IgA腎病的預測方法和IgA腎病患者的選擇方法
2023-11-07 14:24:07
專利名稱：IgA腎病的預測方法和IgA腎病患者的選擇方法
技術領域：
本發明涉及IgA腎病的預測方法和IgA腎病患者的選擇方法，具體而言，涉及在確診IgA腎病前能夠以高概率預測為IgA腎病的方法以及選擇出扁桃體摘除有效的IgA腎病患者的方法。
背景技術：
IgA腎病是一種慢性腎小球性腎炎，其特徵在於，可觀察到IgA在腎臟的腎小球繫膜區域的優勢沉積。IgA腎病佔日本的慢性腎小球性腎炎的一大半，作為單一的腎病是最多的，其中15 30%預後不良而轉為腎功能衰竭。但是，IgA腎病的病因尚未明確，因此沒有根本性的治療方法。IgA腎病的確診使用對腎臟的一部分進行活檢，通過免疫學染色確認腎小球繫膜中的IgA免疫複合物的沉積的方法，因此存在對患者造成的負擔大的問題。因而， 期望開發出能夠在實施腎活檢前、在不對被測者造成軀體上的負擔的情況下簡便且迅速地實施，而且能夠以高概率預測IgA腎病的方法。另外，已知IgA有IgAl和IgA2這兩種，IgAl在上消化道、呼吸道、扁桃體產生， IgA2在下消化道產生。IgA腎病中沉積於腎臟的是IgAl，因而近年來進行了摘除IgA腎病患者的扁桃體的治療方法。非專利文獻1中報導對16名IgA腎病患者進行扁桃體摘除，3年後56. 3%的患者的蛋白尿得到緩解。另外，非專利文獻2中報導對M名IgA腎病患者進行扁桃體摘除， 6個月後41. 7%的患者的蛋白尿得到緩解，2年後50%的患者的蛋白尿得到緩解。此外，非專利文獻3中報導通過並用扁桃體摘除和類固醇脈衝治療，約60%的IgA腎病患者的尿蛋白和尿潛血兩者同時得到緩解。但是，扁桃體摘除對於約40%的IgA腎病患者是無效的，存在無法預先預測扁桃體摘除的有效性的問題。由於扁桃體摘除需要伴隨全身麻醉的手術，軀體上的負擔大，因而期望建立一種以高概率選擇扁桃體摘除有效的患者的方法。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻 1 Tokuda M et al. Acta Otolaryngol Suppl 523 ； 182—184，1988.非專利文獻 2:Akagi H et al. Acta Otolaryngol Suppl 540 ；64-66,1999.非專利文獻3 =Hotta et al. Am J Kid Dis 38，pp736_743，2001.
發明內容
本發明的目的在於提供一種能夠在不對被測者造成軀體上的負擔的情況下簡便且迅速地實施、而且能夠以高概率預測IgA腎病的方法。另外，本發明的目的在於提供一種以高概率選擇對於IgA腎病的治療扁桃體摘除有效的IgA腎病患者的方法。本發明為了解決上述課題，包含以下技術方案。[1] 一種IgA腎病的預測方法，其特徵在於，包括對來自被測者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬(Ti^ponema)細菌或彎曲桿菌屬(Campylobacter)細菌進行檢測的步
馬聚ο[2]如上述[1]所述的IgA腎病的預測方法，其特徵在於，所述步驟中，對密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性的核酸進行檢測。[3]如上述[1]所述的IgA腎病的預測方法，其特徵在於，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。[4]如上述[1]所述的IgA腎病的預測方法，其中，密螺旋體屬細菌選自通過以下 PCR檢測出的細菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細菌提取的總RNA反轉錄所得到的cDNA作為模板，並且使用序列號1表示的鹼基序列構成的引物和序列號2表示的鹼基序列構成的引物組合而成的引物組。[5]如上述[1]所述的IgA腎病的預測方法，其中，密螺旋體屬細菌為選自由齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、文氏密螺旋體(Ti^ponema vincentii)、媒介密螺旋體(Ti^ponema medium)、索氏密螺旋體(Ti^ponema socranskii)、蝕瘡潰瘍密螺旋體 (Treponema phagedenis)、食果月交密il旋體(Treponema pectinovorum)、食澱粉密il旋體 (Treponema amylovorum)、 嗜麥芽糖密螺旋體(Tr印onema maltophilum)、布氏密螺旋體 (Treponema bryantii)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)、嗜糖密螺旋體(Treponema saccharophilum)和產琥珀酸密螺旋體(Treponema succinifaciens)組成的組中的一種以上。