圓錐繡球總香豆素苷、其製備方法及其組合物與用途與流程

2023-11-03 07:28:52 2

本發明涉及從圓錐繡球枝條提取的總香豆素苷及其製備方法，含有圓錐繡球總香豆素苷的藥物組合物，以及圓錐繡球總香豆素苷和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是在製備預防和/或治療免疫性腎病藥物中的應用。

背景技術：

免疫性腎病是一組由多種病因引起的具有相同免疫病理學特徵的慢性腎小球疾病。免疫性腎病包括紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、iga腎病等，由於患者的免疫系統功能紊亂，產生的免疫複合物沉積在腎臟中，對腎臟的固有細胞造成損傷，引發炎症反應等，破壞腎臟固有細胞的正常功能而使患者出現蛋白尿、血尿、水腫等症狀[1,2]。

免疫性腎病中，以iga腎病為最常見，iga腎病(iganephropathy，igan)為一種免疫病理診斷，是以iga或iga為主的免疫球蛋白伴補體c，呈顆粒狀沉積於腎小球繫膜區的臨床病理症候群，它屬於一種特殊類型的腎小球腎炎，佔原發性腎小球疾病的26％一34％，該疾病多發於兒童和青年，男女比例約為2：l，起病前多有上呼吸道感染等誘因，臨床表現多種多樣，以發作性肉眼血尿和(或)持續性鏡下血尿最為常見，可伴蛋白尿。部分患者表現為腎病症候群、急性腎炎症候群，甚至急進性腎炎症候群，可並高血壓及腎功能減退。

目前治療上也是以腎上腺皮質激素和環磷醯胺、環孢素a、黴酚酸酯等免疫抑制劑為一線治療藥物[3-5]，但由於毒副作用大，易復發，治療難持久，病人一旦進入終末期腎病，便不可避免的進入到透析治療階段，極大增加了患者和社會的負擔，所以開發新型有效且毒副作用更低的藥品非常有必要性。

參考文獻

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2.mokcc:membranousnephropathyinsystemiclupuserythematosus:atherapeuticenigma.natrevnephrol2009,5(4):212-220.

3.aaltonens,honkanene:outcomeofidiopathicmembranousnephropathyusingtargetedstepwiseimmunosuppressivetreatmentstrategy.nephroldialtransplant2011,26(9):2871-2877.

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5.sahingm,sahins,kantarcig,erginh:mycophenolatemofetiltreatmentfortherapy-resistantglomerulopathies.nephrology(carlton)2007,12(3):285-288.

圓錐繡球(hydrangeapaniculatasieb)是虎耳草科(saxifragaceae)繡球屬(hydrangea)植物，廣泛分布於浙江、安徽、江西、廣西等地。民間用於治療咽喉痛，瘧疾，食積不化，胸腹脹滿，骨折等。圓錐繡球的天然資源豐富，未見有毒性報告。眾所周知，一種中藥材含有數百種化學成分，它們的藥效作用特點是具有多種生物活性，不同類型化合物的藥效通常是不同的，根據大量中藥活性成分的研究結果發現往往一類成分的作用強度要好於單體化合物，毒性要低於單體化合物，這也是中藥被公認為毒性低、用藥安全的主要原因，在前期研究中發現茵芋苷具有對5/6大鼠腎切除致慢性腎功能不全的保護作用，並製成了含有50-80％茵芋苷提取物。但在進一步研究中發現以茵芋苷為純化指標進行純化後得到的提取物在製備過程中對藥材的資源具有較大的浪費，而且製造成本較高，給患者帶來較大的經濟負擔，鑑於中藥有效成分研究的成果，我們利用不同的製備工藝(特別是使用了新型的吸附聚合材料)對圓錐繡球的總香豆素苷進行富集，得到了含有10種以上單體化合物的總香豆素苷(結構如下所示)，在進一步的藥效學實驗中發現該總香豆素苷具有對陽離子化牛血清白蛋白所致免疫性腎病大鼠的腎小球繫膜細胞及毛細血管基底膜增厚有一定的抑制作用，對繫膜基質增厚均有明顯的抑制作用。作用強度大於陽性對照藥黴酚酸酯和洛沙坦，未見到毒副作用(見實施例)，因此該藥如果開發成功將給患者帶來巨大的福音。

圓錐繡球總香豆素苷主要組成物的結構式如下：

技術實現要素：

為了克服現有技術中治療免疫性腎病的藥物的不足，本發明解決的技術問題是提供一種圓錐繡球總香豆素苷、圓錐繡球總香豆素苷的製備方法、含有圓錐繡球總香豆素苷的藥物組合物、以及圓錐繡球總香豆素苷在製備預防和/或治療免疫性腎病藥物中的應用。

為解決本發明的技術問題，本發明提供如下技術方案：

本發明技術方案的第一方面是提供了從圓錐繡球枝條提取總香豆素苷的製備方法，其中含有50％以上總香豆素苷。

圓錐繡球枝條經乾燥並適當的粉碎，以利增大與溶劑的接觸面積，提高效率。

圓錐繡球枝條的提取溶劑使用水、醇類、或水與醇類的混合物。優選的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等。水與醇類的混合物，例如濃度為20-95％(體積比)的醇。提取時溶劑浸過藥材為宜，溶劑量為原藥重量的2-14倍。提取可以在靜態或動態下，優選在動態條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如20℃)到溶劑回流溫度的範圍內，優選在回流的溫度下。提取可連續或間歇進行，間歇提取時可重複1-4次，優選2-3次。

上步結束後，合併濾液，濾去藥渣，濃縮濾液回收溶劑,得浸膏。濃縮優選在動態狀態下進行，可以在常壓或減壓條件下，優選在減壓條件下。濃縮的溫度40-80℃，。

浸膏用10-20倍水溶解後通過吸附柱層析純化，純化的次數可以是1-4次，優選是1-2次。

吸附劑選自大分子聚合物hpd100和hp2mgl。

洗脫系統的條件：依次用水和不同濃度的水和醇混合溶劑洗脫。水和醇混合溶劑部分濃縮得到含有50％以上總香豆素苷的圓錐繡球提取物。

為了得到更高純度總香豆素苷也可以再進行1次層析方法。

本發明技術方案的第二方面是提供利用第一方面製備方法製備得到的圓錐繡球總香豆素苷，其中含有50％以上總香豆素苷。

本發明技術方案的第三方面是提供含有第二方面所述圓錐繡球總香豆素苷的藥物組合物。

該藥物組合物含有作為活性成份的圓錐繡球總香豆素苷和常規藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發明藥物組合物含有0.1-95重量％的圓錐繡球總香豆素苷。

