從動物組織中提取病毒基因組rna的方法

2023-11-02 22:59:07

專利名稱：從動物組織中提取病毒基因組rna的方法
技術領域：
本發明涉及一種從動物組織中提取病毒基因組RNA的方法，屬於微生物 病原檢測技術領域。
技術背景隨著動物貿易的飛速發展，養殖業養殖規模、養殖密度越來越高，也帶 來了大規模的動物疾病頻頻爆發。2004年爆發的禽流感及2006年爆發的豬高 致病性藍耳病給養殖業造成了致命創傷。當前，養殖業的疾病爆發呈現多病 原混合感染特點，爆發周期越來越短，對病原的診斷檢測提出了更高的要求。 現有技術中，對動物病原的診斷主要方法是首先分離病菌或病毒，然後分 析病原的生理生化特性，再進行基因組學、蛋白質組學研究。而對於病毒， 尤其是突發的新病毒，進行病原的分離鑑定需要一個非常長的時間，而且極 易對研究人員造成危險。放射免疫法、酶聯免疫分析或免疫電鏡法總體而言 缺乏檢測低濃度病毒的靈敏度，加上病毒高變異性的特點，常用的血清學及 免疫學診斷方法往往造成漏檢。目前，採用聚合酶鏈反應(PCR)對DNA或逆 轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)來檢測RNA病毒方法具有最好的敏感性。但是 相對於DNA病毒來說，RNA病毒在處理過程中死亡，組織以及環境中存在的大 量RNA酶會快速降解其基因組；病毒含量極少時往往得不到完整的病毒RNA。國內他人的實驗研究直接提取少量組織、血液或尿囊液中的RNA進行檢 測，同樣因為處理樣品量太小的原因，不能提取得到完整的病毒基因組RNA， 進而無法檢測到極微量的病毒。為此，研製一種簡單靈敏的病毒基因組RNA 提取方法對於重大畜禽疾病的早期測具有重要意義。 發明內容本發明的目的是提供一種從動物組織中提取病毒基因組RNA的方法，解 決了當前各種檢測、診斷病毒方法中耗時長、靈敏度低的問題。 本發明的方法包括以下步驟(1) 組織勻漿取病變組織剪碎後加入無菌水，勻漿器內高速勻漿至單細胞懸液；(2) 細胞裂解、病毒釋放將單細胞懸液反覆凍融、超聲破碎，使細胞裂解、病毒釋放出來；(3) 離心分離 將上述處理液在低溫下離心分離，收集病毒沉澱；(4) RNA提取向沉澱物中加入RNAiso Reagent試劑，重懸，分離後提取得到RNA。 在本發明的步驟(3)中，離心分離時，控制溫度4t:，首先低速離心分離去除宿主細胞物質，然後再高速離心分離收集病毒沉澱，效果更好。利用隨機或者特異引物RT-PCR擴增基因，擴增產物經序列測定及生物信息學研究，結果顯示用該方法提取RNA病毒基因組既可以避免宿主細胞物質的千擾，又可以得到高豐度、高純度、高完整性的病毒RNA，方便後續實驗研究。利用本發明從ELISA試劑盒鑑定為豬繁殖與呼吸綜合症病毒陰性的豬肝 髒提取RNA， lmLRNAiso Reagent可提取0D260/280值為2. 0左右的RNA約 250嗎，進行瓊脂糖凝膠電泳分析後可得到清晰的RNA條帶；根據GenBank 公布的ATCC VR2332全基因序列設計GP5及N蛋白的引物各1對，經RT-PCR 後電泳觀察到大小分別約600bp和400bp的基因片段；測序後進行同源性比 較，與ATCC VR2332目的序列的同源性分別為89. 74%、 93.83%。證明該方法 適宜於從含有極微量病毒的組織中提取大量高完整性的病毒RNA。本發明取得的有益效果是用該方法從組織中提取RNA病毒基因組，既 可以縮短分離、鑑定病毒所耗費的時間，又可以獲得豐度高、完整性好而且 極少細胞RNA汙染的RNA樣品；本發明克服了以往方法操作中對實驗檢驗人 員的大量危害，並且節約了開支；處理樣品量大，檢測下限遠低於目前常用 方法。


