2′－支鏈核苷的製備方法

2023-11-01 12:51:52

專利名稱：2′－支鏈核苷的製備方法
技術領域：
本發明涉及具有保護的氧取代基的糖類似化合物的製備方法，特別是關於2，3，5-(獨立任選保護的羥基)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖和2，3，5-(獨立任選保護的羥基)-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯的製備方法。本發明還包括製備核苷的方法，特別是通過任選使用按照在此提出的方法製備的糖來製備3′，5′-(獨立任選保護的羥基)-2′-C-甲基-β-D-胞苷的方法，特別的，是關於藥物化合物前體的合成。更具體地，本發明描述了用作抗病毒核苷和核苷類似物衍生化合物給藥的前藥的合成，特別的，是2′-C-甲基-β-D-胞苷的′-O-纈氨酸酯的合成。
背景技術：
在用於核苷和維生素合成中的糖類似物的製備中，一種關鍵的中間體為2-C-甲基-D-核糖酸-內酯。早在1880，Scheibler就介紹了製備內酯的方法(JohnSowden，″The Saccharinic Acids″in Adv.Carbohydrate Chem.1243-46(1957)，引用C.Scheibler，Berichte 132212(1880))。然而，產物的產率卻只有大約10％(Id.)。大約在同一時間，H.Kiliani利用氫氧化鈣處理D-果糖，合成了2-甲基-D-核糖酸內酯(H.Kiliani，Berichte，152953(1882)，在F.J.Lopez-Herrera etal.，J Carbohydrate Chemistry，13(5)767-775(1994)中被引用)。然而，該方法需要數月的時間來完成，且產率僅有10％(Id.at 768)。但是，Kiliani的方法使他能夠確定重要的官能基在化合物上的位置(John Sowden，″The Saccharinic Acids″in Adv.Carbohydrate Chem.1243-46(1957)，引用H.Kiliani，Ann.，213361(1883))。
在20世紀60年代早期，Whistler和BeMiller嘗試過改進Kiliani的合成(RoyL.Whistler and J.N.BeMiller，″a-D-Glucosaccharino-1，4-lactone″in Methods inCarbohydrate Chemistry，2484-485(1963))。Whistler和BeMiller向D-果糖中加入沸水和氫氧化鈣，向該體系中通入氮氣，重複相同的過程。兩周後；再將混合物放置6-8周，再用CO2和二水合草酸處理，壓力下過濾。重複洗滌殘渣，直至變為均勻的漿液狀，合併濾液，減壓下蒸餾溶劑，使所得產物冷卻下結晶(Id.)。最終產率仍僅為約10％(Id.at 485)。
在提高產率的嘗試中，Lopez-Aparicio等報導了由2，3-O-異亞丙基-D-甘油醛合成2-C-甲基-D-核糖酸-1，4-內酯來替代Kiliani合成(Lopez-Aparicio et al.，Carbohydrate Res.，12999(1984)，在F.J.Lopez-Herrera et al.，J.CarbohydrateChemistry，13(5)767-775(1994)第768-769頁中被引用)。Lopez-Aparicio的方法包括使2，3-O-異亞丙基-D-甘油醛與(1-甲氧基-羰基-乙縮醛)三苯基正膦縮合，產生甲基E-(S)-4，5-二羥基-4，5-O-異亞丙基-2-甲基-2-戊烯酸酯；水和(在HCl中)並且將戊烯酸酯進行光化學異構化；對戊烯酸酯產物進行內酯化，產生丁烯酸內酯；通過與三苯甲基氯和吡啶的反應，在C-5對丁烯酸內酯進行三苯甲基化，然後用高錳酸鉀和二氯甲烷在冠醚存在下進行順式羥基化作用。通過與TFA(三氟乙酸)(Id.at 768)的反應，最終得以除去三苯甲基。據Lopez-Aparicio等報導，核糖酸內酯的產率約為80％，但是其他人根據在他們發表的實驗部分中給出的材料的質量(克)，卻不能得到上述數據。相反，經計算表明核糖酸內酯的百分產率約為36％。並且，Lopez-Aparicio等的方法比起Kiliani合成而言要複雜得多，需要使用如高錳酸鉀這樣的有毒試劑和專門的設備用於輻射以獲得光化學異構化，且最少需要60小時的反應時間(Id.at 768，770-772)。
Walton等報導了由2-C-甲基-D-核糖酸-內酯合成2′-C-甲基腺苷(Walton etal.，J.Am.Chem.Soc.，88(19)4524-5(1966))。在這裡，內酯被轉換成其2，3，5-三-O-苯甲醯衍生物，然後用二(3-甲基-2-丁基)硼烷還原，得到2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-呋喃核糖(Id.)的端基異構混合物。在酸洗氧化鋁和矽膠上試圖分離端基異構混合物時，導致重排為1，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-α-D-呋喃核糖(Id)。為了避免重排，需要增加用苯甲醯氯在吡啶中處理混合的端基異構體以獲得1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-(α)/(β)-D-呋喃核糖的步驟，以及用色譜分離最終產物的步驟(Id.)。此後，Walton等報導了通過Hilbert-Johnson反應合成了2′-C-甲基-5-氟胞苷、2′-C-甲基-5-氟尿苷和2′-和3′-C-甲基胞苷(Walton et al.，AntiviralNucleosides 12306-309(1969))。然而，出乎意料的是，在由N-乙醯胞嘧啶-汞合成2′-C-甲基胞苷時，產生了大量的O-配醣，而汞本身是有毒試劑，希望避免使用(Id.)。在Walton等報導的兩種合成方法中，最終產物的產率均只有約11％。
在1997年，Harry-O′Kuru等報導了製備′-C-支鏈核糖核苷的合成路線(Harry-O′Kuru et al.，J Org.Chem.，621754-9(1997))。可從商業上獲得的1，3，5-三-O-苯甲醯-α-D-呋喃核糖被用作起始原料，其是由D-核糖或D-樹膠醛醣(D-阿拉伯吡喃糖)製得。1，3，5-三-O-苯甲醯-α-D-呋喃核糖在自由的2-OH和Dess-Martin periodinane試劑作用下被氧化，產生1，3，5-三-O-苯甲醯-2-酮-呋喃核糖以及其相應的水合物。期望的產物以及水合物與過量的MgSO4攪拌，並放置過夜。然後過濾混合物並濃縮產生大量純的酮類產物。用MeMgBr/TiCl4(或者也可用MeTiCl3、CH2＝CHMgBr/CeCl3、或TMSC＝CLi/CeCl3)處理得到的2-酮糖，以接近5∶3的期望產物和異構形式(Id.at 1755)的比例，產生期望的1，3，5-三-O-苯甲醯-2-取代的烷基、鏈烯基或炔基核糖呋喃糖苷(ribofuranoside)和其酯交換反應了的異構體的端基異構混合物，以及α-和β-2，3，5-三-O-苯甲醯-2-取代的烷基、鏈烯基或炔基核糖呋喃糖苷(Id.at 1755)。然後，通過苯甲醯氯、DMAP和三乙胺處理，以大約70％的產率和4∶1的β/α的比率(Id.)，將2-烷基化的核糖呋喃糖苷轉化為單獨的期望產物1，2，3，5-四苯甲醯-2-烷基核糖呋喃糖苷。
Beigelman等報導了由D-葡萄糖和D-核糖合成2′-C-甲基-核苷(Beigelman etal.，Carbohydrate Research，166219-232(1987))。使用D-葡萄糖作為起始原料時，製備了1，2，5，6-二-O-異亞丙基-3-C-甲基-α-D-allofuranose，通過5，6-O-二丁基stannylidene衍生物選擇性地的插入p-甲基苯甲醯基而進行轉化(Id.)。然後，用90％的三氟乙酸處理和進行高碘酸鹽氧化作用，除去化合物上的甲酸基，進行乙醯化(Id.)。最終產率約為77％(Id.)。使用D-核糖作為起始原料時，使5-位保護的2，3-二甲基-異亞丙基衍生物與甲醛進行醇醛縮合，然後用過量的甲苯p-磺醯氯在吡啶中處理(Id.)。接著，按照文獻中已知的條件，例如，Kuhn甲基化、用LiAlH4在THF中還原、酸催化水解，以及在吡啶中過量的Ac2O中沸騰進行乙醯化作用(Id.)，用該化合物形成各種產物。
Novak和Sorm詳細報導了通過硼氫化鈉還原，由2-C-甲基-D-核糖酸內酯製備結晶2-C-甲基-D-核糖及其衍生化合物(J.J.K.NovakF.Sorm，CollectionCzechoslov.Chem.Commun.，34857-866(1969))。他們描述了在2-C-甲基-核糖呋喃糖苷的2-位的羥基的性質，特別是與位於相應的內酯的類似位置的羥基進行了比較(Id.)。雖然內酯上的羥基容易在本領域已知的條件下被乙醯化而產生2，3，5-三-O-乙醯基和2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸內酯，但在類似的條件下，由2-C-甲基-核糖呋喃糖苷只產生3，5-二-O-乙醯基-和3，5-二-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸內酯(Id.)。
此後，Novak描述了2-C-甲基-1，4-內酯的手性-光活特性，2-C-甲基-1，4-內酯是由D-lyxose和D-木糖通過次碘酸鹽氧化製得，且在內酯的C3和C5上有p-甲苯醯保護基(J.J.K.Novak，Collection Czechoslov.Chem.Commun.，39869-882(1974))。特別是，由3，5-p-甲苯醯-2-Br，2-CH3-核糖酸-1，4-內酯，通過水解合成了2-CH3-核糖酸-1，4-內酯(Id.)。然而，Novak提到了在分離保護的內酯時有難度，並且在嘗試通過鹼的醇解來切斷內酯時生成了漿狀的產物(Id.at 871)。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.(JP 61-212592)和BASF Aktiendgesellschaft(EP 0 288847)都報導了由D-樹膠醛醣，一種常用的生產核糖的起始原料來製備未保護的D-核糖的方法。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.，教導了含水D-樹膠醛醣在有機溶劑中，優選在鉬(VI)酸和硼酸化合物的存在下的差向異構，通過2-或3-價的陽離子交換材料(優選轉變為Ca-型的多苯乙烯磺酸型強酸性離子交換樹脂)收集和通過反應液，用水洗提分離未保護的核糖，以及收集核糖化合物(JP 61-212592，摘要)。
BASF教導了D-樹膠醛醣的水/醇溶液在有負載了鉬(VI)化合物的鹼性離子交換器的存在下，在溶劑中加熱的連續工藝。洗出液被收集和乾燥，向乾燥的洗出液中加入甲醇或乙醇，將混合物冷卻至約0℃，使未保護的D-樹膠醛醣結晶，然後再對其分離和回收。根據本領域公知道方法，通過強酸性離子交換器以Ca2+的形式濃縮和純化剩餘的濾出液，而在結晶階段，任何與產物脫離的樹膠醛醣/核糖都循環到樹膠醛醣中(EP 0288847)。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.和BASF的方法均要求複雜和昂貴的設備和試劑，且得到的產物化合物仍需要添加保護基。
日本Tobacco，Inc.，通過保護位於γ-核糖酸內酯上的5-OH，製得了3-DPA-內酯，其中，用到了鹽酸或酸酐以及叔胺使得3-OH發生β-消除，在碳2和3之間形成雙鍵，同時使2-OH發生乙醯化，最終對C-2和C-3之間的雙鍵進行催化加氫，並除去保護基，生成5-OH。參見EP O 526,655A1，EP O 553,358 A1和EP O 553,358B1，以及它們的美國同族專利U.S.5,322,955和U.S.5,391,769。
關於合成帶有保護的取代基的核糖酸內酯以及糖類似物合成的其他相關工作還包括以下Li et al.，Organic Letters，3(7)1025-28(2001)由1，3，5-三-O-苯甲醯-α-D-呋喃核糖合成了′-C-β-三氟甲基嘧啶核苷，然後將其轉化成3，5-二-O-苯甲醯-2-C-β-三氟甲基-α-D-1-呋喃核糖溴化物。該溴化衍生化合物被發現是在形成核苷時的有效反應中間體。
Beigelman et al.，Bioorg Khim.，12(10)1359-65(1986)，通過1，2，5，6-二-O-異亞丙基-3-C-甲基-α-D-allofuranose的苄基化合成了2-C-甲基-D-核糖衍生化合物，形成第一中間體；水解並選擇性乙醯化該第一中間體，形成3-O-卞基-1，2-O-異亞丙基-3-C-甲基-6-O-甲苯醯-c-D-allofuranose；繼續脫除異亞丙基，氧化(用高碘酸)，脫甲醯化，乙醯化，脫卞基化，再次乙醯化，從而得到最終產品1，2，3-三-O-乙醯-2-C-甲基-5-O-甲苯醯-β-D-核糖呋喃糖。
Feast et al.，Acta Chemica Scandinavica 191127-34(1965)，報導了α-D-葡糖酸的製備，其為2-C-甲基-D-核糖-戊酸，是通過1，4-內酯中間體，經鹼處理D-果糖或1-O-取代的D-果糖得到的。
Kohn et al.，J.Am.Chem.Soc.，87(23)5475-80(1965)描述了獲得醛醣的呋喃糖衍生物的簡短的路徑，其是採用disiamyl硼烷作為還原劑，將四環己氧基-γ-內酯還原成其相應的四醯基己糖呋喃糖。該反應對於在合成C-1′呋喃基核苷中的中間體的形成尤為重要。
