增強自然殺傷細胞增殖和活性的方法

2023-10-31 20:35:07 5

專利名稱：增強自然殺傷細胞增殖和活性的方法
技術領域：
本發明,在其某些實施方式中,涉及自然殺傷(NK)細胞的離體(體外，ex-viVO)培養，更具體地，而不排他地，涉及通過用煙醯胺處理所述細胞並結合細胞因子促進的NK細胞增殖而增強NK細胞繁殖和/或功能性的組合物和方法。
背景技術：
自然殺傷(以下也簡稱為「NK」)細胞是參與免疫反應的淋巴樣細胞。這些細胞具有多種功能，特別是殺傷腫瘤細胞、發生致癌轉化的細胞和活體內其它不正常的細胞，是先天免疫監督機制的重要組成部分。採用用NK細胞的免疫治療的臨床經驗，強調了強效並有效地擴增NK細胞群並同時保持甚至增強其體內功能性(殺傷能力、轉運、定位、持續和增殖)的更好方法的需要。
NK細胞根據表型和功能代表了不同的淋巴細胞群。NK細胞具有大顆粒淋巴細胞形態並表達特徵NK細胞表面受體，同時缺乏TCR重排和T細胞、B細胞、單核細胞和/或巨噬細胞表面標誌。細胞殺死通過釋放蛋白質的小胞質顆粒(穿孔素和顆粒酶)而導致靶細胞通過細胞凋亡而死亡。NK細胞具有通過啟動MHC I類分子、MHC類I類分子和與MHC無關的分子的多個抑制和活化受體而區分潛在的「靶」細胞和健康細胞的機制(Caliguiri Blood2008 112:461-69)。抑制性 NK 細胞受體包括 HLA-E (CD94/NKG2A) ；HLA-C (組 I 或 2)，KIR2DL ；KIR3DL (HLA-B Bw4)和 HLA-A3 或 A4+肽。激活性 NK 細胞受體包括 HLA-E (CD94/NKG2C) ；KIR2DS (HLA-C)和KIR3DS (HLA_Bw4)。其它受體包括NK細胞受體蛋白-I (在小鼠中稱為NKl. I)和對IgG的Fe部分低親和力受體(Fe YRIII ;CD16)。Cosman等人的美國專利申請US20090234699詳細描述了具體的NK細胞活化器、UL結合蛋白(ULBP)和其潛在的治療用途。(其結合於本文中作為參考)。「激活性」和「抑制性」的表面受體控制NK細胞的細胞毒活性。對於治療考慮因素重要的是，需要NK細胞抑制作用以防止通過「激活」NK細胞破壞正常的宿主組織，但在NK細胞中抑制性信號傳遞看起來比活化信號更強。完整骨髓對於NK細胞生成是必要的。人類骨髓來源的NK細胞是⑶2+⑶16+⑶56+表型的大顆粒淋巴細胞(LGL)，缺乏CD3，還包含T-細胞受體ζ鏈[Zeta ( ζ )-TCR]。NK細胞可以在各種淋巴樣和非淋巴樣組織中，包括血液、脾、肝、肺、腸和蛻膜中找到。在腫瘤中已發現相當數量的NK細胞，其中這些細胞可能發揮抗腫瘤活性。NK細胞展示出抗病毒感染和腫瘤細胞的自發非MHC-限制的細胞毒活性和體內病毒性感染和癌進展的介導抗性。因此，NK細胞代表先天免疫的關鍵效應器細胞。此外，NK細胞具有多種其它功能，包括分泌細胞因子的能力和調節適應性免疫應答和造血功能。NK細胞在幾個實驗動物模型中的感染早期期間內提供了必要的Y-幹擾素(IFN-Y )。大多數癌在HLA的背景下缺乏可識別的腫瘤特異性抗原，因此不可能屈服於抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞。由於廣泛的癌細胞對NK細胞活性敏感，則能夠採取移植自然殺傷(NK)細胞在異源位置對抗癌細胞，而無移植物抗宿主病的風險。最近研究都強調這種潛在的NK細胞療法。在移植的動物模型中，供體NK細胞溶解白血病細胞和宿主淋巴造血細胞，而不會影響非造血組織。因為NK細胞受結合至殺傷性免疫球蛋白樣受體(KIR)的自我HLA分子抑制，這些發現已經導致了選擇採用有助於NK-細胞活化(HLA-和KIR錯配)的HLA和KIR型造血幹細胞移植受體的臨床實踐，由此可能預期促進抗白血病作用。然而，「最好」供體的選擇受限於具有不只一個潛在的供體的患者，NK細胞溶解淋巴樣細胞的能力一般較低而難以預測。自身免疫性疾病中NK細胞分布和功能的一項調查已經表明在許多自身免疫性疾病(如SLE，乾燥症候群，多發性硬化，牛皮癬，RA，潰瘍性結腸炎等)中NK細胞群的數量和功能降低。因此，用NK細胞的治療能夠主動抑制潛在致病性自身免疫性T細胞，自身免疫性T細胞可以介導骨髓移植後炎性反應，調節抗原非特異性模式中自身免疫記憶T細胞激活而維持臨床緩解和防止GVH效應。對於臨床使用，NK細胞通常通過白細胞分離而從患者或捐獻者收集。然而,最大的NK細胞劑量是有限的，而高NK細胞劑量只可能為低體重患者獲得，致使孩子們成為NK細胞療法的最佳人選。值得注意的是，NK細胞的總數和活性在病毒性感染和/或癌中顯著降低，而使得基於內源性NK細胞激活的免疫療法無效。此外，難治性的復發是細胞輸入中主要的併發症，而許多臨床方案需要反覆輸注淋巴細胞群。
在這方面，Verneris等(Brit J Hematol 2009 ; 147:185-91),綜述了胳血 NK 細胞臨床應用的前景，最近表示，新鮮臍血NK細胞群可能需要進一步操作，才能表達其全功能(細胞毒性，遷移率)的潛力。一旦實施採用各種生物反應調節劑，尤其是IL-2後的全身治療，活化的NK細胞數目和其抗病毒和抗轉移活性已發現在各種組織中顯著增加。基於這方面的證據，有人嘗試了涉及NK細胞聯合IL-2 (和IL-15)的激活和擴張的治療策略，以及向輸注受者共給予IL-2。然而，迄今為止，這些結果卻令人失望，僅僅表明輸注(注入)的NK細胞有限的歸巢和瞬態植入。此外，IL-2是有毒的，在臨床應用中必須極為謹慎使用。在嘗試開發NK細胞離體富集和增殖的臨床可行性方案中，磁性細胞選擇技術使用順磁性⑶56微球和細胞選擇柱，已經用於隔離包含⑶3756+NK (60.6% ±10. 8%)和⑶3+/56+NK T細胞(30. 4% ±8.6%)的⑶56+群而開始增殖研究。根據不同的供體，甚至在不同場合下進行同一供體的測試，通過加入重組人IL-2或IL-2+重組人IL-15，觀察到較明顯的細胞擴增變異。選擇和繁殖的低E:T比⑶56+的細胞毒性顯著地比起始群更高，與相同條件下培養2周的非分離PBMC相當。在新鮮的未經選擇的PBMC培養中，IL-15 (結合IL-2)比單獨IL-2以I: I的E:T比率引起更高的殺滅作用。值得注意的是，由於⑶3+細胞在培養之前並未耗盡，CD3+CD56+NKT細胞的增殖是CD3XD56+NK細胞的2至3倍。CD56+/CD3_細胞只有中度增殖發生，所得到的大多數細胞都是CD56+/CD3+NKT細胞。在不同的方法中，人⑶3TD56+NK細胞培養自通過骨髓基質細胞和/或免疫細胞(c-kit配體，IL-2和IL-15)產生的各種細胞因子存在下培養的BM-衍生的⑶34+造血祖細胞(HPC)。向這些培養基中加入幹細胞因子，對⑶3-⑶56+細胞毒性效應器細胞的分化沒有影響，而大大增強了其在培養基中的增殖。大多數這些細胞缺乏CD2和CD16，但的確表達了 ζ -TCR。類似於外周血中發現的NK細胞，在IL-15存在下生長的骨髓來源的⑶2-⑶16-⑶56+NK細胞據發現是IFN- Y響應單核細胞衍生的細胞因子的強效生產者。IL-15能夠誘導⑶34+HPC分化成⑶3-⑶56+NK細胞，而KL可以放大其數量。然而，NK細胞的產量受限於CD34+細胞群中潛在NK祖細胞低的數量。繁殖NK細胞的其它方法已經進行了描述。Frias等人，(Exp Hemato12008 ；36:61-68)在基質細胞層上用無血清培養基培養了選自臍血的NK祖細胞(CD7+CD34-Lin-CD560，採用SCF、IL-7、IL_15、FL和IL-2誘導NK分化，使細胞毒性的經培養的 NK 細胞數量增加。Harada 等(Harada et al. ,Exp Hematol. 2004 ;32:614-21)通過來自腎母細胞瘤細胞系的細胞培養了 NK細胞。Waldmann等人(US20070160578)描述了採用IL-15/R-配體激活子絡合物在培養基中增強了來自整個血液、骨髓或脾細胞的NK細胞和⑶8-T細胞的增殖，以降低不良的細胞因子產生。Campana等人，(US20090011498)描述了在表達IL-15和4-1BB並具有弱的或沒有MHC- I或II的表達的白血病細胞存在下，進行移植的NK細胞的離體培養和活化。Childs等人(US20090104170)描述了通過在IL-2存在下與照射的EBV-轉化的淋巴母細胞共培養而離體增殖和活化NK細胞。Tsai (US20070048290)使用另一種方法，通過採用照射的3T3-衍生的0P-9S細胞離體培養永生的NK祖細胞由造血幹細胞生產連續的NK細胞系，進行研究和潛在的治療應用。(上述所有引用參考文獻都結合於本文中作為參考)。然而，NK細胞培養基的確立方法也支持T細胞增殖，甚至在T細胞耗盡之後，殘餘T細胞通常會在刺激之後數量上增加，由於潛在的移植物抗宿主病而排斥擴增的細胞群的 臨床應用。這進一步使得輸注之前下一輪的細胞耗盡成為必要，而使製備過程耗時，成本高昂，而且往往造成大量NK細胞損失。為了減少擴增之後T細胞汙染，NK細胞的擴增方案是使用純化的CD56+CD3_細胞作為擴增培養中要進行接種的初始群。為了獲得高度純化的CD56+CD3-細胞部分，需要兩個步驟的淨化過程正選擇CD56細胞，接著耗盡CD3細胞，或先耗盡CD3細胞，接著正選擇CD56細胞。然而，這個過程是昂貴的，而在兩個純化循環期間涉及大量細胞損失。即使在採用純化CD56+CD3-細胞開始的培養中，仍然有受T細胞汙染的擴增NK產物。使用細胞因子僅僅用於擴增NK細胞的方案，指示了相對溫和的效應和對除了細胞因子之外的另外的刺激物的要求，以獲得大幅擴增(Korean J Lab Med 2009;29:89-96，Koehl U et al. Klin Padiatr 2005 ；217:345 - 350)o輻照的飼養細胞(例如，外周血單核細胞，埃博斯坦-巴爾病毒轉化的淋巴母細胞系(ABV-LCL)，K562骨髓白血病細胞系，基因修飾以表達白細胞介素-15的膜結合形式和共刺激分子4-1BB的配體)而其它常常作為其它刺激物而用於NK細胞的擴增。雖然大多數NK擴增方案使用純化的CD56+CD3-細胞作為初始群，但是一些方案卻結合輻照的基質或抗-CD3抗體而使用單核細胞作為初始接種群(Blood，15March 2008, Vol. 111，No. 6，pp. 3155-3162)。擴增之後，這些培養基嚴重受到⑶3+和⑶3+⑶56+細胞汙染，因此，⑶56+⑶3-細胞需要在輸注之前進行純化。Miller等人，(Blood，199280:2221-2229)，通過塗在抗體塗覆的塑料燒瓶底上，使用NK祖細胞和包含CD56+CD3-細胞的單核細胞富集的部分並結合純化的CD14+細胞或MNC耗盡⑶5和⑶8以18天的培養而獲得了 30倍的NK細胞擴增。Ve』 ronique Decot等人(Experimental Hematology 2010 ;38:351 - 362)在輻照 T 和 B 細胞上通過耗盡 T 和 B細胞的單核細胞而報導了約20倍的NK細胞擴增，並發現耗盡之後汙染的群主要是單核細胞。然而，在這種培養模型中，飼養細胞和細胞因子對於獲得NK細胞擴增是必要的，因為在單獨細胞因子或單獨飼養細胞存在下沒有觀察到擴增。因此，相對於Miller，所考慮的單核細胞都富集於這些接種的群中，在不存在照射T和B基質細胞時沒有觀察到NK細胞擴增(Decot et al. , Exper Hematology 2010;38:351-362)。
然而，進一步地，儘管離體培養的NK細胞常常證實對無關靶細胞具有相當的活性(例如，細胞毒性)，但是對更臨床相關的腫瘤和癌細胞的活性，無論體外還是體內往往令人失望，有人已經提出了增強活化的方法。Zitvogel等(美國專利No. 6849452)(結合於本文中作為參考)教導了通過暴露引發的樹突細胞(triggered dendritic cells)而離體或體內活化NK細胞。其他人建議通過用缺乏MHC-I分子的細胞培養NK細胞並基因修飾表達IL-15 (Campana et al.，美國專利申請No. 2009011498)或用蛋白酶體抑制劑預處理NK細胞(Berg et al. Cytotherapy 2009 ; 11:341-55)增強活化作用(結合於本文中作為參考)。然而，沒有任何一種方案已經顯著取得了能夠在移植之後在合適的宿主靶器官中倖存和擴增的擴增NK細胞群(穩態增殖)，而採用離體增殖的NK細胞免疫療法仍然受限於無法獲得臨床方案適用的足夠數量且高度純化的功能合適的NK細胞(Bachanova et al. , CancImmunol. Immunother. 2010 ；59:739-44 ;Guven，Karolinska Institute，2005 ；Schuster etal.，E. J. Immunology 2009 ；34:2981-90 ；Bernardini et al. Blood 2008 ;111:3626-34)。因此，仍然需要簡化的且成本有效的方法以離體優先擴增NK細胞，如分離的NK細胞，或來自耗盡或並非來自CD3+細胞的單核細胞的混合細胞群。有人已經證明，煙醯胺能夠調節細胞命運和功能(參見，例如W02003/062369，WO 2005/007799, WO 2005/007073， WO 2006/030442, WO 2007/063545 和 WO 2008/056368，其
所有都以其全部內容結合於本文中作為參考)。

發明內容
由於對大量治療上有效的NK細胞臨床應用如用於治療白血病和其它癌的細胞療法的需求不斷增長，增強適用於臨床應用的自然殺傷細胞的離體增殖和活化的改進、簡化和具有成本有效的方法仍存需要。因此，NK細胞在離體培養擴增，輸注之後增強其功能性，對於其採用的免疫療法中的臨床適用性是至關重要的。根據本發明一些實施方式的一方面，提供了一種離體培養自然殺傷(NK)細胞的方法，所述方法包括採用至少一種生長因子和有效濃度、有效暴露時間和煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的有效持續時間培養包含NK細胞的細胞群，其中採用至少一種生長因子和有效濃度、有效暴露時間和煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的有效持續時間培養所述NK細胞，導致以下至少之一(a)採用小於0. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，⑶62L的表達提高；(b)採用小於0. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，遷移響應提高；(C)採用小於0. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，歸巢和體內停留增加；(d)採用小於0. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，增殖更多；和(e)採用小於0. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，細胞毒活性增加。
根據本發明一些實施方式的另一方面，提供了本發明的所述方法培養的NK細胞群。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供的NK細胞群特徵在於以下至少之一(a)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，⑶62L的表達提高；(b)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，遷移響應提高；(C)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，歸巢和體內停留增加；(d)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下 培養的NK細胞比較，增殖更多；(e)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，細胞毒活性增加；(f)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，⑶3+與⑶56+/⑶3-的細胞比降低。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供的NK細胞群特徵在於，移植時歸巢、植入和保留得以增強，其中至少15 X IO6的所述NK細胞群輸注到照射的SCID鼠宿主中，導致在宿主淋巴組織中產生至少25%的供體來源的NK細胞，這在輸注之後4天時通過免疫檢測和流式細胞術進行測定。根據本發明一些實施方式，所述NK細胞群進一步的特徵在於，在輸注之時在至少30%的所述細胞群中表達CD62L，這通過免疫檢測和流式細胞術進行測定。根據本發明還有的其它實施方式，所述NK細胞群進一步的特徵在於，在輸注之時CD3+與CD56+/CD3-的細胞比等於或小於1:100。根據本發明一些實施方式還有的另一方面，提供了一種在需要其的主體中抑制腫瘤生長的方法，包括給予所述主體本發明治療有效量的所述NK細胞群。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供了一種在需要其的主體中治療或預防病毒性感染的方法，包括給予所述主體本發明治療有效量的所述離體培養的NK細胞群。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供了一種在需要其的主體中治療或預防移植物抗宿主病的方法，包括給予所述主體本發明治療有效量的所述離體培養的NK細胞群。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供了一種在需要其的主體中治療或預防自身免疫性疾病或病症的方法，包括給予所述主體本發明治療有效量的所述離體培養的NK細胞群。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供了一種在需要其的主體中治療或預防白血病的疾病或病症的方法，包括給予所述主體本發明治療有效量的所述離體培養的NK細胞群。根據本發明一些實施方式，NK細胞群與所述主體是自體同源的或異源的。根據本發明一些實施方式，所述給予通過單次輸注或重複輸注所述NK細胞群完成。
根據本發明一些實施方式，所述主體採用至少一種生長因子並同時給予所述NK細胞群進行治療。根據本發明一些實施方式，所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。根據本發明一些實施方式的另一方面，提供了一種轉導具有外源基因(exogene)的離體培養的NK細胞的方法，所述方法包括(a)根據本發明的所述方法離體培養NK細胞群；和(b)轉導具有外源基因的所述培養的NK細胞群。根據本發明一些實施方式，所述至少一種生長因子是IL-2，所述暴露時間為從包含NK細胞的細胞群接種的時間，所述暴露持續時間為約2到約3周，而所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的濃度為5mM。
根據本發明一些實施方式，所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的有效濃度為約O. 5mM至約50mM，或約I. OmM至約25mM，或約2. 5mM至約10mM，或約2. 5mM,約5. OmM或約7. 5mM0根據本發明一些實施方式，所述暴露時間為從接種至培養之後約5周的時間，或從接種之後約Ih至培養之後約3周的時間，或接種之後約24h至培養之後約3周的時間，或從接種之後約2天至培養之後約2周，或從包含所述NK細胞的細胞群在所述培養基中接種的時間。根據本發明一些實施方式，所述暴露持續時間為約2h至約5周，或約30h至約4周，或約2天至約3周，或約I周，約2周，約3周，約I天，約2天，約3天，約5天，約10天，約12天，約15天，約17天或約20天。根據本發明一些實施方式，包含所述NK細胞的細胞群獲自選自由臍血、骨髓和外周血組成的組中的來源。根據本發明一些實施方式，包含所述NK細胞的細胞群是包含NK細胞部分和⑶3+細胞部分的異質細胞群。根據本發明一些實施方式，所述⑶3+細胞部分大於所述NK細胞部分。根據本發明一些實施方式，所述NK細胞部分大於所述⑶3+細胞部分。根據本發明一些實施方式，包含所述NK細胞的細胞群是耗盡CD3+細胞的單核或總核細胞群(total nuclear cell population)。根據本發明一些實施方式，包含所述NK細胞的細胞群是耗盡⑶3+和⑶19+細胞的單核或總核細胞群。根據本發明一些實施方式，包含所述NK細胞的細胞群是未經選擇的NK細胞群。根據本發明一些實施方式，所述NK細胞包含⑶56+⑶3-細胞。根據本發明一些實施方式，所述NK細胞包含⑶56+⑶16+⑶3-細胞。根據本發明一些實施方式，培養包含所述NK細胞的細胞群在無飼養層或飼養細胞下完成。根據本發明一些實施方式，至少一種生長因子包括選自由SCF、FLT3、IL_2、IL_7、IL-15、IL-12和IL-21組成的組中的生長因子。根據本發明一些實施方式，所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。根據本發明一些實施方式，所述至少一種生長因子僅為IL-2。
根據本發明一些實施方式，所述⑶62L的表達通過選自由流式細胞術、免疫檢測、定量cDNA擴增和雜交組成的組中的方法進行測定。根據本發明一些實施方式，所述⑶62L的表達通過螢光激活細胞分選法(FACS)進行測定。根據本發明一些實施方式，所述⑶62L的表達採用螢光抗人⑶62L單克隆抗體進行測定。根據本發明一些實施方式，所述遷移響應提高通過遷移或補洞分析法(gapclosure assay)進行檢測。
