一種洞穴動球菌及其應用的製作方法

2023-12-05 00:12:42

本發明屬於微生物
技術領域：
，具體涉及一種洞穴動球菌。同時，本發明還涉及所述洞穴動球菌的應用。
背景技術：
：微生物種類豐富，長期以來，人們利用純培養技術對環境中的微生物進行調查研究和開發利用。隨著科學技術的發展，微生物資源在科技研究及生物產業中的重要性日益凸顯。世界上許多國家都在搜集、保存各種微生物資源，其不斷豐富將為我國生物技術的發展奠定堅實的物質基礎。加香加料是捲菸工藝中的關鍵環節，是有效提升捲菸抽吸品質，形成捲菸特有風格的有效手段之一。目前我國菸草中添加的煙用香料大多是採用傳統方法萃取再加以調配所得，雖然生產操作簡單，但也存在香氣單調、改善捲菸抽吸效果不明顯等缺點。利用微生物對香原料進行發酵，可以增加傳統提取香料中多種香氣物質的含量，提升香氣豐富性。而現有工業產香微生物存在種類固化，發酵香料類型有限等問題，迫切需要尋找並篩選新的能夠發酵產生特殊香氣的微生物菌株，以拓展煙用香料的豐富性，滿足捲菸生產需求。國內外菸草工作者在利用微生物發酵生產煙用香料方面已經做了很多工作，但多限於產香酵母。本發明提供的洞穴動球菌為首次被分離得到，經鑑定為微生物新種，目前未有任何關於所述洞穴動球菌及相關應用的公開報導。技術實現要素：本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種洞穴動球菌。本發明的目的還在於提供所述洞穴動球菌的應用。本發明通過以下技術方案實現上述目的。一種洞穴動球菌，分類命名為洞穴動球菌(kineococcuscavernaesp).sysuzl-1，該菌株於2016年12月9日保藏於中國典型培養物保藏中心cctcc，保藏編號m2016738。所述的洞穴動球菌sysuzl-1的16srrna基因核苷酸序列如序列表所示。所述的洞穴動球菌sysuzl-1在大多數培養基上生長良好，基內菌絲紅褐色到棕色。明膠液化、牛奶凝固、腖化呈陽性，澱粉水解、硝酸還原呈陰性，不產生硫化氫，形成黑色素。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸鈉。細胞壁含有l-二氨基庚二酸和甘氨酸。所述的洞穴動球菌sysuzl-1從雲南省石林縣印象煙莊煙田相鄰近的喀斯特洞穴土壤中分離得到，固體培養過程中，發現絕大部分的微生物具有產生揮發性物質的能力，經液體發酵後產生的氣息明顯不同。在獲得的純培養分離菌株中，篩選得到可在含有簡單碳氮源的培養基上產生揮發性、且為特殊香味氣息的菌株sysuzl-1。所述的洞穴動球菌sysuzl-1具有產生特殊香氣的功能，gc-ms鑑定結果顯示，菌株sysuzl-1能夠產生幾類主要揮發性化合物，苯甲醛及土味素、欖香烯、欖香醇、a-桉葉醇。因此可以用於發酵製備煙用香料的工業生產中，對拓展煙用香料的豐富性，滿足捲菸生產需求具有良好的應用前景。利用所述洞穴動球菌sysuzl-1發酵製備煙用香料的優選方法，將洞穴動球菌sysuzl-1經擴大培養後接種於發酵培養基中，28℃搖瓶培養6d後，進行回流提取，過濾除渣，將上清液減壓濃縮得到所需煙用香料。該香料具有十分特殊的香氣，能夠強化捲菸風格，豐富煙香，使香氣更加圓潤飽滿。本發明的有益效果是：從煙田相鄰近的喀斯特洞穴土壤中分離得到的純培養菌株中，篩選得到可在含有簡單碳氮源的培養基上產生揮發性，且為特殊香味氣息的菌株sysuzl-1。經過微生物學特性分析和16srrna基因序列分析表明該菌株是一種新的細菌。該菌株能夠產生苯甲醛及土味素、欖香烯、欖香醇、a-桉葉醇等幾類主要揮發性化合物。其中，苯甲醛具有香味氣息，微生物中較常見，但產量不高；土味素為放線菌產生的常見化合物，本身有腥味。欖香烯具有抑制癌細胞的作用，是目前一類上市抗癌藥中的主要成分，具有較高經濟價值，特別是微生物自主代謝產生。欖香醇常用作香精原料。桉葉醇本身具有一定香味，且可做定香劑來使用。利用該菌株發酵，能夠得到特殊香氣的煙用香料，所得香料具有強化捲菸風格，豐富煙香，圓潤煙氣的作用，並且具有抗細菌及真菌的活性，效果穩定而持久。此外，該菌株還具有開發新型、高效、無毒天然藥物的巨大潛力。保藏生物材料的說明本發明的菌株，已於2016年12月9日，保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，該中心地址：中國湖北省武漢市武昌區八一路珞珈山武漢大學內，該菌株分類命名為：洞穴動球菌(kineococcuscavernaesp)sysuzl-1，保藏編號cctccno：m2016738。附圖說明圖1為本發明的洞穴動球菌在r2a培養基上的顯微和電鏡照片。圖2為本發明的洞穴動球菌及部分相關菌株依據16srrna基因序列構建的系統發育樹。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不是對本發明技術方案的限定。實施例1——洞穴動球菌sysuzl-1的分離於雲南省石林縣印象煙莊煙田相鄰近的喀斯特洞穴中取土壤樣品，塑膠袋密封帶回，4℃保存待用。準確稱取10g土樣，加入90ml無菌水，30℃、180rpm搖床振蕩30min。用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度，分別取0.2ml塗布於lb平板培養基上，每個設3個重複。在30℃培養48h後，從每份土樣的平板上挑取不同單菌落，在相應固體培養基上純化後按菌液體積20％加入甘油、置於-80℃冰箱保存備用。將分離得到的微生物分別接種於lb液體培養基中，於30℃、160rpm搖床振蕩培養，細菌培養過夜至菌液濃度為od＝2.0，作為種子液備用。將每一待測菌株的種子液按1％接種在篩選培養基中，於30℃、160rpm搖床振蕩培養3-5天，每天觀察發酵液外觀和香氣特徵變化情況，篩選得到能夠產生特殊香味氣息的微生物，編號sysuzl-1。實施例2——洞穴動球菌sysuzl-1的鑑定分離純化的sysuzl-1進行形態學、生理生化及分子生物學鑑定。將sysuzl-1分類命名為洞穴動球菌(kineococcuscavernaesp.nov.)。sysuzl-1在r2a培養基上的顯微和電鏡照片見附圖1。sysuzl-1在大多數培養基上生長良好，基內菌絲紅褐色到棕色。明膠液化、牛奶凝固、腖化呈陽性，澱粉水解、硝酸還原呈陰性，不產生硫化氫，形成黑色素。