Kempe et al.，Nucleic Acids Res.，10(21)6695-6714(1982)報導了在保護的核糖核苷的順2′，3′-二醇的選擇性的2′-苯甲醯化，以及將2′-苯甲酸酯異構化為3′-苯甲酸酯。這些保護的核苷被用於在固體矽膠支撐物上合成低聚核糖核苷，然後進行脫保護，這樣的好處是內部核苷分解最少。
Schmidt等的美國專利U.S.4,294,766詳細介紹了由核糖酸內酯和阿拉伯酸內酯的混合物合成純的核糖酸內酯。核糖酸內酯是在形成核黃素(riboflavin(維生素B2))時的中間體。阿拉伯酸鉀和核糖酸鉀的混合物被「內酯化」，得到的約70％為核糖酸內酯的內酯混合物用二噁烷或乙二醇單甲醚通過分級結晶進行分離。採用已知道方法進行內酯化，例如，通過使用離子交換器，或在H2SO4或K2SO4下濃縮內酯，並過濾掉沉澱物。
核苷偶聯Walton描述了支鏈核苷的合成，其是通過使2，3，5-三-O-醯基-2-(或3)-C-烷基核糖呋喃糖滷化物和氯汞嘌呤或嘧啶化合物反應而製備(U.S.3,480,613)。3-低級烷基-D-核糖呋喃糖滷化物中間體是以1，2-O-異亞丙基-5-O-醯基-α-D-赤-戊呋喃-3-酮糖作為起始原料，通過使該化合物與格氏試劑反應而在C3引入低級烷基而得到。然後，按兩條途徑進行在第一條途徑中，5-O-醯基-1，2-O-異亞丙基-3-低級烷基-D-核糖呋喃糖被進行酸性醇解，形成烷基5-O-醯基-3-低級烷基D-核糖呋喃糖苷；其又被醯化為烷基2，3，5-三-O-醯基-3-低級烷基-D-核糖呋喃糖苷；所得到核糖呋喃糖苷然後通過進行鹼性溶劑分解以及進一步在強酸溶液介質中水解，而被轉化為自由糖，或者通過在合適當溶劑中進行滷素取代反應而轉變為滷代糖。在第二條途徑中，5-O-醯基-1，2-O-異亞丙基-3-低級烷基-D-核糖呋喃糖在鹼性條件(吡啶)下的惰性溶劑中被醯化，形成3，5-二-O-醯基-1，2-O-異亞丙基-3-低級烷基-D-核糖呋喃糖，其再在強酸中被水解，進而醯化得到目標中間體。然後，通過使2，3，5-三-O-醯基-D-核糖呋喃糖滷化物和氯汞2，6-二取代嘌呤在100℃到140℃的甲苯或二甲苯等溶劑中反應，製備在糖部分的2位或3位具有支鏈的2-取代、6-取代或2，6-二取代的嘌呤核苷。通過與2，4-二烷氧基-嘧啶反應形成1-(2，3，5-三-O-醯基-2(或3)-C-低級烷基-D-核糖呋喃糖)-4-烷氧基-2(1H)-嘧啶酮，由2，3，5-三-O-醯基-2(或3)-C-低級烷基-D-核糖呋喃糖滷化物衍生得到了具有期望嘧啶酮鹼基的核苷，其再與氨或伯胺或仲胺反應得到在嘧啶酮的C-4有氨基取代的化合物，或者在酸性或鹼性條件下水解，得到在C-4具有羥基的嘧啶酮鹼。然而，Walton的合成包含多個步驟、特殊的條件以及多種有毒試劑。
如圖5所示，現有技術教導了在乙腈中使用BSA，使1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)和N4-苯甲醯胞嘧啶偶聯。反應混合物被加熱回流約30分鐘，然後加入路易斯酸SnCl4，溶液再次加熱並回流約3.5小時，得到4-NH-苯甲醯-2′，3′，5′-三-O-苯甲醯-β-D-2′-C-甲基-胞苷(5a)。通過用乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌並進行充分色譜純化而得到化合物(5a)。用氨預飽的甲醇溶液對(5a)進行過夜處理以除去苯甲醯保護基，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。
前藥藥學上的活性化合物有時以酯化的前藥形式給藥。其中以羧酸酯最為常用，而膦酸酯和磷酸酯由於不能夠在體內水解而可能產生有毒副產物，因而較少使用。(參見Erion等的美國專利U.S.6,312,662)。醯氧基烷基酯有時被用作膦酸酯和磷酸酯化合物，如環狀膦酸酯和芳香酯特別是苯基和卞基酯的前藥(Farquhar et al.，J.Pharm.Sci.，(1983)，72(3)324；Erion等的美國專利U.S.6,312,662)。如同核苷一樣，膦酸例如膦甲酸和PMEA(Adefovir；9-(2-膦醯甲氧基-乙基)腺嘌呤)與核苷的羧酸或醚脂質前藥一樣，均顯示出抗病毒活性(Gosselin等的美國專利U.S.6,458,773)。
長久以來，典型的前藥的合成和設計均包括核苷或核苷類似物的5′位。上述Gosselin等報導的核苷中，5′-OH的H被以下任何一種基團取代醯基，包括其中的酯基的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環狀的C1-C20烷基，苯基或卞基；天然和非天然的胺基酸；5′-醚脂質或5′-磷酸醚脂質；烷氧基烷基，包括甲氧基甲基；芳烷基，包括卞基；芳氧基烷基，如，苯氧基甲基；芳基，包括苯基，任選以滷素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代；二羧酸，如琥珀酸；磺酸酯，如，磺酸烷基酯或磺酸芳烷基酯，包括磺酸甲酯；或單-、二-或三磷酸酯。
Matulic-Adamic等(U.S.6,248,878)報導了核苷類似物的合成。該類似物包含呋喃核糖環，其上在3′位通過氧原子和取代的嘧啶鹼連有含磷基團。含磷基團包括dithioates或亞磷醯胺，或者可以是低聚核苷的部分。這些前藥化合物進一步反應而提供最終期望的核苷和核苷類似物。這些化合物通過多步合成，包括偶聯作為起始原料的在C-1具有羥基或乙酸基，在C-2-、C-3和C-5具有苯甲醯保護基的呋喃核糖和4-OSiMe3嘧啶，產生1-(2，3，5-三-O-苯甲醯-核糖-呋喃糖)-嘧啶-4-酮；然後，向第一反應的產物中加入含有氨的甲醇，以除去苯甲醯保護基；然後，DMT-Cl/Pyr與未保護的化合物反應，在呋喃核糖的5′-O位加成DMT；接著，用TBDMS-Cl、AgNO3和Pyr/THF與5′-O-DMT取代的呋喃核糖反應；最後進行標準的亞磷酸化(phosphitylation)，在3′-O產生含磷基團。各合成包括至少4～7步。
Chu等描述的前藥是疊氮化物衍生物和組合物，包括核苷以及磷酸化的核苷類似物(U.S.6,271,212)。這種疊氮化物前藥的優點是能夠通過血-腦屏障，提供更長的半衰期和更高的生物利用度，以及增加藥物活性形式的穩定性。然而，Chu等報導了為製備他們的疊氮化物前藥需要長期和多步的合成。
Borretzen等描述的抗病毒前藥是核苷及核苷類似物。他們報導了抗病毒核苷及核苷類似物的某些脂肪酸酯，其中某些一元不飽和C18或C20脂肪酸通過醯化過程而連接在核苷及核苷類似物的5′-位(U.S.6,153,594)。該過程在催化劑存在下進行24-60小時。經有機溶劑萃取完成產物分離，通過選擇適當溶劑進行色譜和/或重結晶進行純化。產物的百分產率在15-82％之間變化。但是，Borretzen等沒有使用術語「前藥」。
1999年，McCormick等描述了使用未保護的核糖作為起始原料，在鳥苷的3′-OH形成碳酸酯。(McCormick et al.，J Am.Chem.Soc.1999，121(24)5661-5)。McCormick通過連續、逐步地引入O-和N-配醣聯接、利用某些保護基、磺化以及最後脫保護，完成了合成。作為他們的方法中的步驟之一，McCormick等使未保護的鳥苷與BOC-酐、DMAP、Et3N和DMSO在室溫下反應4小時，直接獲得鳥苷的3′-OH的碳酸酯。
同樣在1999年，Tang等公開了製備′-C-β-甲基-胞苷核糖核苷的亞磷醯胺前藥的方法。(Tang et al.，J.Org.Chem.，1999，64747-754)。與他們的許多同行一樣，Tang等將1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D呋喃核糖與經全矽烷化去活的4-N-苯甲醯胞嘧啶在路易斯酸和SnCl4的存在下反應，以其作為合成中的第一個步驟。(Id.at 748，SchemeIa)。
2000年，Novirio Pharmaceuticals(現在為Idenix)發現了通過施用抗病毒核苷的胺基酸酯形式，抗病毒核苷的穩定性及生物利用度得以提高(U.S.序列號No.09/864,078，審查中；U.S.序列號No.10/261,327，審查中；WO01/90121；及U.S.臨時申請60/377,983和60/392,351)。製備這些核苷和核苷類似物的胺基酸酯的方法首先是以適當的可被適當的保護基如甲矽烷基選擇性保護的支鏈β-D或β-L核苷開始，然後，採用公知的方法進行脫保護(Zhang et al.，Tetrahedron Letters，1992，331177-80；Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John WileySons，2ndEdition(1991)；Kerr et al.，J.Pharmaceutical Sciences，1994，83582-6；Tang et al.，J.Org.Chem.，1999，64(3)747-754；及Cavelier et al.，TetrahedronLetters，1996，375131-4)。然後，被選擇性保護的支鏈核苷與合適的醯基供體，如醯氯和/或醯酐或活性酸偶聯，偶聯在合適的質子溶劑或非質子溶劑中在合適的反應溫度下進行，得到1′，2′，3′或4′支鏈β-D或β-L核苷的2′或3′前藥，任選在適當的偶聯劑存在下進行(參見Synthetic Communications，1978，8(5)327-33；J.Am.Chem.Soc.，1999，121(24)5661-5；Bryant et al.，Antimicrob.Agents Chemother.，2001，45，229-235；Standring et al.，Antiviral Chem.Chemother.，2001，12(Suppl.1)，119-129；Benzaria et al.，Antiviral Res.，2001，50，A79；Pierra et al.，Antiviral Res.，2001，50，A79；以及Cretton-Scott et al.，Antiviral Res.，2001，50，A44)。可用的偶聯試劑是那些能夠將化合物和其中一部分連接到其他部分之上的物質，包括但不限於各種碳二醯亞胺，CDI，BOP和羰基二醯亞胺。例如，對於2′-支鏈核苷的3′-前藥，核苷優選被保護，但是通過碳二醯亞胺偶聯劑，直接偶聯到烷醇酸或胺基酸殘基上。
圖5中所示的現有技術的方法包括按以下順序反應來製備胞苷的3′-纈氨酸酯核苷前藥將1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)加入到乙腈中的BSA和N4-苯甲醯胞嘧啶的混合物中，加熱至回流約30分鐘，然後，向溶液中加入路易斯酸SnCl4，溶液再次加熱至回流約3.5小時，產生4-NH-苯甲醯-2′，3′，5′-三-O-苯甲醯-β-D-2′-C-甲基-胞苷(5a)。化合物(5a)通過用乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌並進行充分色譜純化而得到。用氨預飽和的甲醇溶液對(5a)進行過夜處理以除去苯甲醯保護基，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。化合物(6)的DMF溶液與N，N-二甲基甲醯胺二甲基縮醛在室溫下反應約1.5小時，得到在C4有保護的氨基的胞苷N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-β-D-2′-C-甲基-胞苷(7)；然後，胺基酸-保護的胞苷(7)的幹吡啶溶液與咪唑和TBDPSCl在室溫下反應約6小時，得到5′-O甲矽烷基保護的胞苷(8)；然後，在DEC、DMAP以及THF/DMF的存在下，將N-Boc-L-纈氨酸在室溫下加入到4-和5′-保護的β-D-2′-C-甲基胞苷(8)，約兩天後，得到4-和5′-保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷3′-O-L-N-BOC-纈氨酸酯(9)；在4-和5′-保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-O-L-N-BOC-纈氨酸酯(9)的幹甲醇溶液中加入氟化胺，然後混合物回流以除去5′-甲矽烷基和4-氨基保護基，生成β-D-2′-C-甲基胞苷的3′-O-L-N-(叔-丁氧基羰基)纈氨酸酯(10)，其通過色譜柱提純；最後，向β-D-2′-C-甲基胞苷的3′-O-L-N-(叔-丁氧基羰基)纈氨酸酯(10)的幹乙酸乙酯溶液中，加入20％的HCl/乙酸乙酯溶液，將混合物攪拌約2小時，除去BOC-保護基，生成最終產物β-D-2′-C-甲基胞苷的′-O-纈氨酸酯的鹽酸鹽(11)。圖6中表示的現有技術的合成使用了尿嘧啶代替苯甲醯胞嘧啶來製備化合物(11)β-D-2′-C-甲基胞苷。
綜上所述，若能夠有一種有效的方法製備核苷或核苷類似物將會是有利的。這樣的核苷或核苷類似物例如是2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-纈氨酸-核苷，它們的中間體，包括2-C-甲基-核糖酸內酯和2-C-甲基-D-呋喃核糖，以及它們的鹽和/或前藥。
本發明的另一目的是提供在核苷的3′-OH選擇性加成的方法，以衍生出前藥化合物。