根據本發明一些實施方式，所述遷移響應提高通過遷移分析法(transmigrationassay)進行檢測。根據本發明一些實施方式，所述遷移是響應SDFl的刺激進行分析。根據本發明一些實施方式，歸巢(homing)和體內停留(in-vivo retention)增加通過FACS進行測定，表示為輸注之後靶器官中植入的NK細胞的百分數。根據本發明一些實施方式，所述靶器官選自由脾、骨髓和淋巴結組成的組。根據本發明一些實施方式，所述歸巢和植入在NK細胞輸注之後約I天至約2周進行測定。根據本發明一些實施方式，所述增殖速率通過集落生成分析法、機械分析法、代謝分析法和直接增殖分析法進行測定。根據本發明一些實施方式，所述增殖速率通過⑶56+⑶3-細胞百分數的FACS分析進行測定，並表示為隨時間的倍數增加。根據本發明一些實施方式，所述細胞毒活性採用細胞殺傷分析法進行分析。根據本發明一些實施方式，所述細胞殺傷分析法的靶細胞是癌細胞系、原發性癌細胞、實體腫瘤細胞、白血病細胞或病毒感染細胞。根據本發明一些實施方式，所述煙醯胺部分是煙醯胺。根據本發明一些實施方式，所述煙醯胺部分是煙醯胺類似物或衍生物。根據本發明的其它實施方式，所述煙醯胺類似物或衍生物是取代的苯甲醯胺、取代的煙醯胺、煙乙硫醯胺(乙硫異煙醯胺，nicotinethioamideXN-取代的煙醯胺、煙硫醯胺(硫代煙醯胺，nicotinthioamide)、3-乙醯卩比唳或煙酸鈉。


本發明的一些實施方式在本文中僅僅通過實施例的方式，參照附圖進行描述。現在將詳細地具體參照附圖，應該強調，所示的細節是通過舉例的方式為了示意性討論本發明實施方式的目的。在這方面，以附圖進行的描述，使本發明領域的技術人員很清楚如何可以實施本發明的實施方式。在附圖中圖IA和IB顯示在缺乏(細胞因子)或存在遞增濃度(如所示,0. 5至5mM 「NAM」)的煙醯胺培養之後，臍血來源的純化NK細胞部分的劑量依賴性增殖的柱狀圖。這些培養過程以在免疫磁性微球上純化的⑶56+表型的臍血NK細胞開始，並以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)維持高達3周。圖IA顯示了在14天培養下⑶56+NK細胞的增殖(相對於第O天培養開始，增長倍數或「細胞增殖」倍數)。圖IB顯示了培養3周之後的⑶56+NK細胞的增長倍數。注意到，相對於對照(細胞因子)，煙醯胺處理的培養基的CD56+細胞組分劑量依賴性急劇增加，在整個培養期間都持續發生。圖2A-2C是顯示在以維持在無煙醯胺(細胞因子)或存在煙醯胺下的完全臍血來源的單核細胞部分開始的培養基中根據細胞表面標記(CD56，CD45，CD3)進行分組的不同淋巴細胞亞類的比例柱狀圖。這些培養採用細胞因子(包括Flt-3，IL-15和IL-2)，有或沒有濃度逐漸增加(0.5至5!111)的煙醯胺(「NAM」)之下維持3周，與表面標記的特異性抗體反應，而隨後通過FACS對特異性表型進行分析。圖2A=⑶56+/⑶45+細胞；(NK細胞和NK-T細胞)圖 2B=CD56+/CD3- (NK)細胞；圖 2C=CD3+/CD56_ (T)細胞。注意到 NK 細胞群(CD56+/⑶45+和⑶56+/⑶3-表型)劑量依賴性增加，而煙醯胺處理的培養基中T淋巴細胞群(⑶3+/CD56-表型)伴隨降低；圖3是顯示無(細胞因子)或有2. 5mM煙醯胺存在下培養之後純化骨髓來源的純化⑶56+細胞部分的增殖柱狀圖。這些培養以由免疫磁性微球上的骨髓純化的⑶56+細胞(NK細胞和NK-T)開始，並以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在有(黑暗陰影)或無(細胞 因子，淡陰影)2. 5mM煙醯胺下維持高達3周。注意到，相比較對照(細胞因子，淡陰影)，煙醯胺處理的培養基的⑶56+⑶3-NK細胞組分急劇增加，在整個培養期間持續發生；圖4A和4B是顯示無(細胞因子)或有煙醯胺存在下培養之後骨髓NK相對於NKT細胞的增殖柱狀圖。這些培養以由免疫磁性微球上純化的骨髓來源的CD56+細胞開始，並以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在有或無2. 5mM煙醯胺下維持3周。圖4A和4B表示兩個獨立示例性實驗的結果。注意到，相比較對照(細胞因子)，CD56+CD3-NK細胞(黑暗陰影)的比例急劇增加，而煙醯胺處理的培養物的CD56+CD3+NKT細胞組分(淡陰影)降低，這與接種細胞中NK相對於NKT細胞的初始比例無關；圖5是顯示由無(細胞因子)或有煙醯胺存在下培養之後的純化骨髓來源的⑶56+細胞展示⑶56+⑶16+NK細胞表型的細胞增加百分數的柱狀圖。這些培養以圖4A和4B中所述的骨髓來源的免疫磁性純化⑶56+細胞開始，並以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在有或無2. 5mM煙醯胺下維持高達3周。注意到，相比較對照(細胞因子)中⑶56+⑶16+細胞份數的降低，煙醯胺處理的培養基中CD56+CD16+NK細胞的比例在14天(淡陰影)時增加，在21天(黑暗陰影)時仍然持續；圖6A-6C是顯示採用煙醯胺的短期培養對骨髓NK和NKT細胞亞類增殖的影響。這些培養以由骨髓來源的免疫磁性純化的CD56+細胞開始，並以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在無(細胞因子)或有濃度逐漸增加的煙醯胺(「NAM」，ImM, 2. 5mM和5mM)下維持7天，並與表面標記的特異性抗體反應，而通過FACS對特異性表型進行分析。圖6A表示作為煙醯胺函數的CD56+CD3-NK細胞群百分數；圖6B描述了培養基中作為煙醯胺函數的NKT細胞CD56+CD3+群的降低；而圖6C表示相對於對照(細胞因子)，作為煙醯胺函數，⑶56+⑶16+NK細胞亞類的增殖；圖7是顯示在濃度逐漸增加(I. OmM至5. OmM)的煙醯胺存在下培養3周的純化臍血來源的⑶56+細胞的抑制性NK細胞⑶56+/NKG2A+亞類降低的柱狀圖。免疫磁性純化臍血來源的⑶56+細胞在濃度逐漸增加(I. OmM至5. OmM)的煙醯胺(「NAM」)存在或不存在(細胞因子)下採用細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)進行培養。在3周後，這些細胞與表面標記的特異性抗體反應，並通過FACS對⑶56+/NKG2A+表型進行分析。相比較對照(細胞因子)，在煙醯胺處理的培養基中CD56+NKG2A+細胞急劇減少，表明採用煙醯胺暴露NK細胞活化作用增強；圖8A是顯示隨著煙醯胺濃度增加培養的純化臍血來源的NK細胞遷移電位增強的柱狀圖。免疫磁性純化臍血來源的⑶56+細胞採用細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在2. 5mM或5. OmM)煙醯胺存在或不存在(細胞因子)下進行培養。在2周後，這些細胞在轉孔試驗(Transwell assay)中響應250ng/mL SDF對離體遷移(遷移)進行分析。底室的細胞通過FACS計數。相比較對照(細胞因子)，在無(淡陰影)或有SDF (黑暗陰影)(250ng/mL)存在下的遷移增強，表明通過煙醯胺增強了 NK細胞移動性，並引導了 NK細胞的遷移；圖8B是顯示在2. 5mM或5mM煙醯胺存在下培養3周的臍血來源的⑶56+細胞上遷移(CXCR4)、附著(⑶49e)和轉運(⑶62L)受體表達增加的表格。這些培養以免疫磁性微球純化臍血來源的⑶56+細胞開始，並採用細胞因子(包括FLT-3，IL-2和IL-15)或細胞因 子加煙醯胺(2. 5mM和5mM)維持。3周後，培養的細胞與所述指定的表面標記的特異性抗體反應，然後通過FACS監測。注意到，相比較對照(僅僅細胞因子)在煙醯胺存在下培養的細胞中CXCR4和⑶62L的表達急劇增強，⑶49e的表達提高；圖9是顯示採用濃度逐漸增加的煙醯胺培養的臍血來源的⑶56+細胞殺傷潛力增強的柱狀圖。免疫磁性微球純化臍血來源的⑶56+細胞採用細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在有(黑暗陰影)或無(淡陰影)2. 5mM煙醯胺存在下進行培養。經過2周之後，FACScalibur分析表明，所有的細胞都具有⑶56+/⑶3-表型。採用每次試驗5 X 103K562靶細胞對臍血NK細胞分析離體殺傷潛力進行分析，每個靶細胞5:1，10:1和20:1的NK細胞(EiT)0對Κ562細胞的死亡通過FACS作為PI陽性CFSE標記的細胞百分數進行監測。相比較對照(細胞因子)和新鮮未培養的臍血來源的CD56+細胞(無陰影)，增強的靶細胞殺傷作用強有力地表明，通過煙醯胺增強了 NK細胞殺傷潛力的活化作用；圖10是舉例說明採用煙醯胺培養3周的人體外周血NK細胞擴增的柱狀圖。通過新鮮單元單核細胞部分的T細胞(⑶3+或⑶3+⑶19+)耗盡而製備的外周血NK細胞[MidiMACS 分離(MACS 分離柱，Cat. No. 130-042-901)或 RosetteSep Human CD3+CellDepletion Cocktail (Stem Cell Technologies, RosestteSep, Cat. No. 15661)],通過 FACS分析進行表徵，並在所示濃度的煙醯胺(NAM 2. 5淡陰影和NAM 5mM黑暗陰影)存在下於VueLife Bags中培養。對照=僅僅細胞因子(NAM 0，無陰影)。培養介質包含MEM α，人體血清(10%ν/ν)和細胞因子(20ng/mL IL-15 和 50ng/mL IL-2 或僅僅 50ng/mL IL-2) 在 I和2周之後培養體積加倍，而在7天、14天和21天之後對細胞進行FACS分析的計數和染色。注意，在煙醯胺存在下擴增大大增加(相比較第O天倍數增加)，而同時僅僅細胞因子(NAM 0)對照卻表現出隨時間失去自更新能力的趨勢；圖11是顯示3周培養的煙醯胺和接種密度對人體外周血NK細胞的影響的柱狀圖。外周血NK細胞通過如圖10中描述的單核細胞T細胞(⑶3+或⑶3+⑶19+)耗盡而製備，並在每個培養袋中按2，5或IOXlO5個細胞/mL而以IOmL進行接種。細胞隨後在所示濃度(NAM 2. 5，淡陰影和NAM 5mM，黑暗陰影)煙醯胺，或僅僅細胞因子(細胞因子，無陰影)存在下擴增。在所有的接種密度下，顯而易見通過煙醯胺增強了 NK細胞的增殖；圖12是顯示在人外周血NK細胞21天培養中⑶56+⑶3-NK細胞百分比的柱狀圖。外周血NK細胞通過圖10中描述的單核細胞T-細胞(⑶3+或⑶3+⑶19+)耗盡進行製備，並在每個培養袋中按照2，5或IOX IO5個細胞/mL而以IOmL進行接種。細胞隨後在所示濃度(NAM 2. 5和NAM 5mM)煙醯胺，或僅僅細胞因子(細胞因子)存在下進行培養。注意到，即使在培養基中21天之後所有組中NK細胞百分數都較高，但是在暴露於煙醯胺的培養基中NK百分數比對照培養中高得多；圖13A-13C是顯示暴露於煙醯胺的人體外周血NK細胞培養中遷移受體⑶62L表達增加的柱狀圖。外周血NK細胞是通過在圖10中描述的單核細胞T-細胞(CD3+或⑶3+⑶19+)耗盡進行製備，並在所示濃度(NAM 2. 5，淡陰影和NAM 5mM,黑暗陰影)煙醯胺，或僅僅細胞因子(細胞因子，無陰影)存在下擴增。經過7 (13A)，14 (13B)和21 (13C)天之後，培養細胞與指定的表面標記的特異性抗體反應，然後通過FACS監測。注意，相比較對照(僅僅細胞因子)，在煙醯胺存在下培養的細胞中，CD62L表達急劇增強，隨著暴露持續時間而增加；圖14A-14B是顯示暴露於煙醯胺的人體外周血NK細胞培養中單核細胞的和粒性白細胞增殖的抑制作用的柱狀圖。外周血NK細胞圖10中描述的單核細胞T-細胞(CD3+ 或⑶3+⑶19+)耗盡進行製備，並在所示濃度(NAM 2. 5，淡陰影和NAM 5mM,黑暗陰影)煙醯胺，或僅僅細胞因子(細胞因子，無陰影)存在下擴增。經過2周，培養的細胞對於單核細胞標記⑶14 (圖14A)或粒性白細胞標記⑶15 (圖14B)與特特異性抗體反應，然後通過FACS監測。注意到，相比較對照(僅僅細胞因子)，在煙醯胺存在下培養的細胞中CD14+或CD15+細胞降低顯著增強；圖15A-1 是圖示說明採用暴露煙醯胺的人體外周血NK細胞的煙醯胺培養的NK細胞殺傷潛力增強的柱狀圖。外周血NK細胞是用圖10中描述的單核細胞CD3+或⑶3+⑶19+耗盡進行製備的，並在所示濃度(NAM 2. 5，淡陰影和NAM 5mM,黑暗陰影)煙醯胺，或僅僅細胞因子(細胞因子，無陰影)存在下擴增。經過2周之後，FACScalibur分析表明，所有的細胞都具有⑶56+/⑶3-表型。採用K562或BL2(15A)，原發性雙表型白血病(圖15B和15C)和Colo205克隆癌(圖15D)靶細胞按照每個靶細胞1: 1，2. 5:1，5:1或10: INK細胞的E:T比對外周血NK細胞分析離體殺傷潛力，如所示。細胞系的靶細胞死亡通過FACS作為雙重PI陽性和CFSE陽性的細胞百分數進行監測。原發性白血病的靶細胞死亡通過FACS作為CFSE標記靶細胞的降低百分數進行監測。相比較對照(細胞因子，NAM 0，無陰影)和新鮮未培養的NK細胞(對照，陰影線)，增強的靶細胞殺傷作用強有力地表明，通過煙醯胺增強了 NK細胞殺傷潛力的活化作用；圖16是顯示煙醯胺存在下擴增的NK細胞體內功能性(歸巢和植入)增加的柱狀圖。外周血NK細胞是用圖10中描述的單核細胞CD3+或CD3+CD19+耗盡進行製備，並在所示濃度(2. 5mM NAM，淡陰影；5mMNAM，黑暗陰影)煙醯胺，或僅僅細胞因子(細胞因子，無陰影)存在下擴增。在培養基中經過2至3周之後，每個實驗組的15X IO6個NK細胞輸注到照射的(350Rad) N0D/SCID小鼠中。輸注之後4天處死小鼠，並對脾、骨髓和外周血的樣品分析人體NK細胞(CD45+CD56+)細胞的移植。注意到，相比較未採用煙醯胺培養的NK細胞，採用煙醯胺培養的NK細胞的體內歸巢/停留/植入顯著更高；圖17是顯示在無(細胞因子)或有濃度逐漸增加(NAM，I至7. 5mM)的煙醯胺存在下培養時臍血來源的CD56+-純化NK細胞部分劑量依賴性增殖的柱狀圖。這些培養以免疫磁性微球上⑶56+表型純化的臍血NK細胞開始，並以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)維持高達3周。圖17顯示了培養基中在7天(無陰影)、14天(淡陰影)和21天(黑暗陰影)時CD56+NK細胞的增殖(相對於第O天，培養之初，成倍增加)。注意到，相比較對照(細胞因子)，在煙醯胺處理培養基的擴增中劑量依賴性顯著增加，在整個培養期間持續；圖18A和18B顯示了以部分⑶3-耗盡的外周血開始而在無(細胞因子，0ΝΑΜ，無陰影)或有煙醯胺存在下維持的培養基中T(CD3+)和NKT(CD3+CD56+)細胞增殖的抑制作用。這些培養以細胞因子(包括Flt-3，IL-2和IL-15)在有或無濃度逐漸增加(2. 5，黑暗陰影；5mM，淡陰影和7. 5mM，非常淡的陰影)的煙醯胺下維持3周，表面標記(56FITC和3APC)與特異性抗體反應，並通過FACS (圖18)分析特異性表型。注意到，在暴露煙醯胺的NK培養基中CD3+T細胞和CD3+CD56+NKT細胞顯著降低；圖19A和19B顯示了採用煙醯胺對⑶62L轉運受體表達的增強。圖19A是顯示相比較僅僅細胞因子的對照(O 「NAM」，無陰影)，在2. 5 (淡陰影)和5 (黑暗陰影)mM煙醯胺中暴露3周培養而具有IL-2的培養基中活化之前(非常淡陰影)和之後由外周血純化的⑶56+細胞上⑶62L轉運受體表達水平的柱狀圖。圖19B是在(2. 5至7. 5mM)煙醯胺，或對 照(NAM O)中培養3周的純化外周血⑶56+細胞上⑶62L表達的FACS分析。注意，相比較對照(僅僅細胞因子)，在有煙醯胺存在下培養的細胞中CD62L的表達顯著增強；圖20是顯示煙醯胺對由CD3耗盡而接著進行CD56+細胞選擇的外周血源單核細胞部分純化的CD56+細胞增殖(倍增)的效果的柱狀圖。純化的CD56+細胞在培養基(IL-2，IL-15和Flt-3，在有或無煙醯胺2. 5和5. OmM下)中而用源自相同血液單元(Cyt+Irr，NAM 2. 5+Irr和NAM 5+Irr)的外周血單核細胞的照射基質進行接種。照射的外周血細胞和CD56+選擇的細胞比為10:1。注意到，相比較對照(僅僅細胞因子)，用煙醯胺處理的培養基中增殖顯著增強；圖21是顯示所述煙醯胺對CXCR4在如圖20中所述用細胞因子和照射的基質細胞處理的培養基中⑶56+細胞上表達的效果的柱狀圖；圖22是顯示採用煙醯胺培養對CD62L在如圖20中所述用細胞因子和照射的基質細胞處理的培養基中⑶56+細胞上表達的效果的柱狀圖；圖23是顯示E:T為每個靶細胞1:1，2. 5:1和5:1的⑶56+細胞下用煙醯胺培養對K562靶細胞的CD56+細胞離體殺傷潛力的效果的柱狀圖。靶細胞死亡通過FACS作為PI-陽性CFSE標記的K562細胞的百分數進行監測。增強的靶細胞殺傷作用，對於在所示濃度的煙醯胺(NAM 2. 5+Irr,淡陰影；和NAM 5+Irr,黑暗陰影)培養的細胞，相比較對照(僅僅細胞因子，NAM Ο+Irr，無陰影)，強有力地表明，通過煙醯胺增強了 NK細胞殺傷潛力的活化作用，而與照射細胞的效果無關。
具體實施例方式本發明涉及繁殖自然殺傷(NK)細胞群而同時維持或增強細胞離體和/或體內功能的方法。在一個實施方式中，採用煙醯胺和/或其它煙醯胺部分和NK細胞生長因子離體培養NK細胞，有助於產生適用於作為治療性離體培養的細胞製劑的NK細胞群，這包括功能性NK細胞的繁殖群，在這種群中CD3+細胞的增殖受到抑制而同時NK細胞增殖優先增強。具體而言，在這個方面，本發明能夠用於提供功能性NK細胞的強健群，能夠適用於治療癌症和其它疾病的細胞移植的應用，以及適用於基因操作的NK細胞生成的應用，在這種應用中可以用於細胞基因療法。其它非限制性應用可以包括治療移植物抗宿主病(例如，在骨髓重構中)，異源和自體同源的採用的免疫療法，治療自身免疫性疾病，在NK細胞中採用敏化劑和基因修飾的組合療法。本發明進一步涉及適用於輸注的NK細胞製劑，並涉及製備這種製劑的製品生產。本發明的原理和操作參照實施例和附加描述可以更好地理解。在詳細解釋說明本發明至少一個實施方式之前，應該理解到，本發明在其應用中並無必要僅限於在以下描述中提出或通過實施例舉例說明的細節。本發明能夠以各種方式實踐或實施其它實施方式。自然殺傷(以下簡稱為「NK」)細胞是參與免疫反應的淋巴樣細胞。這些細胞具有各種功能，尤其是殺死活體內腫瘤細胞、發生致癌轉化和其它異常細胞的功能，而是先天免疫監視機制的重要組分。NK細胞展示出抗病毒性感染和腫瘤細胞的自發非-MHC-受限的細胞毒活性，並介導體內對病毒性感染和癌進展的抵抗力。因此，有效提高NK細胞數目的方 法能夠用於治療腫瘤並消除認為是腫瘤產生潛在之源的病毒感染細胞。因此，制定診斷級別的方案(例如，無基質層，最低細胞因子)而有效擴增活體NK細胞數目和有效增強其功能和提高向淋巴結歸巢及其輸注後體內穩態增殖的可能性，能夠提高採用的用NK細胞的免疫療法治療實體腫瘤、造血系統惡性腫瘤、病毒和自身免疫性疾病等的成功率。本發明基於培養期間NK細胞離體暴露於以上一定濃度的煙醯胺，這將在本文中進一步詳細描述，而有效增強功能性強效NK細胞的增殖和/或功能性並導致培養基的T細胞部分顯著降低的發現。因此，在其一個實施方式中，本發明提供了臨床上能夠有效誘導離體和體外功能上成熟的NK細胞的增殖和/或功能的合適培養條件，而同時不會導致非-NK細胞(例如，⑶3+)的增殖。因此，根據本發明一個實施方式的一個方面，提供了一種離體培養自然殺傷(NK)細胞的方法，所述方法包括採用至少一種生長因子和有效濃度、有效暴露時間和煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的有效持續時間培養包含NK細胞的細胞群，其中採用至少一種生長因子和有效濃度、有效暴露時間和煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的有效持續時間培養所述NK細胞導致以下至少之一(a)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，⑶62L的表達提高；(b)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，遷移響應提高；(C)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，歸巢和體內停留增加；(d)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，增殖更多；和(e)採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，細胞毒活性增加。正如本文中所用術語自然殺傷(NK)細胞是指涉及先天免疫應答的大顆粒淋巴細胞。功能上，NK細胞展示出經由含多種蛋白質，包括穿孔蛋白和顆粒酶蛋白酶的胞質顆粒的胞吐作用對抗各種靶的溶胞活性。殺傷作用在不需要預先對抗原敏化的暴露依賴性的非吞噬過程中觸發。人體NK細胞的特徵在於存在細胞-表面標記⑶16和⑶56，而不存在T細胞受體(⑶3 )。人體骨髓來源的NK細胞的進一步特徵在於⑶2+⑶16+⑶56+⑶3-表型，進一步包含T-細胞受體Zeta鏈[Zeta ( ζ )_TCR]，而經常以ΝΚρ46，ΝΚρ30或ΝΚρ44為特徵。非-NK細胞如NKT細胞或CD8NKT同時具有T細胞和NK細胞的特性和細胞-表面標記。在一個實施方式中，本發明的所述方法適用於由細胞群離體繁殖成熟NK細胞。正如本文中所用術語「成熟的NK細胞」被定義為一個堅定的NK細胞，具有特性表面標記和NK細胞的功能，而缺乏進一步分化的潛力。正如本文中所用，成熟的NK細胞包括但不限於0056胃細胞，可以進行增殖，並產生豐富的細胞因子，⑶56 細胞，表現出強大的細胞毒性，⑶56SOT94S和CD56 CD94*細胞。在另一個實施方式中，NK祖細胞，或混合的NK祖細胞和成熟的NK細胞群進行繁殖。例如，經由FACS分析或免疫組織化學染色技術，可確定⑶56+，⑶3+，⑶16，⑶94和其它標記的細胞表面表達。正如本文中所用術語「祖」是指能夠分裂和/或分化成一個或多個成熟的效應器細胞的不成熟細胞。