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸鈉。細胞壁含有l-二氨基庚二酸和甘氨酸。(表1-3)表1sysuzl-1的培養特徵表2sysuzl-1的生理生化特徵表3sysuzl-1的碳氮源利用情況碳源利用結果碳源或氮源利用結果葡萄糖+蜜二糖+半乳糖+甜醇+果糖+甘油+蔗糖肌醇-阿拉伯糖-甘露醇+木糖+山梨醇+棉子糖+醋酸鈉+鼠李糖+sysuzl-1的16srrna序列見序列表所示。該序列與genbank資料庫中的已知序列進行blast比較分析，並從資料庫獲得相關種屬的16srrna基因序列，構建系統發育樹，見於圖2。經比較分析發現，本發明的洞穴動球菌與菌株(kineococcusradiotoleranssrs30216t)親緣關係最近，洞穴動球菌的16srrna基因序列與kineococcusradiotoleranssrs30216t有99.03的同源性，且dna-dna雜交值低於<70％，在系統進化樹上形成獨立的分枝。因此，綜合形態、生理生化、細胞化學和系統進化分析等特徵，洞穴動球菌與動球菌屬參考菌株kineococcusradiotoleranssrs30216t有明顯差異，表明本發明的洞穴動球菌是一個新物種，命名為kineococcuscavernaesp.nov.sysuzl-1在genbank資料庫的16srrna基因序列登錄號ky593935。中國武漢大學專利保藏中心菌種保藏號為m2016738。sysuzl-1及部分相關菌株依據16srrna基因序列構建的系統發育樹見附圖2。實施例3——洞穴動球菌sysuzl-1在發酵製備煙用香料中的應用上述篩選出的洞穴動球菌sysuzl-1在發酵生產煙用香料中的應用，具體步驟如下：(1)斜面培養：培養基：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白腖0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性澱粉0.5g；丙酮酸鈉0.3g；磷酸氫二鉀0.3g；硫酸鎂0.05g；瓊脂15g；蒸餾水1000ml，ph7.2；培養溫度為28℃，培養時間為7d。(2)種子培養：從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養36小時。種子培養基：糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，ph7.2，培養溫度為28℃。(3)發酵培養：按10％的接種量接到發酵培養基中，搖瓶培養6d。培養基：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白腖3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，ph7.2，培養溫度為28℃，培養時間為6d。將發酵液進行回流提取，過濾除渣，將上清液減壓濃縮得到所需煙用香料。該香料為不澄清棕色液體，將其按0.2‰的量加入到捲菸菸絲中，對照組加入等量蒸餾水。將處理組和對照組的菸絲放入恆溫恆溼箱內，在溼度60％±2，溫度22℃±2條件下平衡24h後，製成捲菸。由評吸專家組成的評吸小組進行感官評吸。該香料具有十分特殊的香氣，能夠強化捲菸風格，豐富煙香，使香氣更加圓潤飽滿，並且具有抗細菌及真菌的活性，效果穩定而持久(表4，表5)。表4sysuzl-1發酵香料的理化指標序號檢測項目sysuzl-1發酵香料1酸值12.232相對密度d20201.16313折光指數nd201.42564乙醇中的溶混度(25℃)1體積樣品在1-20體積50％-70％的乙醇溶液中溶解稍好5揮發成份總量(％)43.46澄清度不澄清7xds未檢出8hzs未檢出表5sysuzl-1發酵香料的感官評吸表洞穴動球菌sysuzl-116srrna1tggctcaggacgaccgctggcggcgtgcttacacatgcaagtcgaacggtgaagcccttc61ggggtggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgcccctggctctggga121caaccactggaaacggtggctaataccggatacgacctaccaccgcatggtgtgtgggtg181gaaagtttttcggctggggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcc241taccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagac301acggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctg361atgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagctccga421agaagcgcaagtgacggtaggagcagaagaagcaccggctaactacgtgccagcagccgc481ggtaatacgtagggtgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcgg541tgtgtcgcgtctgctgtgaaaactcagggctcaactctgagcttgcagtgggtacgggca601cacttgagtgctgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatc661aggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagttactgacgctgaggagcgaaa721gcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcgcta781ggtgtggggtccattccacggattccgtgccgcagctaacgcattaagcgccccgcctgg841ggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcgga901gcatgcggattaat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