本發明的再一目的是提供一種有效的製備保護的糖類似化合物的方法，該方法包含最少數目的步驟，並使用廉價的起始原料。
本發明的又一目的是與合成類似產物相比，大幅減少製備保護的糖中間體的時間。
另外，本發明的目的之一是提供一種方法，其在數小時內即能完成，並且以高產率和高純度提供最終產物。
本發明的另一目的是提供一種方法，該方法採用了易於使用的無毒的試劑，且其最終產品易於通過常規技術被分離，且容易擴大規模。
本發明的又一目的是以超過至少90或95％的高產率和高純度獲得最終產物。
本發明的再一目的是使用無毒、易於操作的試劑。

發明內容
本發明公開了一種新的改改進的用於製備核苷及核苷類似物，如β-D和β-L2′-C-甲基-核苷及2′-C-甲基-3′-O-酯核苷以及它們的鹽和/或前藥的方法，該方法通過在更短的時間內使用一種或多種用量更少的試劑，通過更為簡單的純化步驟，得到比現有技術更高的產率。此外，本發明的方法在滿足工業生產的要求上非常有利。
本發明的具體實施方式
中，特別包括含有以下步驟的方法(a)將D-果糖與CaO反應，獲得2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯；和/或(b)使任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯與合適的還原劑如Red-Al，任選在溶劑如乙醇中反應，獲得任選保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖；和/或(c)將任選保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖與未保護的鹼基進行偶聯，偶聯如是與胞嘧啶在活化劑如甲矽烷化試劑(例如BSA)存在下，任選在路易斯酸如SnCl4存在下進行的，得到任選保護的2′-C-甲基-核苷，例如，2′-C-甲基-胞苷；和/或(d)在優化的試劑、反應條件(溶劑、反應時間等)和提取/純化技術下，得到2′-C-甲基-核苷，例如2′-C-甲基-胞苷的3′-酯。在本發明的一個具體的實施方式中，反應過程示於圖1和4中。
還提供一種有效的可擴大規模的、以高產率製備核苷前藥的方法，這種核苷在核苷的3′-位有可裂開的部分。
進一步提供節約成本的採用無毒試劑來製備核苷、核苷類似物、其鹽及前藥的方法。比較示於圖4的本發明的方法和示於圖5的現有技術的方法，可以看出，在改進的方法中經濟效益有所增加。比較示於圖4中的本發明的方法，以及示於圖5中的現有技術的方法，可以證明在改進的方法中提高了過程的經濟性。
另外，再提供一種有效的、可擴大規模的製備2-C-甲基糖中間體，如獨立的2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內酯)和獨立的1，2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖的合成方法。比起現有技術的方法而言，該方法採用了一種或多種便宜的試劑，所需時間更短，純化方法更為簡便，產率更高。
本發明與眾不同的一方面在於使用了特定組合的試劑，從而省去了合成步驟中的分離、離析和/或純化。特定試劑的選擇使得絕大多數的起始原料被轉化為產物，並降低了外消旋化作用，能夠容易地從最終產物中除去，從而提供了比以往的方法更為有效的合成方法。總的結果是得到最終前藥產品的時間縮短，並且期望產品的百分產率提高。
此外，需要更少的時間以及更少的試劑提高了整體成本效率和工業上可擴大規模和安全的方法。
在一個實施方式中，本發明的方法是一種核苷的製備，其在2′-C上發生雙取代，如2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-纈氨酸-核苷，其中間體，例如2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內酯)以及1，2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖，和其鹽和/或前藥。在一個優選的實施方式中，本發明被用於製備2，3，5-(獨立任選保護的)或未保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯。在另一優選的實施方式中，本發明被用於製備1，2，3，5-(獨立任選保護的)或未保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖。在又一優選的實施方式中，本發明被用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在另一優選的實施方式中，本發明被用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-胺基酸酯(包括但不限於纈氨醯酯)或其優選的鹽酸鹽形式。由本發明製備的核苷、核苷類似物、鹽或酯前藥可用作製備各種其他核苷類似物的中間體，或者直接用作抗病毒和/或抗腫瘤試劑。
在一個實施方式中，本發明的改進的方法包括使胞嘧啶與活化劑，如BSA，任選在路易斯酸如SnCl4存在下，以及1，2，3，5-(獨立任選保護的)或未保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖反應，生成4-氨基-1-(3，4-(獨立任選保護的-羥基)-5-O-保護-羥基亞甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(見圖4) 其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基；然後，如果需要，則選擇性地將前步反應中的4-氨基-1-(3，4-(獨立任選保護的-羥基)-5-(任選O-保護-羥基亞甲基)-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮脫去保護，形成4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(6)。
例如，如果中間體(V)的P1、P2和P3是苯甲醯基，則該化合物可以與NaOMe/MeOH反應，得到4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)，其也被稱為β-D-2′-C-甲基-胞苷，可任選從乙醇等中重結晶，獲得β-D-2′-C-甲基-胞苷的純化形式。該化合物可根據需要用作抗病毒製劑，或者進一步進行衍生成為前藥。
然後，中間體(VI)可選擇地被任選保護，如在3′-位被酯化，使用已知的方法進行任選脫保護，獲得β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯前藥，例如，β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，或者其優選的鹽酸鹽形式。
作為本發明的一個非限制性的實例，如果3′-纈氨酸酯是優選的，則酯化反應可包括圖4中所表示出的步驟，即，使β-D-2′-C-甲基-胞苷與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應，形成(7)，N[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲醯胺，其是(VI)的氨基-保護的形式；使(7)與TBDPSCl和咪唑在DCM中反應，生成(7)的5′-甲矽烷基-保護的形式，N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲醯胺(8)；使(8)與N-Boc-L-纈氨酸、EDC、和DMAP在DCM中反應，形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(9)；使(9)與NH4F在MeOH中反應，並加入乙酸乙酯(為防止析出的氨切斷3′-O-纈氨酸酯)，以除去甲矽烷基和氨基保護基，並回流混合物，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(10)，其通過簡單的結晶而純化；最後，使(10)與HCl在EtOH中反應，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽(11)作為最終產品。
使用胞嘧啶代替現有技術中使用的苯甲醯胞嘧啶或其他保護的胞嘧啶，改善了經濟性並簡化了純化過程。
本發明的方法與類似的現有技術相比的優勢在於，其使用的試劑可減少到約50％。即便是使用更少的試劑，與最接近的現有技術相比較，本發明的方法的總產率卻得到提高，比如在一例中，產率由12％提高到38％。進一步的優勢體現在減短了完成前藥合成的周期。與現有技術的合成相比較，本發明的改善的方法將周期簡短了約80％。這主要是出於以下四個原因i)隨著負荷的增加，減少了所需反應的批次；ii)百分產率的提高；iii)使用易於處理的溶劑和試劑；以及iv)避免了耗費工時的色譜純化步驟。
本發明與眾不同的一個方面在於使用了特定組合的試劑，從而省去了合成步驟中的分離、離析和/或純化。特定試劑的選擇使得絕大多數的起始原料被轉化為產物，並降低了外消旋化作用，能夠容易地從最終產物中除去，從而提供了比以往的方法更為有效的合成方法。總的結果是得到最終前藥產品的時間縮短，並且期望產品的百分產率提高。此外，需要更少的時間以及更少的試劑提高了整體成本效率和工業上可升級的和安全的方法。
在本發明的另一實施方式中，通過使2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-D-核糖酸內酯與還原劑如二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑如乙醇中反應，得到了1，2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基；然後，如果需要，則選擇性地保護(例如苯甲醯化)前步反應中的呋喃核糖衍生化合物，形成1，2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基。
使用Red-Al作為本發明的還原劑，出乎意料地提供了具有特定立體化學的產物，這就實現了有效分離。從而簡化了最終期望產品的分離。
在本發明的又一實施方式中，2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-D-核糖酸內酯通過使D-果糖與CaO反應得到；
然後，如需要，則任選保護內酯，例如，用苯甲醯氯(或其他合適當醯氯)，形成2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-D-核糖酸內酯； 其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基。
另外，為了分離純的單一的端基異構產物(例如，實質純的形式指的是至少95％)，可根據需要增加純化步驟。
本發明的方法採用了廉價的D-果糖作為起始原料，因此為生產者節省了大量的成本。這一點對於需要和預計擴大工業應用時尤其重要。
除了使用D-果糖作為起始原料帶來的重大的經濟效益外，本發明與眾不同的一方面還在於使用氧化鈣(CaO)作為方法的第一步中的試劑。CaO被加入到D-果糖的水溶液中，製備2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯。這一步本身很快就完成，比起現有技術中的類似步驟提高了產率30-40％。此外，CaO無毒，易於使用，並與果糖和水混合良好。
可利用沉澱劑來從溶液中除去鈣。在一個實施方式中，向反應混合物中加入CO2和比核糖酸強的酸，在一個優選的實施方式中，加入的是有機酸，形成碳酸鈣。適合的有機酸包括但不限於草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、馬來酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸。
此外，圖1和圖4結合起來的總過程的優勢在於，與現有技術方法相比，其使用的試劑可減少到約50％。即便是使用更少的試劑，與最接近的現有技術相比較，本發明的方法的總產率卻得到提高，比如在一例中，產率由12％提高到38％。進一步的優勢體現在縮短了完成前藥合成的周期。與現有技術的合成相比較，本發明的改善的方法將周期簡短了約80％。這主要是出於以下四個原因i)隨著負荷的增加，減少了所需反應的批次；ii)百分產率的提高；iii)使用易於處理的溶劑和試劑；以及iv)避免了耗費工時的色譜純化步驟。
因此，在本發明的一個實施方式中，提供了由D-果糖製備2′-C-甲基-D-胞苷的方法，其包括以下步驟(a)使D-果糖CaO反應，得到2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯； (b)如需要，則任選保護內酯，例如，用苯甲醯氯(或其他合適當醯氯)，形成2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-D-核糖酸內酯； 其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基；(c)使2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-D-核糖酸內酯與還原劑如二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑如乙醇中反應；