淋巴祖細胞包括，例如，能夠產生成熟B細胞，T細胞和NK細胞譜系細 胞的多能造血幹細胞。在B細胞譜系(B卩，在產生成熟B細胞的發育途徑中)中，祖細胞還包括特徵在於免疫球蛋白基因重組和表達的原-B細胞和前-B細胞。在T細胞和NK細胞譜系中，祖細胞也包括骨髓來源的雙電位T/NK細胞祖細胞[例如，⑶34+⑶45RA (hi)⑶7抗原⑴和CD34 ( + )CD45RA (hi) Lin (-)CDIO ( + )細胞]，以及胸腺內祖細胞，包括雙陰性(關於⑶4和⑶8)和雙陽性胸腺細胞(T細胞譜系)和堅定NK細胞祖細胞。造血祖細胞包括CD34+細胞和早期祖細胞，如CD133+，CD34+CD38-和CD34+Lin_細胞。正如本文中所用的術語「離體(ex-vivo)」是指細胞從活有機體移出而在生物體外(例如，試管中)繁殖的過程。正如本文中所用術語「體外(試管內，in-vitiO)」是指僅在體外繁殖的細胞如各種細胞系進行培養的過程。NK細胞離體擴增，能夠根據本發明這個方面通過為離體NK細胞提供細胞增殖的條件並用煙醯胺部分離體培養NK細胞進行實施，從而離體繁殖NK細胞的細胞群。正如本文中所用的「培養」，包括提供NK細胞維持所需的化學和物理條件(例如，溫度，氣體)和生長因子。在一個實施方式中，培養NK細胞，包括為NK細胞提供增殖的條件。能夠有助於NK細胞增殖的化學條件的實例，包括但不限於緩衝劑，營養物質，血清，維生素和抗生素，以及細胞因子和其它通常提供於生長(即，培養)培養基中的生長因子。在一個實施方式中，NK細胞培養介質包括的MEM包含10% FCS的MEMa或包含5%人體血清/ LiforC'eil FBS 替代品(Lifeblood Products)的細胞 Gro SCGM (細胞 Genix)。適合本發明使用的其它介質，包括但不限於Glascow培養基(Gibco Carlsbad CA), RPMI培養基(Sigma-Aldrich 公司，聖路易斯 MO)或 DMEM (Sigma-Aldrich, St Louis MO)。應該注意至IJ，許多培養介質含有例如作為維生素補充劑的煙醯胺，MEMa (8. 19 μ M的煙醯胺)，RPMI(8. 19 μ M的煙醯胺)，DMEM (32. 78 μ M的煙醯胺)和Glascow培養基(16. 39 μ M的煙醯胺)，然而，本發明方法涉及補充包括培養基配方，或源自整體調節培養基組分濃度的任何煙醯胺和/或煙醯胺部分的外加煙醯胺。根據本發明一些實施方式，用生長因子培養NK細胞包括為細胞提供營養物和至少一種生長因子。在某些實施方式中，所述至少一種生長因子包括細胞因子和/或趨化因子，如但不僅限於，幹細胞因子(SCF)，FLT3配體，白細胞介素-2 (IL-2)，白細胞介素-7(IL-7)，白細胞介素-15 (IL-15)，白細胞介素-12 (IL-12)和白細胞介素-21 (IL-21)。使用其它細胞因子和生長因子都是可以設想的，例如，加入IL-l，TNF_a等。細胞因子和其它生長因子通常按照O. 5至100ng/mL,或I. O至80ng/mL,更通常5至750ng/ml,而更加常見的是5. O至50ng/ml (高達IOX的這種濃度也是可以設想的)的濃度範圍提供，而例如能夠從美國新澤西州落基山Perpo Tech, Inc.商購獲得。在一個實施方式中，至少一種生長因子IL-2。在另一個實施方式中，生長因子是IL-15。在另一個實施方式中，NK細胞採用IL-2 和 IL-15 培養。另外，在這個方面應該理解到，新型細胞因子不斷發現，其中一些可以在本發明NK細胞增殖的方法中找到用武之地。對於許多應用，將細胞引入(或重新引入)人體主體中，經常優選使用無血清製劑，如培養淋巴細胞的AM V. 無血清培養基或MARROWMAX. 骨髓培養基。這種培養基製劑和補充劑可從商業來源如Invitrogen (GIBCO) (Carlsbad,Calif)獲得。這些培養能夠用胺基酸、抗生素和/或採用細胞因子進行補充而提高最佳生命力、增 殖、功能性和/或存活率。根據一個實施方式，這些細胞採用生長因子和煙醯胺和/或煙醯胺部分進行培養。正如本文中所用術語「煙醯胺部分」是指煙醯胺以及由煙醯胺衍生的產物，衍生物，類似物及其代謝物，如例如，MD，NADH和NADPH，這些能夠有效而優選增強NK細胞增殖和/或活化作用的物質。煙醯胺衍生物、類似物和代謝物能夠進行篩選，並通過加入到按以下描述而維持的NK培養基中，加入到功能分析試驗如殺傷和遷移率分析試驗(參見實施例部分)中或在設計用於本領域眾所周知的高產量分析試驗的自動篩選方案中評價其對培養基中的離體NK增殖的影響。正如本文中所用，短語「煙醯胺類似物」是指在以上提及的或類似試驗分析中已知作用類似煙醯胺的任何分子。煙醯胺類似物的代表性實例能夠包括，但不限於，苯甲醯胺，煙乙硫醯胺(乙硫異煙醯胺，nicotinethioamide)(煙醯胺的硫醇類似物),煙酸和α_氨基-3-吲哚丙酸。短語「煙醯胺衍生物」進一步是指煙醯胺自身或煙醯胺類似物的任何結構衍生物。這種衍生物的實例包括，但不限於，取代的苯甲醯胺，取代的煙醯胺和煙乙硫醯胺(乙硫異煙醯胺，nicotinethioamide)和N-取代的煙醯胺和煙硫醯胺(硫代煙醯胺，nicotinthioamide), 3-乙醯卩比唳和煙酸鈉。在本發明一個具體實施方式
中，煙醯胺部分是煙醯胺。正如本文中所用短語「煙醯胺和/或其煙醯胺部分的有效濃度」定義為當煙醯胺和/或煙醯胺部分提供於培養基中所述NK細胞群達到對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分有效暴露持續時間和在對培養基中煙醯胺和/或其它煙醯胺部分暴露有效時間而導致相比較相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或煙醯胺部分培養的NK細胞出現NK細胞的CD62L表達提高、遷移響應提高、歸巢和體內停留增加、增殖更多和細胞毒活性增加的一種或多種情況時的濃度。適合在本發明的某些實施方式中使用的煙醯胺或煙醯胺部分濃度通常的範圍為約O. 5mM至約50mM，約I. OmM至約25mM，約I. OmM至約25mM，約2. 5mM至約10mM，約5. OmM至約10mM。基於這些煙醯胺濃度對增殖和NK細胞功能的效應，以下實施例I-VII證明了約O. 5至約10mM，通常2. 5或5. OmM的典型煙醯胺部分(煙醯胺)有效濃度。根據本發明的一些實施方式，煙醯胺和/或煙醯胺部分的濃度範圍為約O. 5，約O. 75，約I. 0，約I. 25，約 I. 5，約 I. 75，約 2. O,約 2. 25，約 2. 5，約 2. 75，約 3. O,約 3. 25，約 3. 5，約 3. 75，約 4. O,約 4. 25，約 4. 5，約 4. 75，約 5. 0，約 5. 25，約 5. 5，約 5. 75，約 6. 0，約 6. 25，約 6. 5，約 6. 75，約 7. O,約 7. 25，約 7. 5，約 7. 75，約 8. O,約 8. 25，約 8. 5，約 8. 75，約 9. O,約 9. 25，約 9. 5，約 9. 75，約 10. 0，約 11. 0，約 12. 0，約 13. 0，約 14. 0，約 15. 0，約 16. 0，約 17. 0，約 18. O 和約20. OmM,並包括所有有效中間濃度。煙醯胺和/或煙醯胺部分的有效濃度能夠根據NK增殖和/或活性的任何試驗分析，例如，以下實施例I至VI中詳細描述的細胞培養或功能試驗進行確定。根據一個實施方式，煙醯胺和/或煙醯胺部分的有效濃度是相比較具有小於O. ImM煙醯胺和/或煙醯胺部分的「對照」培養基並由相同的臍血、骨髓或外周血製劑進行測試，在相同的分析試驗和在類似的培養條件(煙醯胺和/或煙醯胺部分的暴露持續時間，對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的暴露時間)下其應用於培養基中「增強」或導致NK細胞在培養基增殖和/或功能淨增加的濃度。
正如本文中所用短語NK細胞對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分暴露的「有效持續時間」定義為當煙醯胺和/或其它煙醯胺按照有效濃度和有效暴露時間提供於培養基中的NK細胞群時導致相比較相同條件下不採用或採用小於O. ImM煙醯胺和/或煙醯胺部分培養的NK細胞出現NK細胞的CD62L表達提高、遷移響應提高、歸巢和體內停留增加、增殖更多和細胞毒活性增加的一種或多種情況的該期間內暴露煙醯胺的持續時間。適合於本發明某些實施方式中使用的NK細胞群對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的持續暴露時間，通常的範圍為約》1至約5周，約30h至約4周，約2天至約3周，約I周，約2周，約3周。基於暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分對增殖和NK細胞功能的效應，以下實施例I-VI證明了約I周至約3周的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分典型有效暴露持續時間。根據本發明的一些實施方式，煙醯胺和/或其它煙醯胺部分暴露持續時間為約I. 0，約，約2. 0，約2. 5，約3. 0，約3. 5，約 4. 0，約 4. 5，約 5. 0，約 6. 0，約 7. 0，約 8. 0，約 9. 0，約 10. 0，約 11. 0，約 12. 0，約 13. 0，約14. 0，約 15. 0，約 16. 0，約 17. 0，約 18. 0，約 19. 0，約 20. 0，約 21. O 天，約 25 天，約 30 天，約35天並包括所有有效中間持續時間。煙醯胺和/或其它煙醯胺部分有效暴露持續時間能夠根據NK增殖和/或活性的任何試驗分析，例如，以下實施例I至VI中詳細描述的細胞培養或功能試驗進行確定。應該理解到，NK細胞群對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的暴露能夠以建立細胞培養，或在細胞培養期間的任何時間開始，甚至恰好在NK細胞使用(例如，輸注(注入))之前進行一段短的持續時間。正如本文中所用短語NK細胞群對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的「有效暴露時間」定義為NK細胞群培養期間將煙醯胺和/或其它煙醯胺部分按照煙醯胺和/或其它煙醯胺部分有效濃度和有效持續時間提供於NK細胞群導致相比較相同條件下不採用或採用小於O. ImM煙醯胺和/或煙醯胺部分培養的NK細胞出現NK細胞的CD62L表達提高、遷移響應提高、歸巢和體內停留增加、增殖更多和細胞毒活性增加的一種或多種情況時的時間。適用於本發明一些實施方式的NK細胞群對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的暴露時間通常為從NK細胞接種至培養之後約5周，從接種之後約Ih至培養之後約3周，從約24h至培養之後約3周和從培養基中NK細胞群接種的時間。根據本發明的一些實施方式，NK細胞對煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的暴露時間接種之時，該細胞接種之後約2h，該細胞接種之後約12h,該細胞接種之後約24h,該細胞接種之後約2天，該細胞接種之後約4天，該細胞接種之後約7天，該細胞接種之後約8. O，約9. O，約10. O，約11.0，約12. 0，約13. 0，約 14. 0，約 15. 0，約 16. 0，約 17. 0，約 18. 0，約 19. 0，約 20. 0，約 21. O 天，約 25 天，約30天，約35天，而包括所有的有效中間時間。煙醯胺和/或其它煙醯胺部分有效暴露時間能夠根據NK增殖和/或活性的任何試驗分析，例如，以下實施例I至VI中詳細描述的細胞培養或功能試驗進行確定。正如在以下實施例部分中的描述，米用至少一種生長因子和以有效暴露時間和培養有效持續時間提供的有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養NK細胞群，導致相比較相同條件下以小於O. ImM煙醯胺和/或煙醯胺部分培養的NK細胞出現所培養細胞增殖提高和/或NK細胞功能增強中至少之一。正如本文中所用術語「繁殖」或「增殖」是指生長，例如，細胞生長，和細胞數量的倍增。正如本文中所用的繁殖和增殖，涉及培養期間出現的NK細胞數量的增加。展示NK細胞表型的細胞體內或體外繁殖是一種在其受到例如用IL-2、EB病毒轉化的淋巴線等刺激 之後的已知現象。細胞增殖的試驗分析在本領域內是眾所周知的，包括但不限於集落生成分析法，其中細胞以低密度接種和生長，並對集落計數；機械分析法[流式細胞術(例如，FACS )，碘化丙啶]，這種方法機械測定細胞數目；代謝分析法(如引入四唑鎗鹽，例如，XTT, MTT等)，這種方法測定活體細胞數量；直接增殖分析法(如BudR，胸腺嘧啶核苷引入等)，這種方法測定生長群的DNA合成。在一個實施方式中，採用根據本發明的有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞群的細胞增殖，在培養基中接種NK細胞之後的預定時間(例如，約10h，12h，約1，2，3，4，5，6，7天，約1，2，3，4，5周，2月或更長)通過FACS分析，使用抗-CD56和抗-CD3標記識別和定量群的CD56+CD3-NK細胞部分而進行測定。NK細胞的增殖能夠表示相比較培養之前原始NK細胞部分的NK細胞倍增，(例如，擴增或成倍擴增)。在某些實施方式中，根據本發明暴露有效濃度的煙醯胺的NK細胞群，在約5，約7，約12，約14，約18，約21，約25，約30或更多天培養之後，所具有的NK細胞群倍增至少2X，至少10X，至少20X，至少40X，至少50X，至少75X，至少100X，至少150X，至少250X和至少500X或更高。在另一實施方式中，暴露有效濃度的煙醯胺的NK細胞群的成倍擴增，通過FACS 測定，為至少約 I. 2X,約 I. 3X,約 I. 5X,約 I. 75X,約 2X,約 2. 25X,約 2. 5X,約 2. 75X,約 3. 0，約 3. 5X,約4X，約4. 5X，約5X，約6X，約7X，約8X，約9X，約10X，大於在相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞的擴增。正如本文中所用術語「功能」或「NK細胞功能」是指歸屬於NK細胞的任何生物功能。NK細胞功能非限制性的清單包括，例如，細胞毒性，誘導細胞凋亡，細胞移動性，定向遷移，細胞因子和其它細胞信號響應，細胞因子/趨化因子的產生和分泌，活化和抑制性細胞表面分子的體外表達，在移植的宿主中細胞歸巢和植入(體內停留)，以及體內疾病或疾病過程的改變。在某些實施方式中，通過暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分增強的NK細胞功能包括CD62L表面標記的表達提高、遷移響應提高和NK細胞細胞毒活性更大，以及輸注的NK細胞的歸巢和體內停留增加中的至少一種。粘附和遷移分子如⑶62L、CXCR-4、⑶49e等，對於移植中細胞的歸巢/植入和停留是很重要的，對其試驗分析在本領域內是眾所周知的。CD62L在細胞中的表達能夠，例如，通過流式細胞術、免疫檢測、定量cDNA擴增和雜交等進行試驗分析。在一個實施方式中，⑶62L的表達通過將細胞暴露螢光標記的特異性抗人體⑶62L單克隆抗體[例如，⑶62LPE, Cat. No. 304806,BioLegend (San Diego，CA，USA)]，並通過螢光激活細胞分選法(FACS)進行這些細胞的分類而在不同NK細胞群中進行檢測。在某些實施方式中，暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群通過FACS 檢測而檢測到具有至少25%，至少30%，至少40%或更多表達⑶62L的細胞。在另一實施方式中，通過檢測FACS ，當相比較相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞，根據本發明暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群具有至少約I. 2X，約I. 3X，約I. 5X，約I. 75X，約2X,約 2. 25X,約 2. 5X,約 2. 75X,約 3. 0X,約 3. 5X,約 4X,約 4. 5X,約 5X,約 6X,約 7X,約 8X,約9X，約IOX或更多倍的⑶62L表達。對於細胞遷移的試驗分析在本領域內是眾所周知的。例如，通過遷移試驗分析法或補洞試驗分析法就能夠分析細胞的遷移。在遷移試驗分析法中，如雙室技術，細胞通過障礙(例如，過濾器)與刺激物分離，而細胞的遷移通過在特定的時間間隔下從起點計數損失的細胞，累計穿過障礙的細胞，或同時進行這二者而進行檢測。在補洞試驗分析中，細胞置 於可見隙(刻痕瓊脂板，繞著一個圓圈，等)的周邊並用刺激物培養。細胞響應刺激物而施加細胞移動性的細胞之間的空間封閉，採用細胞計量術、免疫檢測、顯微鏡/形態測定等進行可視觀察。在一個實施方式中，NK細胞不同群的遷移電位響應SDF (250ng/mL)而通過「Transwell」 遷移試驗分析法進行檢測。在某些實施方式中，根據本發明暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群，通過本文中描述的Transwell試驗分析，具有至少40%，至少50%，至少60%，至少70%和至少80%或更多的遷移測定值。在另一實施方式中，暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群，通過Transwell試驗分析進行檢測，相比較相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞時，具有至少約 I. 2X,約 I. 3X,約 I. 5X,約 I. 75X,約 2X,約 2. 25X,約 2. 5X,約 2. 75X,約 3. 0，約3. 5X，約4X，約4. 5X，約5X，約6X，約7X，約8X，約9X，約IOX或更多倍的遷移。對輸注或移植細胞進行歸巢和體內停留的試驗分析在本領域內是眾所周知的。正如本文中所用術語「歸巢」是指輸注或移植細胞在宿主靶器官中到達和存活的能力。例如，NK細胞靶器官能夠是淋巴樣組織，肝細胞靶器官能夠是肝臟軟組織，肺泡細胞靶器官能夠是肺軟組織等。正如本文中所用術語「體內停留」(也已知為「植入」)是指輸注或移植細胞進行增殖而在靶器官中存活的能力。實驗分析移植NK細胞歸巢和體內停留的動物模型包括但不限於，免疫缺陷的小哺乳動物(如SCID和IL2R Y nul1鼠等)。SCID-Hu鼠模型採用移植人體胎兒胸腺和肝組織或胎兒BM組織的C. B-17SCid/SCid(SCID)鼠，並提供合適的模型進行移植人體NK細胞停留和治療潛力的評價。移植細胞的歸巢和體內停留也能夠在人體宿主主體內進行評價。在一個實施方式中，歸巢和體內停留的試驗分析在受照射的N0D/SCID鼠(參見本文中實施例VI)中進行，這些鼠移植了，例如，約15X104，約15X105，約15X106，約15 X IO7或更多根據本發明採用有效濃度的煙醯胺培養的人體NK細胞，並在輸注之後預定時間(例如，輸注之後約511，1011，1211，1，2，3，4，5，6，7天，1，2，3，4，5周，2，3，4月或更長時間)進行處死。這些鼠一旦處死，就通過FACS對脾、骨髓、外周血和其它器官的樣品評價使用人體特異性Abs的人體NK細胞(CD56+CD45+)的存在。體內停留的百分數表示展示供體表型(例如，人體細胞的CD45)的器官的細胞百分數。在某些實施方式中，輸注根據本發明暴露有效濃度煙醯胺的NK細胞群的宿主鼠的靶器官(例如，淋巴樣組織，如骨髓，脾，胸腺，淋巴結，GALT)具有至少5%，至少10%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%和至少80%或更高的歸巢和體內停留。在一個具體實施方式
