多核苷酸組合物的製作方法

2023-11-04 05:11:02 4

>注射後的時間(分鐘)血漿水平(注射劑量的％)肝臟水平(注射劑量的％)抗HIV共軛物游離的抗HIV寡核苷酸製劑A製劑B01001000059558371091405191584337262079279303075201035實施例13陽離子嵌段共聚物的合成將1，4-二溴代丁烷(5.4g，25毫摩爾，來自Milwaukee，WI的AldrichCo.)加入到一種溶於100ml1，4-二噁烷的N-(3-氨丙基)-1，3-丙二胺(6.55g，50毫摩爾，來自AldrichCo.)中。在20℃時，將這種反應混合物攪拌16小時。這種反應的產物以氫溴酸鹽的形式自發地從溶液中沉澱出來。收集這種沉澱的一級中間產物，並通過旋轉蒸發將中間產物從10％的三乙胺甲醇溶液中乾燥兩次。這種蒸發步驟可有效地除去基本量的溴酸鹽。將這種一級中間產物溶於50ml的1，4-二噁烷並將它與2.7g(12.5毫摩爾)的1，4-二溴代丁烷反應。此外，在20℃時，將該反應繼續進行16小時，並回收所得的二級中間產物並如上所述將它進行乾燥。用乙酸將二級中間產物中和至pH為7-8並使用SephadexG-25的凝膠過濾(用水作洗脫液)將二級中間產物純化。從而分別得到三種主要的聚亞胺餾分(具有的表觀分子量分別是1060，700和500)。將聚(氧化乙二醇)(1.5g，M.W.1500，來自Fluka)溶於8ml的1，4-二噁烷，並在20℃時，將它與0.17g(1毫摩爾)的N，N』-羰基咪唑(AldrichCo.)反應3小時。將反應混合物分成兩部分。將每個部分與4ml10％(W/V)的1060或700MW的聚亞胺餾分溶液混合(溶液進一步含有0.01N的NaOH)。在20℃時，將混合物攪拌16小時。通過凝膠過濾，將通式(XX)和不同MW範圍的嵌段共聚物從這種混合物中分離。實施例14陽離子嵌段共聚物的合成將0.5g的甲氧基-PEG(MW5000，Shearwater聚合物，Inc.，USA)的碳酸琥珀酸亞胺酯溶於1，4-二噁烷。將這種二噁烷溶液加入到含有如上所述的0.2g1060MW的聚亞胺聚合物的一種水溶液中，該水溶液進一步包括0.01N的NaOH。在20℃時，將這種反應混合物攪拌16小時。通過凝膠過濾將通式(XXII)的聚合物從反應中分離。實施例15陽離子嵌段共聚物的合成將1.5g的聚(氧化乙二醇)(MW8000，Fluka)溶於8ml的1，4-二噁烷。將0.34g(2毫摩爾)的N，N』-羰基咪唑(AldrichCo.)加入到上述溶液中並在20℃時，將它們反應3小時。然後，將8ml含有0.01NNaOH的如實施例13中所述15％(W/V)500MW的聚亞胺聚合物的一種水溶液加入到第一次的反應混合物中，在20℃時，將所得混合物通過攪拌反應16小時。通過凝膠過濾，從第二次的反應混合物中分離出通式(XXIII)的聚合物。實施例16與寡核苷酸的共軛合成用一種380B-02DNA合成儀(應用的生物系統，CA)來合成一種12鏈的寡核苷酸(與單純皰疹病毒1型(「HSV-1」)早期mRNA剪接位點(病毒基因組上的983-994位置)互補的5′-CGTTCCTCCTGU(「OligoA」))。合成儀應用的是亞磷醯胺化學和8分鐘的合成循環。如應用生物系統介紹的來製備粗製品製劑並制定循環條件。使用丙酮(2ml)將從合成中獲得的粗OligoA從1MLiCl溶液(0.5ml)中沉澱出來。將沉澱物溶於三乙銨乙酸酯，用反相高效液相色譜法將上述沉澱物進行純化，其中使用SilasorbC18柱(9×250mm，Gilson，法國)並使用溶於20mMTEAA緩衝液(pH8.5)中梯度濃度的乙腈作為展開劑。用高碘酸將純化OligoA的3′末端進行氧化以產生一種醛，並通過還原性烷基化作用將上述OligoA的3′-末端與六亞甲基二胺接頭連接(產生一種胺的衍生物)。見Che-Chung等，《國際生物化學》，25767(1991)；Vinogradov等，BBRC，203959(1994)。將「PluronicA」(一種通式(XIV)的嵌段共聚物(x＝25，y+38，z＝25))進行類似的氧化以產生末端醛。將胺的衍生物(1mg)溶於100μl的0.1M硼酸緩衝液(pH9.0)，並將它與2mg的PluronicA衍生物混合。將1.5mg的氰基硼氫鈉加入到上述混合物中，從而減少在胺和醛基之間形成的希夫鹼。