其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基；(d)如果需要，則選擇性地保護(例如苯甲醯化)前步反應中的呋喃核糖衍生化合物，形成1，2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基，(e)使1，2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶和活化劑，如BSA，任選在路易斯酸如SnCl4存在下反應，生成4-氨基-1-(3，4-(獨立任選保護的-羥基)-5-O-保護-羥基-亞甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮 其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或適當的氧保護基，例如，醯基，優選為苯甲醯基；然後，(f)如果需要，則選擇性地將前步反應中的4-氨基-1-(3，4-(獨立任選保護的-羥基)-5-O-保護-羥基亞甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮脫去保護，形成4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)，
(g)如果需要，任選保護/脫保護，然後對4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)的3′-位用L-纈氨酸等進行酯化，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，任選以鹽的形式存在。


圖1是製備1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖和2，3，5-三-O-保護-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯的優選方法的示意圖。
圖2是製備2-C-甲基-β-D-核糖酸內酯的選擇性方法的示意圖。
圖3是製備1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的供選方法的示意圖。
圖4是本發明的優選的製備核苷、核苷類似物或其鹽或前藥的方法的示意圖。
圖5是製備β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-O-纈氨酸酯的藥學上可接受到的鹽的供選方法。
圖6示出了現有技術中已知道製備β-D-2′-C-甲基-胞苷的供選路徑。
具體實施例方式
提供了一種製備核苷和核苷類似物，如2′-C-甲基-核苷和2′-C-甲基-3′-O-纈氨酸核苷以及它們的鹽和/或前藥的方法，產物包括了所有的立體化學和互變異構的形式。與現有技術相比，該方法使用更少的試劑，在更短時間內獲得了更高的產率。並且，省去了耗時耗力的色譜純化步驟，並將不期望的外消旋化抑制到可接受到水平。該改良的方法包括形成期望的核苷作為前藥合成中的中間體，並且有望擴大規模為符合工業生產的要求。
另外，還提供了一種有效的可擴大規模製備2-C-甲基糖中間體，如2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內酯)和1，2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖的合成方法。比起現有技術的方法而言，該方法採用了便宜的試劑，所需時間更短，純化方法更為簡便，產率更高。
在一實施方式中，本發明的方法是一種核苷的製備，其在2′-C上發生雙取代，如2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-纈氨酸-核苷，其中間體，例如2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內酯)以及1，2，3，5-(獨立任選保護的)和未保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖，和其鹽和/或前藥。在一個優選的實施方式中，本發明被用於製備2，3，5-(獨立任選保護的)或未保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯。在另一優選的實施方式中，本發明被用於製備1，2，3，5-(獨立任選保護的)或未保護的2-C-甲基-D-呋喃核糖。在又一優選的實施方式中，本發明被用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在另一優選的實施方式中，本發明被用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯或其優選的鹽酸鹽形式。由本發明製備的核苷、核苷類似物、鹽或酯前藥可用作製備各種其他核苷類似物的中間體，或者直接用作抗病毒和/或抗腫瘤試劑。
在第一實施方式中，本發明的方法使用D-果糖作為起始原料，以簡短的合成路徑製得了1，2，3，5-(獨立任選保護的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
在第二實施方式中，本發明的方法是一種核苷、核苷類似物以及其鹽或前藥的製備，它們在2′-C上發生雙取代。
在第三實施方式中，本發明的方法被用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。
在第四實施方式中，本發明的方法被用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，或其優選的鹽酸鹽形式。
由本發明製備的核苷、核苷類似物、鹽或酯前藥可用作製備各種其他核苷類似物的中間體，或者直接用作抗病毒和/或抗腫瘤試劑。
本發明的方法與類似的現有技術相比的優勢在於，其使用的試劑比現有技術的少50％。即便是這樣，與最接近的現有技術相比較，本發明的方法的總產率卻由12％提高到38％。進一步的優勢體現在縮短了完成前藥合成的周期。再一優勢在於該新方法的安全性和易升級性，有望成為符合工業生產的要求的方法。
本發明與眾不同的一個方面在於使用了特定組合的試劑，從而省去了合成步驟中中間體的分離、離析和/或純化。特定試劑的選擇使得絕大多數的起始原料被轉化為產物，並降低了胺基酸前藥部分的外消旋化作用，從而能夠容易地從最終產物中除去，從而提供了比以往的方法更為有效的合成方法。總的結果是得到最終前藥產品的時間縮短，並且期望產品的百分產率提高。此外，由於需要更少的時間以及更少的試劑，總的來說，從節約成本考慮是有利的。成本效率和工業上可升級的和安全的方法。
本發明改進方法的優勢體現在圖1中，使用D-果糖作為廉價的起始原料，以及使用CaO，其減少了反應時間並增加了內酯生產的百分產率；採用Red-Al/乙醇進行還原，提供了端基異構產物化合物的區域選擇混合物，能夠採用已知的方法容易地從該混合物中將最終產物1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖分離出；圖4中，採用胞嘧啶作為起始原料，而不是採用現有技術中的苯甲醯-胞嘧啶(圖5)或尿嘧啶(圖6)作為起始原料，這樣由於應用了更為簡單及分子量更低的較廉價的化合物，提高了過程的「原子效益(atom economy)」；與現有方法中類似步驟相比，本發明中需要更少當量的胞嘧啶、SnCl4和BSA；由於反應物和試劑均少於以往的當量，帶給反應雙重的好處，即，反應用3到4小時即完成，且圖4中的中間體(2)的純度如此之高，而無需進一步的色譜分離和純化步驟。
圖1是本發明的一個實施方式的示意圖。在該改進的方法中，由D-果糖形成核糖酸內酯(化合物1)的時間大約為40小時或少於兩天，產品產率約為13.6％，其比最接近的現有技術的高30-40％。相比之，Kiliani和Scheibler的核糖酸內酯合成各需要兩個月或更長時間完成，且產品產率大約為10％(Lopez-Herrera et al.，J Carbohydrate Chemistry 1994，13(5)767-775 at 768)。
出乎意料的是，氧化鈣(CaO)和水能夠與廉價的起始原料D-果糖反應，製備1，2，3，5-四-O-保護-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖，產率為比以前獲得到高30-40％。該方法能夠大量製備具有被保護的羥基的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖，其是在合成生物活性核苷以及某些維他命化合物中的重要的中間體。由此發現帶來的又一好處是節約產品的製備成本，這在大規模工業化合成中是特別重要的。例如，1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖通常是由D-核糖，通過使用D-樹膠醛醣作為起始原料製備的。從D-樹膠醛醣的合成需要至少5步和色譜純化。並且，每公斤D-樹膠醛醣的成本是D-果糖的約250倍！通過使用本發明的改進的方法，只需要4步和廉價的試劑就可以製備出在1、2、3和5位有保護基的2-C-甲基-核糖。因此，無需進行色譜純化即可以較低的成本有效地製得期望的產品。
同樣令人吃驚的是，當使用CaO作為起始試劑時，顯著減少了形成2-C-甲基-β-D-核糖酸內酯所需的時間。與Kiliani和Scheibler早期的使用Ca(OH)2作為反應試劑的工作相比，這就顯著減少了合成所需的總的時間。
另外還發現，當用Red-Al(任選其乙醇溶液)作為還原劑，產生的2，3，5-三-O-苯甲醯-1-羥基-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖被醯化時，產生大量的單一端基異構產物，更容易實現有效分離。這就簡化了對期望的最終產物的分離。
本發明的優勢體現在如下方面選擇D-果糖作為廉價的起始原料對於製備最終的保護的糖類似物而言在經濟上具有優勢；使用CaO提高了產物產率、降低了內酯產生的反應時間；用Red-Al還原提供了端基異構產物的區域選擇混合物，最終產物能夠容易地從其中通過通用方法得以分離。其他方面的優勢包括，除使用廉價的起始試劑外，還使用了廉價的反應試劑、在整個過程中處理中間體所需的步驟最少、只需使用本領域公知的通常的方法和設備，而避免了複雜的步驟和昂貴的裝置。
圖4是本發明的另一個實施方式的示意圖。該改進方法的優勢體現在如下方面。採用胞嘧啶作為起始原料，而不是採用現有技術中的苯甲醯-胞嘧啶(圖5)或尿嘧啶(圖6)作為起始原料，這樣由於應用了更為簡單及分子量更低的較廉價的化合物，提高了過程的「原子效益」。此外，與現有方法中類似步驟相比，本發明中需要更少當量的胞嘧啶、SnCl4和BSA；由於反應物和試劑均少於以往的當量，帶給反應雙重的好處，即，反應用3到4小時即完成，且圖4中的中間體(2)的純度如此之高，而無需進一步的色譜分離和純化步驟。
令人吃驚的發現是，在本發明的脫保護步驟中(圖4，(5)→(6)，脫去苯甲醯保護基)，使用溶於MeOH的NaOMe帶來了比現有方法中使用氨(圖5，(5a)→(6))更為經濟、安全、易用於工業升級的合成。另外的好處是出自更短的反應時間使用甲醇鈉完成反應需要約1小時，而同樣的反應，使用氨則需要1-2天。此外，在本發明中，通過簡單的甲醇或乙醇(優選乙醇)處理，得到了高純度的(6)，從而免去了在現有方法中甚為關鍵但耗時耗力的色譜純化步驟(見圖5，(5a)→(6))。
除了更為簡單、成本更低、使用的反應物和試劑的安全性更高外，本發明方法的頭兩步的總的產品產率為85％，而圖5所示的現有方法中的為24％。在產生(7)的敏感的甲脒-保護步驟(圖4，(6)→(7))中，即使反應負荷(reaction loading)從現有技術的5％增加到本發明的13％，產物產率仍維持在約80+％左右。
在現有技術基礎上的一個簡單的改進對接下來的兩步，甲矽烷-保護和BOC-酯偶聯，產生了正面的影響，生成了如(8)和(9)。首先，在現有技術中作為反應溶劑的較貴且難除去的吡啶(圖5，(7)→(8))被二氯甲烷代替(圖4，(7)→(8))。在二氯甲烷中的甲矽烷化產生了更少的不期望的3′，5′-二甲矽烷基衍生物，因而能夠更好地控制甲矽烷基副產物地形成，且從(7)轉化為(8)的轉化率超過99％。並且由於二氯甲烷也被用作與BOC-Val-OH偶聯的溶劑，因此無需在(8)與BOC-Val-OH偶聯獲得(9)之前進行分離。在(8)與BOC-Val-OH偶聯獲得(9)之前，只需要簡單的萃取進行收集即可(比較圖4，(8)→(9)與現有技術圖5中的相同步驟)。
進而，現有技術方法採用了N，N-二甲基甲醯胺和乙腈作為BOC-Val-OH偶聯溶劑(圖5，(8)→(9a))。這些試劑均很貴，使得反應的負荷率較低，僅約3％，並且，特別是N，N-二甲基甲醯胺沸點高，難從反應混合物中除去。此外，大致需要兩天和過量的BOC-Val-OH、EDC和二甲基氨基吡啶(DMAP)來完成反應。一方面需要這些過量的試劑來完成反應，但另一方面它們的存在又使得後面的產物純化變得複雜。此外，使用過量的DMAP誘發了L-纈氨酸衍生物的胺基酸部分的外消旋化。
與現有技術的方法不同的是，在本發明中使用二氯甲烷作為偶聯反應的溶劑(圖4，(8)→(9)使得負荷率約為11％，而僅用了現有技術中約一半量的試劑，且反應在約4-6小時即完成。反應時間上的減少和用於本發明的控制用量的DMAP將L-纈氨酸衍生物的胺基酸部分的外消旋化降低至少於0.2％，而這在現有技術中約為6％。像0.2％這樣如此低的外消旋水平進一步處於藥學上可接受的範圍，因為這意味著一種對映體相對於另一對映體而言，具有更強的活性。