中，15X 106個根據本發明採用有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞輸注於照射的SCID鼠，而在輸注之後4天，宿脾內就檢測到至少25%的具有供體特異性細胞譜系(例如，CD45+)的NK細胞。在另一實施方式中，通過檢測FACS ，相比較相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞時，暴露有效濃度的煙醯胺的NK細胞群具有至少約 I. 2X,約 I. 3X,約 I. 5X,約 I. 75X,約 2X,約 2. 25X,約 2. 5X,約 2. 75X,約 3. 0，約 3. 5X,約4X，約4. 5X，約5X，約6X，約7X，約8X，約9X，約IOX或更多倍的歸巢和體內停留。正如本文中所用術語「穩態增殖」是指靶器官或組織中隨時間推移，優選月或年，能夠維持所輸注NK細胞的穩定數目的增殖。目前涉及NK細胞移植患者的許多臨床試驗正在進行，對於這些病症，包括而 不排他地，例如，白血病(NCT 00799799和NCT 00303667)，惡性血液病(NCT 00697671，NCT 00354172 和 00640796)，後-ASCT (NCT00586703)，成神經細胞瘤(NCT 00698009),惡性黑[色]素瘤(NCT00846833)，採用化療的組合療法(NCT 00625729)，實體腫瘤(NCT00640796)和鼻咽癌(NCT 00717184)以及對於各種惡性腫瘤(NCT01105650)。對於NK細胞療法，目前臨床試驗和詳細方案的完整而詳細的現有清單在美國國立健康臨床試驗研究所網站能夠找到。細胞毒性(細胞「殺傷作用」)的試驗分析在本領域內是眾所周知的。適用於重導向殺傷試驗分析的合適靶細胞實例有癌細胞系，原發性癌細胞實體腫瘤細胞，白血病細胞或病毒感染細胞。具體而言，能夠使用K562，BL-2, colo250和原發性白血病細胞，但是能夠使用任何許多其它細胞類型，而這在本領域內是眾所周知的(參見，例如，Sivori etal. (1997)J. Exp. Med. 186:1129-1136 ；Vitale et al. (1998)J. Exp. Med. 187:2065-2072 ;Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:953-960 ；Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab.Immun. 8:1131-1135)。細胞殺傷作用通過細胞存活率試驗分析法(例如，色素排除法，鉻釋放試驗法，CFSE)，代謝分析法(例如，四唑鎗鹽)和直接觀察法進行評價。在一個實施方式中，NK細胞不同群的細胞毒性潛力在暴露E:T比為1:1、2. 5:1、5:1或10:1的NK細胞的細胞中通過CFSE停留和PI攝取進行檢測，而根據本發明暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群殺死至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%和至少80%或更多的所述靶細胞，這通過本文中所述的色素排除分析法進行測定。在另一實施方式中，通過檢測色素排除分析法進行測定，相比較相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞時，暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群具有至少約I. 2X，約I. 3X，約I. 5X，約I. 75X，約2X，約2. 25X，約2. 5X，約2. 75X，約3. 0，約3. 5X，約4X，約4. 5X，約5X，約6X，約7X，約8X，約9X，約IOX或更多倍的殺傷潛力。所述NK細胞的培養能夠使用或不使用飼養細胞或飼養細胞層而完成。無飼養層的離體培養對於所培養的細胞，包括NK細胞的臨床應用是高度有利的。這將在以下實施例部分進行詳細描述，在源自經選擇和未經選擇的臍血和骨髓細胞的無飼養層和飼養細胞的長短期NK細胞培養基中觀察到NK細胞離體增殖和細胞功能的有效增強。因此，根據一個實施方式，所述NK細胞群的培養在無飼養層或飼養細胞下完成。根據本發明一些實施方式，而這將在以下實施例部分進行詳細描述，NK細胞群採用IL-2和5mM煙醯胺進行培養，對煙醯胺的暴露時間為從包含NK細胞的細胞群接種的時間，而所述暴露持續時間為約2周至約3周，可選地為2周，而可選地為3周。在本發明的某些實施方式中，根據本發明暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群，相比較相同條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞時，能夠具有NK細胞CD62L表面標記的表達提高， 遷移響應提高和細胞毒活性更大，以及輸注的NK細胞歸巢和體內停留增加中至少任意兩種，可選地任意三種，可選地任意四種和可選地所有五種。在一個具體實施方式
中，根據本發明暴露有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞群具有更大的增殖，提高的CD62L表達和改善的輸注NK細胞歸巢和體內停留。正如本文中的詳細描述，在飼養細胞存在下也觀察到通過暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的NK細胞增殖和細胞功能的增強。因此，在另一實施方式中，NK細胞在飼養細胞或飼養層存在下進行培養。在通常情況下，飼養層包括照射的基質細胞，永生化細胞系的細胞等。在飼養層上或採用飼養細胞培養NK細胞的方法詳細描述於，例如，Friaset al. (Exp Hematol2008 ;36:61-68)，Harada et al. (Exp Hematol 2004;32:614-21)，Campana et al. (US20090011498)Childs et al. (US20090104170)和Tsai(US20070048290)(結合於本文中作為參考)中。本發明的NK細胞可以源自任何包含這種細胞的來源。NK細胞可以發現於許多組織，並能夠獲自，例如，淋巴結、脾、肝、肺、腸、蛻膜，並也能夠獲自iPS細胞或胚胎幹細胞(ESC)0通常情況下，臍血，外周血，流通外周血和骨髓，含有異質淋巴細胞的細胞群，用於提供大量的NK細胞供研究和臨床應用。因此，根據本發明一個實施方式的一個方面，所述方法包括培養源自臍血、外周血或骨髓中之一的NK細胞群。正如本文中的詳細描述，據發現，不同源的NK細胞製劑之間在不同比例的淋巴細胞的細胞類型中發現了顯著差異。例如，(通過免疫磁性分離法)從臍血中分離的CD56+細胞通常比骨髓或外周血的CD56+部分包含更大比例的⑶56+⑶3-NK細胞和更少的共表達⑶56NK標記和⑶3T細胞標記(⑶56+⑶3+)的NKT細胞(參見本文中的實施例I-VI)。因此，在某些實施方式中，NK細胞由包含NK細胞、⑶3-細胞和⑶3+細胞的異質細胞群培養。在一個實施方式中，⑶3+部分大於⑶3-NK細胞部分，這在骨髓，臍血或外周血中是很典型的。在還有的另一實施方式中，NK細胞群針對NK細胞進行了選擇或富集。在某些實施方式中，NK細胞能夠由新鮮的細胞群繁殖，而同時其它實施方式由儲存的細胞群(如低溫冷藏和解凍的細胞)或先前培養的細胞群繁殖NK細胞。NK細胞與臍血或外周血或骨髓的單核細胞部分有關。在一個實施方式中，包含所述NK細胞的細胞群是耗盡CD3+細胞，或CD3+和CD19+細胞的單核或總核細胞群。在另一實施方式中，包含所述NK細胞的細胞群是未經選擇的NK細胞群。在還有的另一實施方式中，所述細胞經過了進一步的選擇而所述NK細胞包含⑶56+⑶16+⑶3-細胞和/或⑶56+⑶16-⑶3_。根據表型選擇NK細胞的方法(例如，免疫檢測法和FACS分析法)在本文中，例如，在以下方法部分中進行了詳細描述。
最常見的是，整個血液或骨髓樣品進一步加工處理而獲得在將淋巴細胞放置於培養基(或緩衝液)中之前的細胞群。例如，血液或骨髓樣品能夠進行加工處理而富集或純化或分離具體定義的細胞群。術語「純化」和「分離」並不需要絕對純度；相反，這些預想作為相對術語。因此，例如，純化的淋巴細胞群是指其中指定的細胞比在其源組織中的那些細胞更富集的群。基本純淨的淋巴細胞製劑能夠經過富集而使之所需的細胞佔製劑中存在的總細胞的至少50%。在某些實施方式中，基本純淨的細胞群佔製劑中總細胞的至少60%，至少70%,至少80%，至少85%，至少90%或至少95%或更多。富集和分離淋巴細胞的方法在本領域內是眾所周知的，而合適的方法能夠基於所需的群進行選擇。例如，在一種方法中，源材料通過去除紅血球而富集淋巴細胞。在其最簡單的形式中，紅血細胞的去除可能涉及未凝血的整個血液或骨髓的離心。紅血細胞基於密度而與淋巴細胞和其它細胞分離。淋巴細胞富集部分隨後能夠選擇性地回收。淋巴細胞及其祖細胞也能夠通過離心而採用分離介質如獲自許多商業渠道的標準淋巴細胞分離介質(LSM)進行富集。另外，淋巴細胞/祖細胞能夠採用各種基於親合力的方法和步驟進行富集。許多抗體介導親合力的製備方法在本領域是眾所周知的，如抗體共軛磁力微珠。淋巴 細胞的富集也能夠採用陰性選擇多餘細胞的商購獲得的製劑，如FICOLL-HYPAQUE 和其它配製用於富集整個淋巴細胞、T細胞或NK細胞的密度梯度介質而進行實施。由血液、骨髓或組織樣品選擇NK細胞的方法在本領域內是眾所周知的(參見，例如，Litwin等的美國專利NO. 5，770，387)(以其全文結合於本文中作為參考)。最常用的是基於分離和純化⑶56+細胞，通常接著是單核細胞分離和耗盡非-NK細胞如⑶3+，CD34+，CD133+等的方案。兩種或多種方案的組合能夠用於提供無非-NK汙染物的更大純度的NK細胞群。NK細胞製劑的純度對於臨床應用意義重大，因為非-NK細胞，如T-細胞和NKT-細胞有助於抗原特異性反應如GVHD，而損害NK細胞移植的潛在受益。分離NK細胞的商購可獲得的試劑盒包括一步法(例如，⑶56微珠和⑶56+，⑶56+⑶16+分離試劑盒，Miltenyi Biotec, Auburn CA)和多步法，包括⑶3+的耗盡或部分耗盡或採用非-NK細胞抗體識別而去除T-細胞(例如，0KT-3)、B細胞、幹細胞、樹突細胞、單核細胞、粒性白細胞和紅系細胞的耗盡。因此，在某些實施方式中，NK細胞選擇⑶56+⑶3_、⑶56+⑶16+⑶3_、CD56+CD16-CD3-或其它純化的NK細胞群。然而，應該注意到，臨床應用通常偏好操作更少的候選細胞群。在一個實施方式中，NK細胞通過短或長期培養基進行離體繁殖。正如實施例I中的詳細描述，根據本發明的方法，NK細胞採用生長因子和煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養少至7天，或多至3周，導致相比較採用細胞因子而煙醯胺和/或其它煙醯胺部分小於O. ImM培養的細胞，所培養的NK細胞優先增殖和/或功能性增強。因此，在本發明的某些實施方式中，NK細胞群培養至少3，至少5，至少7，可選10，可選12，可選14，可選16，可選18，可選20和可選21天，或1，2或3周，4周，5周，6周，或更長時間。正如實施例I至VI中的詳細描述，典型的非限制性培養持續時間為7天(I周)和21天(3周)。NK細胞群能夠使用各種方法和設備進行培養。培養設備的選擇通常基於培養的規模和目的。細胞培養按比例放大，優選涉及使用專用設備。大規模臨床級別的NK細胞生產的設備詳細描述於，例如，Spanholtz et al. (PLoS ONE 2010 ;5:e9221)和 Sutlu etal. (Cytotherapy 2010, Early Onlinel-12)中。
Peled等(WO 03/062369，以其全文結合於本文中作為參考)最近已經公開了煙醯胺處理對CD34+細胞植入潛力的顯著影響。在培養基中的細胞增殖和足以發生最低或無細胞分裂的短持續期培養中都已經觀察到這種煙醯胺的效應。因此，儘管離體培養基中的NK細胞增殖增強是本發明的重要目標，但是還設想了 NK細胞幾分鐘、幾小時、I天等的短期離體暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分。這種NK細胞短期暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分不足以發生增殖的時間，能夠潛在地增強，例如，NK細胞功能性(細胞毒性，遷移電位，細胞表面分子表達，植入潛力等)。煙醯胺的短期處理能夠提供於新鮮細胞、低溫冷藏和解凍細胞、培養基中細胞、純化細胞、混合細胞群等。在一個實施方式中，這種短期煙醯胺和/或其它煙醯胺部分處理在NK細胞使用(移植，輸注等)之前立即提供。本發明人已經令人驚訝地觀察到，在培養基中有效濃度的煙醯胺存在下，培養包含NK (CD56+)細胞和非-NK細胞(例如，T (CD3+)細胞，NKT (CD56+CD3+)細胞等)的混合細胞群，不僅增強了 NK細胞的增殖、生長和功能性，而且抑制了相同培養基中非-NK細胞(例如，T-細胞和NKT細胞)的增殖和生長(參見本文中的實施例V)。因此，在本發明的一個實施方式中，採用有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養NK和CD3+細胞的異質群，導致相比較在其它相同的培養條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的 NK細胞群，產生了具有⑶3+與⑶56+⑶3-的細胞比降低的NK細胞群。在還有的另一實施方式中，根據本發明的方法，採用有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養NK和CD3+細胞的異質群，導致相比較在其它相同的培養條件下採用小於O. ImM煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養的NK細胞群，產生了 CD14+和CD15+細胞數目降低的NK細胞群。以上所述的離體培養NK細胞群的方法尤其能夠產生NK細胞的培養群。因此，進一步根據本發明的一方面，與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，提供的NK細胞群特徵在於以下的至少之一⑶62L的表達提高，遷移響應提高，歸巢和體內停留增加，增殖更多，細胞毒活性提高和⑶3+與⑶56+/⑶3-的細胞比降低。在某些實施方式中，，與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，所述NK細胞群特徵在於以下方面至少任意兩方面，至少任意三方面，至少任意四方面，至少任意物方面或所有TK方面CD62L的表達提聞，遷移響應提聞，歸巢和體內停留增加，增殖更多，細胞毒活性提高，而⑶3+與⑶56+/⑶3-的細胞比降低。在實施例VI中，本發明人已經證明，根據本發明方法製備的NK群提高了體內功能潛力，這通過靶器官(例如，脾，骨髓和外周血)中的定位和體內停留進行證實。因此，在本發明一些實施方式的一個具體方面，提供的NK細胞群特徵在於移植時歸巢、植入和體內停留增強，其中向照射的宿主(例如，SCID鼠)輸注至少15 X IO6個NK細胞群的細胞導致宿主淋巴樣組織中產生至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少70%，至少80%和至少90%或更多的供體來源的NK細胞，這通過免疫檢測和流式細胞術在輸注後第4天進行測定。在一個實施方式中，輸注至少15 X IO6個NK群的細胞導致宿主淋巴樣組織中產生至少25%供體來源的NK細胞，這通過免疫檢測和流式細胞術在輸注後第4天進行測定。其它相關的標準可以適用於表徵NK細胞群。因此，在還有的另一實施方式中，本發明的NK群進一步的特徵在於向宿主輸注之時至少30%的細胞群表達⑶62L，這通過流式細胞術和免疫檢測測定。在還有的另一實施方式中，NK細胞群能夠根據CD3+細胞汙染的純度程度進行進一步表徵，例如，在輸注之時NK細胞群具有的CD3+與CD56+/CD3-的細胞比等於或小於1:100。在本發明的上下文中，應該理解到，治療性細胞群能夠連同包含煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的培養基一起，與培養基分離，和與藥用載體混合而提供。因此，本發明的細胞群能夠採用藥用載體或稀釋劑，如滅菌鹽水和水性緩衝溶液給予。這種載體和稀釋劑的使用在本領域內是眾所周知的。在本發明這方面的一個具體實施方式
中，NK細胞群包含在有效用量的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分存在下離體培養的NK細胞群；和藥用載體。在還有的另一實施方式中，所述離體培養的細胞群，當相比較採用生長因子在小於O. ImM的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分中培養的NK細胞群時，包含已經活化並提高了對靶細胞毒性能力的NK細胞。
煙醯胺和/或其它煙醯胺部分維持NK細胞增殖和功能的能力能夠進一步用於各種技術應用中根據本發明的其它方面，提供了一種保存NK細胞的方法。在一個實施方式中，所述方法在有效用量的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分存在下通過在以下步驟至少之一中處理NK細胞而進行實施收穫，分離和/或儲存。根據本發明還有的其它方面，提供了 NK細胞的收集/培養袋。本發明的細胞收集/培養袋採用有效用量的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分進行補充。根據本發明，也提供了 NK細胞的分離和/或衝洗緩衝液。這種分離和/或衝洗緩衝液採用有效用量的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分進行補充。正如以下的進一步詳細描述，NK細胞可以進行遺傳修飾。在離體基因療法中，細胞從患者移出，而同時進行體外培養處理。一般而言，功能替代基因經由合適的基因遞送載體/方法(轉染、轉導、均質重組等)和表達系統按需引入該細胞中，隨後改性的細胞經過培養而返回宿主/患者中。這些遺傳重新移植的細胞已經表明能夠原位表達所轉染的遺傳物質。因此，進一步根據本發明的一個方面，提供了一種轉導具有外源基因的離體培養的NK細胞的方法。這種方法，根據本發明的這個方面，通過以下步驟實施(a)根據本發明NK細胞培養方法通過培養NK細胞群而離體培養NK細胞群，和(b)轉導具有外源基因的所述培養的NK細胞群的細胞。應該理解到，步驟(a)和步驟(b)的次序可以顛倒。轉導所培養的NK細胞的方法在本領域是已知的，例如，離體修飾的NK細胞的用途已經由Campana等(US20090011498)公開。因此，本發明所培養的細胞能夠進行改性而表達基因產物。正如本文中所用短語「基因產物」是指蛋白，肽和功能RNA分子。一般而言，通過核苷酸分子編碼的基因產物是要供給於主體的所需基因參悟。這種基因產物的實例包括蛋白，肽，糖蛋白和脂蛋白，通常通過接受主體的細胞生產。另外，所編碼的基因產物是通過所述細胞(例如，引入的遺傳物質編碼誘導要供給於主體的基因產物的轉錄的轉錄因子)誘導所需基因參悟表達的產物。例如，這種NK細胞能夠改性而表達細胞表面分子，或能夠增強或調節NK細胞功能的胞內基因產物，如細胞因子，粘附分子，活化和/或抑制性受體，等。真核細胞轉染的合適載體、構建和方案的描述,能夠查閱Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel,F. M. et al. (eds. )Greene Publishing Associates(1989),Section 9. 2 和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition, Sambrook etal. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)(結合於本文中作為參考)，例如，Sectionsl6. 41-16. 55，9或其它標準實驗室手冊。正如以上詳細的討論，NK細胞的離體繁殖能夠有利地應用於NK細胞移植或植入。因此，根據本發明的另一方面，提供了一種向受者移植或植入NK細胞的方法。根據本發明這方面的方法通過以下步驟實施(a)根據本發明的方法採用生長因子和有效濃度的煙醯胺和/或其它煙醯胺部分離體培養NK細胞群和(b)向主體給予治療有效量的所述培養的NK細胞。供體和受者能夠是同一個體或不同個體，例如，異源個體。因此，所述NK細胞群能夠是與所述主體自體同源的或異源的。當實施異源移植時，能夠進行降低植入排異和/或移植物抗宿主病的方案，正如本領域中眾所周知的。這種方案目前增在人體療法中實施。最先進的方案公開於Slavin S.等的出版物中，例如，J Clin Immunol (2002) 22:64，和JHematother Stem Cell Res (2002) 11:265), Gur H. et al. (Blood (2002) 99:4174)，和 Martelli MF等的出版物(Semin Hematol (2002) 39:48)中，結合於本文作為參考。根據一個實施方式，NK細胞群的移植用於主體中治療或預防疾病。根據本發明一個實施方式還有的另一方面，提供了一種在需要其的主體中抑制腫瘤生長的方法。根據本發明這方面的方法通過給予所述主體本發明治療有效量的NK細胞群而進行實施。「治療」或「處治」包括，但不限於給予本發明富集的、活化的或培養的NK細胞組合物或群而預防或延遲疾病的症狀、綜合症或生化標記的發作，緩解症狀或阻止或抑制該疾病、病症或失調(例如，癌，轉移癌或轉移實體癌)的進一步發展。治療能夠是預防性的，即，輔助性的(預防或延緩疾病的發作，或預防其臨床或亞臨床症狀的顯現)或治療性抑制或減輕疾病顯現之後的症狀。在一個實施方式中，NK細胞群按照有效劑量給予而減低或消除癌，如實體腫瘤或惡性腫瘤，或預防其發生或復發。「有效降低或消除實體腫瘤或預防其發生或復發的用量」或「有效降低或消除過度增生疾病或預防其發生或復發的用量」是指在治療腫瘤疾病症態或過度增生疾病之後改善通過患者測試數據、存活數據、腫瘤標記水平的升高或抑制、基於遺傳分布或對環境因子暴露的易感性而測定的患者療效或存活率的治療組合物用量。「抑制腫瘤生長」是指降低腫瘤細胞的尺寸或生存力或數量。「癌」、「惡性腫瘤」、「實體腫瘤」或「過度增生性疾病」都作為同名術語使用而是指任何多種通過細胞失控異常增殖、所影響細胞局部或通過血液循環和淋巴系統擴散到身體其它部位(即，轉移)的能力以及任何多種特性結構和/或分子特點表徵的疾病。「癌性的」或「惡性的細胞」或「實體腫瘤細胞」應該理解為具有特異性結構性質而缺乏分化和能夠侵襲和轉移的的細胞。「癌」是指在哺乳動物內發現的所有類型的癌或贅生物或惡性腫瘤，包括癌和肉瘤。例子有乳腺癌，肺癌，非小細胞肺癌，胃癌，腦癌，頭和頸癌，結腸，泌尿生殖系統癌，膀胱癌，尿道癌，腎癌，睪丸癌，子宮癌，卵巢癌，宮頸癌，前列腺癌，黑色素瘤，間皮瘤，肉瘤，(參見，DeVita et al.，(eds.)，2001，Cancer Principles and Practice of Oncology,6th. Ed. , Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, Pa.;該參考文獻儀器全文處於各種目的結合於本文中作為參考)。