含有本發明圓錐繡球總香豆素苷的藥物組合物可根據本領域公知的方法製備。用於此目的時，如果需要，可將本發明圓錐繡球總香豆素苷與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，製成可作為人藥或獸藥使用的適當的施用形式或劑量形式。

本發明圓錐繡球總香豆素苷或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、鼻腔、口腔黏膜、皮膚、透皮、皮下、皮內、腹膜、直腸、靜脈內、肌內、鞘內、硬膜外、眼內、顱內、陰道給藥等。

本發明圓錐繡球總香豆素苷或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射、穴位注射、鞘內注射和腹膜內注射等。

給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型的溶液性質可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。液體劑型形式可以是糖漿劑、酏劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液；固體劑型例如片劑、錠劑、膠囊、滴丸、丸劑、粒劑、粉劑、霜劑、溶液劑、栓劑、可分散粉劑如凍乾粉針劑、氣霧劑等。

本發明圓錐繡球總香豆素苷可以製成普通製劑、也可以是緩釋製劑、控釋製劑、靶向製劑及各種微粒給藥系統。

為了將單位給藥劑型製成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子包括，賦形劑例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣、磷酸鈉；稀釋劑與吸收劑例如澱粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、矽酸鋁、葡聚糖、膠態二氧化矽、阿拉伯膠、明膠、三矽酸鎂、角蛋白等；溼潤劑與粘合劑例如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑例如乾燥澱粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻澱粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、三乙胺硬脂酸鎂、三乙胺硬脂酸、二氧化矽、玉米澱粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步製成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片，以延遲其在胃腸道中的崩解和吸收，並由此提供在較長時間內的持續作用。

例如為了將給藥單元製成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或麵糊等；崩解劑，如瓊脂粉、乾燥澱粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。

例如為了將給藥單元製成膠囊，將本發明圓錐繡球總香豆素苷與上述的各種載體混合，並將由此得到的混合物置於硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將本發明圓錐繡球總香豆素苷製成微囊劑，混懸於水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或製成注射劑應用。

例如為了將給藥單元製成口服液體製劑，包括乳液、溶液、懸浮液、糖漿等。合適的載體包括溶液、懸浮液、糖漿等，並任選含有添加劑例如潤溼劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。

例如，將本發明圓錐繡球總香豆素苷製成注射用製劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍乾粉針劑，這種製劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射有機酯例如油酸乙酯、聚氧乙烯山梨醇、脂肪酸酯等。這樣的劑型還可以含有輔料例如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。另外，為了製備等滲注射液，可以向注射用製劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規的助溶劑、緩衝劑、ph調節劑等。這些輔料是本領域常用的。

此外，如需要，也可以向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑例如薄荷、冬青油等，甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精等或其它材料。

本發明所用的無菌介質都可以通過本領域技術人員眾所周知的標準技術製得。可將它們滅菌，例如通過經由細菌過濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱宋滅菌。還可以在臨用前將它們製成無菌可注射介質。

為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。當然用於實施本發明的圓錐繡球總香豆素苷的給藥途逕取決於疾病和需要治療的部位。因為本發明圓錐繡球總香豆素苷的藥動學和藥效學特徵會有某種程度的不同，因此在組織中獲得治療濃度的最優選方法是逐漸增加劑量並監測臨床效果。對於這樣的逐漸增加治療劑量，初始劑量將取決於給藥途徑。對於任何特定患者，本發明圓錐繡球總香豆素苷藥物組合物的具體治療有效劑量水平取決於許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質、疾病嚴重程度、給藥途徑、給藥次數、治療目的、圓錐繡球總香豆素苷的清除速度、治療持續時間，圓錐繡球總香豆素苷聯合或同時使用的具體藥物，患者或動物的性別、年齡、體重、性格、飲食、個體反應以及一般健康狀況等醫藥科學領域眾所周知的因素，因此本發明的治療劑量可以有大範圍的變化。根據所治療患者的病症，可能必須對劑量作出某些改變，並且在任何情況下，都由醫師決定個體患者的合適劑量。

給藥劑量是指不包括載體重量在內(當使用載體時)的圓錐繡球總香豆素苷的重量。一般來講，本發明中藥學成分的使用劑量是本領域技術人員公知的。可以根據本發明圓錐繡球總香豆素苷組合物中最後的製劑中所含有的實際藥物數量，加以適當的調整，以達到其治療有效量的要求，完成本發明的預防或治療目的。本發明圓錐繡球總香豆素苷的每天的合適劑量範圍優選為0.1—100mg/kg體重，更優選為1—30mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥；這受限於給藥醫生的臨床經驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。本發明的圓錐繡球總香豆素苷或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對症藥物合併使用並調整劑量。

本發明技術方案的第四方面是提供第二方面所述圓錐繡球總香豆素苷在製備製備預防和/或治療免疫性腎病的藥物中的應用。

有益技術效果

由於目前在臨床上沒有較好的治療免疫性腎病的藥物，一般臨床上主要用黴酚酸酯和洛沙坦進行治療，本專利發明的圓錐繡球總香豆素苷在動物模型的藥效要強於黴酚酸酯和洛沙坦，而且毒副作用小，來源於天然，資源豐富，生產成本低，有望給患者帶來福音。

在前期研究中(200910254316.2)，我們製備了含有50％-80％茵芋苷的提取物，在其實施例中也可以看到在製備50％以上茵芋苷的提取物工藝中存在許多缺點，如使用了不可反覆利用的矽膠導致了廢物難處理汙染環境，還使用了易燃易爆溶劑，給工業生產帶來了非常致命的問題。另外，藥材在製備該提取物時的收率為0.5％左右，生產成本高，給患者購藥費用帶來較大的壓力。在進一步研究過程中我們發現圓錐繡球其他的香豆素苷如繡球苷的藥效活性要好於茵芋苷(見實施例5),因此，參考中藥多成多靶點協同作用的原理，我們研究出簡便，經濟的提取圓錐繡球總香豆素苷的工藝，藥理試驗結果顯示總香豆素苷的作用要優於茵芋苷(見實施例4),這個新工藝能夠提高藥材的利用率(收率約為2％)，有利於環保和保護生態環境。新工藝不使用矽膠和石油醚丙酮等易燃易爆溶劑。使生產成本大大降低，能給患者帶來廉價的藥品，減低患者的經濟負擔。

