H5n1譜系的通用疫苗的製作方法

2023-11-08 01:25:07 1

專利名稱：H5n1譜系的通用疫苗的製作方法
H5N1譜系的通用疫苗相關申請的交叉參考本申請涉及並要求2010年4月30日申請的美國臨時申請系列號61/329，802的優先權，其援引加入本文。序列提交本申請與電子形式序列表一起提交。序列表名稱為2577_201PCT_ST25. txt，創建於2011年I月13日，大小為54kb。電子形式序列表的信息是本申請一部分並且以其全文援引加入本文。發明背景
本發明涉及通用H5N1疫苗。本發明更特別涉及三種H5N1毒株的鑑別，其覆蓋大多數H5N1譜系中血凝素的中和表位中的全部變體。本發明進一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三種H5N1毒株或者包含這三種毒株每一毒株的血凝素肽。本文中用於例證本發明背景或者提供關於實施的其它詳細描述的出版物及其它材料均援引加入本文，為方便起見在「參考文獻」中分別列出。流感病毒通過隨機改變抗原決定簇如存在於血凝素球形頭部區域中的主要中和表位而逃避免疫系統。在感染時,宿主應答的主要特徵在於誘導針對這種中和表位的抗體，其阻斷病毒血凝素對於靶細胞受體的附著。然而，這些HA的中和表位內相當多的胺基酸變化導致抗原性獨特的流感H5N1病毒的出現。事實上，已報導季節性流感病毒在人群中通過抗原性漂移能有效逃避疫苗誘導的免疫性。此外，HAl可變區中幾個關鍵胺基酸的突變足以使得病毒逃避疫苗誘導的抗體應答。先前鑑別逃避單克隆抗體的中和作用的變體的HA序列內的胺基酸取代的嘗試揭示了 HA的中和表位位點(Kaverin et al. , 2002 ；Kaverin etal. , 2007)。流感病毒隨機突變及進化為具有多樣抗原性決定簇的新類型的性質在流感感染控制中是重要的挑戰(Plotkin et al. , 2002) 0通過近年來H5N1禽流感的爆發及目前HlNl豬源性甲型流感病毒(S-OIV)的大流行局面已經清楚地認識到這點。事實上，在文獻中已經充分記錄了 H5N1已經獲得感染人體組織的能力，這主要由於突變事件發生所致(Ayora-Talavera et al.，2009)。高致病性禽流感(HPAI)H5N1由於血凝素(HA)序列中的差異而是抗原性可區別的，由此產生H5N1的不同譜系或進化枝，HA是流感免疫性的主要決定簇(Lam et al.，2008 ；WH0, 2005)。使用目前的H5N1疫苗控制感染看起來對於異源毒株或H5N1的系統發生變體進化枝不是有效的，這部分是由於HA序列、特別是中和表位區域中的變化所致。由於現有疫苗僅基於誘導針對這些表位的中和抗體，因此這些序列中的差異可導致目前的疫苗不能勝任預防全球性流感。事實上，目前的H5N1疫苗候選物持續提供對於相應進化枝內大多數分離株的良好的抗原性覆蓋，近年來認識到進化枝1、2. 2及2. 3自身內一些病毒示出抗原性異質性的跡象。為克服這種限制及完全了解世界範圍的疫苗潛力，近年來提出了基於保守病毒蛋白質的通用疫苗的觀念。已經對流感病毒的高度保守的離子通道蛋白(M2)或者核蛋白(NP)誘導交叉保護性細胞免疫性和病毒清除進行了評估(Wu et al. , 2007 ；Chen andSubbarao, 2009)。一種類似的使用血凝素的保守的融合肽的方法是抑制病毒與宿主細胞膜融合的另一選項(Gerhard et al.，2006)。針對這些保守蛋白產生的抗體可以降低病毒傳播及促進從流感中康復。然而，特異於這些蛋白質的抗體的免疫原性不佳且發現是感染容許的(infection permissive)。因此,基於流感病毒血凝素的疫苗的開發看起來是預防HPAI如H5N1感染的唯一可行選項。然而，H5亞型中主要抗原性中和表位區域內的胺基酸改變限制了針對不同H5N1譜系的這種通用疫苗的開發。因此，需要開發一種通用疫苗，其提供對於不同H5N1譜系的一定程度的保護性免疫性。發明概述本發明涉及通用H5N1疫苗。本發明更特別涉及三種H5N1毒株的鑑別，其覆蓋大多數H5N1譜系中血凝素中和表位中的全部變體。本發明進一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三種H5N1毒株或者包含這三種中每一毒株的血凝素肽。
因此，第一方面，本發明提供了預防對象疾病的通用H5N1疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒的H5N1亞型相關。在一個實施方案中，所述通用H5N1疫苗包含預防有效量的第一免疫原性物質，預防有效量的第二免疫原性物質以及預防有效量的第三免疫原性物質。在另一實施方案中，每種免疫原性物質均包含血凝素或其抗原性部分或者編碼所述血凝素或其抗原性部分的核酸。在另一實施方案中，所述抗原性部分包括血凝素的表位。在進一步的實施方案中，所述對象可以是人、家畜(狗、貓、猴等)、牲畜(馬、牛、綿羊、山羊、豬等)、野禽(野鵝、野鴨等)以及家禽(雞、鴨、鵝等)。在一個實施方案中，免疫原性物質是包含血凝素的病毒。在另一實施方案中，所述病毒是失活的。在另一實施方案中，所述病毒是減毒的病毒。在另一實施方案中，所述病毒是病毒體形式。在進一步的實施方案中，所述病毒衍生自卵或者衍生自細胞培養物。在另一實施方案中，所述免疫原性物質是包含血凝素的裂解病毒或者裂解病毒抗原性製備物。在一個實施方案中，所述免疫原性物質是血凝素或其抗原性部分。在另一實施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已經被分離。在另一實施方案中，所述血凝素或其抗原性部分是通過表達系統產生的。在一個實施方案中，所述表達系統是任何表達系統，如病毒表達載體，其中血凝素或其抗原性部分呈遞或展示在所述病毒表面。在一個實施方案中，所述病毒表達載體是任何病毒表達載體，如修飾的痘苗病毒表達載體，腺病毒表達載體，痘病毒表達載體，杆狀病毒表達載體等。在一個實施方案中，所述表達載體是杆狀病毒表達載體，呈遞或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是杆狀病毒。