「癌相關的」是指核酸及其表達，或其缺失，或蛋白及其水平或活性，或其缺失，對主體細胞中惡性腫瘤發作的關係。例如，癌可能與正常健康細胞中並未表達，或低水平表達的具體基因的表達有關。相反，癌相關的基因可能是在惡性腫瘤細胞(或在發生轉化的細胞)中並未表達，或在惡性腫瘤細胞中以比其在正常健康細胞中表達更低的水平表達的基因。「過度增生疾病」是指其中細胞增殖比正常組織生長更迅速的任何疾病或病症。因此，過度增生細胞是比正常細胞增殖更迅速的細胞。「晚期癌」是指不再定域於原生腫瘤位置的癌，或處於根據美國癌聯合委員會(American Joint Committee on Cancer) (AJCC)的 III 或 IV 階段的癌。「良好耐受性」是指不存在健康狀態下由於治療發生而將會影響治療決策的不良變化。「轉移癌」是指一旦輸注免疫缺陷鼠的乳腺脂肪墊和/或循環系統而能夠在免疫缺 陷鼠的肺、肝、骨骼或腦中建立次生腫瘤損傷的腫瘤細胞，例如，人體實體腫瘤或生殖泌尿的惡性腫瘤。「實體腫瘤」包括，但不限於，肉瘤，黑色素瘤，惡性瘤，或其它實體腫瘤癌。「肉瘤」是指由像胚胎結締組織的物質構成而一般包含緊密填充而嵌入纖維或均質物質中的細胞的腫瘤。肉瘤包括，但不僅限於，軟骨肉瘤，纖維肉瘤，淋巴肉瘤，黑素肉瘤，粘液肉瘤，骨肉瘤，阿伯內西肉瘤，脂肉瘤，脂肪肉瘤，肺泡軟組織肉瘤，造釉細胞肉瘤，葡萄狀肉瘤，綠色肉瘤，絨毛膜癌，胚胎肉瘤，維爾姆斯腫瘤肉瘤，子宮內膜肉瘤，間質肉瘤，尤文氏肉瘤，筋膜肉瘤，纖維母細胞肉瘤，巨細胞肉瘤，粒細胞肉瘤，何杰金氏肉瘤，特發性多色素出血性肉瘤，B細胞免疫母細胞肉瘤，淋巴瘤，T-細胞免疫母細胞肉瘤，傑森肉瘤，卡波西氏肉瘤，庫普弗細胞肉瘤，血管肉瘤，白血病性肉瘤，惡性間葉肉瘤，骨旁肉瘤，網狀細胞肉瘤，勞氏肉瘤，漿液囊肉瘤，滑膜肉瘤，和毛細血管擴張性肉瘤。「黑色素瘤」是指源自皮膚和其它器官的黑色素細胞系統的腫瘤。黑色素瘤包括，例如，肢端-雀斑黑色素瘤，無色素性黑色素瘤，良性幼年黑色素瘤，克勞德曼黑色素瘤，S91黑色素瘤，哈丁 -帕西黑色素瘤，幼年黑色素瘤，雀斑惡性黑色素瘤，惡性黑色素瘤，結節性黑色素瘤，甲下黑色素瘤和淺表擴散黑色素瘤。「癌」是指由易於滲透周圍組織並產生轉移的上脾細胞構成的惡性新腫瘤。典型的癌包括，例如，腺泡癌，粒狀癌，腺胞囊癌，腺樣囊性癌，癌腺癌，腎上腺皮質的癌，肺泡癌，胞狀細胞癌，基部細胞癌，基底細胞癌，基底細胞樣癌，基底鱗狀細胞癌，支氣管肺泡癌，細支氣管癌，原發性支氣管癌，腦樣癌，膽管細胞癌，絨膜癌，膠體狀癌，粉刺癌，原體癌，篩狀癌，胸甲狀癌，上皮瘤，圓柱形癌，圓柱形細胞癌，導管癌，硬癌，胚胎性癌，髓樣癌，表皮癌，癌上皮增殖腺，外生性癌，潰瘍癌，纖維癌，膠狀癌，凝膠性癌，巨細胞癌，巨細胞癌，腺性癌，粒層細胞癌，毛髮基質癌，血樣癌，肝細胞癌，啫酸細胞癌，透檬癌，副腎樣癌，幼稚型胚胎性癌，原位癌，表皮內癌，內上皮癌，克龍派切爾癌，庫爾契茨基-細胞癌，大-細胞癌，水晶體癌，豆狀癌，脂瘤樣癌，髓樣上皮癌，髓樣軟癌，髓樣癌，黑色素癌，軟性癌，粘液癌，生粘液癌，克魯肯伯格氏癌，黏液表皮樣癌，膠樣癌，似粘液癌，粘液瘤樣癌，鼻咽癌，燕麥細胞癌，骨化性癌，化骨性癌，乳頭狀癌，門脈周癌，原位癌癌，鱗狀細胞癌，果肉狀癌，腎臟腎細胞癌，貯備細胞癌，肉瘤化肌癌，內翻性乳頭狀癌，慢性癌，陰囊癌，印戒細胞癌，單純癌，小-細胞癌，馬鈴薯狀癌，球狀細胞癌，梭狀細胞癌，海綿體軟癌，鱗狀癌，鱗狀細胞癌，串狀癌，血管擴張性癌，血管擴張癌，移行細胞癌，結節性皮癌，結節性癌，疣狀癌和近絨毛狀癌。「白血病」是指造血器官的漸進性惡性疾病而一般特徵在於血液和骨髓中異常增殖和發育白細胞及其前體。白血病一般基於(I)疾病急性或慢性的持續期和特性；(2)涉及的細胞類型骨髓樣(粒細胞)，淋巴樣(淋巴細胞)，或單核細胞樣；和(3)血液-白血病或非白血白血病(亞白血病)進行臨床分類。白血病包括，例如，急性非淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病，急性粒細胞性白血病，慢性粒細胞性白血病，急性早幼粒細胞白血病，成年T-細胞白血病，非白血白血病，非急性骨髓性白血病，嗜鹼性白血病，急變細胞白血病，牛白血病，慢性粒細胞白血病，皮膚白血病，胚胎白血病，嗜曙紅細胞白血病，格羅斯白血病，毛髮性細胞白血病，成血細胞性白血病，成血細胞白血病，組織細胞性白血病，幹細胞白血病，急性單核細胞白血病，白細胞減少性白血病，淋巴白血病，淋巴細胞性白血病，淋巴腺白血病,淋巴球性白血病,淋巴樣白血病,淋巴瘤細胞白血病,肥大細胞白血病，巨核細胞白血病，小原粒細胞性白血病，單核細胞白血病，髓細胞白血病，粒細胞性白血病，骨髓性粒細胞性白血病，髓性單核細胞白血病，內格利型白血病，漿細胞白血病，漿細胞性白血病，早幼粒 細胞白血病，多形核細胞白血病，希林氏性白血病，幹細胞白血病，亞白血病型白血病和未分化細胞白血病。其它癌症包括，例如，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多發性骨髓瘤，神經母細胞瘤，乳房癌，卵巢癌，肺癌，橫紋肌肉瘤，原發性血小板增多症，原發性巨球蛋白血症，小細胞肺癌腫瘤，原發性腦腫瘤，胃癌，結腸癌，惡性胰腺胰島素瘤，惡性類癌，膀胱癌，皮膚癌前病變，睪丸癌，淋巴瘤，甲狀腺癌，神經母細胞瘤，食道癌，生殖泌尿道癌，惡性高鈣血症，宮頸癌，子宮內膜癌，腎上腺皮質癌和前列腺癌。在本發明這方面的另一具體實施方式
中，所述方法伴隨在造血細胞、造血祖細胞或造血幹細胞移植至所述主體中時一起、之後或之前進行實施。在還有的另外的實施方式中，主體伴隨用敏化劑或增效劑(例如，蛋白酶體抑制劑，IL-2，IL-15，等)進行治療而進一步增強所輸注NK的體內功能(詳見，例如，Childs等的美國專利申請20090104170)。在自體免疫疾病患者中已經觀察到NK細胞的數量和功能降低，表明在各種自身免疫性疾病和病症中具有NK細胞療法的可能性(參見，Schleinitz, et al. , Immunology2010 ;131:451-58 和 French and Yokohama, Arthrit Res Ther 2004;6:8-14)。因此，在本發明還有的另一實施方式中，提供了一種在需要其的主體中治療自身免疫性疾病或病症的方法。根據本發明這方面的方法通過給予所述主體本發明治療有效量的NK細胞群而進行實施。通過本發明的方法能夠治療的自身免疫性疾病包括但不限於，心血管疾病，類風溼疾病，腺體疾病，胃腸道疾病，皮膚疾病，肝臟疾病，神經系統疾病，肌肉疾病，腎臟疾病，與生殖相關的疾病，結締組織疾病和全身性疾病。自身免疫性心血管疾病的例子包括，但不限於，動脈粥樣硬化，心肌梗死，血栓形成，韋格納肉芽腫病，高安氏大動脈炎，川崎綜合症，抗因子VIII自身免疫性疾病，壞死性小血管炎，顯微鏡下多血管炎，Churg-Strauss症候群(變應性肉芽腫血管炎)，寡免疫局灶性壞死和新月體性腎小球腎炎，抗磷脂症候群，抗體引起的心臟衰竭，血小板減少性紫癜，自身免疫性溶血性貧血，克氏錐蟲病中的心臟自身免疫性疾病和抗輔助性T淋巴細胞自身免疫性疾病。
自身免疫性類風溼病的實例包括但不限於，類風溼關節炎和強直性脊柱炎。自身免疫性腺體疾病的例子包括但不限於，胰腺疾病，I型糖尿病，甲狀腺疾病，格雷夫斯病，甲狀腺炎，自發免疫性甲狀腺炎，橋本氏甲狀腺炎，特發性粘液性水腫，卵巢自身免疫性疾病，自身免疫性抗精子不孕不育，自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺體症候群。這些疾病包括，但不僅限於，胰腺的自身免疫性疾病，I型糖尿病，自身免疫性甲狀腺疾病，格雷夫斯病，自發自身免疫性甲狀腺炎，橋本氏甲狀腺炎，特發性粘液性水腫，卵巢自身免疫性疾病，抗精子免疫性不孕不育，自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺體症候群。自身免疫性胃腸疾病的實例包括但不限於，慢性炎性腸道疾病，腹腔疾病，結腸炎，迴腸炎和克羅恩病。自身免疫性皮膚疾病的例子包括，但不僅限於，自身免疫性大皰性皮膚病，如，但不僅限於，尋常型天皰瘡，大皰性類天皰瘡和落葉型天皰瘡。
自身免疫性肝病的例子包括，但不僅限於，肝炎，自身免疫性慢性活性肝炎，原發性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎。自身免疫性神經系統疾病的例子包括，但不限於，多發性硬化症，阿爾茨海默氏症，重症肌無力，神經病變，運動神經病變；格林-巴利症候群和自身免疫性神經病變，重症肌無力，蘭伯特-伊頓肌無力症候群；副腫瘤性神經系統疾病，小腦萎縮症，副腫瘤性小腦萎縮和僵人症候群；非副腫瘤性僵人症候群，漸進性小腦萎縮，腦炎，Rasmussen腦炎,肌萎縮性側索硬化症，西登哈姆舞蹈病，吉爾斯德拉妥瑞症和自身免疫性多內分泌腺疾病；免疫異常神經病；獲得性神經性肌強直，先天性多發性關節攣縮症，神經炎，視神經炎和神經退行性疾病。自身免疫性肌肉疾病的例子包括，但不僅限於，肌炎，自身免疫性肌炎和原發性乾燥症候群和平滑肌自身免疫性疾病。自身免疫性腎臟疾病的例子包括，但不僅限於，腎炎和自身免疫性間質性腎炎。與生殖相關的自身免疫性疾病的例子包括，但不僅限於，反覆性失胎。自身免疫性結締組織病的例子包括，但不僅限於，耳疾，自身免疫性耳疾病和內耳的自身免疫性疾病。自身免疫性全身性疾病的例子包括，但不僅限於，全身性紅斑狼瘡和全身性硬化症。在本發明還有的另一實施方式中，提供了一種在需要其的主體中抑制病毒性感染的方法。根據本發明這方面的方法通過以下步驟實施(a)用NK細胞生長因子和有效濃度的煙醯胺離體培養NK細胞群，其中相比較採用生長因子而不採用所述濃度的煙醯胺培養的細胞群，有效濃度的煙醯胺增強了 NK細胞的增殖jP(b)給予所述主體治療有效量的所述培養的NK細胞。適合採用本發明NK細胞或NK細胞組合物治療的病毒性感染包括但不限於，HIV，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，巨細胞病毒(CMV)，牛痘病毒，流感和副流感病毒，肝炎(包括A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎，非-A非-B型等)，單純皰疹病毒，皰疹帶狀皰疹病毒，泰勒病毒和HSV-I。適合採用本發明NK細胞或NK細胞製劑治療的其它傳染病包括但不限於，寄生蟲感染，如瘧原蟲，利什曼蟲和弓形蟲感染，和細菌感染如結核分枝桿菌和李斯特氏桿菌(對於NK細胞治療病毒、細菌和原蟲疾病的綜述，參見Zucchini etal. , Exp Rev Anti-Infect Ther 2008 ;6:867-85，其結合於本文中作為參考)。造血細胞移植已經變成各種遺傳性或惡性疾病的治療選擇方案。然而，造血細胞組合物經常富含T-淋巴細胞，這種細胞有助於移植物抗宿主病。因為患有惡性血液病的患者經常缺乏NK細胞數目和功能，則連同造血細胞移植一起外給予NK細胞目前正在研究增強長期移植和預防移植物抗宿主病。因此，在本發明還有的另一實施方式中，提供了一種在需要其的主體中治療或預防移植物抗宿主病的方法。因此，在本發明還有的另一實施方式中，提供了一種在需要其的主體中治療自身免疫性疾病或病症的方法。根據本發明這方面的方法通過給予所述主體本發明治療有效量的NK細胞群而進行實施。用NK細胞治療，以及用NK細胞和HSC細胞群組合治療的臨床方案，在本領域中是眾所周知的。例如，近來的報導已經證明，NK細胞輸注是安全的，而並不會導致受者中出現GVHD0 一個這種方案涉及骨髓細胞清除，活化的IL-2、NK富集的(非-NK耗盡的)HLA_錯配臍血的輸注，接著雙倍臍血輸注進行HSC復育[參見，Miller et al. ,Blood 2006 ；108:3111(摘要)]。作者報導，連同臍血HSC —起移植NK細胞導致長期移植HSC改善。
治療方案根據本發明一些實施方式的一些方面，提供了包含NK細胞群並連同藥用載體配製而用於治療疾病，例如，轉移癌、實體腫瘤、自身免疫性疾病、過增生疾病或病毒性感染的藥物組合物。一些組合物包括本發明多種(例如，兩種或多種)NK細胞群的組合。在預防性應用中，向易感，或要不然就是具有疾病或病症(B卩，過增生疾病或實體腫瘤)風險的患者按照足以消除或降低過增生疾病或實體腫瘤復發風險，降低嚴重度或延緩疾病發作，包括疾病的生化、組織和/或行為症狀，其綜合症和疾病發展期間表現出的中間病理表型的用量給予藥物組合物或醫藥。在治療應用中，向易感或已經患有這種疾病的患者按照足以治癒，或至少部分抑制這種疾病的症狀(生化的、組織的和行為的)，包括其綜合症和疾病發展期間的中間病理表型的用量給予藥物組合物或醫藥。足以完成治療或預防治療的劑量定義為治療或預防有效劑量。在預防性和治療性的這兩種方案中，藥劑通過按照幾個劑量給予直至實現足夠抗增生響應。通常情況下，抗增生響應要進行監測並在抗增生響應開始消退時提供重複劑量。有效劑量NK細胞群組合物用於治療本文中描述的疾病，如轉移癌，實體腫瘤或過增生疾病的有效劑量，要根據許多不同的因素而變化，包括給予方式，靶位點，患者生理狀態，患者是人還是動物，其它給予的醫藥，以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人，但是也能夠治療非人的動物，包括基因修飾哺乳動物。治療劑量需要斟酌而優化安全和效能。對於給予治療性NK細胞群，劑量範圍為每患者約I X IO6至約I X IO9個NK細胞。對於給予NK細胞群,每kg受者體重劑量範圍為約I X IO5至約I X IO9個NK細胞,或每kg受者體重劑量範圍為約5 X IO5至約I X IO8個NK細胞。典型的治療方案要求每兩周給予I次或每月I次或每3至6個月I次。在一些方法中，兩種或多種NK細胞群同時給予，在這種情況下，所給予的每種NK細胞群的劑量都處於所示的劑量範圍。NK細胞群能夠進行多次給予。單劑量之間的間隔可能是以周為單位，以月為單位或以年為單位。間隔也能夠是不定期的，這要按照患者體內NK細胞群的血液水平測定所示。另外，NK細胞群能夠作為緩釋製劑給予，在這種情況下需要更小的給予頻率。劑量和頻率根據患者體內NK細胞群的半衰期而變化。給予的劑量和頻率能夠根據治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性的應用中，相對較低的劑量以相對不太頻繁的間隔在長時間內進行給予。一些患者繼續在其生命的剩餘時間內接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較高的劑量以相對較短時間間隔給予直至病情發展降低或終止，而優選直至患者表現出部分或完全緩解疾病症狀。此後，緩則能夠按照預防性方案給予。給藥途徑治療性NK細胞群的組合物用於治療疾病，例如，轉移癌，實體腫瘤或過增生疾病，能夠按照靜脈注射，囊內，鞘內，腸外，局部外用，皮下，口腔，鼻腔，動脈，顱內，腹腔，或肌肉注射的方式進行給予。作為預防性/輔助性或用於治療疾病，治療性NK細胞群靶向過增生疾病或實體腫瘤，例如，生殖泌尿的惡性腫瘤和/或治療性治療。最典型的給予免疫原性藥物的途徑是皮下給予，但是其它途徑可能是等效的。另一最常見的途徑是肌肉注射。這種類型的注射是最典型地實施於胳膊或大腿肌肉。在某些方法中，藥物直接注射到沉積物累積的具體組織，例如頭顱內注射。對於NK細胞群的給予，優選關於靜脈滴注的肌肉注射。在某些方法中，具體治療性的NK細胞群直接注射到膀胱內。 製劑NK細胞群的組合物用於治療疾病，例如，轉移癌，實體腫瘤或過增生疾病。NK細胞群的組合物用於治療疾病，例如，轉移癌，實體腫瘤或過增生疾病，經常作為包含活性治療藥物，即，和許多各種其它藥用組分的藥物組合物給予。參見，例如，Alfonso R GennaroCed),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(FormerlyRemington’s Pharmaceutical Sciences) 20th ed. , Lippincott, Williams & Wilkins,2003，以其全文結合於本文中作為參考。優選的形式取決於預想的給予模式和治療應用。這種組合物，更具所需的配方，也能夠包括藥用無毒載體或稀釋劑，這定義為常用於配製動物或人給予的藥物組合物的載體。稀釋劑經過選擇而使之不會影響這些組合的生物活性。這種稀釋劑的實例是包含10%的熱失活人體AB血清或10%自體同源血清的X-vivo 20介質(Cambrex Bio Science, Walkersville, Md.)。這種稀釋劑的其它實例有蒸懼水,磷酸鹽緩衝的生理鹽水，林格氏溶液，葡萄糖溶液和漢克溶液。另外，藥物組合物或製劑也能夠包括其它載體，佐劑或無毒非治療性的非免疫原性的穩定劑等。藥物組合物也能夠包括大而代謝緩慢的大分子如蛋白、多糖如殼聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(如，乳膠功能化的瓊脂糖 ，瓊脂糖，纖維素等)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和脂質聚結物(如油滴或脂質體)。另外，這些載體能夠起到免疫刺激劑(即，佐劑)作用。對於非腸道給予，本發明的組合物能夠作為該物質在生理可接受稀釋劑中的可注射劑量的溶液或懸浮液與可能是滅菌液體如水油、鹽水、甘油或乙醇的藥用載體一起給予。另外，佐劑物質，如潤溼或乳化劑、表面活性劑、PH緩衝劑物質等能夠提供於組合物中。其它藥物組合物組分是石油、動物植物或合成源，例如，花生油、豆油和礦物油的那些組分。一般而言，二元醇如丙二醇或聚乙二醇，都是優選的液體載體，尤其適用於可注射溶液。治療性NK細胞群能夠以按照容許緩釋活性成分的方式配製的積存或輸注製劑形式給予。典型的組合物包含5mg/mL的治療性NK細胞群，在由50mM L-組氨酸、150mM NaCl構成的水性緩衝液中配製，用HCl調節pH 6.0。通常情況下，組合物製備成可注射液，要麼是液體溶液，要麼是懸浮液；在注射之前適合液體載體中重構溶液或懸浮液的固體形式也能夠製備。這種製劑也能夠在脂質體或大顆粒如聚交酯、聚乙交酯或共聚物中乳化或囊封而增強佐劑效應，正如以上的討論。Langer, Science，249:1527，1990 ；Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews，28:97-119，1997，以其全文結合於本文中作為參考。本發明的藥物能夠按照容許緩釋或脈衝式釋放活性成分的方式配製的積存注射或輸入製劑的形式給予。和用於其它方式給予的其它製劑包括口服、鼻腔和肺部製劑、栓劑、透皮施用。對於栓劑，粘合劑和載體包括，烈日，聚脂肪二醇或三甘油酯；這種栓劑能夠由包含範圍為O. 5%至10%，優選1%至2%的活性成分的混合物形成。口服製劑包括賦形劑，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精酸鈉、纖維素和碳酸鎂。這種組合物採用溶液、懸浮液、片劑、藥丸、膠囊、緩釋製劑或粉末的形式並含有10%至95%，優選25%至70%的活性成分。藥物組合物一般包含以適用於向患者給予形式的治療性NK細胞群的組合物。這種藥物組合物一般配製成無菌而基本等滲的，並遵守美國食品和藥物管理局的所有《良好生產規範》(GMP)的規定。 毒性優選本文中描述的治療有效量的NK細胞群組合物將會提供治療性受益，而不會導致顯著的毒性。本文中所述的治療性NK細胞群的毒性，能夠在細胞培養或實驗動物中通過標準製藥方法，例如通過測定LD. sub. 50 (50%群的致死劑量)或LD. sub. 100 (100%群的致死劑量)而進行確定。毒性和療效之間的計量比率是治療指數。產品名高這些細胞培養實驗分析和動物研究中獲得的數據能夠用於配製適用於人體的無毒劑量範圍。本文中所述的治療性NK細胞群的劑量優選處於包括有效劑量而幾乎無或沒有毒性的循環濃度範圍。這種劑量能夠根據採用的劑量形式和所使用的給藥途徑而在此範圍內變化。精確配方、給藥途徑和劑量能夠由各個醫師根據患者病症進行選擇。(參見，例如，Fingl, et al.，ThePharmacological Basis Of Therapeutics,Ch. 1,1975),以其全文結合於本文中作為參考。試劑盒屬於本發明範圍內的還有包含本發明組合物(例如，治療性NK細胞群)和使用說明書的試劑盒。這種試劑盒能夠進一步包含至少一種附加試劑，或一種或多種本發明的附加人體抗體(例如，具有結合至不同於第一人體抗體的抗原中的抗原決定基的互補活性的人體抗體)。這些試劑盒通常包括指示試劑盒內容物預想用途的標籤。術語標籤包括任何書面的，或提供於試劑盒上或以試劑盒提供的記錄材料，或其它連同試劑盒一起的材料。正如本文中所用的術語「大約」是指±10%。術語「包含」，「含有」，「包括」，「囊括」，「具有」及其詞形變化體是指「包括但不限於」。這個術語涵蓋了「由...構成」和「基本由...構成」。短語「基本由..構成」是指組合物或方法，但只要附加其它成分和/或步驟並不實質性改變所要求授權的組合物或方法的基本而新穎的特性，可以包括其它成分和/或步驟。正如本文中所用單數形式「一個」，「一種」和「這個(種)」包括複數參指物，而除非上下文清楚地另外指出。例如，術語「一種化合物」或「至少一種化合物」可以包括多種化合物，包括其混合物。縱觀整個本說明書，本發明的各個實施方式可以按照一定範圍的格式提呈。應該理解到，按照範圍格式的描述僅僅是為了方便和簡短，而不應該詮釋為不靈活的限制本發明範圍。因此，範圍的描述應該考慮成專門公開所有的可能子範圍以及此範圍內的各個數字值。例如，如I至6的範圍描述,應該當作專門公開了如I至3,1至4,1至5, 2至4, 2至6，3至6等的子範圍，以及此範文誒的各個數字，例如，1，2，3，4，5和6。無論該範圍的幅度範圍如何，這都適用。每當本文中指示數字範圍時，是指其包括任何所指示範圍內的引述的數值(分數或整數)。術語第一個指示數和第二指示數之間的「範圍/範圍」和從第一個指示數「至」第二個指示數之間的「範圍/範圍」，在本文中可以互換使用並意味著包括第一和第二指示數和其間的所有分數和整數數值。正如本文中所用的術語「方法」是指完成咯啶任務的方式，模式，技術和方法與步驟，包括但不限於，化學、製藥、生物、生化和醫藥領域的從業者已知的，或通過其由已知的 方式、模式技術和方法與步驟隨時開發出來的那些方式、模式、技術和方法與步驟。正如本文中所用術語「治療」包括消除，基本抑制、延緩或逆轉病症的發展，基本改善病症的臨床或美學症狀或疾病預防病症的臨床或美學症狀出現。應該理解到，本發明的某些特徵，儘管為了清晰起見描述於獨立的實施方式的上下文中，而也可以在單個實施方式中組合提供。