本發明觀察了圓錐繡球總香豆素苷在小鼠一次灌胃給藥的急性毒性，發現給小鼠一次灌胃5g/kg,給藥後動物無異常反應，兩周內無死亡。屍檢肉眼觀察各主要臟器未發現明顯病理改變。說明圓錐繡球總香豆素苷的毒性較低。

本發明還觀察了圓錐繡球總香豆素苷對陽離子化牛血清白蛋白(c-bsa)所致大鼠免疫性腎損傷的保護作用。

研究結果表明，大鼠經皮下注射陽離子化牛血清白蛋白+佛氏不完全佐劑預免疫後，每日尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白，2周後造成大鼠免疫性膜性腎病模型。之後維持每日尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白並同時灌胃給予陽性對照藥losartan和黴酚酸酯以及不同劑量的圓錐繡球總香豆素苷。生化指標表明，陽離子化牛血清白蛋白致大鼠免疫性腎損傷模型組24h尿白蛋白(p<0.01)、血肌酐(p<0.05)、血尿素氮(p<0.05)明顯增高，尿肌酐和肌酐清除率均明顯降低(p<0.05)。陽性對照藥黴酚酸酯和洛沙坦可降低24h尿白蛋白水平(p<0.05)；圓錐繡球總香豆素苷(45mg/kg)可顯著降低免疫性腎損傷大鼠24h尿白蛋白水平(p<0.05)，同時可顯著降低血肌酐和尿素氮水平(p<0.05)，同時增加尿肌酐濃度和肌酐清除率(p<0.05)，且45mg/kg劑量的圓錐繡球總香豆素苷強於所用劑量的陽性對照藥。

腎臟組織病理學檢查顯示，圓錐繡球總香豆素苷45mg/kg對陽離子化牛血清白蛋白所致免疫性腎病大鼠的腎小球繫膜細胞及毛細血管基底膜增厚有一定的抑制作用，對繫膜基質增厚均有明顯的抑制作用。

附圖說明

圖1.圓錐繡球總香豆素苷hplc色譜圖色譜條件：流動相：12％甲醇，色譜柱：ods柱，檢測波長：318nm。

圖2.impdh的酶學篩選原理：次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶(inosinemonophosphatedehydrogenase，impdh)在nad+輔因子存在下，將imp(inosine5』-monophosphate)轉化為xmp(xanthosine5』-monophosphate)。

圖3.圓錐繡球總香豆素苷(hp-t)對c-bsa所致大鼠免疫性腎損傷腎小球中igg沉積影響的代表圖。

圖4.圓錐繡球總香豆素苷(hp-t)對c-bsa所致大鼠免疫性腎損傷腎小球中il-1β表達影響的代表圖。

圖5圓錐繡球總香豆素苷(hp-t)對c-bsa所致大鼠免疫性腎損傷腎小球中il-6表達影響的代表圖。

具體實施方式

實施例1圓錐繡球總香豆素苷的製備

圓錐繡球枝條，粉碎，加入10倍量的水回流提取2次，每次3小時，提取液趁熱過濾，合併濾液，取濾液通過預先用水平衡好的大孔吸附樹脂柱(hpd100)，先用3倍大分子聚合物體積的水洗脫雜質，水液棄去。再用5倍大分子聚合物體積的17％乙醇解吸香豆素苷，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至浸膏狀，噴霧乾燥，即得圓錐繡球提取物。然後將其用水溶解，溶液通過預先用水平衡好的大分子聚合物柱hp2mgl，先用3倍大分子聚合物體積的水洗脫雜質，再用3倍大分子聚合物體積的25％乙醇解吸香豆素苷，洗脫液減壓蒸乾，真空乾燥，所得含有多種香豆素苷的淺褐色粉末(圓錐繡球總香豆素苷純度65％，圖1為圓錐繡球總香豆素苷hplc色譜圖)。

實施例2大分子聚合物種類的選擇

圓錐繡球中有效成分為總香豆素苷類物質，而水提取物中除了含有該類物質外，還含有糖、胺基酸和無機鹽等雜質。總香豆精苷在水和乙醇中都能溶解，在水中能被大分子聚合物選擇性吸附，又能被乙醇解吸附，而其它水溶性雜質則不被大分子聚合物吸附。利用這一特點，可以分離純化處方中的總香豆精苷類成分。

考察大分子聚合物的性能

大分子聚合物來源

d101(天津市海光化工有限公司生產)

hpd-100(天津市海光化工有限公司生產)

hpd-400(河北滄州寶恩化工廠)

hpd-600(河北滄州保恩化工廠)

dm130(河北滄州寶恩化工廠)

dm301(鄭州勤實科技有限公司)

da201(鄭州勤實科技有限公司)

ab-8(河北滄州保恩化工廠)

1)各種類型大分子聚合物的水分測定

分別稱取各種型號大分子聚合物，平行2份，放置在真空乾燥烘箱中(105℃)烘至恆重，稱重記錄，並計算各種型號大分子聚合物的溼度，結果如下表1

表1各型大分子聚合物水分測定結果

各種類型大分子聚合物吸附性能的比較——靜態吸附試驗

稱取各種類型大分子聚合物5.0g，將各大分子聚合物裝入10ml具塞三角瓶中，每份各加入100ml圓錐繡球水提取液(0.068g生藥/ml藥液)，不時振搖，吸附24h，吸取一定量的靜態吸附後的藥液，測定香豆素苷的吸附率。然後將各份藥液過濾，得到吸附後的大分子聚合物，在各份中加入50ml50％乙醇溶液解吸，過濾得到解吸液，定容至50ml。精密吸取各份解吸液，測定各份解吸液的香豆素苷的量並計算各型大分子聚合物的解吸附率。結果如表2所示。

表2.各種類型大分子聚合物吸附結果

以上數據可以看出，各種類型大分子聚合物的靜態吸附性能如下所示：

hpd100〉hpd400〉d101〉da201〉dm301〉ab-8〉dm130〉hpd600；

因此，選用hpd100形大分子聚合物，可以多吸附香豆素苷，提高生產效率，降低生產成本。

實施例3圓錐繡球總香豆素苷中的單體化合物製備和結構鑑定

取圓錐繡球總香豆素苷，進行矽膠柱(200-300目)色譜分離，用氯仿-甲醇-水(80:20:2)洗脫，得到8個洗脫部分(yaa-yaf)。yad析出大量白色固體，即化合物ya-1，過濾，濾液繼續採用矽膠柱色譜、sephadexlh-20柱色譜、反相hplc製備色譜得到化合物ya-2，ya-3。yae析出大量白色固體，即化合物ya-5。yaf繼續進行矽膠柱(200-300目)色譜分離，用氯仿-甲醇-水(80:20:2)洗脫，得到22個洗脫部分(frc.1～frc.11)。frc.9進一步採用mplc(5-50％ch3oh梯度洗脫)、反相hplc製備色譜得到ya-4，ya-6，ya-7，ya-8。frc.11進一步採用mplc(5-50％ch3oh梯度洗脫)、反相hplc製備色譜得到ya-9，ya-10。