在另一實施方案中，所述免疫原性物質是編碼血凝素或其抗原性部分的核酸，其能在對象中表達。第二方面，本發明提供了一種對禽流感病毒產生保護性免疫性的方法，所述方法包括給對象施用預防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第三方面，本發明提供了一種預防或治療與禽流感病毒相關疾病的方法，所述方法包括給對象施用預防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第四方面，本發明提供了通用H5N1疫苗在刺激對於禽流感病毒的免疫應答中的應用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第五方面，本發明提供了通用H5N1疫苗在預防與禽流感病毒相關疾病中的應用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。
第六方面，本發明提供了通用H5N1疫苗，其用於醫藥中。第七方面，本發明提供了通用H5N1疫苗，其用於調節對象體內的免疫應答。第八方面，本發明提供了通用H5N1疫苗，其用於治療或預防對象中與禽流感病毒相關的疾病。第九方面，本發明提供了通用H5N1疫苗在生產調節對象體內免疫應答的藥物中的應用。第十方面，本發明提供了通用H5N1疫苗在生產治療或預防對象中與禽流感病毒相關的疾病的藥物中的應用。附圖
簡述圖I示出血清血細胞凝集抑制效價。將小鼠組在第O天和第28天用 BacHA (BacHA-VN)的 Tri-BacHA (BacHA-mix)或 Mono-BacHA (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫兩次。每個點表示算術平均值(η = 10) 土SD。圖2Α和2Β示出小鼠中交叉進化枝血清微量中和實驗。將小鼠組在第O天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三種毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的單一毒株(Α/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫兩次。在這項研究中使用來自進化枝 I. O (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))、進化枝 2. I (A/Indonesia/CDC1031/2007 (H5N1))、進化枝 2. 2 A/turkey/Turkeyl/05* (H5N1)、進化枝 4. O (clade 4. OA/goose/Guiyang/337/06 (H5N1))、進化枝 7. O (A/chicken/Shanxi/2/06 (H5N1))及進化枝
8.O (A/chicken/Henan/12/04 (H5N1))的病毒。進化枝I、2. I和2. 2在圖2A中示出，進化枝
4、7和8在圖2B中示出。來自峰值應答當天的血清及在最終免疫後14天的血清用於該測定。每個點表示算術平均值(η = 10) 土SE。圖3示出小鼠免於致死性Η5Ν1病毒攻擊的保護作用。將小鼠組在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三種毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的單一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫兩次。在最終免疫接種後三周，將小鼠用5MLD50(50%小鼠致死劑量)的進化枝1.0(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))HPAI H5N1毒株經鼻內感染。在14天觀測期間監測小鼠存活情況。結果以存活率百分比表示。圖4示出小鼠免於致死性H5N1病毒攻擊的保護作用。將小鼠組在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三種毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的單一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫兩次。在最終免疫接種後三周，將小鼠用5MLD50 (50%小鼠致死劑量)的進化枝2. I (A/Indonesia/TLL013/2006 (H5N1))HPAIH5N1毒株經鼻內感染。在14天觀測期間監測小鼠存活情況。結果以存活率百分比表示。圖5示出小鼠免於致死性H5N1病毒攻擊的保護作用。將小鼠組在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三種毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的單一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫兩次。在最終免疫接種後三周，將小鼠用5MLD50(50%小鼠致死劑量)的進化枝7. O (A/chicken/Shanxi/2/06 (H5N1))HPAIH5N1毒株經鼻內感染。在14天觀測期間監測小鼠體重減輕情況。結果以體重百分比表示(在實驗開始時)。