相反，本發明的許多特性，儘管為了清晰起見描述於單個實施方式的上下文中，而也可以獨立提供或以任何合適的子組合物或正如適合本發明任何其它描述的實施方式中提供。各個實施方式的上下文中描述的某些特性不應該當作這些實施方式的基本特性，除非該實施方式如果沒有這些元素就是無效的。本文以上已經概述和以下權利要求部分中要求授權的本發明各個實施方式和方面，在以下實施例中找到實驗支持證據。實施例現在參照以下實施例，這將連同以上描述一起，以非限制性方式舉例說明本發明的一些實施方式。一般而言，本文中所用術語學和本發明中利用的實驗室方法與步驟包括，分子，生化、微生物和重組DNA技術。這些技術在文獻中進行了深入解釋。參見，例如，〃MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al. , (1989) ;〃Current Protocols inMolecular Biology^Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994) ；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland (1989) ；Perbal, 〃A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley& Sons, New York (1988) ；ffatson et al. , "Recombinant DNA〃，Scientific AmericanBooks, New York ；Birren et al. (eds)"Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；美國Nos. 4，666，828 ；4, 683，202 ；4, 801，531 ；5, 192，659 和 5，272，057 專利中提出的方法學；"Cell Biology:A Laboratory Handbook", Volumes I-III, Cellis, J. E., ed. (1994);紐約 Freshney Wiley-Liss 的"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"(1994),第三版/'Current Protocols in Immunology^Volumes I-III Coligan J. E.,ed. (1994) ；Stites et al. (eds)，"Basic and Clinical Immunology^ (8th Edition)，Appleton & Lange,Norwalk,CT (1994) ；Mishell and Shiigi (eds)，"Selected Methodsin Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，New York (1980);可供使用的免疫試驗分析廣泛地描述於專利和科技文獻中，參見，例如，美國專利Nos. 3，791，932 ；3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ;3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ；3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ;4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 和5，281，521 ;"01igonucleotide Synthesis"Gait，Μ· J.，ed. (1984) ;「Nucleic AcidHybridization^Hames, B. D. , and Higgins S. J. , eds. ( 1985) ;"Transcriptionand Translation〃Hames，B. D.，and Higgins S. J. , eds. (1984) ;〃Animal CellCulture〃Freshney，R. I.，ed. (1986) ;〃Immobilized Cells and Enzymes^IRL Press，(1986) ;"A Practical Guide to Molecular Clonin g"Perbal，B.，(1984)和"Methodsin Enzymology^Vol. 1，2，317，Academic Press ;〃PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications"，Academic Press，San Diego, CA (1990) ；Marshak et al.，"Strategiesfor Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual^CSHLPress (1996);所有這些文獻都如同其全文結合於本文中作為參考。其它一般參考文獻都提供於這整個文檔中。其文中的方法與步驟據信在本領域是眾所周知的，為方便讀者而提 供。其文中所含的所有信息都結合於本文中作為參考。材料和實駘步驟臍血樣品在正常足月分娩(知情同意)之後從臍帶臍血中獲得細胞。產後24h內樣品收集並冷凍。簡而言之，臍血通過重力從分娩胎盤收集，富含白細胞的部分通過密度梯度離心而分離，細胞混合DMSO (10%)並隨後在_80°C下冷凍。使用之前，細胞在含有2. 5%的人體血清白蛋白(HSA) (Bayer Corp. Elkhart, IN, USA)的 Dextran 緩衝液(Sigma, St. Louis, MO,USA)中解凍。而除去防凍劑。BM和外周血樣品骨髓(BM)和外周血(PB)細胞在Ficoll-Hypaque 梯度(I. 077g/mL ；Sigma)上分層，並以800Xg離心30min。收集界面層上的單核細胞並在含0. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS) (Biological Industries, Israel)中衝洗 3 次。CD56+細胞的富集臍血(CB)，骨髓(BM)或外周血(PB)細胞在Ficoll-Hypaque 梯度(I. 077g/mL ；Sigma)上分層，並以800Xg離心30min分離單核細胞。收集界面上的細胞並在含0. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)(Biological Industries, Israel)中衝洗3次。為了純化⑶56+細胞，根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS CD56祖細胞分離試劑盒」(MiltenyiBiotec Bergisch, Gladbach,德國),將單核細胞部分經過兩個循環的免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD56+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，通過衝洗而從未結合的細胞中純化出來。由此獲得的CD56+群的純度通過流式細胞儀評價，為約92%。可選地，這些細胞並不在Ficoll-Hypaque梯度上分離，而在含O. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS) (Biological Industries)中衝洗3次(「總單核細胞部分」)。在最後一次衝洗中，細胞用50μ g/mL rHu-DNAse培養lOmin。為了純化⑶56+細胞，根據廠商建議，使用「MiniMACS CD56 祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch,Gladbach,德國)，將該細胞經過兩個循環的免疫磁性微珠分離。由此獲得的CD56+群的純度通過流式細胞儀評價，為約92%。可選地，骨髓細胞使用「MiniMACS或CliniMACS CD133細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國)通過免疫磁性微珠分離耗盡⑶133+或CD34+細胞，並隨後根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS CD56祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國),將該這些細胞經過兩個循環的免疫磁性微珠分離而對NK細胞進一步富集⑶133-或⑶34陰性部分。CD56+CD3-細胞的富集臍血(CB)，骨髓(BM)或外周血(PB)細胞在Ficoll-Hypaque 梯度(I. 077g/mL ； Sigma)上分層，並以800Xg離心30min分離單核細胞。收集界面上的細胞並在含O. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS) (Biological Industries, Israel)中衝洗3次。為了純化CD56+CD3-細胞，根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS CD56祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch,Gladbach,德國),將單核細胞部分經過免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD56+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，通過衝洗而從未結合的細胞中純化出來。根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS⑶3祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國),將純化⑶56+細胞部分經過另外一次免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD3+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，而在未結合的細胞部分中回收CD56+CD3-細胞。由此獲得的CD56+CD3-群的純度通過流式細胞儀評價，為約85%至97%。可選地，這些細胞並不在Ficoll-Hypaque梯度上分離，而在含O. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS) (Biological Industries)中衝洗3次(「總單核細胞部分」)。在最後一次衝洗中，細胞用50 μ g/mL rHu-DNAse培養lOmin。為了純化⑶56+細胞，根據廠商建議，使用「MiniMACS CD56 祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch,Gladbach,德國)，將該細胞經過兩個循環的免疫磁性微珠分離。由此獲得的CD56+群的純度通過流式細胞儀評價，為約92%。為了純化CD56+CD3-細胞，根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS CD56祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國),將該細胞經過免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD56+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，通過衝洗而從未結合的細胞中純化。根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACSCD3祖細胞分離試劑盒」 (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國),將純化的⑶56+細胞部分經過另外的免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD3+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，在未結合的細胞部分中回收CD56+CD3-細胞。由此獲得的⑶56+⑶3-群的純度通過流式細胞儀評價，為約85%至97%。可選地，骨髓細胞使用「MidiMACS或CliniMACS CD133細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國)通過免疫磁性微珠分離耗盡⑶133+或CD34+細胞，並隨後根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS CD56祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國),將該這些細胞經過兩個循環的免疫磁性微珠分離而對NK細胞進一步富集⑶133-或⑶34陰性部分。為了純化⑶56+⑶3-細胞，根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS CD56祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi BiotecBergisch, Gladbach，德國)，將CD133-或CD34陰性部分經過免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD56+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，通過衝洗而從未結合的細胞中純化。根據廠商建議，使用「MiniMACS或CliniMACS⑶3祖細胞分離試劑盒」(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國),將純化的⑶56+細胞部分經過另外的免疫磁性微珠分離。簡而言之，CD56+細胞與CD3+特異性磁性免疫微珠反應，並採用磁性分離器分離，在未結合的細胞部分中回收⑶56+⑶3-細胞。由此獲得的⑶56+⑶3-群的純度通過流式細胞儀評價，為約85%至97%。培養之前CD3+或CD3+CD19+細胞的耗盡對於耗盡過程，臍帶臍血(CB)，骨髓(BM)或外周血(PB)細胞的總核細胞在Ficoll-Hypaque梯度(I. 077g/mL ；Sigma)上分層，並以800 Xg離心30min而分離單核細胞。收集界面層上的細胞並在含O. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS) (BiologicalIndustries, Israel)中衝洗3次。可選地,這些細胞並不在Ficoll-Hypaque梯度上分離，而在含O. 5%HAS的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS) (Biological Industries)中衝洗3次(「總單 核細胞部分」)。使用⑶3細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach,德國)耗盡⑶3細胞，並培養全部⑶3陰性細胞部分。可選地，⑶19細胞也採用⑶19細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，德國)耗盡 CD19 細胞，並培養 CD3/CD19 陰性細胞部分(CD3/CD 19耗盡)。可選地，RosetteS印人體CD3+細胞耗盡混合液(Stem CellTechnologies，RosestteS印，Cat. No. 15661)用於CD3耗盡並培養整個CD3陰性細胞部分。在陰性耗盡之後，這些細胞通過FACS分析進行計數和表徵。離體培養I.總單核細胞部分在培養基袋(American Fluoroseal Co. Gaithersburg, MD,USA), T-燒瓶或24孔孔板中按照(O. 5至2. O) X IO6個細胞/mL的濃度於包括10%而由5%至10%含有以下人體重組細胞因子的人體血清/UforCell FBS替代物(LifebloodProducts)構成的FCS或細胞Gro SCGM (Cell Genix)的MEMa中採用或不採用0KT-3 (10至50ng/ml)，採用或不採用煙醯胺(O. 5至IOmM)進行培養細胞介素_2 (IL-2) (5_50ng/ml)，白細胞介素-15 (IL-15)，白細胞介素7 (IL7)，白細胞介素21 (IL21 )，FLT-3或SCF或 FLT3 和 SCF (Perpo Tech, Inc.，Rocky Hill, NJ, USA)，並在 37°C下於空氣中 5%C02 潤溼氣氛中培養。當培養基中使用0KT-3時，在5至7天之後將培養基離心並將這些細胞採用排除了 0KT-3的相同培養基中懸浮。所有培養基都採用相同體積的含生長因子而有或無煙醯胺的新鮮培養基每周或每周兩次加滿。為了計數，細胞用錐蟲藍染色。在各個的時間點，取樣分析 NK 細胞，CD56+CD3-, CD56+CD3+，CD34+CD56+，CD56+CD16+ 和 / 或 CD56+NKG2A細胞的相對分數。細胞形態在以May-Grunwald/Giemsa溶液染色的塗片劑製備的Cytospin(細胞離心塗片器)(Shandon, Pittsburgh, PA, USA)上測定。2.源自總核或單核細胞或⑶34+或⑶133+細胞耗盡的部分的純化⑶56+或⑶56+⑶3-細胞在培養基袋，T-燒瓶或24孔孔板中按照(I至100) X IO4個細胞/mL的濃度於MEMa/10%FCS或細胞Gro SCGMCCell Genix)/5%含有以下人體重組細胞因子的人體血清/ UforCeIl貧FBS替代物(Lifeblood Products)中採用或不採用煙醯胺進行培養白細胞介素-2 (IL-2) (5-50ng/ml)，白細胞介素-15 (IL-15)，FLT-3 或 SCF 或 FLT3 和 SCF或 IL-2 和 IL-15 或僅僅 IL-2 (Perpo Tech, Inc. , Rocky Hill，NJ，USA)，並在 37°C下於空氣中5%0)2潤溼氣氛中培養。所有培養基都採用相同體積的含生長因子而有或無煙醯胺的新鮮培養基每周或每周兩次加滿。實際上，這些培養基能夠每周I次或每周幾次採用IL-2和/或IL-2和IL-15進行補充。為了估計培養基中細胞的數目，細胞樣品用錐蟲藍染色進行計數。在各個的時間點，取樣進行FACS分析而確定NK細胞，⑶56+⑶3_，⑶56+CD3+，CD34+CD56+，CD56+CD16+ 和 / 或 CD56+NKG2A 細胞的相對分數。3.源自PB、BM和CB的⑶3+耗盡的，或⑶3+/⑶19+耗盡的單核細胞部分在培養基袋，T-燒瓶或24孔孔板中按照(I至1000) X IO4個細胞/mL的濃度於MEM a /10%FCS或細胞Gro SCGM (Cell Genix) /5%含有以下人體重組細胞因子的人體血清/ LiforCell FBS替代物(Lifeblood Products)中採用或不採用 FLT-3 或 SC F 或 FLT3 和 SCF(5 至 50ng/mL)(Perpo Tech，Inc.，Rocky Hill，NJ，USA)，所有組合，採用或不採用煙醯胺，進行培養白細胞介素-2 (IL-2)或/和白細胞介素-15 (IL-15)，並在37°C下於空氣中5%0)2潤溼氣氛中培養。所有培養基都採用相同體積的含生長因子而有或無煙醯胺的新鮮培養基每周或每周兩次加滿。這些培養基能夠每周I次或每周幾次採用IL-2和/或IL-2和IL-15進行補充。為了估計培養基中細胞的數目，細胞樣品在用錐蟲藍染色之後進行計數。在各個的時間點，取樣進行 FACS 分析而確定 NK 細胞，CD56+CD3-，CD56+CD3+，CD34+CD56+，CD56+CD16+和/或⑶56+NKG2A細胞的相對分數。4.源自PB、BM和CB細胞的總單核細胞部分、源自總核或單核細胞或源自CD34+或⑶133+耗盡部分的純化⑶56+或⑶56+⑶3-細胞，和⑶3+耗盡，或⑶3+/⑶19+耗盡的單核細胞部分，也能夠在生物反應器如GE Wave Bioreactor袋或Gas Permeable Cultureware燒瓶(Wilson Wolf)中按照(I至10000) X IO4細胞/mL中含有MEMa，人體血清(10%v/v)，20ng/mL IL-2和可選的50ng/mL IL-2和可選的IL-15的培養基介質中採用煙醯胺進行培養。這些培養基採用相同體積的含生長因子而有或無煙醯胺的新鮮培養基每周或每周兩次加滿。後來這些培養基能夠每周I次或每周幾次採用IL-2和/或IL-2和IL-15進行補充。並且，在1，2和3周之後對細胞計數和染色進行FACS試驗分析。具有照射的基質的NK細胞培養源自PB、BM和CB細胞的總單核細胞部分、源自總核或單核細胞或源自CD34+或⑶133+耗盡部分的純化⑶56+或⑶56+⑶3-細胞，或⑶3+耗盡，或⑶3+/⑶19+耗盡的單核細胞部分的NK細胞，能夠採用照射的基質進行培養。為了製備照射的基質(飼養細胞)，採用3000rad照射這些單核細胞。在⑶56或⑶56+⑶3-選擇或⑶3耗盡之後，對這些細胞計數並通過本文以上所述的FACS分析進行表徵。這些細胞按照本文以上所述，採用或不採用煙醯胺，採用和不採用照射的基質，按照20 X IO5個細胞/mL的照射細胞的濃度進行培養。FACS 分析對於FACS 分析，細胞採用以下螢光抗體CD15FITC、Cat. No. 332778、CD14FITC、Cat. No. 345784、CD3APC、Cat. No. 345767、所有這些螢光抗體都來自 Becton Dickinson(San Jose, CA, USA)，來自 BioLegend (San Diego, CA, USA)的 CD62L PE, Cat. No. 304806，來自 eBioscience (San Diego, CA, USA)的 CD56FITC、Cat. No. 11-0569-42 和來自 Dako(Glostrup, Denmark)的 CD45PE、Cat. No. R7807 進行染色。NK 細胞也通過 CXCR4，KIR3, DL1/2, DL2/2, DLl, NKG2A, NKG2C, NKG2D, TRAIL, Fe- y受體 Illb，NKp44，NKp30, NKp46，Fas-L, L-選擇蛋白，藻紅蛋白，IL-2 受體 Y 鏈(CD16)，VLA-5 α鏈和CD8進行表徵。在第O天接種的NK細胞數的計算為了計算第O天NK細胞的數目，第O天接種的細胞總數乘以第O天通過FACS測定的CD56+/CD3-細胞的百分數。培養物中的NK細胞數和接種後第7、14和21天倍增的計算為了測定第7、14和21天細胞的總數，細胞計數/mL乘以培養基的體積。為了確定培養基中NK細胞數，培養基中的細胞總數乘以在第7、14和21天測定的CD56+/CD3-細胞百分數。為了測定成倍擴增，第7、14和21天的NK細胞總數除以第O天培養基中接種的NK細胞總數。