圖l是PRRSV各目的基因的RT-PCR產物電泳結果圖。圖中2.1， 2.2， 2, 3， 4, 5, 6和7分別代表NSP2.1, NSP2.2， GP2， GP3, GP4， GP5, M及N蛋白基因的RT-PCR擴增產物，M. DNA marker: 2000,1000,750， 500，250，畫bp。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明。實施例1豬病肺中病毒基因組RNA的提取實驗(1 )(1) 組織勻漿稱取200g豬病肺，剪成碎塊後加入500mL無菌水，於組織勻漿器內高速 勻漿至單細胞懸液；(2) 細胞裂解、病毒釋放將勻漿液置於試劑瓶中，密封后-20°C， 15T:反覆凍融三次；移取30mL 懸液於50mL無RNA酶的離心管，300W超聲破碎2min，工作8s間歇8s;(3) 離心分離上述處理液控制溫度4。C、 8000g離心15min，上清移至新離心管後控制 溫度4。C、 35000g離心3h，棄上清，收集病毒沉澱；(4) RNA提取向沉澱中加入2mLRNAiso Reagent (lmLRNAiso Reagent/60mg沉澱)將 沉澱重懸，移入鄧氏勻漿器勻漿，按RNAi so Reagent說明書要求進行RNA的 分離純化操作得到RNA。(5) 豐度與完整性檢驗將RNA用60pL DEPC水溶解後，微量核酸測定儀測得0D260/280值分別為 1.98、 1.87， 200倍稀釋後濃度分別為47.0jxg/mL， 42. 3嗎/mL;取5拜A溶 液進行非變性瓊脂糖凝膠電泳，可以觀察到清晰的RNA條帶。 實施例2豬病肺中病毒基因組RNA的提取實驗(2 )(1) 組織勻漿稱取200g豬病肺，剪成碎塊後加入500mL無菌水，於組織勻漿器內高速 勻漿至單細胞懸液；(2) 細胞裂解、病毒釋放將勻漿液置於試劑瓶中，密封后-20°C， 30'C反覆凍融五次；移取30mL懸液於50mL無RNA酶的離心管，600W超聲破碎2min，工作8s間歇8s;(3) 離心分離上述處理液控制溫度4°C、 8000g離心15min，上清移至新離心管後控制 溫度4。C、 35000g離心3h，棄上清，收集病毒沉澱；(4) RNA提取向沉澱中加入2mLRNAiso Reagent (lmLRNAiso Reagent/60mg沉澱)將 沉澱重懸，移入鄧氏勻漿器勻漿，按RNAi so Reagent說明書要求進行RNA的 分離純化操作提取RNA。(5) 豐度與完整性檢驗將RNA用30pL DEPC水溶解後，微量核酸測定儀測得0D260/280值為2. 1 ， 80倍稀釋後濃度分別為23. 0嗎/mL;取5pLRNA溶液進行非變性瓊脂糖凝膠電 泳，觀察到RNA條帶呈彌散狀；證明細胞裂解、病毒釋放過程中條件過於劇 烈，致使部分病毒死亡，RNA釋放於組織懸液中並在後續的實驗操作中被降解。 實施例3兔病肝中病毒基因組RNA的提取實驗(1) 組織勻漿稱取50g兔病肝，剪成碎塊後加入100mL無菌水，於組織勻漿器內高速 勻漿至單細胞懸液。(2) 細胞裂解將勻漿液置於試劑瓶中，密封后-2(TC， l(TC反覆凍融三次；移取30mL 懸液於50mL無RNA酶的離心管，200W超聲破碎4min，工作8s間歇8s。(3) 離心分離將上述處理液控制溫度4。C、 8000g離心10min，上清移至新離心管後控 制溫度4。C、 12000g離心30min，棄上清，收集病毒沉澱;(4) RNA提取向沉澱中加入3mLRNAiso Reagent (lmLRNAiso Reagent/60mg沉澱)將 沉澱重懸，移入鄧氏勻漿器勻槳，按RNAi so Reagent說明書要求進行RNA的 分離純化操作。(5) 豐度與完整性檢驗將RNA用60^L DEPC水溶解後，微量核酸測定儀測得OD260/280值為2. 