一種黑楊花粉二倍體誘導方法
2023-12-06 20:06:51
專利名稱:一種黑楊花粉二倍體誘導方法
技術領域:
本發明涉及一種黑楊花粉誘導方法,尤其是一種黑楊花粉二倍體(2n)的誘導方法。
背景技術:
我國的楊樹栽培與育種實踐證明,黑楊(section Aigeiros)是我國楊樹人工林重要的造林樹種和育種親本資源,但是以利用種間雜交產生雜種優勢為核心的傳統黑楊改良育種方法經過了半個多世紀,單株材積超過對照親本的幅度小於50%(中國楊樹雜交育種研究進展.世界林業研究,李善文等,2004),已很難有更大的突破。要想進一步利用引進的黑楊資源,使其能在我國的工業用材林和環境保護林建設中發揮更大的作用就必須採用其它育種方法,將傳統育種方法與其它育種方法結合起來,才有可能產生突破性的進展。
Zhang,S.(A report of triploid populus of the section Aigeiros.Silvae Genetica,2004)報導在我國當前推廣的黑楊優良無性系中染色體計數檢查出有三倍體,這些三倍體當年生苗胸徑達5cm,樹高5m,生長很快。由於我國目前還沒有發現四倍體,他們推測這些三倍體是通過不減數的2n配子與正常的1n配子雜交而得到的。多倍體育種已在白楊派樹種的育種中獲得成功,我國選育的毛白楊雜種三倍體8年生時是當地普通二倍體毛白楊材積的2-3倍,國外15年生的歐美山楊三倍體是美洲山楊二倍體材積的2倍(毛白楊異源三倍體B301等無性系選育的研究,林業科學,朱之悌等,1995),可見培育多倍體是一條非常有效的途徑。利用不減數的2n花粉是培育植物多倍體的重要方法。因此,如何誘導出穩定且高產的2n花粉是培育黑楊多倍體的關鍵技術之一。
有關黑楊2n花粉的研究報導很少,前蘇聯Mashkina(Method of obtaining diploidpollen of woody species.Lesovedenie,1989)曾用高溫誘導過白楊的2n花粉,文獻中提到2n花粉比率高達94.4%,具體步驟包括在恆溫箱內溼度為30-40%的狀態下,用38-40℃高溫處理幾種楊樹及其雜種(P.balsamifera,P.alba,P.deltoids,P.alba×P.tremula)的雄花枝1.5-2h,之後在溫度18-20℃,空氣溼度為70-80%的條件下水培至花粉成熟。結果發現在花粉母細胞處於減數分裂的前期I,上述處理得到最高達94.4%的楊樹2n花粉。
但是,文獻中未指明對黑楊進行高溫誘導的效果,也沒有說明每花序的產粉量情況。本發明人在利用此方法對黑楊2n花粉誘導時,發現僅一次處理在粗線期得到90.25%的2n花粉,而且這些花粉粘連在乾癟的花葯內無法散出,只能將不開裂的花葯人為壓碎才能在顯微鏡下進行檢測,檢測中發現花葯內有許多是不正常的連體花粉。由於花芽經高溫誘導後不散粉或散粉量極少且所得2n花粉是不正常的連體花粉,所以難以滿足培育多倍體的需要。因此前蘇聯Mashkina的誘導方法不適用於黑楊2n花粉的誘導。
發明內容本發明的目的是針對以上問題提供一種誘導黑楊2n花粉的方法,該方法可獲得高比率且花粉量大的2n花粉,通過用所得2n花粉雜交,得到黑楊多倍體植株。
為了實現本發明目的,本發明方法採取的技術方案包括以下步驟1)於冬春季採集黑楊長花枝於室溫內水培;2)待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的細線期至終變期階段,向花芽內多次注射秋水仙鹼溶液;3)繼續水培花枝,直至花粉散出。
其中,注射的秋水仙鹼溶液的濃度為0.2-0.8%,優選0.4-0.8%;注射秋水仙鹼溶液的次數為4至5次,相鄰兩次注射間隔時間2至3小時。
採集的黑楊花枝長度為75-100cm,在室溫下水培,溫度優選15-25℃。特別是水培期間,每兩天將容器內的水更換一次,保持花枝下部培養用水清潔。
黑楊種類選自山海關楊、鑽天楊、歐美楊和群眾楊中的一種。
特別是,黑楊花枝浸入水中的高度一般是30-40cm。
本發明黑楊2n花粉誘導方法的優點是通過誘導,極大地提高了黑楊2n花粉的比率,實驗數據表明採用本發明方法誘導的黑楊,2n花粉比率達40%至95%,每花序的花粉產量是對照的0.32至2倍,誘導效果穩定。而同期天然的黑楊2n花粉比率一般低於5%。
與前蘇聯Mashkina(1989)誘導方法相比,本發明不僅顯著地提高了黑楊2n花粉的比率,而且能夠收到正常散出的花粉,因此更適用於培育多倍體的雜交授粉。
具體實施方式下面通過實施例詳細描述本發明方法。
實施例一至六為誘導山海關楊花粉的實施例。
實施例一1.於1月20至2月20日採集山海關楊雄花枝,在溫度為20℃的溫室內水培,水培期間,每兩天將容器內的水更換一次,保持花枝下部培養用水清潔;2.待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的細線期,向花芽內注射濃度為0.8%的秋水仙鹼溶液,注射次數4次,相鄰兩次注射間隔時間3小時。
3.繼續水培花枝,直至花粉散出。
誘導效果是2n花粉比率為87.4%,每花序散粉量是對照的0.41倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
採取以下步驟對2n花粉比率進行檢測在顯微鏡下統計2000粒花粉中花粉直徑大於40μm的花粉所佔比率。直徑大於40μm花粉的DNA含量是直徑小於40μm花粉的2倍。所有花粉均採用這一標準方法進行統計。
採用以下公式計算相對花粉量相對花粉產量=各種誘導處理後的每序花粉產量/對照的每序花粉產量。
對照花粉是同時同批在溫室水培的花枝上採集的,與誘導處理花枝的唯一區別就是沒有進行秋水仙鹼溶液誘導。
每花序散粉量的檢測方法是每處理收集25個花序的花粉稱重,除以花序數。