[6]如上述[1]所述的IgA腎病的預測方法，其中，彎曲桿菌屬細菌為選自由直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、結腸 ^ ffiff S『 (Campylobacter coli)、·明胃曲 ff (Campylobacter concisus)、 曲桿菌(Campylobacter curvus)、昭禾口彎曲桿菌(Campylobacter showae)、黏膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、月臺兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、豬腸彎曲桿菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液彎曲桿菌(Campylobacter sputorum)、瑞士彎曲桿菌(Campylobacter helveticus)、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacter upsaliensis)禾口紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)組成的組中的一種以上。[7]如上述[1] W]中任一項所述的IgA腎病的預測方法，其特徵在於，被測者在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項中被判斷為陽性。[8] 一種試劑盒，用於預測IgA腎病，其特徵在於，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用於特異性檢測密螺旋體屬細菌的引物組；(b)用於特異性檢測彎曲桿菌屬細菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。[9] 一種IgA腎病患者的選擇方法，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者，其特徵在於，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌進行檢測的步驟。[10] 一種IgA腎病患者的選擇方法，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除和類固醇脈衝療法有效的IgA腎病患者，其特徵在於，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌進行檢測的步驟。[11]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特徵在於，所述步驟中，對密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性的核酸進行檢測。[12]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特徵在於，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。[13]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細菌選自通過以下PCR檢測出的細菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細菌提取的總 RNA反轉錄所得到的cDNA作為模板，並且使用序列號1表示的鹼基序列構成的引物和序列號2表示的鹼基序列構成的引物組合而成的引物組。[14]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細菌為選自由齒垢密螺旋體、文氏密螺旋體、媒介密螺旋體、索氏密螺旋體、蝕瘡潰瘍密螺旋體、 食果膠密螺旋體、食澱粉密螺旋體、嗜麥芽糖密螺旋體、布氏密螺旋體、梅毒密螺旋體、嗜糖密螺旋體和產琥珀酸密螺旋體組成的組中的一種以上。[15]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，彎曲桿菌屬細菌為選自由直腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、結腸彎曲桿菌、簡明彎曲桿菌、曲形彎曲桿菌、昭和彎曲桿菌、黏膜彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、豬腸彎曲桿菌、痰液彎曲桿菌、瑞士彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌和紅嘴鷗彎曲桿菌組成的組中的一種以上。[16] 一種試劑盒，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者，其特徵在於，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用於特異性檢測密螺旋體屬細菌的引物組；(b)用於特異性檢測彎曲桿菌屬細菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。根據本發明，能夠在不對被測者造成軀體上的負擔的情況下簡便且迅速地、而且以高概率預測被測者是否為IgA腎病。另外，根據本發明，能夠在不對被測者造成軀體上的負擔的情況下簡便且迅速地、而且以高概率選擇對於IgA腎病的治療扁桃體摘除有效的 IgA腎病患者。
圖1是表示通過DGGE法網羅性地分析扁桃體菌群的結果的電泳圖。圖2是表示通過RT-PCR法檢測摘除的扁桃體中的密螺旋體屬細菌的結果的電泳圖。圖3是表示通過RT-PCR法檢測摘除的扁桃體中的直腸彎曲桿菌的結果的電泳圖。圖4(A)是表示扁桃體中密螺旋體屬細菌的有無和扁桃體摘除+類固醇脈衝療法的治療效果的圖。圖4(B)是表示扁桃體中嗜血桿菌屬細菌的有無和扁桃體摘除+類固醇脈衝療法的治療效果的圖。圖4(C)是表示扁桃體中彎曲桿菌屬細菌的有無和扁桃體摘除+類固醇脈衝療法的治療效果的圖。