圖6示出小鼠免於致死性H5N1病毒攻擊的保護作用。將小鼠組在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三種毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的單一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的完全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫兩次。在最終免疫接種後三周，將小鼠用5MLD50 (50%小鼠致死劑量)的進化枝7. O (A/chicken/Shanxi/2/06 (H5N1))HPAIH5N1毒株經鼻內感染。在14天觀測期間監測小鼠存活情況。結果以存活率百分比表示。發明詳述本發明涉及通用H5N1疫苗。本發明更特別涉及三種H5N1毒株的鑑別，其覆蓋大多數H5N1譜系中血凝素中和表位的全部變體。本發明進一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三種H5N1毒株或者其包含這三株中每一株的血凝素肽。除非特別定義，本文使用的所有技術和學術術語均具有與本發明所屬領域技術人員通常了解的相同含義。除非特別指出，本文中提及的所有專利、專利申請、公布的申請及出版物、Genbank序列、網站及及其它公開的材料均以其全部內容援引加入本文作參考。 雖然目前H5N1疫苗候選物繼續提供對於相應進化枝內大多數分離株的良好的抗原性覆蓋，但是近年來已經認識到進化枝1、2. 2及2. 3自身內的一些病毒示出抗原性異質性的跡象。由於H5N1病毒已經分為許多亞系或進化枝，因此本發明提供了代表H5亞型特別是在中和表位區域中的變化的疫苗毒株的分析和選擇。根據本發明的這種疫苗毒株選擇提供了對於大多數H5N1譜系的廣泛保護作用。如本文所示，如果可以鑑別一些HPAI H5N1進化枝中中和表位的變化或保守性，則完全基於流感病毒HA的通用疫苗的開發是可行的。了解這種中和表位的分布模式有助於通過在疫苗組合物中摻入兩或更多個理想的H5N1毒株而設計通用疫苗。選擇的病毒毒株的中和表位覆蓋大多數H5亞型中的變化，以獲得針對大多數H5N1亞型的廣泛的保護性免疫性。先前鑑別逃避單克隆抗體中和作用的變體的HA序列內的胺基酸取代的嘗試揭示了HA的中和表位位點(Kaverin et al. , 2002 ；Kaverin et al.，2007)。結合先前的發現，本發明提供了通過使用中和性單克隆抗體對其胺基酸序列作圖鑑別H5N1的其它主要中和表位。對H5亞型中所有鑑別的中和表位的分布進行的分析表明來自人和禽來源的H5N1亞型的抗原性決定簇中的變化。基於這些結果，本發明提供了三種疫苗毒株，其包含HA的主要中和表位以覆蓋H5N1譜系內全部變體。為了檢測證實在體內的廣泛保護作用，將選擇的疫苗毒株的HA蛋白在杆狀病毒表面上表達並在用系統發生變體H5N1毒株攻擊的小鼠模型中評估疫苗配製物的效力。根據本發明，所述通用疫苗開發策略包括三個步驟(i)使用中和性單克隆抗體(n-mAb)對H5N1病毒血凝素的中和表位作圖；(ii)分析所有H5N1譜系中中和表位的分布；及(iii)選擇理想的疫苗毒株以覆蓋全部H5N1病毒的中和表位內的變化。根據本發明，使用一組5個n-mAb(6B8、4C2、2D9、4F8和3H11)作圖H5N1病毒的中和表位。使用n-mAb對中和表位作圖表明在第138或155或189或223位置的胺基酸參與H5N1病毒血凝素的主要中和表位的形成。此外，作為主要中和表位的一部分而被鑑別的其它胺基酸(140,159,194和218) (Kaverin et al. , 2007)也被考慮用於隨後的分析。如本文所示，將H5N1病毒的主要中和表位序列與流感病毒研究資料庫對比揭示了所有人和禽H5N1病毒血凝素的表位區域內的變化。見下表2。
基於本文描述的表位分布分析，選擇三種不同毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)(進化枝 2. I)、A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(進化枝 I. O)和Anhui/1/2005 (H5N1)(進化枝2. 3)共同代表所有H5N1亞型中的變化。通過病毒中和作用和HI效價證實選擇的疫苗毒株與不同中和性mAb的反應性模式。如下表4A和4B所不,n-mAb4C2 和 4F8 僅識別 A/Indonesia/CDC669/2006 (H5N1)毒株，與 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)和A/Anhui/1/2005 (H5N1)毒株不反應。這種反應性模式可能是由於在第189位置的胺基酸改變所致，因為A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株在第189位具有「Arg」，而在A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和 A/Anhui/1/2005 (H5N1)毒株的相同位置是「Lys」。另一方面，η-mAb 6B8 與 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)和 A/Anhui/1/2005 (H5N1)毒株均反應，可能是由於在第189位存在共同殘基「Lys」所致。相似地，也已經發現在第155位的胺基酸對於H5N1毒株的抗體識別具有顯著影響。此外，如下表2所示，150的環有兩個變體，63. 4%的人H5N1分離株具有胺基酸「Ser」，而剩餘34. 4%在這個位置具有胺基酸「Asn」。同樣，位於HA的受體結合位點內的第189位的胺基酸，在64. 26%的所有人H5N1毒株中含有胺基酸「Arg」，剩餘的34. 65%在此位置具有胺基酸「Lys」。因此，合理推測根據本發明選擇的疫苗 毒株應代表幾乎99%的所有H5N1譜系包括人和禽病毒的主要抗原性表位內的變化。將選擇的毒株的HA蛋白分別在杆狀病毒表面上表達，並在小鼠模型中評估疫苗配製物。構建具有WSSV的立即早期啟動子I (iel)的重組杆狀病毒以促進流感病毒H5血凝素在昆蟲和哺乳動物細胞中的高水平表達。iel作為立即早期啟動子的性質支持在杆狀病毒生命周期的早期階段的蛋白質表達，導致杆狀病毒包膜上的功能性血凝素展示增強。由於寡聚化是HA蛋白質有效轉運至宿主細胞膜所必需的(Copeland et al. , 1986),這是杆狀病毒獲得該蛋白質的先決條件，因此推定在杆狀病毒表面上展示的HA應以其寡聚形式呈遞。因此，這個模型將幫助模擬蛋白質的天然結構，因此模擬野生型流感病毒。通過血凝活性及HAO真正裂解為HAl和HA2證實，在杆狀病毒表面上展示的HA保持其天然結構(數據未示出)。