實施例二除了待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的粗線期向花芽內注射秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為59.15%,每花序散粉量是對照的0.62倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例三除了待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期,向花芽內注射秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為50.20%,每花序散粉量是對照的0.38倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例四除了待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期,向花芽內注射濃度為0.6%的秋水仙鹼溶液,注射次數5次,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為40.53%,每花序散粉量是對照的0.37倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例五除了待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期,向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為40.22%,每花序散粉量是對照的0.44倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例六除了待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期,向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為43.15%,每花序散粉量是對照的0.36倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例七至十二為誘導鑽天楊花粉的實施例實施例七除了採集鑽天楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期,向花芽內注射濃度為0.2%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為55.67%,每花序散粉量是對照的0.32倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例八除了採集鑽天楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為40.73%,每花序散粉量是對照的0.35倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例九除了採集鑽天楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為40.61%,每花序散粉量是對照的0.32倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十除了採集鑽天楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.6%的秋水仙鹼溶液外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為40.23%,每花序散粉量是對照的0.53倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十一除了採集鑽天楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.6%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為40.47%,每花序散粉量是對照的0.48倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十二除了採集鑽天楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為42.44%,每花序散粉量是對照的0.41倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十三至十九為誘導歐美楊花粉的實施例實施例十三除了採集歐美楊花枝,向花芽內注射濃度為0.5%的秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為4小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為62.02%,每花序散粉量是對照的1.00倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十四除了採集歐美楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的粗線期向花芽內注射濃度為0.5%的秋水仙鹼溶液外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為41.80%,每花序散粉量是對照的0.67倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十五除了採集歐美楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為57.94%,每花序散粉量是對照的0.62倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十六除了採集歐美楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.5%的秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為66.41%,每花序散粉量是對照的1.63倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十七除了採集歐美楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