生化需氧量微生物傳感器敏感膜活化方法及自動活化裝置的製作方法
2023-12-06 13:18:11
專利名稱：生化需氧量微生物傳感器敏感膜活化方法及自動活化裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物傳感器，尤其是涉及一種可用於生化需氧量(BOD)微生物傳感器敏感膜的活化方法及其自動活化裝置。
背景技術：
生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand，BOD)是水質評價過程中最常用、最重要的指標之一。目前廣為採用的5日生化需氧量標準稀釋測定法是由美國公共衛生協會於1936年制定的標準方法。但是，傳統的測量方法不僅需要5天培養等耗時和複雜的操作步驟，而且測定的準確度與操作者的熟練程度及經驗有很大關係，無法實現對環境水樣的實時和在線監測。因此能夠滿足在線檢測需要的BOD微生物傳感器及相關儀器的研究受到人們的關注。BOD微生物傳感器的原理是基於微生物對有機物的耗氧代謝，測定BOD只涉及到初始氧化速率，因而可在10～15min內完成一個樣品的測定，大大縮短了測定所需的時間。已有的BOD微生物傳感器根據其二次傳感原理的不同可以分為兩種微生物膜氧電極法和微生物光化學傳感法。前者已被規定為我國水質生化需氧量(BOD)測定的行業標準(HJ/T86-2002)。
微生物菌膜是生化需氧量微生物傳感器的核心部件，通過將特定的微生物菌種在保持其生理機能的狀態下封入膜中製成。製成的微生物菌膜可在室溫乾燥條件保存，當天檢測任務完成後也要用該方法保存微生物菌膜。用上述方法保存的菌膜，其微生物處於休眠狀態，活性較低，在下次使用之前必須對微生物菌膜進行活化。行業標準中規定微生物菌膜的活化方法為將微生物菌膜放入0.005mol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中浸泡48h以上才能將其安裝在微生物傳感器上使用(HJ/T86-2002)。如果間斷測量時間超過7h，則應重新更換新的菌膜，新菌膜需活化48h後使用(國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》編委會，水和廢水監測分析方法，國家環境科學出版社，2002，232～233)。中科院長春應用化學研究所董紹俊等(董紹俊等，生化需氧量微生物傳感器的研究進展，分析化學，2005，5609～613)指出，生物膜在使用之前需在30℃恆溫條件下活化24～36h後，繼續在電極表面活化24h，使其信號值達到穩定。新膜的活化周期短於久置菌膜的活化周期，若活化菌膜的緩衝液含有一定濃度的有機物有利於縮短活化周期。文章中還提到將4℃下保存14個月的生物膜浸泡於PBS中活化50d後進行實驗，其活性約為原來的70％。由上述內容可見，微生物菌膜的活化是微生物傳感器快速測定法中不可缺少的一個步驟，同時與現有行業標準類似的微生物菌膜的保存和活化方法存在以下不足(1)耗時長，需要48h甚至幾天的時間。(2)菌膜在PBS活化後，需繼續安裝到電極表面活化，觀察信號穩定後才能使用，影響傳感裝置的使用和樣品的連續測定。(3)菌膜若數小時間斷使用，需換新膜並重新活化，影響測定的連續性及測定結果的重現性和穩定性。
關於BOD的微生物光化學傳感法，也有文獻報導使用葡萄糖-穀氨酸標準溶液(GGA)溶液來保存菌膜的方法。如Isao Karube(Isao Kambe et al.Biosensors Bioelectronics，2000，15371～376)在文章中提到新制的菌膜需用pH＝7的1mg/L GGA溶液浸泡預處理。Kwok-Yin Wong和Xi Chen(Kwok-Yin Wong et al.Sensors ActuatorsB.2005，2289～298；Xi Chen et al.Intern.J.Environ.Anal.Chem.2004，8607～617)主張把菌膜在4℃下，用100mg/L GGA溶液浸泡保存，以保持菌膜的活性。用GGA溶液浸泡保存菌膜的方法可以在一定程度上保存菌膜的活性，但並非使其活性保持在最佳狀態，固菌膜取出後還必須反覆浸泡和曝氣來進行活化。對於新制的膜，大概需要2～3d的時間進行活化，對於已使用過的膜需要約12h進行活化。這些工作都需在傳感器上手動完成，耗時、繁瑣，而且佔用傳感裝置，影響檢測的連續性和及時性。至今還未有專門用於生化需氧量(BOD)微生物傳感器的微生物傳感膜的自動活化裝置。