03， 取5nLRNA溶液進行非變性瓊脂糖凝膠電泳，觀察到RNA條帶呈彌散狀；證明 離心分離不充分，宿主細胞物質沒有完全去除、病毒沒能完全離心沉澱 下來，致使提取的RNA中含有大量的組織RNA碎片。 實施例4 RT-PCR擴增及序列分析(1) RT-PCR擴增取RT-PCR試劑盒要求的適量RNA溶液，分別加入據GenBank公布的ATCC VR2332全基因序列設計的8對特異性引物進行梯度PCR擴增。瓊脂糖電泳觀 察，獲得大小分別約1200bp、 1400bp、 800bp、 750bp、 580bp、 600bp、 500bp 和400bp的基因片段(見附圖1)。(2) 序列測定及分析將RT-PCR產物分別連接到pUCm-T載體上，轉化到感受態細胞DH5a中， 經IPTG/X-gal瓊脂平板藍白斑篩選，隨機挑選白色菌落，提取質粒後進行雙 酶切鑑定。將克隆的陽性質粒送上海生工生物技術服務有限公司進行序列測 定。用DNAMAN序列分析軟體將所得序列與ATCC VR2332目的基因的核苷酸序 列進行同源性分析，結果表明7個完整基因的同源性分別為79. 45%、 93. 26%、 88.76%、 89.76%、 89.57%、 95.62%、 93.83%。 實施例5 靈敏度比對實驗取豬繁殖與呼吸綜合症病毒ELISA檢測試劑盒鑑定為陰性的豬肝臟，經 組織勾漿，細胞裂解，病毒富集與RNA提取後，分別用例2的8對特異性引 物進行RT-PCR，結果同樣得到大小與預期相同的基因片段；測序並進行同源 性分析後認為所擴基因均為豬繁殖與呼吸綜合症病毒基因。證明該份病料中 含有微量的豬繁殖與呼吸綜合症病毒，該方法的靈敏度高於ELISA試劑盒。
權利要求
1. 一種從動物組織中提取病毒基因組RNA的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)組織勻漿取病變組織剪碎後加入無菌水，勻漿器內高速勻漿至單細胞懸液；(2)細胞裂解、病毒釋放將單細胞懸液反覆凍融、超聲破碎，使細胞裂解、病毒釋放；(3)離心分離將上述相處理液低溫下，離心分離收集病毒沉澱；(4)RNA提取向沉澱物中加入RNAiso Reagent試劑，重懸，分離後提取得到RNA。
2 、按權利要求1所述的從動物組織中提取病毒基因組RNA的方法，其特徵在於步驟(3 )中，控制溫度4'C，首先低速離心分離去除宿主細胞物質，然後再高速離心分離收集病毒沉澱。
3、按權利要求2所述的從動物組織中提取病毒基因組RNA的方法，其特徵在於步驟(3 )中，8000g低速離心分離15min, 35000g高速離心分離3h。
4 、按權利要求1所述的從動物組織中提取病毒基因組RNA的方法，其特 徵在於步驟(2)中，反覆凍融3次、3 0 0 W超聲破碎2min。
全文摘要
本發明公開了一種從動物組織中提取單鏈RNA病毒基因組的方法，包括以下步驟(1)組織勻漿取病變組織剪碎後加入無菌水，勻漿器內高速勻漿至單細胞懸液；(2)細胞裂解、病毒釋放將所得單細胞懸液反覆凍融、超聲破碎，使細胞裂解、病毒釋放；(3)離心分離將上述處理液在低溫下，離心分離，收集病毒沉澱；(4)RNA提取向沉澱物中加入RNAiso Reagent試劑，重懸，分離後提取得到RNA。用本發明提取病毒基因組RNA既可以避免宿主細胞物質的幹擾，又可以得到高豐度、高純度、高完整性的病毒RNA，方便後續實驗。用於病毒檢測，可以檢測到極微量病毒離子的存在。本發明為動物源性病毒病的診斷、監控提供了新的途徑。
文檔編號C07H21/02GK101220072SQ20071018535
公開日2008年7月16日 申請日期2007年12月10日 優先權日2007年12月10日
發明者傑 宋, 趙寶華, 黃文娟 申請人:河北師範大學