雖然表達流感病毒血凝素(HA)的杆狀病毒在昆蟲細胞中通常不裂解，但是在裂解位點具有多個鹼性胺基酸的高致病性禽流感病毒(如H5和H7)的HA已經示出在不存在胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶條件下被裂解為HAl和HA2亞基(KuiOda etal.，1986)。目前的研究中HAO的部分裂解可能是由於昆蟲細胞中枯草桿菌蛋白酶樣前蛋白(piOprotein)轉變酶(PC)的存在所致(Ci印Iik et al.，1998)，其底物特異性和抑制劑譜與哺乳動物PC相同。如本文所示，用展示A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)、A/VietNam/1203/2004 (H5N1)或 A/Anhui/1/2005 (H5N1)的 HA 的每種杆狀病毒的佐劑化(adjuvanted)混合物(Tri-BacHA)進行皮下免疫接種，當與其未佐劑化對應物相比時顯著增強血清HI效價。此外，用佐劑化Tri-BacHA接種的小鼠的HI效價與用佐劑化完全RG-H5N1病毒或展示H5Nl-A/VietNam/1203/2004(H5Nl)的HA的佐劑化杆狀病毒(Mono-BacHA)接種的那些小鼠(針對A/Vietnam/1203/2004(H5N1))的相當。此外，佐劑化Tri-BacHA誘導較高的中和抗體效價，與未佐劑化Tri-BacHA相比，其有效地中和來自各個進化枝(進化枝I. O,進化枝2. 1，進化枝2. 2，進化枝4. 0，進化枝7. O及進化枝8. O)的100 TCID50的異源H5N1毒株。僅含有佐劑化Mono-BacHA或失活的RG-H5N1疫苗的疫苗配製物能中和進化枝I (同源)、進化枝2. I和進化枝8. 0，但是不有效中和來自其它進化枝(進化枝2. 2、進化枝4. O和進化枝7. O)的H5N1病毒。佐劑化Tri-BacHA疫苗配製物的強交叉-進化枝免疫性可能是由於覆蓋H5N1譜系的中和表位內的變化所致。疫苗的保護性效力通過用來自進化枝I、進化枝2. I和進化枝7的H5N1毒株攻擊接種的小鼠進行評估。如本文所示，在用針對進化枝I. O和進化枝2. I的佐劑化Tri-BacHA或Mono-BacHA或者失活的全病毒疫苗接種的組中獲得100%存活率。此外，佐劑化Tri-BacHA提供針對進化枝7. O H5N1病毒100%的保護作用，無任何感染症狀。然而，佐劑化失活的全病毒疫苗和Mono-BacHA針對進化枝7. O H5N1感染僅分別提供66. 6%和83. 3%的保護作用。同樣，在不同組中感染的進展通過體重降低的不同傾向表示。用佐劑化Mono-BacHA或者佐劑化全病 毒疫苗接種的小鼠針對進化枝7. O示出在第6天直至17%的較高的體重降低。這表明一價疫苗不能賦予針對不同H5N1亞型的保護作用，這也許是由於不同病毒亞型的抗原性決定簇(如中和表位)內的變化所致。總的來說，用展示來自三種選擇的疫苗毒株的血凝素的杆狀病毒對小鼠進行皮下免疫誘導了系統性免疫應答，並呈現出針對無任何臨床症狀的H5N1病毒感染的交叉保護作用。同樣，揭示了基於亞型中中和表位內的變化選擇疫苗毒株的發現將有助於預防由新出現的H5N1突變體介導的感染。用於這項研究的疫苗配製物不用顧慮任何生物安全性而快速生產。展示HA的杆狀病毒在大流行和大流行前情形是作為疫苗的理想選擇，並加速完成疫苗技術而不需要高生物防護設備或冗長的蛋白質純化過程。如本文所用，術語「治療」是指以任何方式治癒病症或症狀、預防病症或疾病建立或者以其他方式預防、阻礙、延遲、改善或逆轉病症或疾病或其它不希望的症狀進展的任何及所有應用。如本文所用，術語「有效量」或者「預防有效量」是指一種物質或化合物提供所希望的作用所需的無毒性但足夠的量。例如，調節免疫應答的預防有效量是所述物質或化合物在對象體內提供希望的調節免疫應答作用的量。相似地，治療或預防與禽流感病毒相關疾病的預防有效量是所述物質或化合物在所述對象體內提供希望的治療或預防所述疾病作用的量。所需的精確量根據對象如治療物種、對象年齡和健康狀況、治療病症的嚴重性、施用的特定藥物以及施用模式等因素而不同。因此，不可能指定精確的「有效量」。然而，對於任何指定情況，合適的「有效量」可以由本領域技術人員僅使用常規實驗確定。如本文所用，術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」可互換使用，是指胺基酸殘基的聚合物及其片段、變體、類似物、直系同源物或者同系物。因此，這些術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基是合成的非天然發生的胺基酸，如相應天然發生的胺基酸的化學類似物，以及適用於天然發生的胺基酸聚合物。如本文所用，術語「多核苷酸」或「核酸」可互換使用，是指包含一或多個核苷酸的分子，或者寡核苷酸，或者其片段，包括但不限於RNA或DNA核苷酸或者其組合。如本文所用，短語「與H5N1亞型禽流感病毒相關疾病」是指由H5N1亞型禽流感病毒導致的或者與其相關的任何疾病、疾病狀態或失調。如本文所用，術語「調節」當用於與免疫應答相關時是指直接或間接增加或降低針對抗原的免疫應答。疫苗典型增加對於抗原的免疫應答。因此，第一方面，本發明提供了治療或預防對象疾病的通用H5N1疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒H5N1亞型相關。在一個實施方案中，所述通用H5N1疫苗包含預防有效量的第一免疫原性物質，預防有效量的第二免疫原性物質及預防有效量的第三免疫原性物質。在另一實施方案中，所述對象可以是人、家畜(狗、貓、猴等)、牲畜(馬、牛、綿羊、山羊、豬等)、野禽(野鵝、野鴨等)以及家禽(雞、鴨、鵝等)。在一個實施方案中，每種免疫原性物質均包含血凝素或其抗原性部分或編碼血凝素或其抗原性部分的核酸。如本文所用，血凝素的抗原性部分是指包括中和表位的血凝素的一部分。在另一實施方案中，所述抗原性部分包括血凝素的表位。在進一步的實施方案中，免疫原性物質是包含血凝素的病毒。在另一實施方案中，所述病毒是失活的。在另一實施方案中，所述病毒是減毒的病毒。