在4℃時，使該反應繼續進行12小時。使用凝膠過濾色譜法分離該反應的聚合產物，其中使用SephadexLH-20柱並使用90％的含水異丙醇作為洗脫液。將這樣獲得的共軛物稱作下文的「OligoA共軛物」。實施例17OligoA共軛物對病毒生成的作用將OligoA和Oligo共軛物分別溶於RPMI1640培養基(ICN生物醫學公司，CostaMesta，CA)，使最終濃度是0.2mM(以寡核苷酸的吸收度為基準)。然後通過0.22μm的濾器將這些標準溶液過濾，從而除去任何可能的細菌或真菌汙染。在37℃時，將單層Vero細胞與不同濃度的OligoA或OligoA共軛物一起在不含血清的RPMI1640中培養1小時。然後，用每個HSV-1(菌株L2(來自D.I.Ivanovskii病毒學研究所的病毒菌株保藏館，俄羅斯科學院，俄羅斯聯邦))。培養細胞的1個噬斑形成單位來感染上述單層細胞(同時仍受寡核苷酸影響)。該感染法已由Vinogradov等在BBRC，203959(1994)中進行了描述。在病毒和寡核苷酸處於試驗條件下8小時後，用含有10％FCS的新鮮培養基取代細胞上的培養基。在感染培養後的22和39小時，收集來自細胞的培養基，並且如(《病毒學》，實用方法，Mahy編輯，IRL出版社，牛津大學出版社，華盛頓特區，1985))中所述來測定所收集培養基中的病毒滴度。結果如下實施例18一種膦酸酯單體的合成在20℃時，將溶於50ml無水吡啶(Aldrich)的40毫摩爾丁二醇-1，3(Merck)與20毫摩爾的4，4-二對甲氧三苯甲基氯(Sigma)反應1.5小時。使用氯仿∶甲醇(95∶5)展開的矽膠板薄層色譜法來監測該反應。產品的Rf是0.6。將反應混合物加入到200ml8％的碳酸氫鈉水溶液中，並將產品用氯仿萃取。在真空中蒸發氯仿萃取物，將所得含油的一級中間產物用於下一步的合成。將12毫摩爾的一級中間產物溶於30ml的無水1，4-二噁烷(含有3.14ml(18毫摩爾)的二異丙基乙胺(Aldrich))中。在惰性氬氣中，將溶於10ml的無水1，4-二噁烷中的18毫摩爾的水楊基氯代亞磷酸酯(Sigma)加入到小量的二異丙基乙胺中。在20℃時，將反應混合物保溫1小時。用如上所述的薄層色譜法檢測該反應。產品的Rf是0.05。將10ml水加入到反應混合物中。30分鐘後，蒸發溶劑。將產品溶於100ml的氯仿，並將獲得的溶液用下列溶液進行分步洗滌(1)100ml的8％碳酸氫鈉水溶液，(2)100ml的0.2M三乙胺乙酸酯溶液(pH7.2)和(3)100ml的水。將有機溶劑蒸發，並使用(1)氯仿，(2)3％的甲醇氯仿溶液和(3)6％的甲醇氯仿溶液這樣的階式梯度方式，通過矽膠柱色譜法來純化含膦酸酯單體的油性殘餘物。單體的產量是4.1g(＝7.3毫摩爾，63％)。產品具有下列結構其中DMT代表二甲氧基三苯甲基，稱該產品為「膦酸酯單體A」。實施例19聚陽離子BDP的合成將溶於無水吡啶∶乙腈混合物(1∶1)的0.05M膦酸酯單體A溶液放入DNA合成儀(型號380-B02，應用的生物系統，CA)的第6位置上。將溶於乙腈∶吡啶(95∶5)混合物的2％adamantoilchloride(Sigma)溶液用作縮合劑。使用改進的程序將合成進行H-膦酸酯循環(Sinha和Striepeke《寡核苷酸和類似物》實用方法，Eckstein編輯，牛津，紐約-東京的IRL出版社，185頁，1991)，並在合成完成後將DMT基進行保護。將固定在一種標準CPG-500固相支持物上的腺苷(4μmoles)用作聚合物合成中的一級單元(Vinogradov等，BBRC，203，959(1994))。合成儀按規定程序將15個膦酸酯單體A重複單元加入到腺苷單體中。下面是所有的合成步驟在20℃時，用溶於無水吡啶∶CCl4(5∶1)混合物的104mg六亞甲基二胺的溶液使固定在底物上的H-膦酸酯基氧化15分鐘，然後，用吡啶∶乙腈混合物(1∶1)洗滌載體。通過氨解作用進行解封和除去封端劑(《寡核苷酸和類似物》實用方法，Eckstein編輯，牛津，紐約-東京的IRL出版社，1991)。通過HPLC將產物純化，其中使用SilasorbC16柱(9×250mm，Gilson，法國)並使用梯度濃度的乙腈(0-80％)。選擇含有二甲氧基三苯甲基化產物的峰，將溶劑蒸發並將殘餘物用80％的乙酸處理(20分鐘)。