發明內容
本發明的目的在於針對現有的微生物傳感器敏感膜的活化方法存在的不足，提供一種用於生化需氧量(BOD)微生物傳感器敏感膜的活化方法，包括手動活化方法和自動活化方法及其自動活化裝置，以保證生化需氧量微生物傳感器對水樣的快速、實時和在線測定。
本發明所說的生化需氧量(BOD)微生物傳感器為一種光纖光化學BOD微生物傳感器。
本發明所說的光纖光化學BOD微生物傳感器敏感膜由透明片、氧傳感膜和菌膜組成，氧傳感膜設於透明片上，菌膜固定在氧傳感膜上。所說的菌膜最好為混菌膜。透明片選用光學玻璃片。
所說的葡萄糖-穀氨酸標準溶液(GGA溶液)為準確稱取分析純的葡萄糖和穀氨酸各0.0750g，用以上磷酸鹽緩衝溶液定容至100mL，配得的溶液稱為BOD值為1000mg/L的GGA溶液(國標方法)。
本發明所說的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的手動活化方法其步驟為1)用BOD值為50～200mg/L的葡萄糖-穀氨酸(GGA)溶液浸泡敏感膜，浸泡時間為5～60min，螢光信號逐漸增強，當螢光信號趨於穩定時，表明溶解氧的消耗與擴散達到動態平衡，此時可以進入下一步驟；2)排乾GGA溶液，讓敏感膜曝露空氣中，曝氣時間為1～5min，至螢光信號恆定；3)加入新的BOD值為50～200mg/L的葡萄糖-穀氨酸(GGA)溶液浸泡敏感膜，至達到新的動態平衡，動態平衡的標準同步驟1；4)重複進行浸泡-曝氣的步驟；5)經過5～30次活化後，敏感膜周化同一濃度GGA溶液的速度趨於穩定，表明該敏感膜已達到最佳響應活性平臺，可以用於實際水樣的檢測。
在步驟1)中，用葡萄糖-穀氨酸(GGA)溶液浸泡敏感膜，固定在敏感膜上的微生物同化GGA溶液中的有機物，同時消耗溶液中的溶解養，溶解氧來不及擴散到敏感膜周圍，造成敏感膜周圍局部缺氧，表現為螢光信號值逐漸增強，隨著螢光信號逐漸增強，當螢光信號趨於穩定時，表明溶解氧的消耗與擴散達到動態平衡，此時可以進入下一步驟。
在步驟3)中，加入新的葡萄糖-穀氨酸(GGA)溶液浸泡敏感膜，至達到新的動態平衡，動態平衡的標準同步驟1。
在步驟4)中，重複進行浸泡-曝氣的步驟，敏感膜同化同一濃度GGA溶液中的有機物，達到新的動態平衡所需的時間逐漸變短。
本發明所說的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化裝置設有水槽、泵、控制電路、活化槽、3根液位電極和電磁閥。泵置於水槽中，並通過管道與活化槽相連，活化槽設於水槽的上方，3根液位電極為基準電極、低液位電極和高液位電極，3根液位電極分別固定在活化槽的低、中和高液位上，用於控制液面高度，控制電路與泵、3根液位電極和電磁閥電聯接，用於控制泵的轉停、活化槽液面的高度及電磁閥的開閉，在活化槽側面設有溢流管，溢流管的另一端與水槽直接相連，在活化槽底部設導管，導管先通過電磁閥後再插入水槽，當電磁閥接通時，可將活化槽中的溶液排出。3根長短不均的液位電極用來控制溶液液面高度，其中最長的電極為基準電極，次長的電極為低液位電極，最短的電極為高液位電極；活化槽內部側面刻有寬度合適的凹道，用於固定敏感膜。
本發明所說的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化方法其步驟為1)往水槽中加入濃度為50～200mg/L的GGA溶液，並把泵浸入GGA溶液中；2)通過控制電路上的撥碼開關設定敏感膜的浸泡時間和曝氣時間，浸泡時間為5～60min，曝氣時間為1～5min；3)從冰箱中取出敏感膜，放入活化槽的卡槽中；