在另一實施方案中，所述病毒是病毒體形式。在進一步的實施方案中，所述病毒衍生自卵或衍生自細胞培養物。在另一實施方案中，免疫原性物質是包含血凝素的裂解病毒或裂解病毒抗原性製備物。在一個實施方案中，所述免疫原性物質是血凝素或其抗原性部分。在另一實施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已經被分離。在另一實施方案中，所述·血凝素或其抗原性部分是通過病毒表達載體產生的，由此其被呈遞或展不在該病毒表面上。在一個實施方案中，所述病毒表達載體是杆狀病毒表達載體，呈遞或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是杆狀病毒。在另一實施方案中，所述病毒表達載體如修飾的痘苗病毒表達載體、腺病毒表達載體、痘病毒表達載體等。在一個實施方案中，所述免疫原性物質是能在對象體內表達的編碼血凝素或其抗原性部分的核酸。在一個實施方案中，所述免疫原性物質可以是相同類別，例如其可以均是失活的呈遞或展示血凝素或其抗原性部分的病毒或杆狀病毒。在另一實施方案中，所述免疫原性物質可以是不同類別，例如第一免疫原性物質可以是失活的病毒，第二免疫原性物質可以是呈遞或展示血凝素或其抗原性部分的杆狀病毒，第三免疫原性物質可以與這兩類之一相同或者是不同類別。根據本發明，製備通用H5N1疫苗，其中第一免疫原性物質包含病毒毒株A/Indonesia/⑶C669/2006 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽，第二免疫原性物質包含病毒毒株A/Vietnaml203/2004 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽及第三免疫原性物質包含病毒毒株A/Anhui/1/2005 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽。如本文所述，每種免疫原性物質可以是病毒、蛋白質、肽、核酸等，其包含或編碼指定病毒的血凝素或其抗原性肽。所述免疫原性物質可以配製成中性或鹽形式組合物。藥物可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基基團形成)，其是與無機酸如鹽酸或磷酸或者有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等形成的。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機鹼，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，及衍生自有機鹼，如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。通常，可以根據本領域技術人員已知的方法製備合適的組合物，所述組合物可包括藥物可接受的稀釋劑、佐劑和/或賦形劑。所述稀釋劑、佐劑和賦形劑必須是「可接受的」，與組合物的其它成分是相容的，且對其受體無害。藥物可接受的稀釋劑的實例是去礦物質水或蒸餾水；鹽水溶液；植物油如花生油(peanut-oil),紅花油,橄欖油,棉籽油，玉米油，芝麻油如花生油，紅花油，橄欖油，棉籽油，玉米油，芝麻油，花生油(arachis oil)或椰子油；矽酮油，包括聚矽氧烷，如甲基聚矽氧燒，苯基聚娃氧燒及methylphenyl polysolpoxane ;揮發性娃酮；礦物油如液體石臘，軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物如甲基纖維素，乙基纖維素，羧甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級烷醇，如乙醇或異丙醇；低級芳烷醇；低級聚亞烷基二醇或低級亞烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，I, 3- 丁二醇或甘油；脂肪酸酯如異丙基棕櫚酸酯，異丙基肉豆蘧酸酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜聚糖；西黃芪膠或阿拉伯樹膠，以及凡士林油。典型地，所述一或多種載體形成所述組合物重量的1%-99. 9%。最優選地，所述稀釋劑是鹽水。對於作為注射溶液或懸浮液施用，無毒性胃腸外可接受的稀釋劑或載體可包括Ringer溶液，中鏈甘油三酯(MCT)，等滲鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水，乙醇及1，2-丙二醇。口服應用的合適載體、稀釋劑、賦形劑及佐劑的一些實例包括花生油，液體石蠟，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，海藻酸鈉，阿拉伯樹膠，西黃芪膠，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，明膠和卵磷脂。除了這些之外，口服配製物可含有合適的調味劑和著色劑。當以膠囊形式使用時，所述膠囊可以用化合物如延遲崩解的單硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯包覆。佐劑典型包括潤滑劑，乳化劑，增稠劑，防腐劑，殺菌劑和緩衝劑。可用於製備所述組合物的佐劑或免疫刺激性成分包括但不限於鋁鹽，礦物油，分支桿菌產物(如弗氏完全 或不完全佐劑)或者載體如植物糖苷皂苷、膽固醇和磷脂醯膽鹼的混合物，其提供在籠樣(cage-like)結構上呈遞一些蛋白質拷貝的載體。對於本說明書而言，佐劑是強調、增加、適度或增強對於免疫原或抗原的免疫應答的物質。佐劑典型同時增強體液和細胞免疫應答，但是增強一種免疫應答而不增強另一種也定義為佐劑。此外，佐劑及其應用為免疫學者熟知並且當免疫原的劑量受限時、當免疫原的免疫原性不佳時或者當施用途徑是次最佳時典型用於增強免疫應答。因此，術語「佐劑量(adjvating amount)」是能增強對於指定免疫原或抗原的免疫應答的佐劑的量。等於「佐劑量」的物質是變化的，依賴於多種因素，包括但不限於免疫原的特性、施用的免疫原的數量、宿主物種、施用途徑以及施用免疫原的方案。「佐劑量」可易於根據指定特定環境通過常規實驗量化。這為技術人員熟知，典型使用常規劑量應答確定以改變施用的免疫原和佐劑的量。應答可以使用酶聯免疫吸附測定、放射免疫測定、血凝測定等通過確定針對免疫原產生的血清抗體效價或者細胞介導的應答而測量。口服施用的固體形式可含有在人和獸藥物學實踐中可接受的結合劑，甜味劑，崩解劑，稀釋劑，調味劑，包覆劑，防腐劑，潤滑劑和/緩釋劑。合適的結合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米澱粉、西黃芪膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合適的崩解劑包括玉米澱粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾豆膠、黃原膠、皂土、褐藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、矽酸鈣或磷酸二鈣。合適的調味劑包括薄荷油、冬綠油、櫻桃、橘子或覆盆子調味劑。合適的包覆劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、蟲膠或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉，維生素Εδα-生育酚，抗壞血酸，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯或者亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂，硬脂酸，油酸鈉，氯化鈉或滑石。口服施用的液體形式除了上述物質之外，可含有液體載體。合適的液體載體包括水，油如橄欖油、花生油(peanut oil)、芝麻油、葵花籽油、紅花油、花生油(arachis oil),椰子油，液體石蠟，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，異丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或其混合物。口服施用的懸浮液可進一步包含分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸鈉或乙醯基醇(acetylalcohol) 0合適的分散劑包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇單-或二 -油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖單-或二 -油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。口服施用的乳狀液可進一步包含一或多種乳化劑。合適的乳化劑包括如上述舉例的分散劑或者天然膠如瓜爾豆膠，阿拉伯樹膠或西黃芪膠。製備胃腸外施用組合物的方法為本領域技術人員熟知，在例如Remington: TheScience and Practice of Pharmacy,21st Ed. , Ed. D. B. Troy, Lippincott, Williams &Wilkins, Baltimore, 2006中更詳細描述,所述文獻援引加入本文。所述組合物可摻入任何合適的表面活性劑，如陰離子、陽離子或非離子表面活性齊U，如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包含懸浮劑，如天然膠，纖維素衍生物或無機材料如silicaceous silicas,及其它成分如羊毛脂。所述組合物的製備使用本領域技術人員已知的常規方法進行。典型地，這種組合物製備為注射形式，作為液體溶液或懸浮液；也可以製備為適於在注射前在液體中成為溶 液或懸浮液的固體形式。所述製備物也可以是乳化的。活性免疫原性成分通常與賦形劑混合，所述賦形劑是藥物可接受的及與所述活性成分是相容的。第二方面，本發明提供了調節對於禽流感病毒的免疫應答的方法，所述方法包括給對象施用預防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。儘管優選所述通用H5N1疫苗作為單一組合物施用，但是也考慮到疫苗的各個成分可以單獨但同時施用給對象。根據本發明的方法，疫苗和組合物可以通過任何合適途徑施用，全身性、區域性(regionally)或局部(locally)施用。在任何指定情況中使用的特定施用途徑依賴於多種因素，包括治療疾病的性質、疾病的嚴重性和程度、要輸送的特定化合物的需要劑量以及希望的疫苗或組合物的潛在副作用。例如，在需要將適當濃度的希望的疫苗或組合物直接輸送至治療部位的情況中，施用可以是區域性而不是全身性的。區域性施用模式提供了將希望的疫苗或組合物以極高的局部濃度輸送至需要的部位的能力，因此適於達到希望的治療或預防作用，同時避免了機體的其它器官暴露於該疫苗或組合物，從而潛在地降低副作用。例如，根據本發明的實施方案，施用可以通過任何標準途徑完成，包括腔內、膀胱內、肌肉內、動脈內、靜脈內、皮下、表面或口服。腔內施用可以是腹膜內或胸膜內。如果需要，適於持續釋放或間歇釋放的含有免疫原性物質的裝置或組合物可以植入在體內或表面應用以相對緩慢地將這種材料釋放至體內。表達載體或宿主細胞的施用可包括通過直接口服、系統注射輸送，或者輸送至選擇的組織或細胞，或者通過輸送至分離自對象或相容供體的細胞而間接輸送。關於基於核酸的組合物，這種組合物的所有輸送模式均涵蓋在本發明內。所述組合物可以脂質體形式施用。脂質體通常衍生自磷脂或其它脂質物質，是通過在水相介質中分散的單層或多層水合的液體結晶形成的。可以使用能形成脂質體的任何無毒性的生理學可接受的及可代謝的脂質。脂質體形式的組合物可含有穩定劑、防腐劑、賦形劑等。優選脂質是磷脂和磷脂醯膽鹼(卵磷脂)，天然及合成的均可。形成脂質體的方法為本領域熟知。