具體實施例方式本發明人對從經腎活檢診斷為IgA腎病的患者和慢性扁桃體炎患者體內摘除的扁桃體中的菌群進行了網羅性的分析，結果發現IgA腎病患者與慢性扁桃體炎患者之間扁桃體菌群不同，並且發現IgA腎病患者中存在密螺旋體屬細菌、嗜血桿菌屬細菌、彎曲桿菌屬細菌的概率高。由該發現可知，如果扁桃體中存在密螺旋體屬細菌、嗜血桿菌屬細菌、彎曲桿菌屬細菌的任一種，則為IgA腎病的概率高。其中，關於嗜血桿菌屬細菌與IgA腎病的關聯在本申請提出之前已有啟示，但是，IgA腎病患者的扁桃體中密螺旋體屬細菌和彎曲桿菌屬細菌的陽性率高是由本發明人首次發現的。此外，本發明人發現，在IgA腎病患者中，對扁桃體檢測出密螺旋體屬細菌的患者或檢測出彎曲桿菌屬細菌的患者進行扁桃體摘除療法是非常有效的，從而完成了本發明。即，本發明涉及IgA腎病的預測方法，其特徵在於，包括對來自被測者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌進行檢測的步驟。另外，本發明涉及一種 IgA腎病患者的選擇方法，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除、或者進行扁桃體摘除和類固醇脈衝療法有效的IgA腎病患者，其特徵在於，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌進行檢測的步驟。作為本發明的IgA腎病的預測方法的對象的被測者沒有特別限制，優選為疑似患 IgA腎病的人。作為疑似患IgA腎病的人，可列舉出在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項中被判斷為陽性的人。更具體而言，例如，可列舉出在學校體檢、公司體檢等體檢時或門診診察時等實施的尿檢中被查出蛋白尿和血尿且即使複查也持續尿檢異常的人。IgA腎病多同時伴有蛋白尿和血尿，但也有僅呈現血尿的情況，因此優選將任一項持續陽性的人作為被測者。尿蛋白陽性(蛋白尿)的判斷和尿潛血陽性(血尿)的判斷例如可以通過使用通常的尿檢中使用的公知的尿檢試紙來進行。以往，在疑似患IgA腎病時，如果不通過腎活檢來進行組織學檢查則無法診斷，因而其結果是，被診斷為不是IgA腎病的被測者會承受不必要的軀體上的負擔。如果使用本發明的IgA腎病的預測方法，則可以僅對患IgA腎病的概率高的被測者進行腎活檢，從而能夠避免不必要的軀體上的負擔。作為本發明的IgA腎病患者的選擇方法的對象的IgA腎病患者沒有限制。優選為過去未進行過扁桃體摘除術的IgA腎病患者。以往，對於約40%的IgA腎病患者而言，扁桃體摘除是無效的，但是，如果使用本發明的IgA腎病患者的選擇方法，則可以僅對扁桃體摘除有效的概率高的患者進行扁桃體摘除，因而能夠避免不必要的軀體上的負擔和經濟上的負擔。以下，將本發明的IgA腎病的預測方法和本發明的IgA腎病患者的選擇方法並稱為「本發明的方法」，對兩方法中共有的項目進行詳細說明。本發明的方法中，作為檢測對象的密螺旋體屬細菌沒有特別限制，只要是扁桃體中可能存在的密螺旋體屬細菌均可作為檢測對象。作為這樣的密螺旋體屬細菌，例如可列舉出通過以下PCR檢測出的細菌該PCR中，以從密螺旋體屬細菌提取的總RNA反轉錄所得到的cDNA作為模板，並且使用由正向引物(TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC、序列號1)和反向引物(GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTC、序列號2)構成的引物組。這裡，鹼基符號R表示鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(A)，Y表示胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)，M表示腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)，W表示腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)。具體而言，例如，可列舉出齒垢密螺旋體(Tr印onema denticola)、文氏密螺旋體 (Treponema vincentii)、媒介密螺方寵體(Treponema medium)、索氏密螺方寵體(Treponema socranskii)、蝕瘡潰瘍密螺旋體(Tr印onema phagedenis)、食果膠密螺旋體(Treponema pectinovorum)、食澱粉密螺旋體(Treponema amylovorum)、嗜麥芽糖密螺旋體(Treponema maltophilum)、布氏密螺旋體(Treponema bryantii)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)、嗜糖密螺旋體(Treponema saccharophilum)、產琥珀酸密螺旋體(Treponema succinifaciens)等。本發明的方法中，作為檢測對象的彎曲桿菌屬細菌沒有特別限制，只要是扁桃體中可能存在的彎曲桿菌屬細菌均可作為檢測對象。