4)接通活化裝置電源；5)電磁閥處於閉合狀態，泵開始轉動，把水槽中的GGA溶液抽入活化槽中；6)液面開始上升，逐漸淹沒敏感膜，當液面上升到高液位電極處時，泵停止工作，敏感膜浸泡在GGA溶液中；7)當浸泡時間達到預先設定值後，電磁閥打開，GGA溶液回流到水槽中，液面開始下降，當液面與低液位電極底部相平時，電磁閥自動關閉，敏感膜曝露在空氣中，進行曝氣；8)當曝氣時間達到預先設定值後，泵又啟動，重複進行步驟5)～7)；9)新制的敏感膜在6～8h內可完成活化步驟，已用過的敏感膜活化需耗時2～4h，把活化好的敏感膜浸泡在50～200mg/L GGA溶液中，當天使用。
與現有的微生物傳感器敏感膜的活化方法和設備相比，本發明的突出優點和積極效果在於(1)使敏感膜的活化操作實現自動化，大大節省了人力和時間；(2)自動活化裝置的使用，與人工相比，大大提高了工作效率，在相同時間內可以進行更多次數的活化，從而縮短了活化所需的總時間，與行業標準規定的活化方法相比具有明顯的優勢；(3)活化裝置和傳感設備分體，活化操作不影響樣品的測定過程；(4)一次性可以進行多片膜的活化，使多片膜都處於最佳活性，方便於膜片的更換；(5)活化過程中敏感膜的浸泡時間、曝空時間及溶液進樣量都可調並可精確控制，保證了實驗的重現性和穩定性。
另外，生化需氧量(BOD)微生物傳感器微生物傳感膜的自動活化裝置的使用，可以使生化需氧量微生物傳感器所用的敏感膜處於活性良好的狀態，保證了生化需氧量微生物傳感器對水樣的快速、實時、在線測定，充分發揮出了生化需氧量微生物傳感器的特點。
圖1為本發明的敏感膜正面圖。
圖2為本發明的敏感膜側面圖。
圖3為本發明敏感膜的典型活化曲線，橫坐標為時間(t/min)，縱坐標為螢光信號值(I/mV)。
圖4為本發明敏感膜從休眠到最佳響應活性平臺的活化過程。
圖5為本發明實施例的自動活化裝置結構示意圖。
圖6為本發明實施例的自動活化裝置控制電路組成框圖。
圖7為本發明實施例的自動活化裝置控制電路原理圖。
具體實施例方式
以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
實施例1參見圖1和2，本發明所說的生化需氧量(BOD)微生物傳感器為一種光纖光化學BOD微生物傳感器。光纖光化學BOD微生物傳感器敏感膜由透明光學玻璃片1、氧傳感膜2和菌膜3組成，氧傳感膜2設於透明光學玻璃片1的上表面中間，菌膜3固定在氧傳感膜2上。菌膜3採用混菌膜。透明光學玻璃片1的尺寸為長6.5～7.0cm，寬2.0～3.0cm，氧傳感膜2和菌膜3的長寬均為2.0～3.0cm。
所說的葡萄糖-穀氨酸標準溶液(GGA溶液)為準確稱取分析純的葡萄糖和穀氨酸各0.0750g，用以上磷酸鹽緩衝溶液定容至100mL，配得的溶液稱為BOD值為1000mg/L的GGA溶液。
如圖3所示，本發明所說的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的手動活化方法的基本原理和具體步驟為1)用BOD值為50～200mg/L的葡萄糖-穀氨酸(GGA)溶液浸泡敏感膜一段時間，固定在敏感膜上的微生物會同化GGA溶液中的有機物，同時微生物的呼吸活性增強並消耗溶解氧，直至一段時間後達到新的動態平衡，微生物的呼吸活性趨於恆定(如圖3中a所示)。
2)排乾GGA溶液，讓敏感膜曝露空氣中一段時間，約1～5min(如圖3中b所示)。
3)加入新的GGA溶液浸泡敏感膜，微生物在溶液中開始新的呼吸作用直至達到動態平衡(如圖3中c所示)。
4)反覆進行浸泡-曝氣的步驟，微生物會逐漸從休眠狀態中復甦，從而使敏感膜的活性增強，表現為敏感膜同化同一濃度GGA溶液中的有機物，達到新的動態平衡所需的時間逐漸變短。
5)過數次活化後，敏感膜同化同一濃度GGA溶液的速度趨於穩定，表明該敏感膜已達到最佳響應活性平臺，可以用於實際水樣的檢測。
圖4所示為一片新制的BOD敏感膜的活化過程，對同一濃度GGA的響應，最初需要約20min，且響應曲線不平滑；經過約20次活化後，響應時間縮短到約2.5min，曲線平滑，響應速率基本穩定，達到了最佳響應活性平臺。此過程均由手動完成，耗費時間約12h。若換成已使用過的敏感膜，耗時會稍短，一般為4～6h。由此可見，與行業標準中規定的活化方法相比，此方法已經在很大程度上節省了時間。