施用的化合物對於任何特定對象的有效劑量水平依賴於多種因素，包括治療的疾病的類型及疾病的階段，應用的化合物的活性，應用的組合物，所述對象的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食，施用時間，施用途徑，化合物螯合速度，治療持續時間，治療中組合或同時使用的藥物，及本領域熟知的其它相關因素。第三方面，本發明提供了預防或治療與禽流感病毒相關疾病的方法，所述方法包括給對象施用預防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。合適的組合物、施用及劑量如上文所述。第四方面，本發明提供了通用H5N1疫苗調節對禽流感病毒的免疫應答的應用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第五方面，本發明提供了通用H5N1疫苗在治療與禽流感病毒相關疾病中的應用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。製備及施用疫苗的方法為本領域熟知，如美國專利7，510，719、7，537，768、7，666，439 及 7，691，368 ;美國專利申請公開 2008/0187557、2009/0136532、2009/0263422、2009/0304730、2010/0047271、2010/0074916 和 2010/0086485 ;及國際申請公開 WO2007/129984、WO 2008/048984、WO 2008/115314、WO 2009/069447、WO 2009/115917、WO2010/021289及WO 2010/036948例證，所述文獻均援引加入本文。除非特別指出，實施本發明使用常規的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉基因生物學技術，這些為本領域技術人員已知。見例如 Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook et al.，1989，MolecularCloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork) ；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor, New York) ；Ausubel et al.，1992)，CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodicupdates) ；Glover,1985, DNA Cloning(IRL Press, Oxford) ;Russell，1984，Molecularbiology of plants:a laboratory course manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor, N. Y. ) ;Anand，Techniques for the Analysis ofComplex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ；Guthrie and Fink，Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press,New York, 1991)；Harlow and Lane， 1988，Antibodies， (Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, New York) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.J. Higginseds. 1984) ；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R.Lissj Inc. , 1987) ；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B.Perbalj A Practical Guide To MolecularCloning (1984) ；the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc. , N.Y. ) ；Methods In EnzymologyjVols. 154 and 155(Wu et al.eds. ), ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds. , AcademicPress, London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds. , 1986) ;Riott，Essential Immunology, 6th Edition, BlackwellScientific Publications,Oxford, 1988 ；Fire et al. , RNA InterferenceTechnology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge UniversityPress, Cambridge, 2005 ；SchepersjNRA Interference in Practice, Wiley - VCHj2005 ；Engelkej RNA Interference(RNAi):The Nuts &Bolts of siRNA Technology, DNAPress,2003 ;Gott，RNA Interference,Editing,and Modification : Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowaj NJj 2004 ；Sohail, GeneSilencing by RNA Interference:Technology and Application，CRC，2004 所述。