作為這樣的彎曲桿菌屬細菌，例如，可列舉出直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、 結腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、簡明彎曲桿菌(Campylobacter concisus)、曲形彎曲桿菌(Campylobacter curvus)、昭禾口彎曲桿菌(Campylobacter showae)、黏膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、月臺兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、豬腸彎曲桿菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液彎曲桿菌(Campylobacter sputorum)、瑞士彎曲桿菌(Campylobacter helveticus)、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacter upsaliensis)、紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)等。其中，優選直腸彎曲桿菌。供於本發明的方法中的試樣只要是來自被測者或患者的扁桃體的試樣即可。例如，可列舉出由扁桃體組織、扁桃體拭子液等製備的DNA、RNA、細胞懸浮液、細胞破碎液等。 這些試樣均可以通過本領域技術人員公知的方法製備。檢測密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌的方法只要是能夠特異性檢測密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌的方法則沒有特別限制。例如，可列舉出對密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性的核酸進行檢測的方法、使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體的方法等。檢測上述核酸的方法中的核酸可以是DNA，也可以是RNA。本發明中，可以適當使用公知的核酸檢測方法。具體而言，例如，可列舉出PCR法、DNA印跡法、RNA印跡法、RT-PCR 法、原位雜交法、原位PCR法、DNA陣列法等。其中，從檢測靈敏度、操作的簡便性、快速性、 低成本性的觀點來看，優選使用RT-PCR法。在使用RT-PCR法檢測密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌時，使用由扁桃體組織、扁桃體拭子液等製備的總RNA作為試樣。總RNA可以通過公知的方法製備。RT-PCR法可以通過本領域技術人員公知的方法實施。例如，可列舉出以下方法 由扁桃體組織、扁桃體拭子液等製備總RNA，使用反轉錄酶由該總RNA合成cDNA，以該cDNA 為模板，利用對來自檢測對象細菌的DNA片段進行特異性擴增的引物組進行PCR。對來自檢測對象細菌的DNA片段進行特異性擴增的引物組沒有特別限制，只要由公知的資料庫(例如，GenBank等)獲取檢測對象細菌的基因組序列信息或核糖體RNA的序列信息，根據公知的方法設計引物即可。以下，例示出可以適用於本發明的方法的引物組，但不限於此。作為能夠特異性檢測密螺旋體屬細菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC(序列號1)
反向引物GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTC (序列號 2)通過使用該引物組，可以期待擴增657bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測齒垢密螺旋體的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TAATACCGAATGTGCTCATTTACAT(序列號 3)反向引物CTGCCATATCTCTATGTCATTGCTCTT(序列號 4)通過使用該引物組，可以期待擴增860bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測文氏密螺旋體的引物組，可列舉出以下引物組正向引物GTCTCAATGGTTCATAAGAA(序列號 5)反向引物CAAGCCTTATCTCTAAGACT(序列號 6)通過使用該引物組，可以期待擴增851bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測媒介密螺旋體的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CACTCAGTGCTTCATAAGGG(序列號 7)反向引物CCGGCCTTATCTCTAAGACC(序列號 8)通過使用該引物組，可以期待擴增851bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測直腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC(序列號 9)反向引物TTTCTGCAAGCAGACACTCTT(序列號 10)通過使用該引物組，可以期待擴增598bp的DNA片段(Archives of Oral Biology,2006. 51 :ρ·10—14.)。作為能夠特異性檢測空腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGAATGGGTTTAACTCGTGTGATAAGT(序列號 11)