將乙酸蒸發並再次用HPLC將聚陽離子純化。15-鏈(以膦酸酯單體A為單位計)的產量是50％(2.2μmoles)。這樣就產生了通式A的一種聚合物。稱該聚合物為下文的「BDP」。實施例20聚氧乙烯-BDP二嵌段共聚物的固相合成使用聚乙二醇(1500M.W.，來自Fluka)(而不用丁二醇-1，3)，如實施例18中所述來合成二甲氧基三苯甲基-聚環氧乙烷-H-膦酸酯。除了將二甲氧基三苯甲基-聚環氧乙烷-H-膦酸酯用作最後的結構單元(在最後的鏈增長步驟時)以外，如實施例19中所述來合成聚陽離子。使用四亞甲基二胺(Sigma)(而不用六亞甲基二胺)來氧化嵌段共聚物的H-膦酸酯基，從而導致二胺和主鏈磷酸之間形成磷醯胺鍵。實施例21寡核苷酸-BDP二嵌段共聚物的固相合成在DNA合成儀中合成一種含有12鏈寡核苷酸和BDP聚合物的二嵌段共聚物，其中所述的12鏈寡核苷酸即5』-GGTTCCTCCTGU(OligoA，它與單純皰疹病毒1型)HSV-1(的早期mRNA剪接位點互補，見Vinogradov等，BBRC，203，959(1994))。首先，如實施例19中所述來合成BDP聚合物(除了不將它從支持物中分離以外)，然後，使用如Vinogradov等在BBRC，203，959(1994)中所述的標準亞磷醯胺化學法，在與固態支持物連接的BDP聚陽離子聚合物上逐級合成寡核苷酸鏈。用四亞甲基二胺(Sigma)(而不用六亞甲基二胺)，如實施例19中所述來氧化二嵌段共聚物的H-膦酸酯基。實施例22寡核苷酸-BDP二嵌段共聚物對病毒生長的作用除了使用(1)實施例21的寡核苷酸-BDP共聚物和(2)單一的寡核苷酸-BDP共聚物(共軛物)濃度(4μM)以外，本實驗完全如實施例17所述的進行實施例23HSV感染的增強用實施例9中所述的病毒，按0.1PFU/細胞感染複數來感染單層Vero細胞。將不同濃度的聚陽離子BDP(如實施例19中所述合成)加入到感染前的病毒中。在感染後24小時，在單層Vero細胞上測定病毒的感染滴度(PFU/ml)(實施例9)。將所有實驗都做三份。所測定感染滴度中的差異小於25％。本實驗的結果如下表示。細胞培養基中BDP的濃度，μM感染滴度，PFU/ml0(不含聚陽離子的病毒)2×10712×10722×10741×10887×108152×109權利要求1.一種多核苷酸組合物，其包含(a)多核苷酸或多核苷酸衍生物；和(b)高達約15％(w/v)的聚醚嵌段共聚物，它包含含有線性聚合片段的A型聚合片段和含有線性聚合片段的B型聚合片段，其中A型聚合片段的重複單元具有的平均Hansch-Leo片段常數約小於或等於-0.4具有的分子量在約30和約500之間，B型聚合片段具有的平均Hansch-Leo片段常數約大於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，在上述聚醚嵌段共聚物中，至少約80％連接各聚合片段的重複單元的鍵含有醚鍵。2.權利要求1的多核苷酸組合物，其中所述的嵌段共聚物選自嵌段共聚物A-B-A′，A-B，-B-A-B′和L(R1)(R2)(R3)(R4)(I)(II)(III)(IV)和其混合物，其中A和A′是A型線性聚合片段，B和B′是B型線性聚合片段，且其中R1，R2，R3和R4是(1)通式(I)、(II)或(III)的嵌段共聚物或(2)氫，且L是一種連接基團，條件是R1、R2、R3或R4中不超過兩個是氫。3.權利要求1的多核苷酸組合物，其中90％連接各聚合片段的重複單元的鍵含有醚鍵。4.權利要求1的多核苷酸組合物，其中各聚合片段的重複單元具有的分子量在約30和約100之間。5.權利要求4的多核苷酸組合物，其中90％連接各聚合片段的重複單元的鍵含有醚鍵。6.權利要求5的多核苷酸組合物，其中95％連接各聚合片段的重複單元的鍵含有醚鍵。7.權利要求6的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段B或B′的重複單元具有的Hansch-Leo片段常數約大於或等於-30。8.權利要求7的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段A或A′的重複單元具有的Hansch-Leo片段常數約小於或等於-0.4。9.