化合物的理化參數如下：

1.化合物ya-1(茵芋苷)

白色固體。esi-msm/z:325[m+h]+。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:6.32(1h,d,j＝9.5hz,h-3),8.00(1h,d,j＝9.5hz,h-4),7.64(1h,d,j＝8.5hz,h-5),7.04(1h,s,h-8),7.00(1h,d,j＝8.5hz,h-6),5.02(1h,d,j＝7.0hz,h-1′),3.13～3.71(6h,m,h-2′～6′)。13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.2(c-2),160.2(c-7),155.0(c-9),144.2(c-4),129.4(c-5),113.6(c-6),113.2(c-10),113.1(c-3),103.1(c-8),99.9(c-1′),77.1(c-3′),76.5(c-5′),73.1(c-2′),69.6(c-4′),60.6(c-6′)。

2.化合物ya-2(6-甲氧基香豆素-7-o-β-d-葡萄糖苷，東莨菪苷)

白色固體。esi-msm/z:355[m+h]+。1h-nmr(dmso-d6,300mhz)δ:7.95(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.28(1h,s,h-5),7.15(1h,s,h-8),6.32(1h,d,j＝9.6hz,h-3),5.08(1h,d,j＝7.2hz,h-1′),3.81(3h,s,och3-6),3.15～3.80(6h,m,h-2′～6′)。

3.化合物ya-3(8-甲氧基香豆素-7-o-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。esi-msm/z:377[m+na]+。1h-nmr(dmso-d6,300mhz)δ:7.97(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.38(1h,d,j＝9.0hz,h-5),7.17(1h,d,j＝9.0hz,h-6),6.32(1h,d,j＝9.6hz,h-3),5.01(1h,d,j＝7.2hz,h-1′),3.86(3h,s,och3-8),3.15～3.80(6h,m,h-2′～6′)。

4.化合物ya-4(傘形花內酯-7-o-β-d-葡萄糖基-(1→6)-o-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。esi-msm/z509[m+na]+,995[2m+na]+。1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.98(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.64(1h,d,j＝8.8hz,h-5),7.09(1h,dd,j＝8.8,2.4hz,h-6),7.06(1h,d,j＝2.4hz，h-8),6.31(1h,d,j＝9.6hz,h-3),5.02(1h,d,j＝7.2hz,h-1′),4.17(1h,d,j＝8.0hz,h-1″),2.96～4.46(12h,m,h-2′～6′,2″～6″).13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.2(c-2),160.1(c-7),154.9(c-9),144.2(c-4),129.6(c-5),113.4(c-6),113.3(c-10),113.1(c-3),103.4(c-8),103.5(c-1″),99.9(c-1′),77.0(c-3′),76.7(c-3″),76.4(c-5′),75.6(c-5″),73.5(c-2′),73.1(c-2″),70.1(c-4′),69.5(c-4″),68.6(c-6′),61.1(c-6″)。

5.化合物ya-5(傘形花內酯7-o-β-d-芹糖基-(1→6)-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。esi-msm/z:479[m+na]+,457[m+h]+。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:7.98(1h,d,j＝9.5hz,h-4),7.64(1h,d,j＝9.0hz,h-5),7.01(1h,overlapped,h-6),7.01(1h,brs,h-8),6.32(1h,d,j＝9.5hz,h-3),5.01(1h,d,j＝7.5hz,h-1′),4.97(1h,d,j＝6.5hz,oh-2″),4.79(1h,d,j＝3.0hz,h-1″),3.89(1h,d,j＝9.5hz,h-4″),3.86(1h,brd,j＝12.0hz,h-6′),3.74(1h,dd,j＝6.5,3.0hz,h-2″),3.58(1h,d,j＝9.5hz,h-4″),3.59(1h,m,h-5′),3.44(1h,dd,j＝12.0,6.5hz,h-6′),3.38(1h,overlapped,h-5″),3.29(1h,m,h-3′),25(1h,m,h-2′),3.28(1h,overlapped,h-5″),3.12(1h,m,h-4′)。13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.2(c-2),113.3(c-3),144.1(c-4),129.5(c-5),113.4(c-6),160.1(c-7),103.3(c-8),154.9(c-9),113.2(c-10),109.3(c-1″),99.9(c-1′),78.7(c-3″),76.4(c-3′),75.9(c-2″),75.5(c-5′),73.3(c-4″),73.0(c-2′),69.8(c-4′),67.5(c-6′),63.2(c-5″)。

6.化合物ya-6(傘形花內酯-7-o-β-d-槐糖苷)

白色固體。(c0.09,meoh)。esi-msm/z:487[m+h]+,509[m+na]+，hr-esi-msm/z:487.1438[m+h]+，分子式為c21h26o13(c21h27o13計算值：487.1446)。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:8.00(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.62(1h,d,j＝8.4hz,h-5),7.05(1h,dd,j＝8.4,2.0hz,h-6),7.07(1h,d,j＝2.0hz,h-8),6.32(1h,d,j＝9.6hz,h-3),5.15(1h,d,j＝7.2hz,h-1′),4.46(1h,d,j＝7.6hz,h-1″),3.71(1h,dd,j＝10.0,5.6hz,h-6b′),3.12～3.51(10h,overlapped,h-2′～5′,6a′,h-3″～6″),2.99(1h,m,h-2′).13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.3(c-2),113.1(c-3),144.3(c-4),129.3(c-5),113.9(c-6),160.1(c-7),103.4(c-8),154.9(c-9),113.3(c-10),104.7(c-1″),98.6(c-1′),82.8(c-2′),76.9(c-5′,5″),76.2(c-3″),75.8(c-3′),74.7(c-2″),69.6(c-4″),69.3(c-4′),60.6(c-6″),60.5(c-6′)。

