一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法

2023-12-08 08:01:56

一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法
【專利摘要】本發明涉及一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法，其特徵在於包括以下步驟：步驟1，注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分的製備；步驟2，將步驟1所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分製備成注射用益氣復脈凍乾粉提取物；步驟3，將步驟2所述注射用益氣復脈凍乾粉提取物和甲醇在酸性或鹼性條件下進行甲酯化反應。
【專利說明】一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥與化學領域，特別涉及一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法。
【背景技術】
[0002]注射用益氣復脈凍乾粉是由紅參、麥冬、五味子製成的用於靜脈滴注的中藥複方製劑，具有益氣復脈，養陰生津的療效。主要用於冠心病勞累性心絞痛氣陰兩虛證，症見胸痺心痛，心悸氣短、倦怠懶言、頭暈目眩、面色少華、舌淡、少苔或剝苔，脈細弱或結代；冠心病所致慢性左心功能不全I1、III級氣陰兩虛證，症見心悸、氣短甚則氣急喘促，胸悶隱痛，時作時止，倦怠乏力，面色蒼白，動則汗出，舌淡、少苔或剝苔，脈細弱或結代。
[0003]注射用益氣復脈凍乾粉的性狀為淺黃色的疏鬆塊狀物；有引溼性。取I瓶內容物，加水2?3ml溶解後,為棕紅色澄明液體。
[0004]注射用益氣復脈凍乾粉中化學成分正不斷深入研究，注射用益氣復脈凍乾粉經過大孔吸附樹脂吸附，用鹼醇洗脫得到的洗脫液中，含有脂肪酸類物質，對這些物質進行化學分析可以獲得注射用益氣復脈凍乾粉中的有效成分的信息。但由於脂肪酸類物質的沸點較高，不宜直接採用氣相色譜法(GC)進行分析。一般都是將其進行甲酯化衍生化降低沸點後，再通過GC分離測定所含有的脂肪酸信息。
[0005]常用的甲酯化方法分為酸催化、鹼催化兩大類。每種方法各有其優缺點，且使用範圍各不相同。而許多文獻和參考資料中使用的酸鹼濃度、萃取溶劑等也有較大差異。因此，選擇方便、快捷的、穩定、反應完全的甲酯化方法對注射用益氣復脈凍乾粉中的脂肪酸進行GC法分析至關重要。

【發明內容】

[0006]本發明提供一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法，包括以下步驟:
[0007]步驟1，注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分的製備；
[0008]步驟2，將步驟I所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分製備成注射用益氣復脈凍乾粉提取物；
[0009]步驟3，將步驟2所述注射用益氣復脈凍乾粉提取物和甲醇在酸性或鹼性條件下進行甲酯化反應。
[0010]根據本發明實施方式之一，步驟I所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇部分的製備方法如下:
[0011]取注射用益氣復脈凍乾粉上大孔樹脂柱，先用水洗脫，再用鹼醇溶液洗脫，收集該鹼醇洗脫液，濃縮乾燥即得注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇部分。
[0012]所述鹼醇溶液為0.1-lmol/L NaOH的乙醇溶液，乙醇濃度為15%_35%。優選的鹼醇溶液為0.5mol/L NaOH 25%乙醇溶液。
[0013]根據本發明另一實施方式，步驟2所述注射用益氣復脈凍乾粉提取物製備方法如下:
[0014]取步驟I所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分，加氯仿，在20-40°C下超聲提取，提取液濃縮即得注射用益氣復脈凍乾粉提取物。
[0015]根據本發明再一實施方式，步驟3所述甲酯化反應，方法如下:
[0016]取注射用益氣復脈凍乾粉提取物，加入甲醇，酸或鹼，混合後進行反應，反應完畢，用有機溶劑萃取。
[0017]所述酸為1%_25%硫酸，所述鹼為1-10%氫氧化鈉或氫氧化鉀。優選的酸為10%硫酸。
[0018]實驗證明:酸性或鹼性條件下均可生成甲酯化產物，但10%硫酸-甲醇加熱回流酯
化法酯化效率最高。
[0019]所述有機溶劑包括正己烷、氯仿、乙酸乙酯，優選的有機溶劑為乙酸乙酯。