表面杭原分析這些細胞用含1%BSA的PBS溶液衝洗，並用螢光素異硫氰酸(FITC)-或藻紅蛋白(PE)-成對的抗體或別藻藍蛋白(APC)染色。隨後這些細胞在上述緩衝液中衝洗並採用FACSca丨ibur「流式細胞儀(Becton Dickinson, San Jose, CA,USA)進行分析。採用 488nm或661nm氬雷射束作為激發光源，將這些細胞以高達1000個細胞/s的速度通過。採用對數放大測定IO4個細胞的發射,並採用CellQuest軟體(Becton Dickinson)進行分析。用FITC、PE和APC-配對的同種型對照抗體染色的細胞用於測定背景螢光。NK細胞功能的測定「殺傷作用」分析NK細胞(效應器細胞=E)與K562或BL2 (靶細胞=T)，或雙表型白血病細胞按照不同E與T之比(Ε: Τ)混合。BL2或Κ562，或雙表型白血病靶細胞在PBS中用Ing/mL CFSE (Invitrogen)於37°C下標記15min。15min內向細胞中加入小牛血清，隨後衝洗細胞並再懸浮於RPMI介質中。將IOOyL的雙表型白血病細胞、BL2或K562細胞按照5X IO3個細胞/孔的濃度置於96孔圓底孔板中。將100 μ L的未染色NK細胞按照Ε:Τ比為 1:1，2.5:1，5:1，10:1或20:1 (如所示，分別為 5Χ103，1· 25 X IO4, 2. 5 X 104，5 X IO4 和I X IO5細胞/孔)加入到雙表型白血病細胞、BL2或Κ562細胞中。在2至28h之後，細胞系中的靶細胞如K562和BL-2的殺傷作用通過FACS作為碘化丙啶(PI)_陽性(死亡)CFSE_標記細胞百分數進行測定。原發性白血病細胞的殺傷作用通過採用FACS計數其用NK細胞培養之後培養基中剩餘的CFSE染色細胞的數目而進行測定。較低的CFSE+細胞數表明較高的殺傷水平。趨化性(「遷移」)試驗分析人體NK細胞的遷移響應(趨化性)通過Transwell遷移試驗分析(Costar, Cambridge, MA ;直徑6. 5_mm,孔徑5_μ m)進行分析。簡而言之，將含有2X IO5個NK細胞的100 μ L趨化性緩衝液(RPMI 1640，1%FCS)加入上室，而將含有或無250ng/mL基質源的因子CXCL12 (「SDF-1」) (R&D Systems)的O. 5mL趨化性緩衝液加入底室。4h內遷移至「Transwell」底室的細胞採用FACScalibur (Becton DickinsonImmunocytometry Systems) 60s 內進行計數。「體內」歸巢和植入如上所述，採用或不採用2. 5mM或5. OmM煙醯胺進行NK細胞擴增。在培養基中2至3周之後，將相同數目(15 X IO6)的細胞輸注於照射(350Rad)的N0D/SCID鼠中。輸注之後4天殺死該鼠。採用免疫磁性微球法，而將其與外源細胞區分開，對脾、骨髓和外周血分析人體NK (⑶45+⑶56+)細胞的歸巢和植入。植入表示具有使用來自組織中確定的鼠外源細胞總數的抗人體特異性抗體的移植譜系(CD45+CD56+)的NK細胞％。NK細朐表面h⑶62L表汰的分析採用免疫磁性微球純化並用細胞因子(包括IL-2和IL-15)和採用或不採用煙醯胺(2. 5，5和7. 5mM)活化的外周血源⑶56+細胞開始培養。在培養基中活化之前和採用煙醯胺培養3周之後，NK細胞採用特異性抗體對於指定表面標記(例如，CD62L)進行染色，並隨後通過FACS進行監測。MS實施例I :煙醯胺增強NK細胞的離體增殖為了評價所加煙醯胺對NK細胞離體生長的影響，將臍血或骨髓細胞用生長因子(細胞因子)和遞增濃度的煙醯胺，在不使用飼養細胞或飼養層的情況下進行培養，而在不 同時間點測定NK和非-NK (例如，CD3+)細胞的分數。源自臍血的⑶56+細胞據發現富集於⑶56+⑶3-NK細胞群，並含有相當少的⑶56+⑶3+NKT細胞。當在IL-2和IL-15存在下採用煙醯胺培養純化臍血NK細胞(⑶56+)時，早在培養的14天就明顯出現NK細胞增殖大幅度增強，並在所有濃度下都進行測試。圖IA表明，採用2. 5mM煙醯胺的NK細胞在14天的增殖比僅僅採用生長因子(「細胞因子」)(包括IL-2和IL-15)培養的細胞增殖大4倍，而甚至超過採用5mM煙醯胺的情況。當測試更寬的煙醯胺濃度範圍時(圖1B)，據發現，採用O. 5至5mm所有濃度的煙醯胺培養3周，增強的N K細胞增殖，高達僅僅採用生長因子(「細胞因子」)(包括IL-2和IL-15)培養相同細胞的增殖2. 5倍之多。煙醯胺能夠增強來自混合未經選擇的臍血單核細胞群的增殖。未經選擇的臍血單核細胞培養基採用10ng/mL Flt-3, 20ng/mL白細胞介素-15(IL_15)，5ng/mL白細胞介素_2(IL-2)，並採用或不採用O. 5，1,2. 5和5mM煙醯胺進行補充。為了進一步評價煙醯胺對NK細胞離體增殖的特異性影響，採用和不採用濃度逐漸增加的煙醯胺，在培養基中3周之後分析繁殖的細胞。圖2A和2B顯示了⑶56+/⑶45+細胞和來自單核部分的⑶56+/⑶3-NK細胞的培養中顯而易見的劑量依賴性的煙醯胺誘導的增殖增強。圖2C清楚指示出煙醯胺處理的培養基中CD3+CD56-T細胞生長的抑制作用，也是以劑量依賴性的模式，而同時在不使用煙醯胺的對照培養基中生長的CD3+細胞佔據了 NK細胞的優勢。因此，NK和CD3+ (例如，T和NKT)細胞的混合細胞群採用煙醯胺培養，導致NK細胞部分的進一步富集，而同時僅僅採用細胞因子，而不使用煙醯胺的培養，卻幾乎不支持NK細胞增殖，反而增強了 CD3+細胞的增殖。骨髓和外周血細胞據發現含有包含⑶56+⑶3+NKT和⑶56+⑶3_NK細胞群的⑶56+細胞的異質群。骨髓來源的NK細胞的增殖類似地由採用煙醯胺的培養而增強。培養的骨髓純化⑶56+細胞的表徵表明，約20%至60%的細胞展示出NKT細胞(⑶56+⑶3+)的表型而40%至80%的細胞展示出NK細胞(⑶56+⑶3_)的表型(不同BM樣品之間是不同的)。因此，BM源的⑶56+細胞包含NK和NKT細胞的混合細胞群。儘管僅僅採用生長因子(「細胞因子」)(包括FLT3，IL-2和IL-15)培養的骨髓來源的⑶56+細胞中NK細胞增殖在培養基中14天之後幾乎沒有提高，但是在採用生長因子和2. 5mM煙醯胺培養的CD56+細胞中NK細胞的增殖在14天(倍增=8)和21天(倍增=12)之間卻提高了 50% (圖3)。在21天時進一步分析培養細胞的⑶56+⑶3-和⑶56+⑶3+亞類表明，在煙醯胺處理的培養基中⑶56+⑶3-NK細胞對CD56+CD3+NKT細胞具有壓倒性的優勢(大於80%)，而僅僅採用生長因子(「細胞因子」)(包括FLT3，IL-2和IL-15)培養的骨髓來源的CD56+細胞佔優勢的是NKT細胞(CD56+CD3+)而不是NK (CD56+CD3-)(圖4A和4B)。因此，異質NK+NKT細胞群採用煙醯胺培養，導致NK細胞部分進一步繁殖和富集，NKT細胞增殖最低，而同時僅僅採用細胞因子而不採用煙醯胺的培養並不支持NK細胞的優先增殖。⑶56+⑶16+細胞毒性的NK細胞群已經證明能夠具有抗體依賴性的細胞介導細胞毒性(ADCC)。採用生長因子而採用和不採用2. 5mM煙醯胺培養的骨髓⑶56+細胞在14天和21天培養之後的⑶56+⑶16+細胞分析表明，展示⑶56+⑶16+表型的NK細胞部分顯著增加，超過了僅僅採用生長因子(「細胞因子」)(包括FLT3，IL-2和IL-15)培養的骨髓來源的⑶56+細胞(參見圖5)當骨髓來源的CD56+細胞採用生長因子(「細胞因子」)(包括FLT3，IL_2和IL-15) 和煙醯胺離體培養7天時，在ImM，2. 5mM和5mM煙醯胺濃度之下，顯而易見CD56+CD3-NK細胞子組的增殖增強(圖6A)，而⑶56+⑶3+NKT細胞的增殖降低(圖6B)。採用2. 5mM和5mM煙醯胺在第7天時⑶56+⑶16+NK細胞的增殖增強程度最大(圖6C)。煙醯胺和所培養的外周血· NK細胞的自我更新能力:當外周血單核細胞耗盡⑶3+或⑶3+/⑶19+群時，就獲得NK細胞中富集的群，包含2%至10%NK細胞，絕大多數接種的細胞都屬於骨髓細胞譜系。在採用煙醯胺的培養中2至3周之後，培養基中超過90%的細胞是NK (⑶56+⑶3_)細胞。圖10舉例說明了在細胞因子(IL-2或IL-2+IL-15)存在下，在按比例放大(在培養袋中IOmL體積)的培養基中3周的培養期間外周血NK (T-細胞耗盡的)細胞的擴增。這個擴增在培養基中第一個7天期間是所有組中最緩慢的。在14天和21天之後，在都採用2. 5mM和5mM煙醯胺處理的培養基中NK擴增相對於不採用煙醯胺(NAM O)生長的對照培養基顯著更高。有意思的是，採用煙醯胺生長的NK細胞從14天至21天繼續發生擴增，而不採用NAM處理的NK細胞卻停止擴增。當這些培養採用一定範圍的接種密度(2-，5_和IOX IO5個接種細胞)開始時，在21天後在2. 5mM和5mM兩種情況下都觀察到⑶56+⑶3-NK細胞增殖進一步增強(圖11)。在接種後第21天時NK細胞群的FACS分析表明，採用2. 5mM和5. OmM兩個濃度的煙醯胺培養對於NK(⑶56+/⑶3_)群具有明顯的優勢。注意到，即使所有組中NK細胞的百分數都提高，但是相比較不採用煙醯胺的對照培養基，採用煙醯胺處理的培養基中非-NK細胞的分數較小(圖12)。煙釀胺濃度和臍血來源的純化⑶56+NK細胞的擴增當僅僅採用細胞因子(包括Flt-3，IL_2和IL-15)(細胞因子)或在遞增濃度(NAMI至7. 5mM)的煙醯胺存在下培養已經對於⑶56+表型在免疫磁性微珠上純化的臍血來源的NK細胞部分高達3周時，據觀察，相比較僅僅細胞因子的對照，所有濃度的測試煙醯胺都有效增強了臍血來源的NK細胞的NK增殖(參見圖17)。注意，相比較對照(細胞因子)，暴露煙醯胺的培養基的擴增是劑量依賴性的提高，持續於整個培養期間。因此，NK細胞增殖的煙醯胺增強作用對於短期和長期離體NK培養都是有效的，並不需要飼養層或飼養細胞，在整個煙醯胺濃度範圍內是明顯的，並能夠使用來自各種起始細胞群(例如，外周血，臍血)的NK和非-NK (CD3+，T細胞，NKT細胞等)細胞的NK富集的混合物，或高度異質性的單細胞群作為源，所有這些對於提供巨大數量的治療用途的NK細胞是很重要的。實施例II-離體暴露煙醯胺增強NK細胞功能NK細胞特徵在於既能響應抑制刺激，又能響應活化刺激，而具有有效而特異性的細胞毒性的功能NK細胞的生產對於任何離體NK細胞培養的考慮因素都是至關重要的。煙醯胺對NK細胞功能的影響通過其對細胞標記的影響，並採用趨化性「Tranwell」遷移和靶細胞「殺傷」試驗分析而進行評價。為了檢測抑制性和活化NK細胞部分的盛行情況的變化，採用生長因子[10ng/mL Flt-3, 20ng/mL白細胞介素-15 (IL-15)和5ng/mL白細胞介素_2(IL-2)]，採用或不採用1、2. 5和5mM煙醯胺，在孔板孔中培養純化臍血來源的⑶56+細胞。3周的培養之後，相比較僅僅採用生長因子(包括FLT3，IL-2和IL-15)培養的臍血來源的NK細胞(圖7)，在NK細胞中抑制性CD56+NKG2A細胞部分的盛行在所有煙醯胺濃度下出現顯著而劑量依賴性的降低，表明採用煙醯胺增強了 NK細胞的活化作用。功能上勝任的NK細胞能夠通過其趨化性和細胞毒性潛力進行表徵。為了評價煙 醯胺對NK細胞功能的影響，實施了體外遷移(趨化性)和殺傷作用(細胞毒性)試驗分析。相比較僅僅採用生長因子培養的⑶56+細胞的遷移作用，採用生長因子和2. 5或5. OmM煙醯胺培養的免疫磁性純化臍血來源的⑶56+細胞響應250ng/mL SDF刺激的遷移作用被大大增強(圖8A)。另外，煙醯胺培養的CD56+細胞在無SDF刺激存在下表現出移動性增強。煙醯胺對功能上相關的細胞表面受體的影響進行了研究。當使用特異性抗體和FACS分析對遷移(CXCR4 )、粘附(⑶49e )和轉運(⑶62L)受體的表達時，相比較對照(僅僅採用細胞因子)在煙醯胺存在下培養的細胞中CXCR4和⑶62L的表達強烈增強，⑶49e表達提高(圖8B)，強有力地表明煙醯胺處理的細胞遷移和歸巢骨髓、淋巴樣器官和其它器官的能力提高，並能夠預測煙醯胺培養的NK細胞優異的體內歸巢和活性。當分析轉運(⑶62L)受體在煙醯胺存在下培養的T-細胞耗盡(⑶3或⑶3/⑶19耗盡的)外周血NK細胞群表面上的表達時，相比較對照細胞(細胞因子)觀察到該受體的表達提高。在2.5and 5. OmM煙醯胺下，在7 (圖13A)、14 (圖13B)和21 (圖13C)天的培養之後觀察到CD62L-陽性細胞的百分數增加，而同時在僅僅細胞因子的對照中表達CD62L的NK細胞百分數從培養7天的20%縮小至培養21天的小於10%。圖20顯示了⑶62L轉運受體在具有IL_2的培養基中活化之前於外周血源免疫微球純化⑶56+細胞上的表達水平，在採用IL-2活化之後⑶62L表達水平顯著降低而在具有IL-2和濃度逐漸增加的煙醯胺(2. 5至7. 5mM)的培養基中活化之後⑶62L表達水平顯著增加。這些培養都是採用免疫磁性微球純化的外周血源⑶56+細胞開始而僅僅在細胞因子(包括IL-2和IL-15)(參見圖20，柱「O」)或細胞因子+煙醯胺(2. 5，5和7. 5mM)存在下維持。培養之前和3周培養之後，NK細胞用特異性CD62L抗體染色，而隨後通過FACS監測。注意，相比較對照(僅僅細胞因子，「0」)，在煙醯胺存在下培養的細胞中CD62L的表達顯著增強。插入的是FACS數據，顯示了相對於⑶56分布作圖的⑶62L分布。採用CFSE-標記的K562靶細胞進行試驗分析，並對採用生長因子和採用或不採用煙醯胺培養的臍血來源的⑶56+細胞評價NK細胞的殺傷潛力。在E:T之比為1:5，1:10和120NK細胞/靶細胞的情況下，採用生長因子和煙醯胺培養的臍血來源的NK細胞的殺傷(細胞毒性)潛力遠大於相同數目而僅僅生長因子培養的細胞(圖9)。新鮮的未培養細胞幾乎沒有展示出殺傷潛力。對採用生長因子和採用或不採用2. 5mM或5. OmM煙醯胺培養3周的外周血源⑶56+細胞，採用CFSE-標記的K562和BL2靶細胞試驗分析和評價外周血NK細胞的殺傷潛力。在E:T之比為I: I至10: INK細胞/靶細胞的情況下，採用生長因子和煙醯胺培養的增殖外周血源NK細胞的殺傷(細胞毒性)潛力遠大於相同數目而僅僅生長因子培養的細胞(圖 15A。外周血的增殖NK細胞的細胞毒性潛力也採用人體原發性雙表型白血病細胞(其中>90%的細胞是⑶3+T-細胞)作為靶細胞進行證明。圖15B和15C顯示了用NK細胞的2個獨立供體(供體A和供體B)在24h之後的結果，表明通過採用煙醯胺培養NK細胞殺傷潛力的活化作用提高。在培養的供體A的NK對照細胞中沒有任何殺傷潛力，進一步表明煙醯胺對NK細胞具有強烈的活化效應。採用煙醯胺增殖的外周血源NK細胞對實體腫瘤細胞這種重要的治療性靶的細胞 毒性潛力，採用Colo205結腸直腸腺癌細胞系的細胞作為靶細胞進行證實。圖MD顯示了所有測試的E:T比(I: I至10:1)下採用5mM煙醯胺培養的NK細胞提高的殺傷潛力。總之，這些結果表明，CD56+細胞暴露煙醯胺不僅能夠提高NK細胞的增殖，而尤其是CD56+CD62L細胞群的增殖，而且在煙醯胺存在下繁殖的細胞相比較僅僅採用生長因子培養的類似細胞具有更大的移動性、定向遷移和細胞毒性潛力。另外，本文中所示的結果表明煙醯胺能夠有效增強NK細胞的增殖和功能，無論是來自純化的還是總單核細胞部分和來自各種源，如外周血、骨髓或臍血。實施例III-煙釀胺對採用飼養細胞培養的NK細胞增殖的效果NK細胞也能夠採用飼養細胞進行培養。煙醯胺對採用外周血單核細胞(PBMC)飼養細胞共培養的NK細胞增殖和功能性進行了評價。一般而言，採用飼養細胞的培養如下實施含NK的細胞群(例如，臍血，外周血，骨髓)在照射的異源的或自體同源的PBMC飼養細胞存在下按照10:1至100:1的飼養培養的細胞比，並結合細胞因子(包括包括FLT3，IL-2和/或IL-15)和遞增濃度的煙醯胺(O. 5至IOmM)進行培養。這些培養維持2至5周並基於NK細胞和非-NK細胞和亞類(例如，⑶56+，⑶3+，⑶56+⑶3_，⑶56+⑶16+)的分布和NK細胞的功能(例如，趨化性，細胞毒性)評價煙醯胺在飼養細胞培養基中的影響作用。在飼養細胞培養基中採用煙醯胺培養的NK細胞增殖和功能的增強，進一步表明煙醯胺對培養基中NK細胞繁殖的功效。為了評價煙醯胺對採用飼養細胞培養的NK細胞的影響，外周血NK細胞部分在採用照射的基質細胞，採用和不採用煙醯胺的共培養下進行擴增，並分析檢測倍增、表面標記CD56、CXCR4和功能性能。外周血源的單核細胞部分進行⑶3耗盡並隨後通過免疫微珠純化而對⑶56+細胞進行選擇。來自相同血液單位的單核細胞部分一直保留並以3000rad照射，而提供照射的單核細胞。CD56+NK細胞採用照射的外周血源的單核細胞部分按照10 1的照射外周血單核細胞/⑶56選擇的細胞比接種。這些培養基採用IL-2，IL-15和Flt-3，採用或採用煙醯胺(2. 5和5mM)進行補充。採用照射飼養細胞培養21天之後，觀察到煙醯胺補充的培養基具有顯著優勢。在第21天時在2. 5mM和5mM煙醯胺存在下培養的NK細胞倍增，相比較第O天，至少為對照(細胞火速+照射的單核細胞)的4倍(參見圖20)。NK細胞採用照射的單核細胞在煙醯胺存在下共培養，也產生了表面標記CXCR4 (參見圖21)和⑶62L (參見圖22)表達的顯著增力口。因此，採用煙醯胺在照射的單核細胞和細胞因子存在下擴增的NK細胞已經證實遷移(CXCR4)和轉運(⑶62L)潛力都得以增強。當擴增的NK細胞對其離體殺滅K562靶細胞的作用進行分析時，在5: 1，2. 5:1和I: INK細胞/靶細胞時觀察到細胞毒性能力增加(參見圖23)。靶細胞死亡通過FACS作為PI陽性CFSE標記的細胞的百分數而進行監測。增加的靶細胞殺滅潛力，相比較對照(僅僅細胞因子)強有力地表明通過煙醯胺和照射的單核細胞培養，增強了 NK細胞殺傷潛力的活化作用。因此，當NK細胞在煙醯胺存在下採用或不採用另外的飼養細胞進行培養時，都觀察到增殖和功能的同樣增強。總之，這些結果表明在採用煙醯胺處理的NK細胞培養基中觀察到的效應是很獨特的而大於採用飼養細胞培養NK細胞的效應。採用煙醯胺，使用或不適用飼養細胞情況下培養NK細胞，不僅導致其離體增殖提高，而且增強了擴增的NK細胞的功能潛力(例如， ⑶62L和CXCR4的表達)，這對於用NK細胞進行治療的移植和採用的免疫療法的臨床效能都是很重要的。實施例IV-煙醯胺對採用CD3-或CD3CD19-耗盡的麗C開始的NK細胞培養中非NK細胞增殖的效果適用於臨床環境培養的NK細胞擴增方法，對於NK細胞群是必須稍微具有特異性，由於細胞培養條件最不具汙染性的非NK細胞也會增殖。煙醯胺對非NK細胞的影響通過監測暴露2. 5，5和7. 5mM煙醯胺的NK細胞培養基中的單核細胞和粒性白細胞群進行評價。圖14A和14B舉例說明了相比較NAM非未處理的培養基中的百分數，煙醯胺降低用煙醯胺處理14天的NK細胞培養基中汙染性單核細胞(CD14+，圖14A)和粒性白細胞(⑶15+，圖14B)的百分數的效果。令人驚訝的是，採用煙醯胺培養NK細胞，在第14天培養時抑制了 50%的⑶14和⑶16增殖。當開始之後3周時分析根據採用⑶56+純化外周血NK細胞開始而在在無(細胞因子，"NAM 0")或有煙醯胺(NAM 2. 5, NAM 5. 0)存在下維持的培養基中存在的細胞表面標記(CD56，CD3)進行分類的不同淋巴細胞亞類的比例時，採用濃度逐漸增加的煙醯胺觀察到了非NK細胞如⑶3+T細胞和⑶3+⑶56+NKT細胞的分數降低(參見圖18和圖18B，小圖表)。採用煙醯胺培養的NK細胞比未暴露煙醯胺的NK細胞更加有效地抑制了 CD3+細胞。這些培養基採用細胞因子(包括Flt-3，IL-15和IL-2)，採用或不採用濃度(2. 5至7. 5mM)逐漸增加的煙醯胺維持3周，對於表面標記於特異性抗體反應，而隨後通過FACS對特異性表型進行分析。這種經常與移植物抗宿主病、NKT和T-細胞有關的⑶14和⑶15細胞汙染的降低，可能是對於培養基中NK細胞擴增的任何臨床有用方案的重要方面，因為這能夠降低對粗放的T-細胞、單核細胞和粒性白細胞耗盡預移植的需要，並進一步降低移植物抗宿主病和宿主中相關的綜合症。實施例V-煙釀胺對以純化造血幹細胞/祖細胞開始的培養中NK細胞增殖和功能的效果