7.化合物ya-7(傘形花內酯-7-o-β-d-葡萄糖基-(1→3)-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。(c0.08,meoh)。esi-msm/z:487[m+h]+,509[m+na]+，hr-esi-msm/z:487.1446[m+h]+，分子式為c21h26o13(c21h27o13計算值：487.1446)。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:8.00(1h,d,j＝9.5hz,h-4),7.65(1h,d,j＝8.5hz,h-5),7.01(1h,dd,j＝8.5,2.0hz,h-6),7.06(1h,d,j＝2.0hz,h-8),6.32(1h,d,j＝9.5hz,h-3),5.17(1h,d,j＝7.0hz,h-1′),4.36(1h,d,j＝8.0hz,h-1″),3.39(1h,dd,j＝11.5,6.0hz,h-6a″),3.04～3.70(11h,overlapped,h-2′～6′,h-2″～5″,6b″).13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.1(c-2),113.2(c-3),144.2(c-4),129.4(c-5),113.6(c-6),159.9(c-7),103.2(c-8),155.0(c-9),113.4(c-10),103.9(c-1″),99.2(c-1′),87.4(c-3′),76.9(c-5″),76.5(c-5′),76.0(c-3″),71.8(c-2′),73.8(c-2″),70.1(c-4″),68.0(c-4′),61.1(c-6″),60.4(c-6′)。

8.化合物ya-8(傘形花內酯-7-o-β-d-葡萄糖基-(1→3)-[β-d-芹糖基-(1→6)]-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。(c0.09,meoh)。esi-msm/z:641[m+na]+,657[m+k]+，hr-esi-msm/z641.1680[m+na]+，確定其分子式為c26h34o17(c26h34o17na計算值：641.1688)。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:7.99(1h,d,j＝9.5hz,h-4),7.65(1h,d,j＝8.5hz,h-5),7.03(1h,dd,j＝8.5,2.0hz,h-6),7.04(1h,d,j＝2.0hz,h-8),6.33(1h,d,j＝9.5hz,h-3),5.16(1h,d,j＝7.5hz,h-1′),4.79(1h,d,j＝3.0hz,api-h-1),4.37(1h,d,j＝7.5hz,h-1″),3.59(1h,d,j＝9.5hz,api-h-4a),3.40(1h,dd,j＝11.5,6.0hz,h-6a″),3.04～3.87(15h,overlapped,其餘糖上氫信號)。13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.2(c-2),113.3(c-3),144.1(c-4),129.5(c-5),113.4(c-6),159.8(c-7),103.3(c-8),154.9(c-9),113.4(c-10),109.3(api-c-1),104.0(c-1″),99.1(c-1′),87.2(c-3′),78.7(api-c-3),76.9(c-5″),76.0(c-3″),75.9(api-c-2),75.0(c-5′),73.8(c-2″),73.3(api-c-4),71.8(c-2′),70.1(c-4″),68.2(c-4′),67.1(c-6′),63.2(api-c-5),61.0(c-6″)。

9.化合物ya-9(傘形花內酯-7-o-β-d-葡萄糖基-(1→2)-β-d-芹糖基-(1→6)-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。(c0.10,meoh)。esi-msm/z:641[m+na]+,657[m+k]+，通過hr-esi-msm/z641.1691[m+na]+，確定其分子式為c26h34o17(c26h34o17na計算值：641.1688)。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:7.98(1h,d,j＝9.2hz,h-4),7.65(1h,d,j＝8.4hz,h-5),7.00(1h,dd,j＝8.4,2.0hz,h-6),6.99(1h,d,j＝2.0hz,h-8),6.31(1h,d,j＝9.2hz,h-3),4.96(1h,d,j＝7.5hz,h-1′),4.99(1h,d,j＝2.0hz,api-h-1),4.19(1h,d,j＝7.6hz,h-1″),3.90(1h,d,j＝2.0hz,api-h-2),3.04(1h,m,h-5″),2.98(1h,m,h-2″),2.84(1h,m,h-3″),2.84～3.85(13h,overlapped,其餘糖上氫信號)。13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.2(c-2),113.1(c-3),144.2(c-4),129.4(c-5),113.4(c-6),160.1(c-7),103.4(c-8),154.9(c-9),113.3(c-10),107.7(api-c-1),103.4(c-1″),99.9(c-1′),83.7(api-c-2),79.7(api-c-3),76.6(c-3″),76.4(c-3′),76.1(c-5″),75.5(c-5′),73.7(api-c-4),73.5(c-2″),73.0(c-2′),69.9(c-4′),69.1(c-4″),67.0(c-6′),63.9(api-c-5),60.1(c-6″)。

10.化合物ya-10(傘形花內酯-7-o-β-d-葡萄糖基-(1→5)-β-d-芹糖基-(1→6)-β-d-葡萄糖苷)

白色固體。(c0.11,meoh)。esi-ms給出準分子離子峰m/z641[m+na]+,657[m+k]+，通過hr-esi-msm/z641.1680[m+na]+，確定其分子式為c26h34o17(c26h34o17na計算值：641.1688)。1h-nmr(dmso-d6,500mhz)δ:7.99(1h,d,j＝9.2hz,h-4),7.65(1h,d,j＝8.4hz,h-5),7.02(1h,dd,j＝8.4,2.0hz,h-6),7.01(1h,d,j＝2.0hz,h-8),6.31(1h,d,j＝9.2hz,h-3),5.01(1h,d,j＝7.2hz,h-1′),4.81(1h,d,j＝3.2hz,api-h-1),4.14(1h,d,j＝7.6hz,h-1″),3.91(1h,d,j＝9.6hz,api-h-4b),3.86(1h,brd,j＝10.8hz,h-6b′),3.76(1h,d,j＝3.2hz,api-h-2),3.73(1h,d,j＝10.8hz,api-h-5b),3.42(1h,m,h-6a″),3.08(1h,m,h-4″),3.06(1h,m,h-5″),2.98(1h,m,h-2″),2.98～3.63(9h,overlapped,其餘糖上氫信號)。13c-nmr(dmso-d6,125mhz)δ:160.2(c-2),113.2(c-3),144.2(c-4),129.6(c-5),113.3(c-6),160.1(c-7),103.4(c-8),154.9(c-9),113.3(c-10),109.2(api-c-1),103.3(c-1″),99.9(c-1′),77.6(api-c-3),76.8(c-5″),76.5(api-c-2),76.5(c-3″),76.4(c-3′),75.5(c-5′),73.4(api-c-4),73.4(c-2″),73.0(c-2′),71.3(api-c-5),70.0(c-4″),69.7(c-4′),67.8(c-6′),60.9(c-6″)。

