
— 、核苷酸磷脂化合物的合成 根據本發明，製備核苷酸磷脂化合物的合成方法，主要包括以下步驟 A.使用式(I)的結構與式(II)或式(III)通過亞磷醯化方法構建式(IV)化合物
或式(V)化合物，即在無水無氧條件下進行亞磷醯化反應，亞磷醯試劑式(I)Ri基團為一短
的親脂基團，可以是但不局限於甲基、腈乙氧基、苄基；
B.對式(IV)、式(V)的亞磷醯進行氧化，氧化劑可以是但不局限於雙氧水、過氧叔
丁醇，得到式(VI)和式(VII);
6VI VII
C.將式(VI)和式(VII)脫除匿Tr保護，從而形成核苷酸磷脂分子式(VIII)和式 (IX)。
VIII IX
以上所示Base為各種常見的天然嘌呤和嘧啶鹼基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌 呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等； 以上所示&為長度在lnm以內，含12個碳原子以下的不含電荷的取代基，如甲基、 乙基、月青乙基、節基等； 以上所示R2為長度在10到18個碳原子內的脂肪烴取代基，為長度在10到18個 碳原子的脂肪烴或醚類取代基，可以是飽和的或不飽和的，例如十六烷基、十八烯基、聚乙
二醇等。
(1) —釜法策略 根據本發明，核苷酸磷脂化合物的製備應通過包括下列步驟的方法實現(a)在 無水無氧條件下的亞磷醯化反應；(b)反應完成後蒸乾溶劑，無需轉移的氧化反應；(c)氧 化之後無需轉移條件溫和的脫保護基反應； 根據本發明，用於亞磷醯化的試劑可以是1H-四氮唑。 根據本發明，用於脫除匿Tr保護基的試劑可以是三氟乙酸(TFA)。 根據本發明，用於反應的溶劑包括，但不限於吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈
(MeCN)、甲醇(MeOH)禾P N， N_ 二甲基甲醯胺(DMF)。 (2)純化方法 —釜法合成核苷酸磷脂之後的產物可進一步經由正相矽膠色譜方法純化，以二氯
甲烷甲醇=50 : i io : i(體積比)的洗脫條件可分離純化上述系列核苷酸磷脂產物。 以下通過具體合成的實施例進一步說明本發明，但不代表對本發明有任何限制。
根據上述的方法，我們得到了一系列核苷酸磷脂化合物，代表性的例舉其中六個
7化合物A-F :
formula see original document page 8 實施例1化合物B的合成
反應路線如圖l所示。 取化合物Bl (亞磷醯化核苷單體均購自國藥集團，為DNA合成常用化合物，市場來 源廣泛)(740mg) ， 1H-四唑(70mg)，無水無氧條件下混合，溶於雙蒸無水CH3CN 15ml中，攪 拌。取化合物正十六醇(棕櫚醇)(360mg)，溶於10ml雙蒸無水CH3CN中，緩緩注入前述攪 拌反應中。室溫繼續攪拌反應2小時，TLC鑑定反應基本完全後冰浴降溫。
冰浴攪拌下逐滴滴加過氧叔丁醇(0. 3ml， 4eq.)，觀察無劇烈放熱後撤去冰浴，繼 續反應30分鐘。然後向反應體系中加入30ml 5% CHC12C00H的CH2C12溶液，室溫攪拌反應 15分鐘，TLC鑑定反應完全後，矽膠柱層析(環己烷乙酸乙酯=3 : l)分離，產物為白色 小膠珠狀固體，完全抽乾後為貼壁白色間帶紅色固體，共計390mg，總收率66% .
產物核磁氫譜檢驗如圖2所示。 4 NMR(CD30D) :67. 73 (s， 1H) ，6. 24(t， 1H， J = 6. 0Hz， 1H) ， 5. 01 (m， 1H)， 4. 78-4. 08 (m， 5H) ， 3. 73 (d， J = 2. 8， 2H) ， 2. 83 (m， 2H) ， 2. 48 (m， 1H) ， 2. 34 (m， 1H) ， 1. 81 (s， 3H) ， 1. 62-1. 67(m，2H) ， 1. 33(s，26H) ，0. 82(t， J = 7. 2Hz，3H).