隨後的對酯化的β-D-2′-C-甲基-胞苷的脫保護可使用溶於甲醇的氟化胺(NH4F)。溶於甲醇的氟化胺(NH4F)是在由(9)反應得到(10)中，用於化合物脫保護(即除去甲矽烷基和二甲基甲醯胺基)而選擇的試劑(圖4)。現有技術的方法(圖5，(9a)→(10))採用了相同的試劑，但用了10當量的氟化胺，約3％的負荷率，需要色譜分離獲得(10)，相比而言，本發明使用4當量的氟化胺，約10％的負荷率，不需要色譜分離。在改進的方法的此步中，使用更少的氟化胺及大約10摩爾當量的乙酸乙酯所帶來的好處是，BOC-酯(10)水解為β-D-2′-C-甲基-胞嘧啶，也確定為4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃2-基)-lH-嘧啶-2-酮(6)被降低到最小。因此，本發明的方法在其有效的試劑使用和提高負荷率上具有優勢。
另外，(10)通過簡單的EtOAc/TBME/H2O處理而純化，再次免去了色譜分離和純化，從而再次避免了耗時耗力的色譜純化步驟。在甲矽烷化、偶聯及脫保護這3步後的純的(10)的百分產率大約為60％-99％。
在改進方法的最後一步，(圖4，(10)→(11))，用乙醇作為溶劑進行從β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯衍生物脫除BOC-保護基，負荷率從現有技術的2％增加到本方法的12％。在改進的方法中使用乙醇代替現有技術中的乙酸乙酯作為溶劑(圖5，(10)→(11))，這一改變使得負荷增加。選擇乙醇作為溶劑增加負荷率，進而使反應產率從現有技術的約80％提高到本發明的約95％，並避免了由乙酸乙酯產生的乙酸帶來的汙染。獲得的最終產物(11)的＞98％的純的形式，且L-纈氨酸外消旋化被抑制到少於0.2％。
因此，本發明從整體上改進的β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯)的原型化合物′-O-纈氨酸酯或其二鹽酸鹽的合成，使得總百分產率提高了約26％，周期降低了約80％。周期的減短主要歸功於耗時耗力且耗費大的色譜分離和純化步驟地避免。其他的因素包括負荷的增加，從而只需要進行更少的批次，以及使用易於處理的溶劑和試劑。使用更安全更便宜的溶劑和試劑給本發明帶來了額外的好處。然而，如果產品的百分產率低於現有技術方法提供的產率，則這些好處可被忽視。本發明的方法提供了大約26％的產率的增加，因此非常有用。
定義和可選試劑在此使用的術語″基本上無端基異構體″或″基本上沒有端基異構體存在″是指包括至少95％～98％(重量)，更優選為99％～100％(重量)的核苷的指定的端基異構體的核苷組合物。在一個優選的實施方式中，本發明的方法和化合物中基本上無端基異構體。
類似的，術語「被分離的」指的是包括至少85％或90％(重量)，優選95％～98％(重量)，更優選99％～100％(重量)核苷的核苷組合物，剩餘部分含有其他化學物質或端基異構體。
術語″核糖酸-γ-內酯″和″核糖酸內酯″在本文中可互換使用，是指圖1中的化合物1或其氧保護的衍生物。
此處使用的術語「保護的」除非特別指明，是指加到氧、氮或磷原子上的基團，以防止這些基團進一步反應或出於其他目的。大量已知的各種氧、氮或磷的保護基在有機合成中被人們所熟知。
適當的保護基的例子包括但不限於苯甲醯基；取代或未取代的烷基、取代或未取代的醯基、取代或未取代的甲矽烷基；取代或未取代的芳族或脂肪族酯、例如，芳基如苯甲醯基、甲苯醯基(例如對甲苯醯基)、硝基苯甲醯基、氯苯甲醯基；醚基如-C-O-芳烷基、-C-O-烷基、或-C-O-芳基；脂肪族基如醯基或乙醯基、包括任何取代或未取代的芳香族或脂肪族醯基、-(C＝O)-芳烷基、-(C＝O)-烷基、或-(C＝O)-芳基；其中，醯基的芳香部分或脂肪部分可以為直鏈或支鏈；所有的均可以進一步被不受含有改進的合成的反應影響的基團所取代(見Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，2ndEdition(1991))。例如，在本發明的一個實施方式中，保護基被不受選用的還原劑(優選Red-Al)影響的基團取代。對於使用醚作為保護基而言，引用Saischek等的U.S.6,229,008作為參考，其中報導了使用醚作為保護基對試劑的穩定和過程的條件帶來明顯的好處，特別是在戊呋喃糖苷的5′位。這就最終為分離、離析及純化最終產物提供了便利，因此，提高了產物的百分產率。
糖羥基保護基的非限制性例子包括，甲矽烷基、苯甲醯基、對甲苯醯基、對硝基苯甲醯基、對氯苯甲醯基、醯基、乙醯基、-(C＝O)-烷基、和-(C＝O)-芳基，這些取代基都可以是未取代的或被一個或多個不受所選還原劑影響的基團所取代。在一個實施方式中，糖羥基保護基是苯甲醯基。氨基保護基優選為BOC(丁氧羰基)，-(C＝O)-芳烷基，-(C＝O)-烷基或-(C＝O)-芳基。在本發明的一個實施方式中，胺基酸保護基是BOC(丁氧羰基)。
在本申請中，術語″取代的″指由一個或多個指定的取代基進行的單一或多重取代。在公開或要求保護單一取代時，化合物可被取代基取代一次或多於一次。在公開或要求保護多重取代時，被取代的化合物可獨立地被一個或多個公開的或要求保護的取代部分單次或多次取代。
這裡使用的術語″烷基″除非特別指明，是指典型的C1到C10的飽和的直鏈、支鏈或環狀的、一級、二級或三級烴，具體包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、環戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、環己基、環己基甲基、甲基戊基和二甲基丁基。該術語包括取代和未取代的烷基。可在一個或多個位置取代烷基的部分選自由滷素(包括氟、氯、溴或碘)、羥基(例如CH2OH)、氨基(例如，CH2NH2、CH2NHCH3或CH2N(CH3)2)、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、疊氮基(如CH2N3)、氰基(CH2CN)、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根)組成的組，如果需要，上述組中的任何一個或者所有的可以是未保護的或可根據現有技術教導而進一步被保護，例如，在Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，2ndEdition(1991)中所教導的那樣。
術語″烷基氨基″和″芳基氨基″分別包括具有一個或多個烷基或芳基取代基的氨基。
術語″烷芳基″和″烷基芳基″包括具有芳基取代基的烷基。術語″芳烷基″和″芳基烷基″包括具有烷基取代基的芳基。
術語「滷素」包括氯、溴、碘和氟。
這裡使用的術語″芳基″，除非特別指明，是指苯基、聯苯基或萘基。該術語包括取代或未取代的部分。
芳基可被一個或多個部分取代，其包括但不限於羥基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根，如果需要，上述任何一個或者所有的可以是未保護的或可根據現有技術教導而進一步被保護，例如，在Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，2ndEdition(1991)中所教導的那樣。
術語″醯基″包括-C(＝O)-R，其中的非羰基部分R是直鏈的、支鏈的或環狀烷基或低級烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括卞基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基，包括任選被滷素取代的苯基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基、磺酸根，如磺酸烷基根或磺酸芳烷基根，包括甲基磺醯基、單-、二-或三-磷酸根、三苯甲遊基或單甲氧基三苯甲遊基、取代的卞基、三烷基甲矽烷基，如二甲基-叔丁基甲矽烷基)、或二苯基甲基甲矽烷基。酯中的芳基最好包含苯基。術語″低級醯基″指其非羰基部分是低級烷基的醯基。
術語″羧酸″和″羧酸酯″分別包括結構RC(＝O)OH和RC(＝O)O-R′。這裡的非羰基部分，無論是R或R′，例如可以是直鏈的、支鏈的或環狀烷基或低級烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括卞基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基，包括任選被滷素取代的苯基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基。磺酸根，如磺酸烷基根或磺酸芳烷基根，包括甲基磺醯基、單-、二-或三-磷酸根、三苯甲遊基或單甲氧基三苯甲遊基、取代的卞基、三烷基甲矽烷基，如二甲基-叔丁基甲矽烷基)、或二苯基甲基甲矽烷基。酯中的芳基最好包含苯基。在所有的情況下，R和R′可以是相同或不同的取代基。
術語胺基酸包括天然的和合成的α、β、γ和δ胺基酸，包括但不限於蛋白質中的胺基酸、如甘氨酸、丙胺酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺酸、谷醯胺、天門冬胺酸酯、穀氨酸酯、賴氨酸、精氨酸和組氨酸。在優選的實施方式中，胺基酸是L-構型。在另一優選實施方式中，胺基酸是L-纈氨酸。另外，胺基酸也可以是丙氨醯、纈氨醯、亮氨醯、異亮氨醯、脯氨醯、苯基丙氨醯、色氨醯、蛋氨醯、甘氨醯、絲氨醯、蘇氨醯、半胱氨醯、酪氨醯、天冬醯胺醯、穀氨醯、aspartoyl醯、glutaroyl醯、賴氨醯、精氨醯、組氨醯、β-丙胺醯、β-纈氨醯、β-亮氨醯、β-異亮氨醯、β-脯氨醯、β-苯基丙氨醯、β-色氨醯、β-蛋氨醯、β-甘氨醯、β-絲氨醯、β-蘇氨醯、β-半胱氨醯、β-酪氨醯、β-天冬醯胺醯、β-穀氨醯、β-aspartoyl醯、β-glutaroyl醯、β-賴氨醯、β-精氨醯、β-組氨醯的衍生物。
術語「非天然胺基酸」指具有氨基端基但不存在於天然的羧酸。該術語還包括D-和L-胺基酸，以及它們的任何一種互變異構或立體異構形式。
術語核苷鹼基，包括嘌呤或嘧啶鹼基。嘌呤或嘧啶鹼基的例子包括但不限於腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-醯基嘌呤(其中，醯基是C(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基)、N6-卞基嘌呤、N6-滷代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔基嘌呤、N6-醯基嘌呤、N6-羥基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮嘧啶，包括6-氮胞嘧啶、2-和/或4-巰基嘧啶、尿嘧啶、5-滷代尿嘧啶，包括5-氟尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-卞基嘧啶、C5-滷代嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-乙炔基嘧啶、C5-醯基嘧啶、C5-羥基烷基嘌呤、C5-氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮胞苷基、5-氮尿嘧啶基、疊氮基吡啶基、咪唑吡啶基、吡咯嘧啶基和吡唑-嘧啶基。嘌呤鹼基包括但不限於鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和6-氯嘌呤。鹼基上的功能性氧和氮基團如果需要可被保護。適當的保護基對於本領域技術人員是已知的，包括三甲基甲矽烷基、二甲基己基甲矽烷基、叔丁基二甲基甲矽烷基和叔丁基二苯基甲矽烷基、三苯甲遊基、烷基和醯基，如乙醯基和丙醯基，甲基磺醯基和對甲苯磺酸。另外，嘌呤或嘧啶鹼基也可以任選被取代，形成可行的前藥，能在體內分裂。合適的取代基的例子包括醯基部分，胺或環丙基(例如，2-氨基，2，6-二氨基或環丙基鳥苷)。
用於本發明的方法或現有技術中的其他試劑的定義如下BSA(二(三甲基甲矽烷基)乙醯胺)，TMSCl是氯代三甲基矽烷；TFAA是三氟乙酸酐；TBDPSCl是叔丁基二苯基甲矽烷基氯；TBDMSCl是叔丁基二甲基甲矽烷基氯；DCM是二氯甲烷。
本發明的方法不限於使用核苷、保護的胺基酸酯和示例的試劑。對本發明的適合的可選試劑可用於替代上述的試劑。例如，TEA(三乙胺)可被其他適合的胺代替，其包括但不限於二異丙基乙胺、N-乙基嗎啉或其他的三級脂肪胺；DME(1，2-二甲氧基乙烷)可被任何適合的極性非質子溶劑代替，例如THF(四氫呋喃)或其他的醚；Red-Al/EtOH(二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉/乙醇)的甲苯溶液可被NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氫催化劑或LiAl(OtBu)3H(三叔丁氧基氫化鋁鋰)代替，所有的這些都產生了化學選擇和區域選擇還原，唯獨LiAlH4產生了開鏈的二醇。在加入MgSO4前後用THF洗產物漿液可以替代為在丙酮中洗。確實，在規模擴大時，丙酮是一種優選的溶劑。