實施例4：圓錐繡球總香豆素苷(hp)對順鉑致小鼠急性腎功能損傷的影響

實驗目的：觀察圓錐繡球總香豆素苷對順鉑造成小鼠急性腎損傷的影響。

實驗材料：

受試藥物：圓錐繡球總香豆素苷(hp)，及茵芋苷，均採用0.5％羧甲基纖維素鈉配成實驗所需濃度混懸液。

陽性對照藥：苯那普利(benazeprilhydrochloride)，acei諾華製藥產品，批號：03073氯沙坦(losartanpostassium)，at1ra杭州默沙東製藥有限公司，批號：s1241。順鉑(ddp)原料藥：山東齊魯製藥提供。

動物：昆明種小鼠，雄性，體重16-18g，由中國醫學科學院實驗動物研究所實驗動物繁育場提供，ii級，合格證號：scxk(京)2002-0001。飼養條件：屏障級動物房飼養，合格證號：syxk(京)2000-0018。標準飼養盒內餵養，每盒5隻，盒內保持清潔乾燥，房間定時通風消毒，光照時間8:00-20:00，室溫20-26℃，溼度40-70％。飼料：清潔級繁殖鼠料，軍事醫學科學院實驗動物中心，生產許可證號：scxk-(軍)2002-001。

血清生化檢測試劑盒：北京北化精細化學品有限責任公司產品。

主要儀器：wellscanmk3型酶標儀；德國sigma3k15離心機；tgl-16g冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；旋渦混合器，美國bohemian.y公司。

實驗方法：

取雄性昆明種小鼠，16g-18g，按體重隨機分為溶劑對照組和順鉑模型組、陽性對照藥losartan組、圓錐繡球總香豆素苷給藥組，每組8隻。對照組腹腔注射生理鹽水，順鉑以生理鹽水溶解，腹腔注射，按7mg/kg。以上各給藥體積均為0.4ml/20g，於注射順鉑前2天開始給藥，注射順鉑後第3天分別眼球取血，用試劑盒檢測血清bun、scr。處死動物，並稱體重。

實驗結果：

順鉑造成的小鼠急性腎損傷模型，bun和scr指標明顯升高，各受試物組對於順鉑所造成的小鼠急性腎損傷bun升高均具有不同程度的抑制作用，但以圓錐繡球總香豆素苷的作用為佳。

表20-4.茵芋苷和hp對順鉑造成的小鼠急性腎損傷的保護作用(造模後3天)

#p<0.05,與陰性對照組比較；*p<0.05,與順鉑組比較。

實施例5茵芋苷和繡球苷對次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶(inosinemonophosphatedehydrogenase,impdh)的酶活性抑制作用。

次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶是開發免疫抑制藥物的一個重要靶點，它是嘌呤核苷酸從頭合成途徑的關鍵限速酶，抑制了這個酶的活性，可以使鳥嘌呤核苷酸的合成減少。絕大多數體細胞仍可以通過補救途徑來利用嘌呤核苷酸，但是淋巴細胞不能通過補救途徑，只能通過從頭合成途徑，因此，對這個酶的抑制，可以有效抑制t/b淋巴細胞的合成，產生顯著的免疫抑制效果。

圓錐繡球總香豆素苷(hp)在動物實驗中展現出了良好的免疫抑制效果，為了研究其免疫抑制的藥理靶點，我們體外構建了針對impdh的酶學篩選體系，篩選原理簡單描述如圖2。

茵芋苷和繡球苷impdh酶學抑制活性檢測

實施例6圓錐繡球總香豆素苷的小鼠急性毒性實驗

圓錐繡球總香豆素苷急性毒性試驗，試驗根據sfda「藥物單次給藥毒性研究技術指導原則」進行。圓錐繡球總香豆素苷溶於0.5％羧甲基纖維素鈉溶液，本品易溶於該溶液。

本次急性毒性(acutetoxicity)所使用小鼠品係為昆明小鼠和c57品系小鼠，雌雄各5隻，初始體重為16-18g。根據藥監局推薦的最大給藥劑量，我們使用了5g/kg的給藥劑量，單次口服給藥，觀察一周內動物的反應情況。

本次單次給藥毒性試驗嚴格按照《藥物非臨床研究質量管理規範》(glp)執行。

單次給藥毒性試驗符合動物試驗的一般基本原則，即隨機、對照和重複，除5g/kg給藥組外，還設置了相同條件小鼠作為溶劑對照組(給予同體積的羧甲基纖維素鈉溶液)。

觀察時間與指標

給藥後，一般連續觀察至少14天，每天都進行觀察，尤其注意毒性反應的出現時間及恢復時間、動物死亡時間等。

觀察指標包括臨床症狀(如動物外觀、行為、飲食、對刺激的反應、分泌物、排洩物等)、死亡情況(死亡時間、瀕死前反應等)、體重變化(給藥前、觀察期結束時各稱重一次，觀察期間可多次稱重，動物死亡或瀕死時應稱重)等。記錄所有的死亡情況，出現的症狀以及症狀的起始時間、嚴重程度、持續時間，體重變化等。詳細的觀察指標見後面的附錄。

結果分析與評價

整個急性毒性試驗過程中，未見到小鼠有任何異常現象，未見到任何附錄中所提及任何不良觀察指證，同口服溶劑的對照組相比，體重沒有見到顯著性的差異。詳見表3。

表3.急性毒性試驗中，各組小鼠體重比較

急性毒性試驗初步證實，圓錐繡球總香豆素苷具有良好的安全性，即使在5g/kg的劑量下，單次給藥未見任何毒性反應。

結論：圓錐繡球總香豆素苷在小鼠一次灌胃給藥的mtd為5g/kg。

實施例7圓錐繡球總香豆素苷(hp)對觀察圓錐繡球總香豆素苷對陽離子化牛血清白蛋白(c-bsa)所致大鼠免疫性腎損傷的保護作用

實驗目的：觀察圓錐繡球總香豆素苷對陽離子化牛血清白蛋白(c-bsa)所致大鼠免疫性腎損傷的保護作用，推測其有免疫抑制的作用。

實驗材料：

藥物及試劑：

受試藥物：圓錐繡球總香豆素苷，褐色粉末，微溶於水，用0.5％羧甲基纖維素鈉配成實驗所需濃度混懸液。實驗中所採用的劑量均以圓錐繡球總香豆素苷重量表示。

陽性對照藥：氯沙坦(losartanpostassium)，at1ra，杭州默沙東製藥有限公司，批號：h2006d371。黴酚酸酯(商品名：驍溪，mycophenolatemofetil,mmf),上海羅氏製藥有限公司生產，批號：sh0013。弗氏不完全佐劑購自sigma公司；小牛血清白蛋白v組分購自roche公司；無水乙二胺(eda)、碳化二亞胺(edc)購自北京化學試劑公司，均為分析純試劑。