高分辨質譜得MS :m/z 600. 3409 [M+H] +
實施例2化合物F的合成
反應路線如圖3所示。 取化合物Fl (購自國藥集團)(400mg) ， 1H_四唑(40mg)，無水無氧條件下混合，溶 於雙蒸無水CH3CN 10ml中，攪拌。取化合物正十二醇(180mg)，溶於10ml雙蒸無水CH3CN 中，緩緩注入前述攪拌反應中。室溫繼續攪拌反應2小時，TLC鑑定反應基本完全後冰浴降溫。 冰浴攪拌下逐滴滴加過氧叔丁醇(0. 2ml)，觀察無劇烈放熱後撤去冰浴，繼續反應 30分鐘。然後向反應體系中加入25ml 5% CHC12C00H的CH2C12溶液，室溫攪拌反應15分 鍾，TLC鑑定反應完全後，注入飽和濃氨水lOml，攪拌反應30分鐘，TLC鑑定反應完全後，以矽膠柱層析(二氯甲烷甲醇=30 : 1)分離，產物為白色小膠珠狀固體，共計183mg，總收 率73% . 高分辨質譜得MS:m/z 514. 3233 [M+H]+. 本發明要求權利的系列化合物都可以用和產物相對應的原料，以上述方法合成，
故不再一一贅述。 二、核苷酸磷脂脂質體的製備
(1)空白脂質體的製備 經過純化後的上述核苷酸磷脂化合物可用於製備空白脂質體，通過以下方法實 施 (a)將核苷酸磷脂的乙醇溶液通過薄膜分散法制為空白脂質體；
(b)透析去小分子雜質；
(c)凍幹。 該空白脂質體可按照中華人民共和國藥典中關於脂質體藥物載體的使用方法，用 做各種藥物的載體。
(2)脂質體_核酸複合物的製備 除預製空白脂質體用於包載藥物之外，本發明公開的系列核苷酸磷脂化合物還可 以通過溶液狀態與核酸分子相互作用，形成脂質體_核酸複合物，從而發揮轉染試劑的作 用。具體通過以下方法實施 (a)將核苷酸磷脂分散在乙醇水=100 : 0 50 : 50的溶液中；
(b)將上述溶液同核酸(如siRNA、反義寡核苷酸、質粒)溶液混合；
(c)將上述混合液25攝氏度下振搖孵育30分鐘； (d)上述孵育後混合液即為脂質體-核酸複合物，可以直接用於細胞轉染，也可以 通過薄膜法、凍融法等方法修飾粒徑或進一步提高包封率。 根據本發明，用於製備脂質體和透析的主要溶劑包括，但不限於，去離子水(H20)、
吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N， N-二甲基甲醯胺(DMF)。其中
具體操作方法為相關專業人員所熟知，故不再贅述。三、根據本發明，核苷酸磷脂脂質體可
以用於以下用途 A. siRNA透膜轉運 核苷酸磷脂脂質體可以用於協助siRNA的透膜轉運。通過製備脂質體包裹的 siRNA或者將siRNA和核苷酸磷脂簡單共孵育製得的複合物，可以有效的將siRNA轉運進細 胞膜。 B.寡核苷酸透膜轉運 寡核苷酸也可以用和A所述同樣的方式進行轉運。
C.基因轉染 本發明也可以用作基因轉染試劑，通過將核苷酸磷脂和質粒進行大約30分鐘的 簡單共孵育，g卩能形成轉染複合物，完成有效轉染。
應用實例1 :對寡核苷酸雙鏈的結合能力； 使用21個鹼基對長度的雙鏈DNA和化合物合成方法舉例中的核苷酸磷脂化合物 C，對比在有無脂質體參與情況下DNA雙鏈的毛細管電泳行為，說明該類脂質體對寡核苷酸的結合能力，如圖4所示。
實驗條件 所用雙鏈DNA序列(購買自北京奧科生物技術有限公司)如下 5， -TCGGGAAATTTCTCTATTATT-3， 3' -TTAGCCCTTTAAAGAGATAAT-5' 所用核苷酸磷脂化合物C為其乙醇的真溶液。 毛細管電泳實驗溫度25°C ，檢測波長254nm，電泳電壓25kV，流動相緩衝液為25mM
TBE，pH = 8. 0。圖中所示峰為溶液中游離的雙鏈DNA的檢出峰。所用DNA為0. 2od/ y L的
21鹼基dsDNA在25mM的TBE中的溶液。 圖4中所示三條曲線，自上而下分別為 (l)DNA :僅以DNA雙鏈溶液單獨進行毛細管電泳； (2)0':以DNA雙鏈和50倍質量當量的核苷酸磷脂混合振搖後立刻進行毛細管電泳； (3) 30':以DNA雙鏈和50倍質量當量的核苷酸磷脂混合後振搖30分鐘再進行毛細管電泳。 電泳結果顯示，加入該種磷脂後，溶液中游離的雙鏈DNA片段大幅減少，說明該磷脂可以迅速捕捉結合雙鏈DNA寡核苷酸片段。
應用實例2 :轉染和透膜能力，如圖5所示。 轉染實驗使用化合物合成方法舉例中的核苷酸磷脂B和羧基螢光素(FAM)螢光標記的siRNA(序列如下，購買自北京奧科生物技術有限公司)混合孵育，即將核苷酸磷脂B的乙醇真溶液加入到siRNA中孵育，在雷射共聚焦顯微下能夠觀察到脂質體-siRNA複合物(圖5C、D，脂質體中可見明顯綠色螢光聚集)；以粒度儀檢測該複合物的平均粒徑為350nm。將該複合物和細胞共孵育後，觀察到細胞內螢光(圖5A、B)，證明siRNA已被轉染入細胞內。