實施例本發明通過如下實施例進行描述，所述實施例只是例證本發明而不意圖以任何方式限制本發明。利用本領域熟知的標準技術或在下文特別描述的技術。實施例I
材料和方法病毒來自進化枝2. 1A/Indonesia/CDC669/2006、A/Indonesia/TLL013/2006 及一個禽毒株A/Indonesia/TLL014/2006的H5N1人流感病毒得自印度尼西亞衛生部(MOH)。禽H5N2亞型得自新加坡農業食品與獸醫管理局(AVA)。來自不同的系統發生進化枝/亞進化枝的H5N1病毒(表I)通過反求遺傳學拯救[WH0，2004]。簡言之，基於來自NCBI流感病毒資料庫的序列合成來自進化枝1、2. 1、2. 2,2. 3、4、7和8的H5N1病毒的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)基因(GenScript，USA)。將合成的HA和NA基因克隆進雙啟動子質粒中以進行甲型流感病毒反求遺傳學(Prabakaran et al.，2009)。所述雙啟動子質粒得自美國喬治亞州亞特蘭大的疾病控制與預防中心。再造病毒(reassortant virus)通過將含有HA和NA以及衍生自高度生長的主要毒株(master strain) A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的其餘六個流感病毒基因的質粒使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.)轉染進共培養的293T和MDCK細胞中進行拯救。在轉染72小時後，將培養基接種於含胚卵或者MDCK細胞。對來自第二次傳代的再造病毒的HA和NA基因進行測序，以證實導入的HA和NA基因的存在及不存在突變。將原種病毒在11天齡的含胚卵的尿囊腔中增殖，收穫含有病毒的尿囊液並在_80°C等份貯存。病毒含量通過標準血凝測定(HA)確定。使用高致病性病毒的所有試驗均在符合CDC/NIH和WHO建議的生物安全水平3級(BSL-3)的防範設施中進行。表I :產生自反求遺傳學的再造甲型流感病毒
權利要求
1.一種通用H5N1疫苗組合物，其包含預防有效量的第一免疫原性物質或者編碼所述第一免疫原性物質的核酸、預防有效量的第二免疫原性物質或者編碼所述第二免疫原性物質的核酸、預防有效量的第三免疫原性物質或者編碼所述第三免疫原性物質的核酸以及藥物學可接受的載體，其中所述第一免疫原性物質包含病毒毒株A/Indonesia/CDC669/2006 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽，所述第二免疫原性物質包含病毒毒株A/Vietnaml203/2004 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽，及所述第三免疫原性物質包含病毒毒株A/Anhui/1/2005 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽或者編碼所述第三免疫原性物質的核酸。
2.權利要求I的組合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物質的每一個均包含血凝素。
3.權利要求I的組合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物質的每一個均包含血凝素的抗原性肽。
4.權利要求I的組合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物質的每一個均包含編碼血凝素的核酸。
5.權利要求I的組合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物質的每一個均包含編碼血凝素的抗原性肽的核酸。
6.權利要求I的組合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物質的每一個均包含呈遞或展示血凝素的病毒。
7.權利要求6的組合物，其中每種病毒均是杆狀病毒。
8.權利要求I的組合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物質的每一個均包含呈遞或展示血凝素的抗原性肽的病毒。
9.權利要求8的組合物，其中每種病毒均是杆狀病毒。
10.一種調節對象中對禽流感病毒的免疫應答的方法，包括給對象施用預防有效量的權利要求I-9任一項的組合物。
11.一種治療或預防與禽流感病毒相關疾病的方法，包括給對象施用權利要求1-9任一項的組合物。
12.權利要求1-9任一項的組合物在對象中調節免疫應答的應用。
13.權利要求1-9任一項的組合物在治療或預防對象中與禽流感病毒相關疾病的應用。
14.權利要求1-9任一項的組合物，用作藥物。
15.權利要求1-9任一項的組合物，用於調節對象中的免疫應答。
16.權利要求1-9任一項的組合物，用於治療或預防對象中與禽流感病毒相關的疾病。
17.權利要求1-9任一項的組合物在製備用於調節對象中免疫應答的藥物中的應用。
18.權利要求1-9任一項的組合物在製備用於治療或預防對象中與禽流感病毒相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及通用H5N1疫苗。本發明更特別涉及三種H5N1毒株的鑑別，它們覆蓋大多數H5N1譜系中血凝素的中和表位中的全部變體。本發明進一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三種H5N1毒株或者這三種毒株每一毒株的血凝素肽。
文檔編號A61K39/145GK102869379SQ201180021766
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月9日 優先權日2010年4月30日
發明者P·木根, F·和, H-S·J·光 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司