[0020]實驗證明:萃取溶劑為正己烷時得到的成分極少，且含量較低；而乙酸乙酯萃取物檢測成分較多，且亞油酸、棕櫚酸等脂肪酸含量較高。
[0021]本發明最優選的製備方法見實施例。
[0022]本發明的目的在於通過上述製備方法得到所需的脂肪酸甲酯類物質。進一步對這些物質進行檢測，檢測方法包括氣相色譜法，氣相色譜-質譜聯用法。經過檢測可以判斷本發明方法中甲酯化的程度和反應進程，進一步分析所測樣品中脂肪酸的種類以及含量。
[0023]本發明的方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下:
[0024]I 材料
[0025]1.1 儀器
[0026]Agilent 5890-5971氣相色譜-質譜聯用儀，Agilent 6890N氣相色譜配7683B自動進樣器；AE240型十萬分之一電子分析天平(瑞士 METTLER公司);KQ_250DE型醫用數控超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)；Mill1-Q超純水處理系統。
[0027]1.2 試劑
[0028]正己烷，氯仿，乙酸乙酯，氫氧化鉀，氯化鈉，無水甲醇，濃硫酸，均為分析純(天津化學試劑有限公司)，三氟化硼乙醚(國藥集團化學試劑有限公司)，水為超純水。
[0029]1.3樣品的製備
[0030]取注射用益氣復脈凍乾粉上已處理好的AB-8大孔樹脂柱。水衝洗後用0.5mol/LNaOH 25%乙醇溶液衝洗樹脂柱，收集該鹼醇洗脫液，濃縮乾燥即為注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分。精密稱定Ig該物質，加50ml氯仿30°C超聲提取lh，減壓濃縮，得到氯仿提取物70mg，將此提取物平行製備6份。
[0031]2方法與結果
[0032]2.1甲酯化方法
[0033]2.1.1 10%硫酸-甲醇加熱回流酯化法(萃取溶劑為正己烷)
[0034]精密稱取上述氯仿提取物70mg，置以反應燒瓶內，加入5.0ml無水甲醇使之溶解，再慢慢加入0.5ml濃硫酸,在70°C下加熱回流30min。取下冷卻移入分液漏鬥,加入15ml水，20ml正己烷振搖，進行萃取。靜置，待液面分層後放去水相。用無水硫酸鈉除水減壓濃縮定容至5ml，備用。用於測定不同萃取溶劑對該部分物質甲酯化效果的影響。
[0035]2.1.2 10%硫酸-甲醇加熱回流酯化法(萃取溶劑為乙酸乙酯)[0036]精密稱取上述氯仿提取物70mg，置以反應燒瓶內，加入5.0ml無水甲醇使之溶解，再慢慢加入0.5ml濃硫酸,在70°C下加熱回流30min。取下冷卻移入分液漏鬥,加入15ml水，20ml乙酸乙酯振搖，進行萃取。靜置，待液面分層後放去水相。用無水硫酸鈉除水減壓濃縮後用乙酸乙酯定容至5ml容量瓶中，備用。用於測定不同酸法甲酯化效果的影響。
[0037]2.1.3 1%硫酸-甲醇加熱回流酯化法(萃取溶劑為乙酸乙酯)
[0038]精密稱取上述氯仿提取物70mg，置以反應西林瓶(蓋上插一充滿氮氣的氣球，防止溶劑揮發)內，加1%硫酸-甲醇4ml於70°C水浴加熱60min,加入4ml乙酸乙酯,再加蒸餾水至瓶頸，取出上清，再用2ml乙酸乙酯洗一次，合併上清液，所得上清夜減壓濃縮，定容至5ml，即可用於氣相分析色譜。用於測定不同酸法甲酯化效果的影響。[0039]2.1.4 25%硫酸-甲醇加熱回流酯化法(萃取溶劑為乙酸乙酯)
[0040]精密稱取上述氯仿提取物70mg，置以反應西林瓶(蓋上插一充滿氮氣的氣球，防止溶劑揮發)內，加入3.0ml無水甲醇使之溶解，再慢慢加入1.0ml濃硫酸，在70°C水浴中下加熱回流60min，加入5ml水混勻，再每次用IOml乙酸乙酯共萃取兩次，合併萃取液，放入小瓶中，放入適量無水硫酸鈉過夜除水，減壓濃縮定容至5ml，待測。用於測定不同酸法甲酯化效果的影響。
[0041]2.1.5 2%氫氧化鉀-甲醇加熱回流酯化法(萃取溶劑為正己烷)
[0042]精密稱取70mg上述的氯仿提取物，加入2%的氫氧化鉀-甲醇溶液20mL，於電熱套上加熱回流30min,再加入5mL三氟化硼乙醚溶液反應5min。精密加入5mL正己燒,再保持5min。反應液冷卻至室溫後，加入飽和氯化鈉溶液適量，振搖15min，靜置分層，精密吸取正己烷層定容於5mL量瓶中，搖勻，備用。用於測定不同萃取溶劑對該部分物質甲酯化效果的影響。
[0043]2.1.6 2%氫氧化鉀-甲醇加熱回流酯化法(萃取溶劑為乙酸乙酯)
[0044]精密稱取70mg上述的氯仿提取物，加入2%的氫氧化鉀-甲醇溶液20mL，於電熱套上加熱回流30min,再加入5mL三氟化硼乙醚溶液反應5min。精密加入5mL乙酸乙酯,再保持5min。反應液冷卻至室溫後，加入飽和氯化鈉溶液適量，振搖15min，靜置分層，精密吸取乙酸乙酯層定容於5mL量瓶中，搖勻，備用。用於測定鹼法甲酯化效果的影響。
[0045]2.2氣相色譜-質譜分析條件
[0046]2.2.1氣相色譜