實驗所用siRNA序列
5' -UCGGGAAAUUUCUCUAUUAdTdT-3'
3' -dTdTAGCCCUUUAAAGAGAUAAU-5' 本文顯示並詳細描述的信息足以實現本發明的上述目的，因此本發明的優選實施方案代表本發明的主題，該主題為本發明所廣泛涵蓋。本發明的範圍完全涵蓋其它對本領域技術人員來說顯而易見的實施方案，因此，本發明的範圍不被除所附權利要求之外的任何內容所限制，其中除了明確說明外，所用元素的單數形式並不是指"一個和唯一"，而是指"一個或更多"。對本領域一般技術人員來說，所有公知的上述優選的實施方案和附加實施方案部分的結構、組成和功能上的等價物因此引入本文作參考，而且試圖被本發明的權利要求所涵蓋。 此外，不需要某種設備或方法來表達本發明所解決的每個問題，因為它們都已包括在本發明的權利要求之內。另外，無論本發明公開事實中的所有部分、成分，或者方法步驟是否在權利要求中被明確敘述，它們都沒有貢獻給公眾。但是，對本領域普通技術人員來說，很明顯在不背離如所附權利要求中所闡明的本發明的實質和範圍的前提下，可以在形式、試劑和合成細節上做出各種改變和修飾。
10
權利要求
一種核苷酸磷脂分子，其具有如式(VIII)或式(IX)所示的兩親性結構即，一個核苷結構的親水基團和一個脂肪醇或甘油脂的親脂基團，兩種基團由磷脂連接構成一個核苷酸磷脂分子。F2009102387376C0000011.tif
2. 根據權利要求l所述核苷酸磷脂分子，其中所含鹼基，即式(VIII)和式(IX)中的 Base基團，為各種常見的天然嘌呤和嘧啶鹼基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸 腺嘧啶及尿嘧啶等。
3. 根據權利要求1所述核苷酸磷脂分子，其中磷酸部分除結合親水及親脂基團的兩個 羥基之外的第三個羥基，即式(VIII)和式(IX)中的R1基團，為長度在lnm以內，含12個 碳原子以下的非離子型取代基，如甲基、乙基、腈乙基、苄基等，也可以是非取代的氫原子。
4. 根據權利要求1所述核苷酸磷脂分子，其中所含的脂肪醇或甘油脂的親脂基團，即 式(VIII)和式(IX)中的&基團，為長度在10到18個碳原子的脂肪烴取代基，可以是飽 和的或不飽和的，例如十六烷基、十八烯基等。
5. —種製備權利要求1所述核苷酸磷脂分子的方法，是亞磷醯化方法，其可以但不必 須經由一釜法策略製備。
6. 根據權利要求5所述的方法，所述一釜法策略應通過包括下列步驟的方法實現(a) 在無水無氧條件下的亞磷醯化反應；通過三價亞磷醯試劑構建磷脂分子，尤其是 存在含有三價磷的亞磷脂化合物中間體；(b) 反應完成後蒸乾溶劑，無需轉移的氧化反應；(c) 氧化之後無需轉移、條件溫和的脫保護基反應； 進一步，優選脫除保護基完成後經由正相矽膠色譜方法進行純化。
7. —種脂質體，其是由權利要求1所述的核苷酸磷脂分子構建；該脂質體可以單獨由 權利要求1所述的核苷酸磷脂分子構成，也可以由權利要求1所述的核苷酸磷脂分子和其 他化合物混合構成，混合的其他化合物可以是但不局限於膽固醇、含陽離子的磷脂、大豆磷 脂。
8. 權利要求7所述的脂質體，可以攜帶核苷分子、核苷酸鏈或siRNA分子；所述的核苷 分子是指天然核苷、經由化學修飾的核苷、異核苷；所述的核苷酸鏈是指各種天然核苷酸鏈 和經由化學修飾的核苷酸鏈，包括但不局限於單/雙鏈寡核苷酸、直鏈/環狀核苷酸鏈、脫 氧/非脫氧核苷酸形成的鏈；所述的siRNA分子是指化學合成的siRNA分子、經由Dicer酶 降解生產的siRNA分子和化學修飾的siRNA分子。
9. 一種製備權利要求7或8所述脂質體的方法，可以是通過製劑手段使核苷分子、寡核 苷酸鏈或siRNA分子包裹在脂質體內，也可以是將空白脂質體和上述分子簡單混合後孵育形成可以透過細胞膜的結合物。
10.權利要求7或8所述脂質體的用途，可作為轉染試劑，攜帶基因分子透過細胞膜； 所述的基因分子指攜帶遺傳性息的DNA單鏈、RNA單鏈、DNA雙鏈、RNA雙鏈及其他可以用作 質粒轉染的DNA分子。
全文摘要
本發明公開了一類核苷酸磷脂化合物及其製備方法，具有通式(VIII)或(IX)的結構，基於「一釜法」策略大量簡便製取得到。本發明進一步提供一類新型脂質體以及其製備方法，本發明涉及的磷脂脂質體，具有製備簡單、效用良好、應用範圍廣泛等特點。該種脂質體可以作為研究反義寡核苷酸與小幹擾RNA(siRNA)機理的分子生物學工具，也具有潛在的藥物開發前景。
文檔編號A61K47/26GK101709073SQ20091023873
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月1日 優先權日2009年12月1日
發明者唐晨, 張禮和, 楊振軍, 潘德林 申請人:北京大學