實驗動物：

雌性sd大鼠，160-180g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，spf級，合格證號scxk(京)2007-0001。動物飼養在屏障級動物房,合格證號：syxk(京)2004-0001；標準飼養盒內餵養，每盒2隻，盒內保持清潔乾燥，房間定時通風消毒，自然光照，室溫23-25℃，溼度40-70％。飼料：清潔級繁殖鼠料，北京科奧協力飼料有限公司，生產許可證號：京動(2000)第015號。

血清生化檢測試劑盒：北京北化精細化學品有限責任公司產品。

主要儀器：wellscanmk3型酶標儀；德國sigma3k15離心機；tgl-16g冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；旋渦混合器，美國bohemian.y公司。millipore純水儀，millipore公司；dshz-300多用途水浴恆溫震蕩器，江蘇太倉實驗儀器廠；hy-4型調速多用震蕩器，常州國華電器有限公司；besn-ii多通道動物無創測血壓系統，南京德賽生物技術有限公司提供。

實驗方法：

1.陽離子化小牛血清蛋白(c-bsa)的製備

參考border方法，用67mleda加500ml雙蒸水，然後緩慢加入6mol/l鹽酸350ml，調ph至4.75，保持溶液在25℃；將5gbsa溶解於25ml雙蒸水，再將此溶液緩慢加入eda溶液，不斷攪拌，使液溫恆定25℃，加入1.8gedc；2h後用ph為4.75的醋酸緩衝液30ml終止反應，即得等電點提高的c-bsa溶液。用4℃雙蒸水透析72h(每3至5h換水)c-bsa溶液，冷凍乾燥，得等電點(pi)為8.4以上的c-bsa粉劑，保存於-70℃備用。

2.c-bsa腎炎大鼠模型的複製及實驗分組

參考border方法進行模型複製。選取雌性sd大鼠200隻，體重160-180g，隨機分為10組。除正常對照組10隻，不作任何處理，正常飼養外，其餘各組大鼠均分別取c-bsa1.0mg與佛氏不完全佐劑0.1ml混均，大鼠皮下多點注射預免疫。每隻大鼠預免疫1周後，每隻注射c-bsa，先腹腔注射1周過渡，第1天至第7天的劑量依次為1.0mg、1.0mg、2.0mg、2.0mg、4.0mg、4.0mg、5.0mg。第2周起，每次在滅菌條件下尾靜脈注射5.0mgc-bsa，兩周後，檢測各組大鼠的24h尿白蛋白排出量，以24h尿白蛋白排出量與對照組相比升高5倍作為模型成功的標準，選出造模成功大鼠，隨機進行試驗分組，每組10隻，實驗分組為：正常對照組；模型對照組；losartan20mg/kg陽性藥物對照組；黴酚酸酯(mmf)20mg/kg陽性藥物對照組；圓錐繡球總香豆素苷(hp-t)45mg/kg治療組。實驗各組每日灌胃給藥，每周給藥6天，正常組與模型組給予等體積的溶劑。

3.腎臟病理評價方法

①腎小球細胞計數：在h.e染色切片上計數腎小球細胞數，腎小球細胞數包括腎小球內皮細胞、繫膜細胞和足細胞。每例在腎皮質內側帶隨機分別計數5個小球內的細胞數，然後計算各組動物腎小球細胞平均數和標準差(±sd)，經t檢驗分別與模型組進行比較。

②腎小球繫膜基質增生或基底膜增厚：在pas-m染色切片上在每隻動物腎臟皮質內側帶隨機分別計數10個腎小球。在10個腎小球中有幾個腎小球為小球繫膜增生或小球基底膜增厚，然後計算每組有病變的小球平均數和標準差/10個腎小球(±sd)，經t檢驗分別與模型組進行比較。

③腎小管和間質病變，包括小管擴張、透明管型、間質炎性細胞浸潤、纖維組織增生和腎盂黏膜病變等。各項觀察指標根據輕、中、重度打分，求各組病變積分平均數和標準差(±sd)，經t檢驗分別與模型組進行比較。

4.免疫組織化學實驗方法

兔抗大鼠igg抗體、生物素化的羊抗兔二抗及hrp標記的鏈親和素、胃蛋白酶、二步法免疫組化檢測試劑、顯色試劑盒(dabkit)均購自北京中山生物技術公司。il-1β和il-6抗體購自博士德公司。

主要儀器：德國sigma3k-15離心機；tgl-16g冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；jjt-900/1300超淨工作檯，北京半導體設備一廠；旋渦混合器，美國bohemian.y公司。image-proplus圖像分析系統，美國kodak公司產品；c-4040zoom型olympus數位相機及plympusbx51正置顯微鏡，olympus公司產品；photo-2雙頭顯微鏡，日本nikon公司；rm2035石蠟切片機，德國leica公司產品。

具體方法參照《分子克隆》免疫組織化學相關章節的方法，檢測樣本腎小球中igg沉積、il-1β和il-6的表達情況，每組樣品染色時均同批進行空白對照、正常兔血清替代一抗對照染色。

觀察指標及分析方法，在光學顯微鏡下按單盲法觀察全部病理切片，記錄各組的病理所見，並對以下病理指標進行半定量評分：

igg在腎小球的沉積和il-1β和il-6在腎小球的表達：隨機選取9-16個含腎小球的高倍視野(200倍)，應用image-pro.plus5.0軟體進行腎小球陽性區域分析。

5.觀察項目

(1)生化指標：在給藥第28天收集各大鼠24h尿液，進行尿白蛋白定量實驗及檢測尿肌酐含量，同時停止尾靜脈注射c-bsa，給藥後30天，從眼眶靜脈取血，檢測血清肌酐和尿素氮含量，檢測採用市售生化試劑盒(北京北化)。

(2)組織學觀察：於給藥後30天稱量大鼠體重，處死大鼠取腎、脾稱重，計算腎臟係數以及脾臟係數。腎臟組織分成兩份，分別用10％中性福馬林溶液固定和-70℃冷凍保存。固定組織進行he染色，觀察腎臟病理改變；pasm染色，觀察腎小球基底膜、繫膜病變。