[0047]色譜柱:Agilent HP-5MS玻璃毛細管色譜柱(30mX0.25mm，膜厚0.25μπι);柱溫:60°C保持2min，以10°C.mirT1的速度升溫至200°C，保持lOmin，再以的速度升溫至210°C，保持5min ；10°C*min^的速度升溫至280°C，保持10分鐘；檢測器溫度:280°C;進樣口溫度:250°C ;進樣量:lyL (分流進樣，分流比為10:1);氦氣流速:lmL.mirT1 (模式:恆流)。
[0048]2.2.2質譜條件
[0049]離子源溫度:230°C ；MS四極杆溫度:150°C ；EM電壓:1000V。
[0050]2.2.3檢測方法將樣品中主要成分甲酯化後，利用GC-MS進行定性分析，得到樣品的總離子流圖。通過資料庫軟體給出的MS標準譜圖檢索對照結果，並結合質譜碎片峰的人工分析，確定每一個成分的化學結構，採用峰面積歸一化法確定各組成在樣品中的百分含量。[0051]2.3 結果
[0052]2.3.1通過比較10%硫酸-甲醇加熱回流酯化法、2%氫氧化鉀-甲醇加熱回流酯化法分別用正己烷、乙酸乙酯萃取時的總離子圖，對萃取溶劑的影響進行考察。萃取溶劑為正己烷時得到的成分極少，且含量較低；而乙酸乙酯萃取物檢測成分較多，且亞油酸、棕櫚
酸等脂肪酸含量較高。
[0053]2.3.2三種酸法甲酯化方法產物中，1%硫酸-甲醇加熱回流酯化法亞油酸甲酯等主要成分含量較低；25%硫酸-甲醇加熱回流酯化法次之；10%硫酸-甲醇加熱回流酯化法所得主要成分含量最高，較為理想。而與2%氫氧化鉀-甲醇加熱回流酯化法相比，10%硫酸-甲醇加熱回流酯化法產物中主峰含量較高。因此推斷10%硫酸-甲醇加熱回流酯化法酷化效率最聞。
[0054]2.3.3注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分的氯仿提取物甲酯化樣品的總離子流色譜圖見圖1-1，經NIST2005標準譜庫檢索，共識別了 10個化合物，分別為9個脂肪族類化合物、I個芳香族類化合物。其中亞油酸含量最高(佔30.43%)，其次為棕櫚酸(佔15.75%)，檢索結果見表1-1。
[0055]表1-1注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分的氯仿提取物甲酯化產物有機酸GC-MS檢索結果表
[0056]
【權利要求】
1.一種注射用益氣復脈凍乾粉提取物的甲酯化方法，其特徵在於包括以下步驟: 步驟1，注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分的製備； 步驟2，將步驟I所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分製備成注射用益氣復脈凍乾粉提取物； 步驟3，將步驟2所述注射用益氣復脈凍乾粉提取物和甲醇在酸性或鹼性條件下進行甲酯化反應。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於，步驟I所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇部分的製備方法如下: 取注射用益氣復脈凍乾粉上大孔樹脂柱，先用水洗脫，再用鹼醇溶液洗脫，收集該鹼醇洗脫液，濃縮乾燥即得注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇部分。
3.根據權利要求2的方法，其特徵在於，所述鹼醇溶液為0.1-lmol/L NaOH的乙醇溶液，乙醇濃度為15%-35%。
4.根據權利要求3的方法，其特徵在於，所述鹼醇溶液為0.5mol/L Na0H25%乙醇溶液。
5.根據權利要求1的方法，其特徵在於，步驟2所述注射用益氣復脈凍乾粉提取物製備方法如下: 取步驟I所述注射用益氣復脈凍乾粉鹼醇洗脫部分，加氯仿，在20-4(TC下超聲提取，提取液濃縮即得注射用益氣復脈凍乾粉提取物。
6.根據權利要求1的方法，其特徵在於，步驟3所述甲酯化反應，方法如下: 取注射用益氣復脈凍乾粉提取物，加入甲醇，酸或鹼，混合後進行反應，反應完畢，用有機溶劑萃取。
7.根據權利要求6的方法，其特徵在於，步驟3所述酸為1%_25%硫酸，所述鹼為1-10%氫氧化鈉或氫氧化鉀。
8.根據權利要求7的方法，其特徵在於，所述酸為10%硫酸。
9.根據權利要求6的方法，其特徵在於，所述有機溶劑包括正己烷、氯仿、乙酸乙酯。
10.根據權利要求6的方法，其特徵在於，所述有機溶劑為乙酸乙酯。
【文檔編號】G01N30/06GK103575577SQ201210258916
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月24日 優先權日:2012年7月24日
【發明者】葉正良, 逄小倩, 李德坤, 周大錚 申請人:天津天士力之驕藥業有限公司