煙醯胺對造血源細胞中NK細胞增殖和功能的增強作用，能夠通過將煙醯胺處理的造血細胞群暴露培養基中的煙醯胺和合適的細胞因子而進行評價。這些培養採用純化的造血幹細胞和/或祖細胞(例如，⑶34+或⑶133+細胞)開始，並用細胞因子包括TPO，FLT3，SCF和/或IL7和/或IL15的組合，採用或不採用濃度逐漸增加的煙醯胺(0. 5至IOmM)補充I周或兩周。在這段時間之後，培養基用細胞因子包括FLT3，IL7，IL15，IL21和/或IL-2的組合，採用或不採用濃度逐漸增加的煙醯胺(0. 5至IOmM)補充另一段時間(例如，2至3周)。為了評價煙醯胺對所培養的造血源NK細胞的增殖和功能的影響，在所培養的細胞群中監測NK和非NK細胞和亞類(例如，⑶56+，⑶3+，⑶56+⑶3_，⑶56+⑶16+)的分布和NK細胞的功能(例如，趨化性，細胞毒性)。實施例VI-煙醯胺培養的NK細胞的植入和治療潛力在將NK細胞移植到活體宿主中之後，對煙醯胺存在下擴增的NK細胞測試體內對 靶細胞的定位和對器官的植入。照射的(350Rad)N0D/SCID鼠接受15X106個來自人體外周血NK (T-細胞耗盡的)培養基並採用(NAM 2. 5mM和NAM 5mM)或不採用(NAM 0)煙醯胺維持高達3周的細胞。一旦在輸注之後第4天殺死這些小鼠時，通過FACS使用人體特異性Abs對脾、骨髓和外周血樣品評價人體NK細胞(⑶56+⑶45+)的存在。圖16顯示了採用煙醯胺擴增的NK細胞對合適的靶組織定位和植入的提高，表示所示器官總NK細胞的百分數，而證實煙醯胺濃度越高，效應越強。因此，採用煙醯胺培養NK細胞，不僅增加了 NK細胞的數目，而且也提高了其體內功能的潛力，這一點通過對靶器官(例如，脾，骨髓和外周血)的定位和植入得以證實。在進一步的研究中，培養的，以及新鮮的未培養的人體NK或CD56+細胞的輸注能夠在預想實現亞最佳移植的劑量範圍內進行實施，並隨後在小鼠或其後代的部分中進行非植入。在輸注之後4h和高達4周時能夠，例如根據人體⑶45或⑶45⑶56抗原，評價人體NK細胞歸巢和停留。採用亞最佳劑量，能夠給予煙醯胺-培養的NK細胞，並能夠記錄對受者PB、BM和淋巴器官中歸巢和停留的影響，而與不採用煙醯胺(僅僅細胞因子)培養的NK細胞或新鮮NK細胞的歸巢和停留相比較。採用煙醯胺培養的NK細胞體內抗腫瘤潛力能夠採用許多動物腫瘤模型如骨髓性白血病《562)伯基特氏淋巴瘤(81^2)、人體胰腺癌(BxPC-3和Panc-I)人體乳腺癌和結腸直腸癌異體移植進行評價——異體移植的實體腫瘤生長在輸注本發明的NK細胞群之後不同的時間點進行監測。異體移植的腫瘤的轉移癌潛力也在NK細胞輸注之後進行評價。NK細胞對白血病和骨髓增生異常綜合症模型的影響，能夠直接採用輸注I X IO3,1 X IO4,1 X IO5,I X IO6,1 X IO7,1 X IO8或更大劑量的培養NK細胞/kg鼠體重進行評價，或在連同造血祖細胞、骨髓、幹細胞等一起輸注時評價切除後骨髓增殖的效能改善。儘管本發明已經結合其具體實施方式
進行了描述，很明顯，許多改變、修改和變化對於本領域的那些技術人員是很明顯的。因此，本發明預想涵蓋所有這些改變、修改和變化，這些都落入本發明附加權利要求的精神和寬範圍內。本說明書內提及的所有出版物、專利和專利申請都以其全文結合於本說明書中作為參考，就如同每個各個出版物、專利或專利申請特異且單獨指出而結合於本文中作為參考的程度一樣。另外，本申請書中弓I述或確定的任何參考文獻不應該解釋為是承認這些文獻是可得到的本發明的現有技術。至於使用的節標題，不應理解為必要的限制。參考文獻Bachanova et al. Canc Immunol Immunother 2010 ；59 :739-44Beider et al. Blood 2003 ;102 :1951-Berg et al. Cytotherapy 2009 ; 11 :341_55Bernardini et al. Blood 2008;111:3626-34Caliguiri Blood 2008 112:461-69Cho and Campana, Korean J Lab Med 2009 ；29 :89-96
Decor,et al. Exper Hematology 2010 ;38 ;351_62Frias et al. Exp Hematol 2008;36:61-68Gahrton et al. Blood 2008 ；111 :3155-62Guven, Karolinska Institute 2005Harada et al. Exp Hematol. 2004 ;32 :614-21H-g Klingemann ; J Martinson. Cytotherapy 2004 ；6 (I) :15Humeau L.，et al. Blood 1997,90 :3496Koehl et al. , Klin Padiatr 2005 ；217 :345-50Markel et al. PLoS ONE 2009 ；4 Issue 5Meyer-Monad et al. Transfusion 2009 ；49 :362-71Miller et al.，Blood 1992 ；80 :2221-29Miller et al.，Blood 2006 ；108 :3111 (Abstract)Olson et al. J Immunology 2009 ；183 :3219-28Robertson, M. J.，J. Ritz. Blood 1990 ；76 :2421Rosenberg, S. A. J. Natl Cancer Inst 1985.75:595.Rosenberg, et al. J. Natl. Cane. Inst. 1993 ；85 :622-32Rosenberg, S. A. et al. J. Natl. Cancer Inst. 1994 ；85 :622Schleinitz et al. Immunology 2010 131 :451-58Schuster et al. E. J. Immunol 2009 ；34 :2981-90Verneris et al. Brit J Hematol 2009 ；147 :185-91Von Drygalski A et al. Strm Cells Dev ；2004 13 (I) :101-11Yu et al. Blood 2010 ；115 :274-81Zucchini et al.，Exp Rev Anti-Infect Ther 2008 ；6 :867-8權利要求
1.一種離體培養自然殺傷(MO細胞的方法，所述方法包括採用至少一種生長因子和有效濃度、有效暴露時間和有效持續時間的暴露煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養包含NK細胞的細胞群，其中採用所述至少一種生長因子和所述有效濃度、有效暴露時間和有效持續時間的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分培養所述NK細胞產生以下中的至少之一 Ca)與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，⑶62L的表達提高； (b)與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，採用小於O.ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，遷移響應提高； (c)與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，採用小於O.ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，歸巢和體內停留增加； Cd)與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或 其它煙醯胺部分，增殖更多；和 Ce)與其它相同培養條件下培養的NK細胞比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，細胞毒活性增加。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2，所述暴露時間是從包含NK細胞的所述細胞群的接種開始的，所述暴露持續時間為約2至約3周，而所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述濃度為5mM。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述有效濃度為約O. 5mM至約50mM。
4.根據權利要求I所述的方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述有效濃度為約I. OmM至約25mM。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述有效濃度為約2. 5mM至約10mM。
6.根據權利要求I所述的方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述有效濃度為約2. 5mM。
7.根據權利要求I所述的方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述有效濃度為約5. OmM。
8.根據權利要求I所述的方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分的所述有效濃度為約7. 5mM。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露時間是從包含所述NK細胞的所述細胞群在所述培養基中的接種開始的。
10.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露持續時間為約2h至約5周。
11.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露持續時間為約30h至約4周。
12.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露持續時間為約2天至約3周。
13.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露持續時間為約I周。
14.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露持續時間為約2周。
15.根據權利要求I所述的方法，其中所述暴露持續時間為約3周。
16.根據權利要求I所述的方法，其中包含所述NK細胞的所述細胞群獲自選自由臍血、 骨髓和外周血組成的組中的來源。
17.根據權利要求I所述的方法，其中包含所述NK細胞的所述細胞群是包含NK細胞部分和CD3+細胞部分的異質細胞群。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述CD3+細胞部分大於所述NK細胞部分。
19.根據權利要求17所述的方法，其中所述NK細胞部分大於所述CD3+細胞部分。
20.根據權利要求19所述的方法，其中包含所述NK細胞的所述細胞群是耗盡CD3+細胞的單核或總核細胞群。
21.根據權利要求19所述的方法，其中包含所述NK細胞的所述細胞群是耗盡CD3+和CD 19+細胞的單核或總核細胞群。
22.根據權利要求I所述的方法，其中包含所述NK細胞的所述細胞群是未經選擇的NK細胞群。
23.根據權利要求I所述的方法，其中所述NK細胞包含⑶56+⑶3-細胞。
24.根據權利要求I所述的方法，其中所述NK細胞包含⑶56+⑶16+⑶3-細胞。
25.根據權利要求I所述的方法，其中所述培養包含所述NK細胞的所述細胞群在無飼養層或飼養細胞下實施的。
26.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種生長因子包括選自由SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21組成的組中的生長因子。
27.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述至少一種生長因子是單獨的IL-2。
29.根據權利要求I所述的方法，其中所述CD62L的表達是通過選自由流式細胞術、免疫檢測、定量cDNA擴增和雜交組成的組中的方法測定的。
30.根據權利要求I所述的方法，其中所述CD62L的表達通過螢光激活細胞分選法(FACS)進行測定。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述⑶62L的表達通過使用螢光抗人⑶62L單克隆抗體進行測定。
32.根據權利要求I所述的方法，其中所述遷移響應提高通過遷移或補洞分析法進行檢測。
33.根據權利要求I所述的方法，其中所述遷移響應提高通過遷移分析法進行檢測。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述遷移響應於SDFl的刺激進行分析。
35.根據權利要求I所述的方法，其中所述歸巢和體內停留增加是通過FACS測定的，表示為輸注之後靶器官中植入的NK細胞的百分數。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述靶器官選自由脾、骨髓和淋巴結組成的組。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述歸巢和植入在NK細胞輸注之後約I天至約2周進行測定。
38.根據權利要求I所述的方法,其中所述增殖速率通過集落生成分析法、機械分析法、代謝分析法和直接增殖分析法進行測定。
39.根據權利要求I所述的方法，其中所述增殖速率通過CD56+CD3-細胞百分數的FACS分析進行測定並表示為隨時間的增加倍數。
40.根據權利要求I所述的方法，其中所述細胞毒活性使用細胞殺傷分析法進行分析。
41.根據權利要求40所述的方法，其中所述細胞殺傷分析法的所述靶細胞是癌細胞系、原發性癌細胞、實體腫瘤細胞、白血病細胞或病毒感染細胞。
42.根據權利要求I至41中任一項所述的方法培養的NK細胞群。
43.一種NK細胞群，特徵在於以下至少之一 Ca)與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，⑶62L的表達提高； (b)與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O.ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，遷移響應提高； (c)與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O.ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，歸巢和體內停留增加； Cd)與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，增殖更多； Ce)與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，細胞毒活性增加； Cf)與其它相同培養條件下培養的NK細胞群比較，採用小於O. ImM的所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分，⑶3+與⑶56+/⑶3-的細胞比降低。
44.一種NK細胞群，特徵在於移植時歸巢、植入和保留提高，其中將至少15X IO6的所述NK細胞群輸注到照射的SCID鼠宿主中，在輸注之後4天時導致在宿主淋巴組織中產生至少25%供體來源的NK細胞，如通過免疫檢測和流式細胞術檢測的。
45.根據權利要求44所述的NK細胞群，進一步特徵在於在輸注時CD62L在至少30%的所述細胞群中表達，如通過免疫檢測和流式細胞術檢測的。
46.根據權利要求44所述的NK細胞群，進一步特徵在於在輸注時CD3+與CD56+/⑶3-的細胞比等於或小於1:100。
47.一種在需要其的主體中抑制腫瘤生長的方法，包括給予所述主體治療有效量的根據權利要求42至46中任一項所述的NK細胞群。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是自體同源的。
49.根據權利要求47所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是異源的。
50.根據權利要求47所述的方法，其中所述給予通過單次輸注所述NK細胞群完成。
51.根據權利要求47所述的方法，其中所述給予通過重複輸注所述NK細胞群完成。
52.根據權利要求47所述的方法，其中所述主體採用至少一種生長因子伴隨給予所述NK細胞群治療。
53.根據權利要求52所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。
54.一種在需要其的主體中治療或預防病毒性感染的方法，包括給予所述主體治療有效量的根據權利要求42至46中任一項所述的離體培養的NK細胞群。
55.根據權利要求54所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是自體同源的。
56.根據權利要求54所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是異源的。
57.根據權利要求54所述的方法，其中所述給予通過單次輸注所述NK細胞群完成。
58.根據權利要求54所述的方法，其中所述給予通過重複輸注所述NK細胞群完成。
59.根據權利要求54所述的方法，其中所述主體採用至少一種生長因子伴隨給予所述NK細胞群治療。
60.根據權利要求59所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。
61.一種在需要其的主體中治療或預防移植物抗宿主病的方法，包括給予所述主體治療有效量的根據權利要求42至46中任一項所述的離體培養的NK細胞群。
62.根據權利要求61所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是自體同源的。
63.根據權利要求61所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是異源的。
64.根據權利要求61所述的方法，其中所述給予通過單次輸注所述NK細胞群完成。
65.根據權利要求61所述的方法，其中所述給予通過重複輸注所述NK細胞群完成。
66.根據權利要求61所述的方法，其中所述主體採用至少一種生長因子伴隨給予所述NK細胞群治療。
67.根據權利要求66所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和I L-15。
68.根據權利要求61所述的方法，其中所述主體接受造血細胞移植伴隨給予所述NK細胞群。
69.一種在需要其的主體中治療或預防自身免疫性疾病或病症的方法，包括給予所述主體治療有效量的根據權利要求42至46中任一項所述的離體培養的NK細胞群。
70.根據權利要求69所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是自體同源的。
71.根據權利要求69所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是異源的。
72.根據權利要求69所述的方法，其中所述給予通過單次輸注所述NK細胞群完成。
73.根據權利要求69所述的方法，其中所述給予通過重複輸注所述NK細胞群完成。
74.根據權利要求69所述的方法，其中所述主體採用至少一種生長因子伴隨給予所述NK細胞群治療。
75.根據權利要求74所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。
76.—種在需要其的主體中治療或預防白血病的疾病或病症的方法，包括給予所述主體治療有效量的根據權利要求42至46中任一項所述的離體培養的NK細胞群。
77.根據權利要求76所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是自體同源的。
78.根據權利要求76所述的方法，其中所述NK細胞群與所述主體是異源的。
79.根據權利要求76所述的方法，其中所述給予通過單次輸注所述NK細胞群完成。
80.根據權利要求76所述的方法，其中所述給予通過重複輸注所述NK細胞群完成。
81.根據權利要求76所述的方法，其中所述主體採用至少一種生長因子伴隨給予所述NK細胞群治療。
82.根據權利要求76所述的方法，其中所述至少一種生長因子是IL-2或IL-2和IL-15。
83.根據權利要求76所述的方法，其中所述主體接受造血細胞移植伴隨給予所述NK細胞群。
84.一種轉導具有外源基因的離體培養的NK細胞的方法，所述方法包括 Ca)根據權利要求I至41中任一項所述的方法離體培養NK細胞群；和(b)轉導具有外源基因的所述培養的NK細胞群。
85.根據權利要求I至84中任一項所述的群或方法，其中所述煙醯胺和/或其它煙醯胺部分是煙醯胺。
86.根據權利要求I至84中任一項所述的群或方法，其中所述煙醯胺部分是煙醯胺類似物或衍生物。
87.根據權利要求86所述的群或方法，其中所述煙醯胺類似物或衍生物是取代的苯甲醯胺、取代的煙醯胺、煙乙硫醯胺、N-取代的煙醯胺、煙硫醯胺、3-乙醯吡啶或煙酸鈉。
全文摘要
提供了一種自然殺傷(NK)細胞離體培養的方法，更具體地，是通過用煙醯胺或其它煙醯胺部分處理所述細胞並結合細胞因子促進的NK細胞增殖而增強NK細胞的繁殖和/或功能性的方法。還涉及包含培養的NK細胞的組合物及其治療用途。
文檔編號A61K31/455GK102781449SQ201080064938
公開日2012年11月14日 申請日期2010年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者加比·M·弗雷, 託尼·佩勒德 申請人:加米達細胞有限公司