權利要求1的多核苷酸組合物，其中各聚合片段的重複單元基本上由通式為-0-R5的重複單元組成，其中n是從0至約5的整數且R5是(1)-(CH2)n-CH(R6)-，其中n是從0至約5的整數且R6是氫；具有3-8個碳原子的環烷基；具有1-6個碳原子的烷基；苯基；烷基苯基，其中烷基具有1-6個碳原子；羥基；羥烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；具有1-6個碳原子的烷氧基；具有2-7個碳原子的烷基羰基；烷氧基羰基，其中烷氧基具有1-6個碳原子；烷氧基羰基烷基，其中烷氧基和烷基各自獨立地具有1-6個碳原子；烷基羧基烷基，其中每個烷基具有1-6個碳原子；氨烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；烷基胺或二烷基氨基，其中烷基各自獨立地具有1-6個碳原子；單或二烷基氨基烷基，其中烷基各自獨立地具有1-6個碳原子；氯；氯代烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；氟；氟代烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；氰基；氰烷基，其中烷基具有1-6個碳原子或羧基；(2)一種具有3-8個環碳原子的碳環基團，它可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺醯基，羥基，羧基，氟或氯取代基；或(3)一種具有3-8個環原子的雜環基團，它可以包括雜環烷基或芳香雜環基，可以包括1-4個選自氧、氮、硫和其混合物的雜原子，還可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺醯基，羥基，羧基，氟或氯取代基。10.權利要求9的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段B或B′的重複單元具有的Hansch-Leo片段常數約大於或等於-30。11.權利要求10的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段A或A′的重複單元具有的Hansch-Leo片段常數約小於或等於-0.4。12.一種多核苷酸組合物，其包含(a)多核苷酸或多核苷酸衍生物；和(b)具有聚醚片段和聚陽離子片段的共聚物，其中聚醚片段包括含有線性聚合片段的A型聚合片段，聚陽離子片段含有多個陽離子重複單元，所述A型聚合片段的重複單元具有的平均Hansch-Leo片段常數約小於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接聚醚片段的重複單元的鍵含有醚鍵。13.權利要求12的多核苷酸組合物，其中所述的共聚物含有以下通式的聚合物B-A-R，A-R，A-R-A′和R-A-R′，(V)(VI)(VII)(VIII)其中A和A′是A型線性聚合片段，B和B′是線性聚合片段，它們的單體具有的平均Hansch-Leo片段常數約大於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中對於各聚合片段來說，至少約80％的單體間的鍵含有醚鍵，且在上述通式中，R和R′是含有多個陽離子重複單元的聚合片段。14.權利要求13的多核苷酸組合物，其中R和R′在生理pH下含有至少3個帶正電荷的基團。15.權利要求14的多核苷酸組合物，其中R和R′在生理pH下含有至少12個帶正電荷的基團。16.權利要求15的多核苷酸組合物，其中R和R′在生理pH下含有多個間隔為約3埃至約12埃的帶正電荷的基團。17.權利要求16的多核苷酸組合物，其中多個陽離子重複單元是通式-NH-Ro-，其中Ro是2至6個碳原子的直鏈脂族基團，它可以被取代。18.一種多核苷酸組合物，其包含一種含有線性聚合物的多核苷酸衍生物，所述的線性聚合物含有核苷酸片段和聚醚片段，其中聚醚片段包括含有線性聚合片段的A型聚合片段，它的重複單元具有的平均Hansch-Leo片段常數約小於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接聚醚片段的重複單元的鍵含有醚鍵。19.