為48.61%,每花序散粉量是對照的1.02倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十八除了採集歐美楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次,相鄰兩次注射間隔時間為2次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為52.38%,每花序散粉量是對照的0.55倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例十九除了採集歐美楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽內注射濃度為0.2%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為95%,每花序散粉量是對照的2倍,對照花粉中檢測到4.91%的2n花粉。
實施例二十至二十四為誘導群眾樣花粉的實施例實施例二十除了採集群眾楊花枝,向花芽內注射濃度為0.6%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次,相鄰兩次注射的間隔時間為4小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為41.28%,每花序散粉量是對照的0.32倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例二十一除了採集群眾楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽向花芽內注射秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為70.62%,每花序散粉量是對照的0.39倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例二十二除了採集群眾楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽向花芽內注射濃度為0.6%的秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為62.10%,每花序散粉量是對照的0.86倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例二十三除了採集群眾楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,相鄰兩次注射間隔時間為2小時外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為42.36%,每花序散粉量是對照的0.58倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實施例二十四除了採集群眾楊花枝,待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的終變期向花芽向花芽內注射濃度為0.4%的秋水仙鹼溶液,注射次數為5次外,其餘均與實施例一相同。
誘導效果是2n花粉比率為43.95%,每花序散粉量是對照的0.32倍,對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
儘管各實施例中的溫室溫度設為20℃,但是本領域的普通技術人員可以理解該溫度可取15-25℃範圍內的任意值。
權利要求
1.一種黑楊花粉二倍體的誘導方法,其特徵在於包括以下步驟1)於冬春季採集黑楊長花枝於室溫內水培;2)待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的細線期至終變期階段,向花芽內多次注射秋水仙鹼溶液;3)繼續水培花枝,直至花粉散出。
2.如權利要求
1所述的方法,其特徵在於所述步驟2)中使用的秋水仙鹼溶液的濃度為0.2-0.8%。
3.如權利要求
2所述的方法,其特徵在於所述秋水仙鹼溶液的濃度為0.4-0.8%。
4.如權利要求
1至3任一所述的方法,其特徵在於所述步驟2)中注射秋水仙鹼溶液的次數為4-5次。
5.如權利要求
4所述的方法,其特徵在於所述次數為5次。
6.如權利要求
1至3任一所述的方法,其特徵在於相鄰兩次注射間隔時間為2-3小時。
7.如權利要求
4所述的方法,其特徵在於相鄰兩次注射間隔時間為2-3小時。
8.如權利要求
1至3任一所述的方法,其特徵在於所述黑楊種類選自山海關楊、鑽天楊、歐美楊和群眾楊中的一種。
9.如權利要求
1至3任一所述的方法,其特徵在於所述步驟1)中使用的黑楊浸入水中的高度是30-40cm。
10.如權利要求
1至3任一所述的方法,其特徵在於所述步驟1)中採集花枝的時間為1-2月,所述的室溫為20±5℃。
專利摘要
本發明公開了一種黑楊花粉二倍體的誘導方法,包括以下步驟1)於冬春季採集黑楊長花枝於室溫內水培;2)待花枝上的雄花芽發育至減數分裂的細線期至終變期階段,向花芽內多次注射秋水仙鹼溶液;3)繼續水培花枝,直至花粉散出,其中注射的秋水仙鹼溶液的濃度為0.2-0.8%,注射次數為4-5次,相鄰兩次注射間隔時間為2-3小時。通過本發明的誘導方法,極大地提高了黑楊2n花粉的比率,實驗數據表明採用本發明方法誘導的黑楊,2n花粉比率達40%至95%,每花序的花粉產量是對照的0.32至2倍,誘導效果穩定。
文檔編號A01G1/00GK1994066SQ200610169680
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日
發明者張金鳳, 續九如, 衛尊徵, 王麗華, 康向陽, 陳曉陽, 張志毅, 李雲, 胡冬梅 申請人:北京林業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan