檢測豬藍耳病病毒抗體的elisa試劑盒的製作方法

2023-12-04 19:24:21 4

檢測豬藍耳病病毒抗體的elisa試劑盒的製作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種檢測豬藍耳病病毒抗體的ELISA試劑盒。該試劑盒包括：以純化的重組N蛋白作為包被抗原的ELISA板條、樣品稀釋液、酶標兔抗豬抗體、底物A液、底物B液、終止液、豬藍耳病病毒陽性血清、豬藍耳病病毒陰性血清、濃縮洗滌液。本實用新型試劑盒採用間接酶聯免疫吸附試驗的原理來檢測豬藍耳病病毒的抗體。檢測時，在相應的反應孔中加入陰陽對照和待測樣品，若樣品中含有特異性抗體，則與吸附板孔表面的抗原結合形成抗原抗體複合物，反之則不能結合，加入酶標抗體，酶催化底物反應呈現藍色，顏色深淺與樣品中抗體的含量成正相關。
【專利說明】檢測豬藍耳病病毒抗體的ELISA試劑盒

【技術領域】
[0001]本實用新型屬於動物病毒性疾病監測和診斷試劑研製領域，具體涉及一種檢測豬藍耳病病毒抗體的ELISA試劑盒。

【背景技術】
[0002]豬藍耳病又叫豬繁殖與呼吸症候群(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome,PRRS ),是二十世紀八十年代出現的嚴重危害養豬業的一種傳染病。該病的主要特徵是引起妊娠母豬的早產、流產、死胎、木乃伊胎及產弱仔豬，仔豬主要表現為咳嗽、呼吸困難、呼吸急促。1987年美國首先報導了該病的發生，隨後加拿大、德國、荷蘭等國家及地區也相繼爆發了該病。
[0003]本病的病原體是豬繁殖與呼吸症候群病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus ;PRRSV), PRRSV 由荷蘭學者 Wensvoort 於 1991 年首次分離並鑑定，命名為Lelystad病毒(LV)。1992年美國首次分離到一株PRRSV，並命名為VR2332。現在，本病在世界各養豬國家、地區都有發生，已越來越多地引起人們的關注。我國於1996年首次報導有該病的發生。我國是世界養豬大國，本病在我國發生、流行的現狀不容樂觀。
[0004]豬繁殖與呼吸症候群自出現至今，關於本病診斷方法與研究成果不斷湧現。應用最為廣泛的是以全病毒作為包被抗原建立的ELISA方法，即美國IDEXX公司ELISA試劑盒。由於病毒需由細胞培養物中大量增殖，而真正意義上的純化病毒很難獲得，該試劑盒的檢測費用過高使其推廣和應用受到限制。編碼核衣殼蛋白的N基因在兩個基因型中相當保守，當豬受到PRRSV侵襲後，機體最先產生的抗體便是針對病毒核衣殼蛋白的。本公司通過前期研究已經表達得到純化重組N蛋白，但是還沒有利用蛋白建立檢測豬繁殖與呼吸症候群抗體的ELISA試劑盒及其檢測方法的技術。
實用新型內容
[0005]本實用新型的目的是提供一種檢測豬繁殖與呼吸症候群抗體的ELISA試劑盒，用於豬繁殖與呼吸症候群抗體的檢測，試劑盒特異性好、敏感性高，檢測成本低廉，適於推廣。在本病的抗體水平檢測、流行病學調查、類症鑑別及採取有效防制措施方面提供重要方法。
[0006]本實用新型的技術方案是:本試劑盒是採用間接酶聯免疫吸附試驗(Indirect-ELISA)的原理來檢測PRRSV的抗體。檢測時，在相應的反應孔中加入陰陽對照和待測樣品，若樣品中含有特異性抗體，則與吸附板孔表面的抗原結合形成抗原抗體複合物，反之則不能結合。洗滌後，加入酶標抗體，酶催化底物反應呈現藍色，顏色深淺與樣品中抗體的含量成正相關。
[0007]為此，本實用新型提供了一種檢測豬繁殖與呼吸症候群抗體的ELISA試劑盒，包括盒體、放置試劑的下凹瓶位、96孔酶標板、8瓶試劑和一張蓋板膜。其中，酶標板是採用96孔試劑板作為固相載體，在酶標板微孔中包被重組N蛋白製成的檢測板，8瓶試劑分別為濃縮洗滌液、樣品稀釋液、底物A液、底物B液、酶標兔抗豬抗體、終止液、豬繁殖與呼吸症候群陽性血清、豬繁殖與呼吸症候群陰性血清，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致。盒體是硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫製成，蓋板膜是塑料硬膜。酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔包被重組N蛋白；濃縮洗滌液I瓶，70mL ;樣品稀釋液I瓶，120mL ;酶標兔抗豬抗體I瓶，60mL ;底物A液I瓶，30mL ;底物B液I瓶，30mL ;終止液I瓶，60mL ;豬繁殖與呼吸症候群陽性血清I瓶，2mL ;豬繁殖與呼吸症候群陰性血清I瓶，2mL。
[0008]經實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度，相對於其他豬繁殖與呼吸症候群抗體檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，且所需儀器同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。
[0009]本實用新型的有益效果是:能快速、簡便、靈敏、準確地用於豬繁殖與呼吸症候群抗體的檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本實用新型酶標板的側面縱剖面圖(長為8.55cm)；
[0011]圖2為本實用新型酶標板的側面橫剖面圖(長為12.8cm)；
[0012]圖3為本實用新型酶標板的俯視圖；
[0013]圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；
[0014]圖5為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；
[0015]圖6為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。

【具體實施方式】
[0016]實施例1:試劑盒組裝
[0017]參見附圖:酶標反應微孔條(2)上具有包被重組N蛋白的反應微孔(3)，固定於酶標板的外框支撐架(I)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用於酶標板置恆溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2);塑料泡沫模具(5)有8個瓶位，放置位置依次為:2mL豬繁殖與呼吸症候群陽性血清瓶位(6)，2mL豬繁殖與呼吸症候群陰性血清瓶位(7)，70mL濃縮洗滌液瓶位(8)，30mL底物A液瓶位(9)，30mL底物B液瓶位(10)，60mL酶標兔抗豬抗體工作液瓶位(ll)，60mL終止液瓶位(12)，120mL樣品稀釋液瓶位(13)，盒體(14)為是硬紙盒。
[0018]實施例2:試劑盒各材料製備
[0019]1、酶標抗體的製備
[0020](I)稱取辣根過氧化物酶(HRP)2 mg溶解於0.5 mL水中，加入0.5 mL 0.06 mol/L Na14溶液，4°C避光作用30 min ；
[0021](2)加入 160 mmol/L 的乙二醇 0.5mL,室溫作用 30 min ；
[0022](3)加入兔抗豬抗體2 mg，混勻後裝入處理過的透析袋中，置1000 mL的0.05mmol/L碳酸鈉緩衝液中透析，4°C過夜；
[0023](4)透析液吸至10 mL的離心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混勻後置4°C 2h ；
[0024](5)加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4°C作用30 min後4°C下3000 r/min離心25min,棄上清；
[0025](6)將沉澱溶於1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋內，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4°C過夜(中途更換PBS 3次)；
[0026](7)將透析袋中液體吸至微量離心管中，4°C下10000r/min離心30min,將上清液吸出，加等量甘油，混勻，_20°C保存備用。
[0027]2、包被有重組N蛋白的酶標板及其製備
[0028](I)用0.05M的碳酸鹽溶液將重組N蛋白稀釋至2.5ng/mL，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔ΙΟΟμ L，37°C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次10s，拍幹，然後在每孔中加入150 μ L封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。
[0029](2)包被緩衝液:pH9.6,0.05mol/L的碳酸鈉緩衝液；
[0030](3)封閉液:每I升封閉液按照如下方法配製:將5mL馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩衝液溶解並定容至100mL,得到封閉液；其中，磷酸鹽緩衝液的濃度為 0.02M, pH 值為 7.2。
[0031]實施例3:樣本的前處理
[0032]1、配液:
[0033]洗滌工作液:用去離子水將20X濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用於酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環境可保存一個月。
[0034]2、豬血清或血漿樣品處理:
[0035](I)樣品製備:取豬血，按常規方法製備血清或血漿，要求清亮無溶血；
[0036](2)用樣品稀釋液在血清稀釋板或離心管中將豬血清或血漿按1:40 (I份豬血清或血漿+39份樣品稀釋液)稀釋，混勻；
[0037](3 )取100 μ L進行檢測。
[0038]注:稀釋係數:40 ;陰性對照和陽性對照無須稀釋。
[0039]實施例4:使用試劑盒的操作步驟
[0040]1、酶標板上對照和待測樣品添加模式如附圖所示；
[0041]附圖酶標板上對照和待測樣品添加模式
[0042]I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AX SI S 2 S3 S 4
3X
CP
DP
F
?rr
[0043]注:N-表示加陰性對照；P-表示加陽性對照；SI，S2, S3, S4等表示加各種被檢樣品。
[0044]2、在Al和BI抗體包被孔中加入陰性對照100 μ L ;在Cl和Dl抗體包被孔中加入陽性對照10yL;
[0045]3、在各樣品孔中加入處理好的被檢樣品100 μ L ;
[0046]4、蓋上蓋板膜，於37 °C恆溫培養箱下，孵育30 min ；
[0047]5、開蓋板膜，甩去孔內液體，用洗滌工作液洗滌酶標板，300 μ L/孔，洗滌4次，拍幹;
[0048]6、立即在各孔中加入酶標抗體，100 μ L/孔；
[0049]7、蓋上蓋板膜，於37 °C恆溫培養箱下，孵育30 min ；
[0050]8、揭開蓋板膜，甩去孔內液體，用洗滌工作液洗滌酶標板，300 μ L/孔，洗滌4次，拍幹;
[0051 ]9、將底物A液與底物B液按1:1混合，加入孔中，100 μ L/孔，蓋上蓋板膜，室溫(25士 2 0C)下，避光反應15 min ；
[0052]10、揭開蓋板膜，每孔中加入100 μ L終止液；
[0053]11、在酶標儀上讀取OD65tl值(應在加入終止液後5 min內完成讀數)。
[0054]實施例5:結果判定
[0055]1、NC值〈0.200且0.500 < PC值彡2.000，試驗結果才有效。否則，應進行重複試驗。
[0056]2、如果被檢樣品孔OD值〈0.45，說明樣品中無豬繁殖與呼吸症候群病毒抗體；如果被檢樣品孔OD值>0.45，說明樣品中有豬繁殖與呼吸症候群病毒抗體。
[0057]實施例6:注意事項
[0058]1、本品僅供體外檢測使用。
[0059]2、不同批號試劑盒中的組份不可混用。
[0060]3、勿使用過期的試劑盒，已開封的組份應在有效期內使用。
[0061]4、在每次使用時，酶標板上均應分別設立陽性對照和陰性對照各2孔。
[0062]5、必須使用符合藥典規定的水(如蒸餾水、去離子水或純水)稀釋洗滌液。
[0063]6、試劑盒各組份在使用前應預先平衡至室溫(25±2°C)，否則將直接影響實驗結果O
[0064]7、末使用的酶標板應放回鋁箔袋並封口，2?8 °C保存。
[0065]8、應避免使用金屬類物質盛裝和攪拌試劑。
[0066]9、濃縮洗滌液和終止液在低溫(2?8°C)儲存時可能出現結晶，須室溫完全溶解混勻後使用。
[0067]10、勿將底物溶液暴露於強光下。
[0068]11、本品終止液為硫酸，避免終止液同眼、皮膚接觸。
[0069]12、移液系統應保證準確清潔，應提供準確溶液體積的同時不造成交叉汙染。
[0070]13、樣品的運輸須按國家的有關規定進行。
【權利要求】
1.一種檢測豬藍耳病病毒抗體的ELISA試劑盒，包括盒體、放置試劑的下凹瓶位、96孔酶標板、8瓶試劑和一張蓋板膜，其特徵在於:酶標板是米用96孔試劑板作為固相載體,在酶標板微孔中包被重組N蛋白製成的檢測板，8瓶試劑分別為濃縮洗滌液、樣品稀釋液、底物A液、底物B液、酶標兔抗豬抗體、終止液、豬藍耳病病毒陽性血清、豬藍耳病病毒陰性血清，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致。
2.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特徵在於:所屬的盒體是硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫製成，蓋板膜是塑料硬膜。
3.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特徵在於:酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔包被重組N蛋白；濃縮洗漆液I瓶,70mL ;樣品稀釋液I瓶,120mL ;酶標兔抗豬抗體I瓶，60mL ;底物A液I瓶，30mL ;底物B液I瓶，30mL ;終止液I瓶，60mL ;豬藍耳病病毒陽性血清I瓶，2mL ;豬藍耳病病毒陰性血清I瓶，2mL。
【文檔編號】G01N33/68GK204008662SQ201420201362
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】胡蒙蒙, 王世恩, 吳小平, 趙傑, 樊宇飛, 姚琳, 許舒婷 申請人:北京維德維康生物技術有限公司