實施例2本發明所說的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化方法其步驟為
往水槽中加入濃度為50～200mg/L的GGA溶液，並把泵浸入GGA溶液中；通過控制電路上的撥碼開關設定敏感膜的浸泡時間和曝氣時間，浸泡時間為5～60min，曝氣時間為1～5min；從冰箱中取出3～9片敏感膜，放入活化槽的卡槽中，接通活化裝置電源，電磁閥處於閉合狀態，泵開始轉動，把水槽中的GGA溶液抽入活化槽中；液面開始上升，逐漸淹沒敏感膜，當液面上升到高液位電極處時，泵停止工作，敏感膜浸泡在GGA溶液中；浸泡時間達到預先設定值後，電磁閥打開，GGA溶液回流到水槽中，液面開始下降，當液面與低液位電極底部相平時，電磁閥自動關閉，敏感膜曝露在空氣中，進行曝氣；當曝氣時間達到預先設定值後，泵又啟動，重複用GGA溶液浸泡敏感膜和曝氣步驟；新制的敏感膜在6～8h內可完成活化步驟，已用過的敏感膜活化需耗時2～4h，把活化好的敏感膜浸泡在50～200mg/L GGA溶液中，當天使用。
參見圖5，本發明所說的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化裝置設有水槽1、泵2、控制電路3、活化槽4，3根液位電極5～7和電磁閥8。泵2置於水槽1中，並通過橡皮管10與活化槽4的左端相連，活化槽4設於水槽1的上方。3根液位電極為基準電極5、低液位電極6和高液位電極7，3根液位電極5～7分別固定在活化槽4的低、中和高液位上，用於控制液面高度。控制電路3與泵2、3根液位電極5～7和電磁閥8電聯接，用於控制泵2的轉停、活化槽4液面的高度及電磁閥8的開閉。在活化槽4的右側面設有溢流管11，溢流管11的另一端與水槽1直接相連，在活化槽4底部設導管12，導管12先通過電磁閥8後再插入水槽1。當電磁閥8接通時，可將活化槽4中的溶液排出。3根長短不均的液位電極5～7用來控制溶液液面高度，其中最長的電極為基準電極5，次長的電極為低液位電極6，最短的電極為高液位電極7；活化槽4內部側面刻有寬度合適的凹道，用於固定敏感膜9。
如圖6所示，本發明所說的自動活化裝置的電路原理為液位檢測器U1檢測從液位傳感器WATER發出的液位信號；然後送入控制定時器U2，控制定時器中有浸泡時間預置器S1和曝空(即曝氣)時間預置器S2，分別用來預置敏感膜的浸泡時間和曝氣時間；控制定時器與泵驅動繼電器SSR1和閥驅動繼電器SSR2分別用來控制泵PUMP的轉停和閥VALVE的開閉；整個裝置通過一個供電電路來提供電源。
參見圖7所給出的一個電路實例，該例中利用晶振電路提供系統時鐘，並通過兩個撥碼開關S1、S2來實現對浸泡和曝氣時間的預置。該電路的信號流程為接通電源後系統初始化，關閉電磁閥VALVE啟動泵PUMP開始加液；當液位傳感器WATER檢測到高液位時，繼電器SSR1打開，關閉泵，並讀取撥碼開關S1設定的浸泡時間，計時開始；浸泡時間結束後，繼電器SSR2合上，打開電磁閥，開始排液；當檢測到低液位時，繼電器SSR2打開，關閉電磁閥，並讀取撥碼開關S1設定的爆氣時間，計時開始；爆氣時間結束後，繼電器SSR1合上，啟動泵開始加液；反覆進行以上步驟，實現自動活化過程。
在圖7中，各主要器件的型號和組成元件的參數如下晶片U1LM358型，U2AT89C2051型，U37805型；整流橋D1100V/2A型；固態繼電器SSR1，SSR2GTJ3/C型；撥碼開關S1，S25P/DIP型；無源晶振Y16MHz；電阻R1-R3，R6-R8500K，R9，R10200，R138.2K；電位器R4，R5200K；排阻RS1，RS210K；電容C1，C2，C6，C8-C100.1μ，C347μ，C4，C530P，E12200μ，E2220μ。
活化裝置的使用方法參見上述的活化工藝。
權利要求