反向引物TACCACGCAAAGGCAGTATAGCT (序列號 12)通過使用該引物組，可以期待擴增493bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測結腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AAATGCTAGTGCTAGGGAAAAAGACTCT(序列號 13)反向引物TGAGGTTCAGGCACTTTTACACTTACTAC(序列號14)通過使用該引物組，可以期待擴增96bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測簡明彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGCGGGCCTAACAAGAGTTATTACA(序列號反向引物TGTAAGCACGTCAAAAACCATCTTT(序列號 16)通過使用該引物組，可以期待擴增217bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測曲形彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組
正向引物CTGCCAAAGTAAGGACGCAAGTATA(序列號 17)反向引物GGCAAGATCGCCTGAAATACG(序列號 18)通過使用該引物組，可以期待擴增108bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測昭和彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGGGTTTAAGCATAGGAACGCTG(序列號 19)反向引物CACCAGATAAAGCTCGCTGATCG(序列號20)通過使用該引物組，可以期待擴增86bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測黏膜彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TGCGATTATGAACAAGGCCCTA(序列號21)反向引物TCGCTTGAAACACACGGTCA(序列號22)通過使用該引物組，可以期待擴增224bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測胎兒彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGAGCTGGGCTTACAAGAGCTATTACA(序列號 2 反向引物GGTAAAATCGCTTGAAACGCTCTAT(序列號 24)通過使用該引物組，可以期待擴增482bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測豬腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CGGTCAAAAGATGACTTTTGAAGTACTT(序列號 25)反向引物GCTTCCCTGCCACGAGCT(序列號26)通過使用該引物組，可以期待擴增108bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測痰液彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGCTTTACTTGCTGCAAGAGGAAGA(序列號 27)反向引物AGGAAGCGTTCCAACAGAAAAGTT(序列號 28)通過使用該引物組，可以期待擴增94bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測瑞士彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CAATAACATACGCACACCAGATGGA(序列號四)反向引物CAGGCACTTTAACGCTCACTATGG(序列號 30)通過使用該引物組，可以期待擴增176bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測烏普薩拉彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物GCTTACGCGTGTAATTACAAACTATGTC(序列號 31)反向引物AATTGCCTTAGCCTCGATAGGG(序列號 32)通過使用該引物組，可以期待擴增250bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。
作為能夠特異性檢測紅嘴鷗彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CTATGTTCGTCCTATAGTTTCTAAGGCTTC(序列號33)反向引物CCAGCACTATCACCCTCAACTAAATAA(序列號 34)通過使用該引物組，可以期待擴增250bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。關於使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體的方法中的抗體，在檢測密螺旋體屬細菌時只要是與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體即可，在檢測彎曲桿菌屬細菌時只要是與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體即可。抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。另外，可以是完整的抗體分子，也可以是能夠特異性結合的抗體片段(例如，Fab片段、F(ab' )2片段等)。與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體(多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段)和與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體(多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段)，可以通過使用檢測對象細菌的構成成分作為免疫原，利用公知的方法製作、獲取。作為使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體的方法，例如， 可列舉出酶免疫測定法(EIA法)、固相酶聯免疫測定法(ELISA法)、放射免疫測定法(RIA 法)、蛋白質印跡法、免疫沉澱法、免疫組化法、抗體陣列法等。其中，從檢測靈敏度、操作的簡便性、快速性、低成本性的觀點來看，優選使用ELISA法。在使用ELISA法檢測密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌時，適合使用由扁桃體組織、扁桃體拭子液等製備的細胞懸浮液或細胞破碎液等作為試樣。ELISA法可以根據本領域技術人員公知的方法實施。例如，可列舉出以下方法使與檢測對象細菌特異性結合的一次抗體結合到微孔板的孔或塑料管等固相上，向其中添加來自扁桃體的試樣(細胞懸浮液或細胞破碎液等)，清洗後添加酶標記的二次抗體；清洗、 除去未結合的二次抗體後，添加顯色底物，用分光光度計測定生成的顯色物質的量，從而測定吸光度。本發明的方法通過使用試劑盒，能夠簡便且迅速地實施。因此，本發明提供用於預測IgA腎病的試劑盒、以及用於選擇扁桃體摘除有效的IgA腎病患者的試劑盒(以下，將兩試劑盒並稱為「本發明的試劑盒」)。作為本發明的試劑盒的一個實施方式，可以提供以下RT-PCR用試劑盒，該試劑盒包含選自用於特異性檢測密螺旋體屬細菌的引物組和用於特異性檢測彎曲桿菌屬細菌的引物組中的至少一種以上的引物組。除引物組以外的試劑盒的構成品沒有特別限制，例如， 優選含有用於由組織或細胞製備RNA的試劑、反轉錄酶、用於反轉錄反應的緩衝液、耐熱性 DNA聚合酶、PCR用試劑、PCR用管、PCR用板等。作為本發明的試劑盒的另一實施方式，可以提供以下ELISA用試劑盒，該試劑盒包含選自與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體和與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體中的至少一種以上的抗體。除抗體以外的試劑盒的構成品沒有特別限制，例如，優選含有已標記的二次抗體、顯色用試劑、清洗用緩衝液、ELISA用板等。此外，作為本發明的試劑盒的其他實施方式，可列舉出包含DNA陣列的試劑盒、包含抗體陣列的試劑盒等。實施例
以下，通過實施例對本發明進行詳細說明，但本發明並不限定於這些例子。[實施例1:IgA腎病患者的扁桃體菌群的研究](1)患者的登記對於在大阪大學醫學部附屬醫院住院的、經腎活檢被診斷為IgA腎病的68名患者和因慢性扁桃體炎而進行了扁桃體摘除的觀名患者，得到書面同意書後，獲得了扁桃體摘除時的扁桃體樣品。扁桃體摘除後，立即使用iTrizol (invitrogen)進行RNA提取，以RNA 形式進行保存。關於IgA腎病患者的扁桃體的研究，在得到大阪大學醫學部附屬醫院倫理委員會的許可後實施。(2)基於DGGE(變性梯度凝膠電泳)法的扁桃體菌群的網羅性分析將由IgA腎病的患者以及慢性扁桃體炎的患者的扁桃體得到的RNA進行反轉錄， 以所得到的cDNA為模板，使用針對細菌的16S核糖體RNA的V6 · V8區域的PCR引物組通用細菌引物卯4f (CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG G、序列號 35)禾Π 1369r (GCCCGGGAACGTATTCACCG、序列號 36)進行 PCR(參考文獻Yu，Z. and Μ. Morrison, Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(8) :p. 4800-6.)。各 PCR 反應液含有 IOOng的DNAUOpmol的各引物、0. 16mM的三磷酸脫氧核苷酸、5 μ L的IOXBlend Taq緩衝液(東洋紡)和1.25U的Blend Taq聚合酶(東洋紡)，用蒸餾水調節最終容量為50 μ L。 PCR的條件為第1次在95°C下進行4分鐘的融化、在95°C下進行30秒鐘的變性、在61°C 下進行30秒鐘的退火併在72°C下進行1分鐘的延伸，然後，以0. 5°C的間隔降低退火溫度， 同時在95°C下進行4分鐘的融化、在95°C下進行30秒鐘的變性、在各循環的溫度下進行30 秒鐘的退火併在72°C下進行1分鐘的延伸，共進行10個循環。進而，使用56°C的延伸