(3)免疫組織化學方法檢測圓錐繡球總香豆素苷對陽離子化牛血清白蛋白(c-bsa)所致大鼠免疫性腎損傷腎小球部位igg沉積，il-1和il-6表達的影響。

實驗結果

1.生化檢測

研究結果表明，大鼠經皮下注射陽離子化牛血清白蛋白+佛氏不完全佐劑預免疫後，每日尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白，2周後造成大鼠免疫性膜性腎病模型。之後維持每日尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白並同時灌胃給予陽性對照藥losartan和黴酚酸酯以及不同劑量的圓錐繡球總香豆素苷。生化指標表明，陽離子化牛血清白蛋白致大鼠免疫性腎損傷模型組24h尿白蛋白(p<0.01)、血肌酐(p<0.05)、血尿素氮(p<0.05)明顯增高，尿肌酐和肌酐清除率均明顯降低(p<0.05)。陽性對照藥黴酚酸酯和洛沙坦可降低24h尿白蛋白水平(p<0.05)；圓錐繡球總香豆素苷(45mg/kg)可顯著降低免疫性腎損傷大鼠24h尿白蛋白水平(p<0.05)，同時可顯著降低血肌酐和尿素氮水平(p<0.05)，同時增加尿肌酐濃度和肌酐清除率(p<0.05)，且45mg/kg劑量的圓錐繡球總香豆素苷強於所用劑量的陽性對照藥。詳見表4。

表4.圓錐繡球總香豆素苷給藥1個月對陽離子化牛血清白蛋白(c-bsa)所致大鼠免疫性腎損傷的保護作用

n＝10)

#p<0.05；##p<0.01,模型組與對照組比較；*:p<0.05，**:p<0.01，與模型組比較。

2.腎臟病理檢查結果

(1)正常對照組：

在10例大鼠腎臟中，99％腎小球細胞數在100個以內，平均為72.92±12.52，與模型組相比差異非常顯著(p<0.01)，只有個別小球繫膜基質增生或基底膜增厚，平均為0.30±0.48/10個腎小球。與模型組相比差異非常顯著(p<0.01)正常組動物腎小管未見明顯病變,見表5。

(2)模型組和各給藥組動物腎小球病變病理觀察

模型組大鼠經皮下注射陽離子化牛血清白蛋白+佛氏不完全佐劑誘導免疫性腎病模型，經組織病理學檢查顯示，該組腎臟病變特點表現為腎小球細胞增生，腎小球繫膜基質增生和小球毛細血管基底膜增厚，小球體積增大。無論是模型組或造模+給藥組，其小球細胞數均比正常對照組增加，其中模型組與陽性藥losartan組和黴酚酸酯組以數相近，洛沙坦和黴酚酸酯在本次實驗中用到的劑量下並未對腎小球細胞增生有顯著改善(見表7)。圓錐繡球總香豆素苷45mg/kg組小球細胞數低於模型組，經t檢驗有非常明顯差異(p<0.01)。小球繫膜基質增生或基底膜增厚表現為基質多數呈團塊狀增生，附著在基底膜上。基底膜多數為局灶或節段性增厚，或部分小球基底膜呈瀰漫性增厚，毛細血管管腔縮小或閉塞，有的小球呈分葉狀，或小球硬化。在發生硬化的腎小球中小球細胞數有所減少，呈均質玻璃樣變。本實驗小球硬化較少。由表5可見模型組腎小球繫膜基質增生或基底膜增厚在4-5個/10個小球或40-50％以上。陽性藥losartan組和黴酚酸酯組也分別在50％和30％以上發生病變。其中losartan(20mg/kg)組有3例動物腎臟大多數腎小球繫膜細胞增生，繫膜基質增生和基底膜增厚，小球玻璃樣變性有的小球囊壁增厚，與小球粘連。而圓錐繡球總香豆素苷給藥組小球病變數明顯低於模型組和陽性對照藥組，分別與模型組相比有非常顯著差異(p<0.01)。

表5.腎小球細胞數和繫膜基質增生或基底膜增厚的小球數

*：p<0.05；**:p0.05)。

表6.模型組和各給藥組腎小管和間質病變積分

3.圓錐繡球總香豆素苷對igg沉積，il-1和il-6在腎小球表達的影響

陽離子化牛血清白蛋白(c-bsa)誘發大鼠免疫腎損傷模型組大鼠腎小球中igg沉積非常明顯，呈現深棕色染色。陽性對照藥losartan和黴酚酸酯(mmf)及圓錐繡球總香豆素苷各組均較模型組顯著減弱，但圓錐繡球總香豆素苷劑量組為最明顯(圖3和表7)。c-bsa誘發大鼠免疫腎損傷模型組大鼠腎小球中il-1β和il-6均陽性表達，呈深棕色染色。黴酚酸酯和圓錐繡球總香豆素苷大劑量可明顯減弱il-1β(圖4和表8)和il-6(圖5和表9)的表達，提示大劑量圓錐繡球總香豆素苷可抑制由c-bsa所誘發的大鼠免疫性腎損傷，其作用強度與所用劑量的陽性對照藥黴酚酸酯相當。

表7圓錐繡球總香豆素苷對c-bsa所致大鼠免疫性腎損傷腎小球中igg沉積的影響

註：**p<0.01,與對照組比較；#p<0.05,##p<0.01,與模型組比較。

表8圓錐繡球總香豆素苷對c-bsa所致大鼠免疫性腎損傷腎小球中il-1β沉積的影響

註：**p<0.01,與對照組比較；#p<0.05,##p<0.01,與模型組比較。

表9圓錐繡球總香豆素苷對c-bsa所致大鼠免疫性腎損傷腎小球中il-6沉積的影響

註：*p<0.05,與對照組比較；#p<0.05,##p<0.01,與模型組比較。

結論：

圓錐繡球總香豆素苷對陽離子化牛血清白蛋白所致免疫性腎病大鼠腎損傷有顯著改善作用。可以顯著提高腎臟的肌酐清除率，降低尿蛋白。腎臟組織病理學檢查顯示，圓錐繡球總香豆素苷45mg/kg對陽離子化牛血清白蛋白所致免疫性腎病大鼠的腎小球繫膜細胞及毛細血管基底膜增厚有一定的抑制作用，對繫膜基質增厚均有明顯的抑制作用。