權利要求18的多核苷酸組合物，其中所述的多核苷酸衍生物含有以下通式的聚合物A-pN，pN-A，A-pN-A′，pH-A-B，B-A-pN(IX-a)(X-a)(XI)(XII)(XIII)A-pN-R，R-A-pN，A-R-pN，pN-A-R，R-pN-A，pN-R-A(IX-b)(IX-c)(IX-d)(X-b)(X-c)(X-d)pN-A-B-A′，A-B-A′-pN，pN-B-A′-B′，B-A′-B′-pN(X-e)(X-f)(X-g)(X-h)pN-A-B-A′-pN，pN-B-A′-B′-pN(X-i)(X-j)其中pN代表一種具有5′至3′取向的多核苷酸，其中A和A′是A型線性聚合片段，其中B和B′是B型線性聚醚片段，它們的重複單元具有的平均Hansch-Leo片段常數約大於或等於-0.4且具有的分子量是在約30和約500之間，其中至少約80％連接聚醚片段的重複單元的鍵含有醚鍵，且在上述通式中，R和R′是含有多個陽離子重複單元的聚合片段。20.權利要求18的多核苷酸組合物，其中多核苷酸衍生物包含至少一種第二聚醚片段，它可以包括含有線性聚合片段的A型聚醚片段或B型聚醚片段，它們的重複單元具有的平均Hansch-Leo常數約大於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接B型聚醚片段的重複單元的鍵含有醚鍵。21.一種聚陽離子聚合物，其包含含有聚醚片段和聚陽離子片段的嵌段共聚物，其中所述的聚醚片段包括(a)(1)含有線性聚合片段的A型聚合片段或(2)含有線性聚合片段的B型聚合片段中的至少一種，其中A型聚合片段的重複單元具有的平均Hansch-Leo片段常數約小於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，B型聚合片段的重複單元具有的平均Hansch-Leo片段常數約大於或等於-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接上述兩種聚合片段中任何一種的重複單元的鍵含有醚鍵，和(b)一種聚陽離子片段，它含有多個通式為-NH-Ro-的陽離子重複單元，其中Ro是2至6個碳原子的直鏈脂族基團，它可以被取代。22.權利要求21的含有一種嵌段共聚物的聚陽離子聚合物，它包含以下通式的嵌段共聚物B-A-R，A-R，A-R-A′和R-A-R′，(V)(VI)(VII)(VIII)其中A和A′是A型線性聚合片段，B是B型線性聚合片段，且R和R′是含有多個通式為-NH-Ro-的陽離子重複單元的聚陽離子片段，其中Ro是2至6個碳原子的直鏈脂族基團，它可以被取代。23.一種聚陽離子聚合物，其包含多個以下通式的重複單元其中R8是(1)-(CH2)n-CH(R13)-，其中n是0至約5的整數且R13是氫，具有3-8個碳原子的環烷基，具有1-6個碳原子的烷基，或(CH2)mR14，其中m是從1至約12的整數且R14是6至20個碳原子的親脂取代基；(2)一種具有3-8個環碳原子的碳環基團，它可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺醯基，羥基，羧基，氟或氯取代基；或(3)一種具有3-8個環原子的雜環基團，它可以包括雜環烷基或芳香雜環基，可以包括1至4個選自氧、氮、硫和其混合物的雜原子，還可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺醯基，羥基，羧基，氟或氯取代基；R9是一種1至12個碳原子的直鏈脂族基團，且R10，R11和R12獨立地是氫，1-4個碳原子的烷基基團。全文摘要本發明提供了用於穩定多核酸並增加多核酸通過細胞膜且在細胞內起作用的能力的組合物。一方面,本發明提供了一種多核苷酸與某些聚醚嵌段共聚物之間形成的多核苷酸複合物。優選地,多核苷酸複合物進一步包括一種聚陽離子聚合物。另一方面,本發明提供了一種多核苷酸與含有一種聚醚嵌段和一種聚陽離子嵌段的嵌段共聚物之間形成的多核苷酸複合物。另一方面,本發明提供了在5′或3′末端共價修飾以結合聚醚聚合物片段的多核苷酸。另一方面,本發明提供了某些優選的聚陽離子聚合物。文檔編號A61K31/70GK1173128SQ95197357公開日1998年2月11日申請日期1995年11月17日優先權日1994年11月18日發明者A·V·卡巴諾夫,V·Y·阿拉科夫,S·V·維諾格拉鬥夫申請人:休普拉特克藥品有限公司