夕；^〒> * 3 >)進行25個循環，最後在72°C下進行2小時的延伸。使用DCode 通用突變檢測系統(Bio-Rad laboratories)，將 PCR 產物在 82V、60°C 下進行15小時的電泳。電泳用凝膠使用丙烯醯胺/N，N』 -甲叉雙丙烯醯胺30%溶液四 1 (Bio-Rad laboratories，目錄號161-0156)製作。標誌物使用 DGGE Marker 11(10 片段) (株式會社日本基因，目錄號:315-06404)。電泳後的凝膠用STOR Green I(LonZa，羅克蘭， 緬因州，美國)染色，然後使用凝膠攝影裝置GelDoc XR(Bio-Rad laboratories)得到各樣品的條帶的位置和強度(條帶的濃度)的數據(參考文獻MuyZer，G· , et al. ,Denaturant gradient gel electrophoresis in microbial ecology. Molecular Microbial Ecology Manual, Vol. 3. 4. 4，1998 :p. pp. 1-27.)。對於所得到的條帶的位置和強度的數據進行多變量分析(PLS-DA)，由此顯示出在 IgA腎病和慢性扁桃體炎之間扁桃體菌群是不同的。另外，通過進行加載繪圖分析(Loading plot analysis)，發現了 IgA腎病的特徵性條帶。電泳的結果示於圖1。圖1中，染色的條帶分別表示存在於扁桃體中的菌，箭頭A、B和C所示的條帶是IgA腎病的特徵性條帶。將這些條帶切出，進行TA克隆，根據常規方法確定鹼基序列，與公知的基因資料庫收錄的鹼基序列進行同源性檢索，結果可知，A的條帶與密螺旋體屬細菌(Tr印onema sp.)顯示出高同源性，B的條帶與惰性嗜血桿菌(Haemophilus segnis)顯示出高同源性，C的條帶與直腸彎曲桿菌(CampylcAacterrectus)顯示出高同源性。對於68名IgA腎病患者和28名慢性扁桃體炎患者，將上述A、B、C的條帶所對應的細菌的陽性率示於表1。使用t檢驗進行數據的統計學分析。由表1可知，IgA腎病患者的扁桃體中存在密螺旋體(Ti^ponema)屬的細菌、嗜血桿菌(Haemophilus)屬的細菌、彎曲桿菌(Campylobacter)屬的細菌的概率高。其中，關於嗜血桿菌(Haemophilus)屬的細菌，已經報導了在IgA腎病患者的腎小球內和血清中檢測到副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)的構成成分(Suzuki, et al. Lancet 1994)，從而暗示出其與IgA腎病的關聯，但是，IgA腎病患者的扁桃體中密螺旋體屬的細菌和彎曲桿菌屬的細菌的陽性率高是本次才獲知的，由此證實了檢測扁桃體中的密螺旋體屬的細菌或彎曲桿菌屬的細菌的存在對於IgA腎病的診斷是有用的。[表1]
權利要求
1.一種IgA腎病的預測方法，其特徵在於，包括對來自被測者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬(Ti^ponema)細菌或彎曲桿菌屬(Campylobacter)細菌進行檢測的步驟。
2.如權利要求1所述的IgA腎病的預測方法，其特徵在於，所述步驟中，對密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性的核酸進行檢測。
3.如權利要求1所述的IgA腎病的預測方法，其特徵在於，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。
4.如權利要求1所述的IgA腎病的預測方法，其中，密螺旋體屬細菌選自通過以下PCR 檢測出的細菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細菌提取的總RNA反轉錄所得到的cDNA作為模板，並且使用序列號1表示的鹼基序列構成的引物和序列號2表示的鹼基序列構成的引物組合而成的引物組。
5.如權利要求1所述的IgA腎病的預測方法，其中，密螺旋體屬細菌為選自由齒垢密螺旋體(Ti^ponema denticola)、文氏密螺旋體(Ti^ponema vincentii)、媒介密螺旋體(Ti^ponema medium)、索氏密螺旋體(Ti^ponema socranskii)、蝕瘡潰瘍密螺旋體 (Treponema phagedenis)、食果月交密il旋體(Treponema pectinovorum)、食澱粉密il旋體 (Treponema amylovorum)、 嗜麥芽糖密螺旋體(Tr印onema maltophilum)、布氏密螺旋體 (Treponema bryantii)(Treponema pallidum) >Bf(Treponema saccharophilum)和產琥珀酸密螺旋體(Treponema succinifaciens)組成的組中的一種以上。
6.如權利要求1所述的IgA腎病的預測方法，其中，彎曲桿菌屬細菌為選自由直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、結腸彎 ffiff ^ (Campylobacter coli) > M BJ ^ ffi ff ^ (Campylobacter concisus)、曲胃曲桿菌(Campylobacter curvus)、昭禾口彎曲桿菌(Campylobacter showae)、黏膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、月臺兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、豬腸彎曲桿菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液彎曲桿菌(Campylobacter sputorum)、瑞士彎曲桿菌(Campylobacter helveticus)、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacter upsaliensis)禾口紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)組成的組中的一種以上。