1.用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的手動活化方法，所說的生化需氧量微生物傳感器為一種光纖光化學BOD微生物傳感器，光纖光化學BOD微生物傳感器敏感膜由透明片、氧傳感膜和菌膜組成，氧傳感膜設於透明片上，菌膜固定在氧傳感膜上，其特徵在於其步驟為1)用BOD值為50～200mg/L的葡萄糖-穀氨酸溶液浸泡敏感膜，浸泡時間為5～60min，螢光信號逐漸增強，當螢光信號趨於穩定時，表明溶解氧的消耗與擴散達到動態平衡，此時可以進入下一步驟；2)排乾葡萄糖-穀氨酸溶液，讓敏感膜曝露空氣中，曝氣時間為1～5min，至螢光信號恆定；3)加入新的BOD值為50～200mg/L的葡萄糖-穀氨酸溶液浸泡敏感膜，至達到新的動態平衡，動態平衡的標準同步驟1；4)重複進行浸泡-曝氣的步驟；5)經過5～30次活化後，敏感膜同化同一濃度葡萄糖-穀氨酸溶液的速度趨於穩定，表明該敏感膜已達到最佳響應活性平臺，可以用於實際水樣的檢測。
2.用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化裝置，其特徵在於設有水槽、泵、控制電路、活化槽、3根液位電極和電磁閥；泵置於水槽中，並通過管道與活化槽相連，活化槽設於水槽的上方；3根液位電極為基準電極、低液位電極和高液位電極，3根液位電極分別固定在活化槽的低、中和高液位上，用於控制液面高度，控制電路與泵、3根液位電極和電磁閥電聯接，用於控制泵的轉停、活化槽液面的高度及電磁閥的開閉；在活化槽側面設有溢流管，溢流管的另一端與水槽直接相連，在活化槽底部設導管，導管先通過電磁閥後再插入水槽，當電磁閥接通時，可將活化槽中的溶液排出。
3.如權利要求2所述的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化裝置，其特徵在於3根長短不均的液位電極用來控制溶液液面高度，其中最長的電極為基準電極，次長的電極為低液位電極，最短的電極為高液位電極。
4.如權利要求2所述的用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化裝置，其特徵在於活化槽內部側面刻有寬度合適的凹道，用於固定敏感膜。
5.用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化方法，其特徵在於其步驟為
1)往用於生化需氧量微生物傳感器敏感膜的自動活化裝置的水槽中加入濃度為50～200mg/L的葡萄糖-穀氨酸溶液，並把泵浸入葡萄糖-穀氨酸溶液中；2)通過控制電路上的撥碼開關設定敏感膜的浸泡時間和曝氣時間，浸泡時間為5～60min，曝氣時間為1～5min；3)從冰箱中取出敏感膜，放入活化槽的卡槽中；4)接通活化裝置電源，電磁閥處於閉合狀態，泵開始轉動，把水槽中的葡萄糖-穀氨酸溶液抽入活化槽中；5)液面開始上升，逐漸淹沒敏感膜，當液面上升到高液位電極處時，泵停止工作，敏感膜浸泡在葡萄糖-穀氨酸溶液中；6)當浸泡時間達到預先設定值後，電磁閥打開，葡萄糖-穀氨酸溶液回流到水槽中，液面開始下降，當液面與低液位電極底部相平時，電磁閥自動關閉，敏感膜曝露在空氣中，進行曝氣；7)當曝氣時間達到預先設定值後，泵又啟動，重複進行步驟5)～7)；8)新制的敏感膜在6～8h內可完成活化步驟，已用過的敏感膜活化需耗時2～4h，把活化好的敏感膜浸泡在50～200mg/L葡萄糖-穀氨酸溶液中，當天使用。
全文摘要
生化需氧量微生物傳感器敏感膜活化方法及自動活化裝置，涉及一種微生物傳感器，提供一種用於BOD微生物傳感器敏感膜的手動活化方法和自動活化方法及自動活化裝置，用手動方法時，用GGA溶液浸泡敏感膜至螢光信號穩定，排乾GGA溶液，敏感膜曝氣至螢光信號恆定；加入新GGA溶液浸泡敏感膜，至動態平衡，重複浸泡－曝氣步驟經多次活化。自動活化裝置設有水槽、泵、控制電路、活化槽、液位電極和電磁閥。用自動方法時，往水槽加GGA溶液，把泵浸入GGA溶液中；控制敏感膜的浸泡和曝氣時間，將敏感膜放入活化槽卡槽中；再把水槽中的GGA溶液抽入活化槽中，敏感膜浸泡在GGA溶液中，再曝氣後，重複浸泡和曝氣步驟。
文檔編號G01N33/18GK1824790SQ20051012996
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月16日 優先權日2005年12月16日
發明者陳曦, 肖來龍, 辛玲玲, 葉藝文, 範朝, 馬越超 申請人:廈門大學