7.如權利要求1 6中任一項所述的IgA腎病的預測方法，其特徵在於，被測者在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項中被判斷為陽性。
8.一種試劑盒，用於預測IgA腎病，其特徵在於，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用於特異性檢測密螺旋體屬細菌的引物組；(b)用於特異性檢測彎曲桿菌屬細菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。
9.一種IgA腎病患者的選擇方法，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者，其特徵在於，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌進行檢測的步驟。
10.一種IgA腎病患者的選擇方法，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除和類固醇脈衝療法有效的IgA腎病患者，其特徵在於，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌進行檢測的步驟。
11.如權利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特徵在於，所述步驟中，對密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性的核酸進行檢測。
12.如權利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特徵在於，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。
13.如權利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細菌選自通過以下PCR檢測出的細菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細菌提取的總RNA 反轉錄所得到的cDNA作為模板，並且使用序列號1表示的鹼基序列構成的引物和序列號2 表示的鹼基序列構成的引物組合而成的引物組。
14.如權利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細菌為選自由齒垢密螺旋體、文氏密螺旋體、媒介密螺旋體、索氏密螺旋體、蝕瘡潰瘍密螺旋體、食果膠密螺旋體、食澱粉密螺旋體、嗜麥芽糖密螺旋體、布氏密螺旋體、梅毒密螺旋體、嗜糖密螺旋體和產琥珀酸密螺旋體組成的組中的一種以上。
15.如權利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，彎曲桿菌屬細菌為選自由直腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、結腸彎曲桿菌、簡明彎曲桿菌、曲形彎曲桿菌、昭和彎曲桿菌、黏膜彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、豬腸彎曲桿菌、痰液彎曲桿菌、瑞士彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌和紅嘴鷗彎曲桿菌組成的組中的一種以上。
16.一種試劑盒，用於選擇對於IgA腎病的治療進行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者， 其特徵在於，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用於特異性檢測密螺旋體屬細菌的引物組；(b)用於特異性檢測彎曲桿菌屬細菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細菌特異性結合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細菌特異性結合的抗體。
全文摘要
通過檢測來自在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項中被判斷為陽性的被測者或者被診斷為IgA腎病的患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細菌或彎曲桿菌屬細菌，能夠在不對被測者造成軀體上的負擔的情況下，簡便且迅速地以高概率預測IgA腎病。另外，能夠在不對被測者造成軀體上的負擔的情況下，簡便且迅速地以高概率選擇出對於IgA腎病的治療扁桃體摘除有效的IgA腎病患者。
文檔編號C12N15/09GK102317453SQ20108000770
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月10日 優先權日2009年2月12日
發明者大野博司, 豬阪善隆, 福田真嗣, 長澤康行, 飯尾健一郎 申請人:國立大學法人大阪大學