此外，儘管DMF在容易處理和易於從反應混合物中除去上是優選的，但DMF(二甲基甲醯胺)可被任何極性溶劑代替，例如，DMSO(二甲亞碸)。EDC(1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基-碳二醯亞胺氯化氫)；也被稱為DEC)可被任何能進行偶聯的試劑代替，其包括但不限於CDI(羰基二咪唑)、BOP試劑(苯並三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)-膦六氟磷酸鹽)，或已知的類似偶聯試劑。儘管SnCl4是優選的，但這裡可用路易斯酸代替。路易斯酸包括但不限於SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3、SnCl2及它們的混合物。在一個實施方式中，路易斯酸是SnCl4。可用任何的有機溶劑如甲苯等替代乙腈。任何的活化劑，如甲矽烷試劑均可用於使核苷活化進行偶聯。HMDS(六甲基二矽氮烷)、TMSCl或TBDPSCl等均可用於代替BSA(二(三甲基甲矽烷基)乙醯胺)。氨可用於替代溶於甲醇的甲醇鈉，任何極性溶劑DMSO可代替DMF。多種其他甲矽烷化試劑均可代替TBDPSCl，任何氟鹽均可代替NH4F，並且其他的酸如TFA可用於代替HCl。
製備方法步驟的詳細描述核糖酸內酯的製備 核糖酸內酯可通過任何發表的或未發表的方法，包括標準的氧化和取代技術製備。本發明的合成核糖酸內酯的一個實施方式是通過D-果糖，按照以下的步驟進行。
核糖酸內酯可通過D-果糖與氧化鈣(CaO)的反應製得。D-果糖可與CaO以任意摩爾比例進行反應，條件是反應以能夠接受的速率進行而無過多的副產物，對D-果糖，優選的摩爾比率是5∶1，更優選的摩爾比率是3∶1，最優選的摩爾比率是2.3∶1.3。CaO可以任何速率加入，條件是反應以能夠接受的速率進行而不會產生過量的熱或過多的副產物。在一個實施方式中，CaO在室溫下5分鐘內遞增加入。反應可一直進行到D-果糖幾乎被消耗完，例如進行6～22小時，其間，反應進程可被監控，例如定期取出一定量用於TLC分析。
反應可在任何溫度下進行，條件是反應以能夠接受的速率進行而不會促使分解或過量的副產物的產生。優選的溫度是從室溫到約23～40℃。
可利用沉澱劑來從溶液中除去鈣。在一個實施方式中，向反應混合物中加入CO2和比核糖酸強的酸，在一個優選的實施方式中，加入的是有機酸，形成碳酸鈣。適合的有機酸包括但不限於草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、馬來酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸。
因此，在本發明的一個實施方式中，在反應結束階段，可在適當的時間內向混合物中鼓入CO2，例如，2～3小時，以將pH從鹼性降低到中性水平。任何在中和步驟中形成的CaCO3均可被除去，例如通過真空過濾除去。
然後，水層可用酸處理，所用的酸例如為比核酸強的有機酸，例如，草酸，其摩爾比率可以為任意比例，條件是反應以能夠接受的速率進行而不會產生過多的副產物。在一個實施方式中，添加的酸(例如草酸)與D-果糖的摩爾比率為1∶2。
反應可進行到幾乎所有的鈣都發生沉積的程度，這裡包括在任何溫度下，以可接受的速度從溶液中沉積出，而不會促使分解或形成過量的副產物。例如，在室溫或25℃左右攪拌溶液約30分鐘，至出現白色的槳液。然後在約45～50℃攪拌該槳液過夜。
完成後，可蒸發溶液，例如在減壓下進行，以除去決大部分的水但仍留下液體混合物。產物可用已知方法從液體混合物中分離出。例如，可在室溫下約30分鐘內向槳液中加入NaCl和有機溶劑，如THF。分離形成的各層，向水層中加入THF等新鮮的溶劑，再攪拌約10分鐘。加入溶劑、攪拌和分離所得水層的步驟可根據需要而重複多次，例如可重複3次。最後，可合併有機溶液，並加入MgSO4等乾燥劑後攪拌約30分鐘，然後過濾，再用溶劑如THF洗。濾液可蒸發，例如在40℃下減壓蒸發，然後可收集粗產物，其為深橙色的半固體物質。
另外，為純化產物，也可向粗產物中加入丙酮等第二種溶劑，混合物在20℃攪拌3小時。可通過真空過濾收集白色結晶的核糖酸內酯產物，並用如丙酮之類的第二種溶劑洗，並真空乾燥(見圖1，化合物1)。
該反應的產品產率可達到約13.6％，比現有技術的大約提高了4％。
核糖酸內酯的自由羥基可繼續被適當的保護基選擇性地保護，優選的保護基是醯基或甲矽烷基，保護方法可採用本領域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教導的方法。例如，可在室溫下使氯代叔丁基二苯基矽烷與核糖酸內酯在無水吡啶中反應。也可以用醯氯，如苯甲醯氯與核糖酸內酯優選在鹼存在下在DME中回流的條件下反應。
例如，核糖酸內酯產物可與如DMAP等鹼以任意摩爾比率混合，條件是反應以能夠接受的速率進行而不會產生過多的副產物。在一個實施方式中，核糖酸內酯∶鹼(例如DMAP)的摩爾比率約為5∶1。任選通過使用額外的鹼來促進反應，例如，以任意的比率使用TEA，但條件是反應以能夠接受到速的率進行而不會產生過多的副產物。在本發明的一個實施方式中，使用過量的額外的鹼(例如TEA)。在足夠長的時間後，以任意的摩爾比率加入苯甲醯氯等醯氯，使得反應以可接受的速率進行，而不會產生過量的副產物。與核糖酸內酯的摩爾比率大約為5∶1。
核糖酸內酯可在任意的溶劑中製備，只要該溶劑滿足溫度和反應試劑的溶解度的要求即可。溶劑可由任意的非質子溶劑構成，其包括但不限於烷基溶劑，如己烷和環己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲醯胺(DMF)、DME、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺或其任意組合，但優選使用DME。
反應可在任意溫度下以能夠接受的速率完成，但條件是不會產生過多的副產物。優選的溫度範圍是從室溫到約5℃。
然後，可向反應混合物中加入冰水，其後收集粗產物，在叔丁基甲醚等合適的溶劑中攪拌、過濾、洗滌，並通過真空等進行乾燥。
為了進行比較，圖2中給出了現有技術中Kiliani的製備核糖酸內酯的方法。Kiliani方法的詳細描述在Sowden的Adv.In Carbohydrate Chem.1957，1243中給出，其中教導到，加入Ca(OH)2後14天再次加入，然後混合物放置1～2個月，期間偶爾搖動搖動。然後，過濾混合物，濾液用CO2飽和。接著，通過加入完全等當量的草酸，使鈣離子沉澱，過濾溶液，濃縮成槳液，再在低溫條件下待該槳液結晶幾天。最後，將母液從結晶體中分離，再用水溶解結晶體並進行重結晶。
保護的核糖酸內酯的還原 由前述步驟得到的任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯可用任何適當的還原劑進行還原，所用還原劑的摩爾比率任選，但條件是反應以能夠接受的速率進行而不會產生過多的副產物。適當的還原劑包括但不限於Red-Al/EtOH(二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉/乙醇)、NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氫催化劑或LiAl(OtBu)3H(三叔丁氧基氫化鋁鋰)代替，所有的這些都產生了化學選擇和區域選擇還原。在本發明的一個實施方式中，還原劑是Red-Al/乙醇。例如，Red-Al溶液可被加入到任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯溶液中，其中，Red-Al與2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯的摩爾比率約為2∶1。
有趣的是，發現了某些試劑並不理想，在用於本發明方法的過程中產生了期望的和不期望的產物的混合物。例如，當用LiAI(Ot-Bu)3H代替Red-Al的乙醇溶液時，LiAI(Ot-Bu)3H使得反應變慢，並形成了多種不期望的產物。類似的，9-硼二環-[3.3.1]-壬烷、9-BBN和二異丁基氫氧化鋁、DIBALH不發生反應，或者只產生非常少量的期望的產品。
反應可在任何溫度下完成，但條件是反應以能夠接受的速率進行而不會產生過多的副產物。優選的溫度是從約0℃～5℃。
呋喃核糖可在任何滿足溫度和試劑溶解性要求的溶劑中製備。溶劑可包括任意的有機溶劑，包括但不限於烷基溶劑，如戊烷、己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲醯胺(DMF)、DME、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺、醇類溶劑，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇和辛醇，或它們的組合，但優選的是無水甲苯和無水乙醇溶液。
可用合適的質子源，如丙酮、水和1NHCl使反應結束。混合物可用有機溶劑如乙酸乙酯萃取，用鹽水洗、乾燥、在減壓約40℃下除去溶劑。
然後，呋喃核糖的自由羥基可用合適的保護基進行選擇性保護，優選的保護基是醯基或甲矽烷基，保護方法可採用本領域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教導的方法。例如可在室溫下使氯代叔丁基二苯基矽烷與呋喃核糖在無水吡啶中反應。也可以用醯氯，如苯甲醯氯與呋喃核糖優選在鹼存在下在DME中回流的條件下反應。
圖3是Harry-O′kuru et al，J.Org.Chem.，(1997)，62(6)1754-59中提供的可替換方法。該方法缺少內酯中間體，但用於獲得與本發明相同的產物。Harry-O′kuru的方法利用了除C2位外的所有的羥基均在形成酮之前被保護了的D-樹膠醛醣或D-核糖(圖3)。被保護了的糖與Dess-Martin periodinane試劑在CH2Cl2和MgSO4中反應，得到2，4-二-O-苯甲醯-5-甲基-O-苯甲醯-二氫呋喃-3-酮，然後再用MeTiCl3，MeMgBr/TiCl4(或RCeCl2，其中，R將是核糖C2上的取代基)進行還原。化合物(3)和4(4a)與BzCl/DMAP/Et3N的反應產生了最終產物(4b)，1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-R-核糖呋喃糖苷。需要注意的是，在第一步中，目標產物的水合物大量產生，需要與過量的MgSO4反應以製備基本上完全乾燥的酮產物。並且，已觀察到，在關鍵中間體2-酮與有機鈦試劑反應中，產生了期望的1，3，5-苯甲醯-保護的-2-烷基核糖呋喃糖苷和其酯交換的2，3，5-苯甲醯-保護的核糖呋喃糖苷的α-和β異構體的混合物。由於三種產物對於該作者均有用，所以這對他們而言無關緊要。這樣的合成就需要額外的分離步驟來獲得單一定異構體(J.Org.Chem.，1997，62(6)1754-9，at 1755)。無論是D-樹膠醛醣或D-核糖均可用作此目的的起始原料，但使用D-樹膠醛醣時不得不考慮到其經濟性，其費用大約為使用D-果糖的250倍！圖3中的現有技術的方法與本發明的區別在於，除C2位外，D-樹膠醛醣或D-核糖的所有的羥基均在形成酮之前被保護。然後，通過與Dess-Martinperiodinane(見圖3，化合物3)試劑反應，在起始化合物的C2上形成了酮，接著被MeTiCl3或RCeCl2還原，其中的R是將要取代核糖C2上的第二取代基。(見圖3，化合物3和4)。最終產物1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-烷基-核糖呋喃糖苷的產率約為79％。
相比而言，本發明的方法更為有效，其提供的內酯形成於呋喃核糖的C1，對C2，C3和C5進行羥基保護，優選用Red-Al在乙醇內還原內酯，產生區域選擇的易於分離的端基異構產物，然後對位於呋喃核糖的C1的單獨的剩餘自由羥基進行保護。
呋喃核糖與活化的胞嘧啶的縮合反應 由前步得到的或由其他已知方法得到的任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸呋喃糖可用任何公知的方法與核苷鹼偶聯，這些方法包括採用活化鹼的標準偶聯技術。
本發明的一個實施方式包括按照以下步驟進行的合成β-D-2′-C-甲基-胞苷的方法。
β-D-2′-C-甲基-胞苷可通過使2-C-甲基-D-核糖酸呋喃糖與活化的未保護的(如未苯甲醯化的)胞嘧啶反應而得到，這樣的胞嘧啶可以是如用活化劑活化的胞嘧啶，例如甲矽烷化試劑，其包括但不限於BSA((N，O-二(三甲基甲矽烷基)乙醯胺)、HMDS、TMSCl或TBDPSCl。在一個實施方式中，甲矽烷化試劑是BSA。
反應可任選在如SnCl4這樣的路易斯酸存在下進行，所用路易斯酸的摩爾比率任選，但條件是反應以能夠接受的速率進行而不會產生過多的副產物。合適當路易斯酸包括但不限於SnCl4、BF3、AlCl3，TiCl2，TiCl4，FeCl3，SnCl2及它們的混合物。在一個實施方式中，路易斯酸是SnCl4。
β-D-2′-C-甲基-胞苷可在任何滿足溫度和試劑溶解性要求的溶劑中製備。溶劑可包括任意的非質子溶劑，包括但不限於烷基溶劑，如己烷和環己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺或它們的組合，但優選的是乙腈。
該反應可在任何溫度下完成，但條件是反應以能夠接受的速率進行而不會促使分解或過多的副產物。優選的溫度是約20℃～80℃。
然後，核苷可用已知道方法進行脫保護，脫保護的方法可採用本領域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley andSons，Second Edition，1991中教導的方法。例如，苯甲醯保護的羥基部分可用NaOMe的MeOH溶液在約室溫下脫去保護。
圖5中表示的現有技術的方法包括使苯甲醯胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈與1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反應，形成4-苯甲醯氨基-1-(3，4-二苯甲醯氧基-5-苯甲醯氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(5a)；使(5a)與NH3在甲醇中反應並用色譜分離產物，4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(6)，也稱為β-D-2′-C-甲基-胞苷；使(6)與Me2NCH(OMe)2在DMF中室溫下反應1.5小時，形成N[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(7)，使(7)與TBDPSCl和吡啶在室溫下反應6小時形成N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(8)；使(8)與N-Boc-L-纈氨酸、DEC和DMAP在THF/DMF中於室溫下反應2天，並將由該反應得到的產物通過HPLC獲得2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(9a)；將(9a)與NH4F在MeOH中回流約3小時，以除去甲矽烷基和氨基保護基，並將產物進行色譜純化，得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸-5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥基甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(10)；最後，使(10)與HCl在EtOAc中於室溫下反應得到2-氨基-3-甲基-丁酸-5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥基甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽(11)作為最終產物。÷圖6在這裡是作為現有技術中用於製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)的另一供選方法。該現有技術方法利用了尿嘧啶作為起始原料，並包含使尿嘧啶與BSA在乙腈中與1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反應約30分鐘，在乙腈種加入路易斯酸SnCl4，將所得溶液回流約4小時，色譜分離產物1-(3，4-二卞氧基-5-卞氧基-甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(12)；使(12)與NaOMe在甲醇種反應約4.5小時，以除去苯甲醯保護基，然後分離和結晶產物1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(13)，也被稱為β-D-2′-C-甲基-尿苷；最有，使(13)順次與TMSCl和N-甲基吡咯烷在CH3CN中反應約3.5小時，冷卻並在約30分鐘內加入三氟乙酸酐(TFAA)，在0℃加入4-硝基苯酚，攪拌約3小時，加入NH4OH的二噁烷並加熱到50℃，過夜後，通過色譜方法和結晶分離最終產β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的酯化由前述步驟或任何已知方法獲得的任選保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷可通過已知道任何方法進行酯化。
本發明的一個實施方式包括合成β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯的方法，特別是以下的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯的方法。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯可通過採用任何已知的方法任選保護β-D-2′-C-甲基-胞苷的氨基而製得。例如在Greene，et al.，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教導的方法。在本發明的一個實施方式中，β-D-2′-C-甲基-胞苷可與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應，產生N[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒。
在一個具體的實施方式中，化合物可進一步用TBDPSCl和咪唑進行保護，提供5′-甲矽烷基-保護的化合物，N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲脒，反應可在任意溶劑中進行，條件是其與溫度和試劑的溶解性相適合。溶劑可包括任何非質子溶劑，包括但不限烷基溶劑，如己烷和環己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺或它們的任意組合，但優選DCM。
然後，任選保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷可與任何適合的結構偶聯得到藥學上可接受的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-前藥，偶聯可使用已知的任何方法進行，包括標準縮合反應。被偶聯的部分可以是磷酸根(包括單-、二-或三-磷酸根以及穩定的磷酸根)；直鏈的、支鏈的或環狀烷基(包括低級烷基)；醯基(包括低級醯基)；CO-烷基、CO-醯基、CO-烷氧基烷基、CO-烷氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括磺酸烷基酯或磺酸芳烷基酯，包括甲基磺醯基)；卞基，其中的苯基被一個或多個在芳基定義中描述的取代基任選取代；烷基磺醯基、芳基磺醯基、芳烷基磺醯基、脂質(包括磷脂)；胺基酸；碳水化合物；肽；膽固醇或藥學上可接受的離去基團，當體內施用時，其能提供自由羥基(或磷酸根)。
在本發明的一個實施方式中，期望的3′-前藥是β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯，可通過以下步驟製備。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯可通過使任選保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷(例如5′-和N-保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷)與N-Boc-L-纈氨酸優選在偶聯劑，如EDC及鹼如DMAP存在下反應，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基-甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯而製備。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯可在任何滿足溫度和試劑溶解性要求的溶劑中製備。溶劑可包括任意的非質子溶劑，包括但不限於烷基溶劑，如己烷和環己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺或它們的任意組合，但優選的是DCM。
該反應可在任何溫度下完成，但條件是反應以能夠接受的速率進行而不會促使分解或過多的副產物。優選的溫度是在室溫附近。
然後，β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯可用已知的方法脫去保護，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，SecondEdition，1991中教導的方法。在本發明的一個具體實施方式
中，叔丁基二苯基甲矽烷基保護的5′-OH和N Boc-保護的L-纈氨酸可用NH4F在MeOH中，在大約10摩爾當量的乙酸乙酯存在下(為防止析出的氨切斷′-O-纈氨酸酯)，回流混合物得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，從而脫去保護。
3′-纈氨酸酯可用已知的方法轉化為鹽，這些方法包括使β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯與HCl在EtOH中反應，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽，作為最終產物。
優選實施方式本發明的一個優選定實施方式在圖1中示出，其包括使D-果糖在CaO/水存在下於23-40℃反應6-22小時，然後向反應混合物中加入CO2和草酸，使反應進行8-12小時，形成2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(1)；使2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(1)與4-二甲基氨基吡啶(DMAP)與三乙胺(TEA)在1，2-二甲氧基乙烷(DME)中於5-25℃反應約30分鐘，冷卻混合物至約5℃。加入苯甲醯氯，得到2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(2)；使2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯(2)與Red-Al/乙醇在甲苯中於-5～0℃下反應約40分鐘，得到2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(3)，最後在DMAP和DME存在下，向2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(3)的冷溶液中，加入苯甲醯氯/TEA，在約5～50℃下使反應進行約4小時到約12小時，得到最終產物(4)，2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
具體而言，D-果糖的水溶液在室溫下調製，加入到其中的CaO的優選摩爾比率為5∶1，更優選為3∶1，最優選為2.3∶1.3，加入方式為5分鐘內漸增加入。反應於23～40℃下進行6～22小時，定期取出反應液進行TLC分析。
在反應周期結束之際，可在適當的時間內向混合物中鼓入CO2約2～3小時，以將pH從鹼性降低到中性水平。任何在中和步驟中形成的CaCO3均可被除去，例如通過真空過濾除去。合併水層，並用草酸(或其他有機酸)和D-果糖以1∶2的摩爾比率處理，在25℃攪拌約30分鐘直到出現白色漿液。然後，於45-50℃攪拌該漿液過夜，減壓下蒸餾除去絕大部分的水，得到仍為液體狀態的混合物。室溫下向漿液中加入NaCl和THF，攪拌約30分鐘。分離所得的層，將水層加入到新鮮的THF中，另攪拌10分鐘。加入THF、攪拌和分離所得液體層的過程重複3次。最後，合併所有的THF溶液，與無水MgSO4一同攪拌30分鐘，過濾混合物，用THF洗MgSO4濾餅。濾液在約40℃下減壓蒸餾，收集粗產物，為深橙色半固體狀。
然後，向粗產物中加入丙酮，混合物在20℃下攪拌3小時。真空過濾收集白色結晶的核糖酸內酯產物，用丙酮洗並真空乾燥(見圖1，化合物1，流程1)。該反應的產物產率約為13.6％，與現有技術相比較而言，提高了近4％。
然後，獲得的核糖酸內酯產物與DMAP以摩爾比率約5∶1(核糖酸內酯∶DMAP)、過量的TEA和DME混合，室溫下攪拌約30分鐘。所得的懸浮液冷卻到5℃，以與核糖酸內酯約5∶1的比率加入苯甲醯氯。室溫下攪拌混合物約4小時，直到通過TLC確認起始原料已消耗完。然後，向反應混合物中加入冰水並攪拌約30分鐘，接著，收集粗產物，與叔丁基甲基醚攪拌、過濾、洗滌並真空乾燥。收集到的白色固體是2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯，產率為83.4％，純度接近98％(見圖1，化合物2)。
由先前步驟獲得的2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯被冷卻到約-5℃，向其中加入事先在0℃混合的Red-Al的無水甲苯和無水乙醇的溶液。Red-Al與2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯的摩爾比率約為2∶1。混合物保持在-5℃攪拌約40分鐘。從混合物取出樣液用於TLC和/或HPLC分析，以確認起始原料是否消耗完，然後用丙酮、水和1N HCl使反應結束，恢復至室溫。最後，混合物用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗、乾燥，在約40℃下減壓除去溶劑。所得產物2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-呋喃核糖的產率是以在該步驟開始時使用的2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內酯的量為基準的定量產率。(見圖1，化合物3)。
呋喃核糖C-1的保護基緊接著在下一步形成。苯甲醯氯以大約2∶1的摩爾比率加入到5℃的2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-呋喃核糖的溶液中，同時加入的還有溶於無水DME的DMAP和TEA。攪拌反應並過夜，然後，用冰水和碳酸鈉水溶液使反應結束。然後，除去THF，混合物用乙酸乙酯萃取。洗滌、乾燥和去除溶劑後產生稠的油狀產物。向其中加入叔丁基甲醚、庚烷和水，在約20℃攪拌約2小時。洗滌和真空乾燥後，最終產物1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的產率為52％，純度大於98％(見圖1，化合物4，流程1)。
本發明的另一優選實施方式示於圖4，包括使胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈與本發明第一實施方式中的1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反應，得到4-氨基-1-(3，4-二苯甲醯氧基-5-苯甲醯氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(5)；使(5)與NaOMe/MeOH反應，得到(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(6)，也被稱為β-D-2′-C-甲基-胞苷。使用胞嘧啶作為起始原料而不是苯甲醯-胞嘧啶，提高了過程的「原子效益」，並簡化了後續步驟中的純化。
合成可以(6)的形成而終結，產物通過已知的方法進行分離。另外，還可進一步進行合成，製備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，或者其優選的鹽酸鹽形式，本發明的第四優選實施方式。
在本發明的另一優選實施方式中，化合物(6)與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應，形成(7)，N-[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒，其是(6)的胺基酸-保護形式；使(7)與TBDPSCl和咪唑在DCM中反應，得到(7)的5′-甲矽烷基-保護的形式，即N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(8)，其中，使用DCM的好處是對二甲矽烷副產物的形成有更佳的控制；使(8)與N-Boc-L-纈氨酸、EDC和DMAP在DCM中於室溫下反應，形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基-甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(9)；通過使(9)與NH4F在MeOH中在大約10摩爾當量的乙酸乙酯(為防止析出的氨切斷3′-O-纈氨酸酯)存在下反應，除去甲矽烷基和氨基-保護基，並回流混合物，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(10)；最後，使(10)與HCl在EtOH中反應，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽(11)作為最終產品。
本發明進一步示例於以下的非限制性實施例中。這裡給出的這些實例是為了幫助對發明的理解。它們對本發明方法和產品的描述不應理解為對權利要求中限定的本發明構成任何限制。在不脫離本發明精神的前提下，等同物、類似或適合的溶劑、試劑或反應條件可被替換為此處描述的那些特定的溶劑、試劑和/或反應條件。
實施例實施例12-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯在配備了懸掛式攪拌器、攪拌軸、數字溫度讀出裝置和氬氣通道的250mL的3口圓底燒瓶中，攪拌去離子水(100mL)。鼓入氬氣30分鐘，加入D-果糖(20.0g，0.111mol)，溶液在幾分鐘內變得清澈。在5分鐘內分批加入氧化鈣(12.5g，0.223mol)，劇烈攪拌混合物。觀察到放熱，從加入氧化鈣起10分鐘後反應溫度升至39.6℃。大約15分鐘後，反應混合物變為黃色，且顏色隨時間而加深。3小時後，取出部分反應混合物進行TLC分析。取出的部分用飽和草酸水溶液酸化到pH 2。所得到白色懸浮液在減壓下蒸餾除去水。向殘液中加入甲苯(2mL)，混合物在減壓下蒸餾(在45-50℃)，除去所有殘留的水。殘餘固體再次加入到2mL的1∶1的四氫呋喃∶甲醇混合物中。充分混合後，使懸浮液靜置，用上清液點TLC(矽膠板，用含2％甲醇的乙酸乙酯展開，浸在1％鹼性高錳酸鉀中染色。然後，使用熱槍加熱板，直到在粉色背景中出現黃色的點)。在上述條件下，期望的內酯通常出現在Rf值為0.33處。更多的極性副產物和未反應的原料在Rf值為0.0～0.2處檢測到。
儘管3小時後觀察到產物的形成，反應仍繼續進行22小時。其間，反應混合物在25℃攪拌。在該期間最後，混合物的pH是13.06。向反應混合物中鼓入二氧化碳氣體約2.5小時(pH為7.25)。形成的碳酸鈣固體通過真空過濾除去，濾餅用50mL去離子水洗。合併水層並用草酸(5.0g，0.056mol)處理，在25℃下對混合物劇烈攪拌30分鐘(最初的深色基本上消失，混合物變為乳白色漿液)。此階段的混合物的pH通常為2-3。漿液混合物在45-50℃下攪拌過夜。然後，在45-50℃下減壓蒸餾混合物，除去75mL水。向水性漿液(約75mL)中加入氯化鈉(30g)和四氫呋喃(100mL)，在25℃劇烈攪拌混合物30分鐘。分離各層，用75mL的新鮮四氫呋喃攪拌水層10分鐘。該過程重複3次，合併四氫呋喃溶液並與10g的無水硫酸鎂攪拌30分鐘。過濾混合物，硫酸鎂濾餅用60mL四氫呋喃洗。濾液在40℃下減壓蒸餾，得到10.86g粗產物，其為深橙色半固體。(對於更大規模的合成，用丙酮代替四氫呋喃取代蒸餾粗產物至乾燥)。在20℃下，將粗產物在丙酮(20mL)中攪拌3小時。真空過濾收集產物，用12mL丙酮洗濾餅，得到白色結晶固體的期望產物1。真空乾燥得到2.45g(13.6％產率)。化合物1的熔點158-162℃(文獻報導熔點160-161℃)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 5.69(s，1H，用D2O交換)，5.41(d，1H，用D2O交換)，5.00(t，1H，用D2O交換)，4.15(m，1H)，3.73(m，2H)，3.52(m，1H)，1.22(s，3H)。13C NMR(DMSO-d6)δppm 176.44，82.95，72.17，72.02，59.63，20.95。(C6H10O5計算值C，44.45；H，6.22。實測值C，44.34；H，6.30)。
實施例22，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-內酯在25℃氬氣氛圍中攪拌丙酮1(3.0g，18.50mmol.)、4-二甲基氨基吡啶(0.45g，3.72mmol.)和三乙胺(25.27g，249.72mmol.)在1，2-二甲氧基乙烷(50mL)中的混合物30分鐘。將該白色懸浮液冷卻到5℃，在15分鐘內加入苯甲醯氯(11.7g，83.23mmol.)。在25℃攪拌混合物兩小時。TLC分析(矽膠，2％甲醇的乙酸乙酯溶液)表明起始原料完全消耗。向反應混合物中加入冰水(100g)，繼續攪拌30分鐘。形成的白色固體通過真空過濾收集，用冷水(50mL)洗濾餅。在20℃將該粗產物與叔丁基甲醚(60mL)一同攪拌，然後過濾，濾餅用叔丁基甲醚(25mL)洗，並真空乾燥，得到7.33g化合物2(83.4％產率)，其為白色固體，純度為97.74％(HPLC/AUC)。化合物2的熔點137-140℃(文獻值141-142℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.04(d，2H)，7.92(d，2H)，7.73(d，2H)，7.59(t，1H)，7.45(m，4H)，7.32(t，2H)，7.17(t，2H)，5.51(d，1H)，5.17(m，1H)，4.82-4.66(d of an ABquartet，2H)1.95，(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δppm 172.87，166.17，166.08，165.58，134.06，133.91，133.72，130.09，129.85，129.80，129.37，128.78，128.60，128.49，127.96，127.89，79.67，75.49，72.60，63.29，23.80。TOF MS ES+(M+1475)。
實施例32，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖對Red-Al(65wt.％溶於甲苯，2.0mL，6.56mmol)在無水甲苯(2.0mL)中的溶液在0℃氬氣氛圍下攪拌。無水乙醇(0.38mL，6.56mmol)在無水甲苯(1.6mL)中的溶液在5分鐘內被加入到上述甲苯溶液中。所得混合物在0℃攪拌15分鐘，將該Red-Al/乙醇試劑中的2mL(2.18mmol)在10分鐘內加入到2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸內酯2(475mg，1.0mmol)的無水甲苯(10mL)的冷溶液(-5℃)中。TLC分析(矽膠板，35％乙酸乙酯的庚烷溶液)表明起始原料完全消耗。HPLC分析表明僅殘餘0.1％的起始原料。用丙酮(0.2mL)，水(15mL)和1NHCl(15mL)在0℃使反應結束，並加熱到室溫。加入1N HCl(5mL)溶解無機鹽(pH2-3)。用乙酸乙酯(3×25mL)萃取混合物，用鹽水(25mL)洗有機溶液，乾燥(無水硫酸鈉，10g)，40℃減壓下除去溶劑，得到期望的產物3，定量產率(480mg)。該材料被用於以下的步驟。
實施例41，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖向冷的化合物3(480mg，1.0mmol)、3，4-二甲基氨基吡啶(12.3mg，0.1mmol)和三乙胺(506mg，5.0mmol)的無水四氫呋喃(5mL)溶液中，於5分鐘內加入苯甲醯氯(283mg，2.0mmol)。室溫下氬氣氛圍中攪拌反應混合物過夜。HPLC分析表明有0.25％未反應的起始物質。反應通過加入冰水(10g)和碳酸氫鈉飽和溶液而結束。減壓下除去四氫呋喃，用乙酸乙酯(50mL)萃取混合物。用水(25mL)、鹽水(25mL)洗有機溶液，乾燥(無水硫酸鈉，12g)，減壓下除去溶劑，得到650mg稠厚的油狀物。該粗產物與5mL的叔丁基甲醚一同攪拌5分鐘，加入庚烷(5mL)和水(0.1mL)，繼續在20℃攪拌2小時。真空過濾收集固體，濾餅用1∶1的庚烷∶叔丁基甲醚溶液(6mL)和叔丁基甲醚(2mL)洗。真空乾燥固體，得到300mg(52％)期望產物4(純度98.43％，由HPLC/AUC純化)，其為白色固體，熔點154-156.3℃(文獻值155-156℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.13(m，4H)，8.07(d，2H)，7.89(d，2H)，7.63(m，3H)，7.48(m，6H)，7.15(m，3H)，7.06(s，1H)，5.86(dd，1H)，4.79(m，1H)，4.70-4.52(d of an AB quartet，2H)，1.95，(s，3H)。13CNMR(CDCl3)8ppm 166.31，165.83，165.01，164.77，134.01，133.86，133.70，133.17，130.44，130.13，129.97，129.81，129.59，129.39，129.07，128.84，128.76，128.37，98.01，86.87，78.77，76.35，64.05，17.07。(C34H28O9計算值C，70.34；H，4.86。實測值C，70.20；H，4.95)。
實施例54-氨基-1-(3，4-二苯甲醯氧基-5-苯甲醯氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(化合物2，圖4)在配備了回流冷凝器、懸掛式攪拌器和氬氣入口轉接器的12L圓底燒瓶中，將胞嘧啶(89g，0.80mol)懸浮於乙腈(900ml)中。在20℃的氬氣氛圍下攪拌混合物，加入一部分N，O-二(三甲基甲矽烷基)乙醯胺(537ml，2.2mol)。所得溶液加熱到80℃並在相同溫度下攪拌1小時。1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(425.0g，0.73mol)被懸浮於乙腈(4000ml)中，並加入到反應混合物中。幾分鐘後，反應混合物變得清澈，溫度降到ca.50℃。15分鐘內加入氯化錫(IV)(154ml，1.31mol)，在80℃繼續攪拌。1小時後，加入碳酸氫鈉溶液使部分反應混合物結束反應，用乙酸乙酯萃取液層。用TLC(矽膠，20％乙酸乙酯的庚烷溶液，糖衍生物的Rf0.40)檢測乙酸乙酯層。TLC分析表明糖衍生物完全消耗。使用10％甲醇的二氯甲烷溶液，由TLC檢測到期望的產物(Rf0.37)。反應也由HPLC進行監控(方法#2)。反應混合物冷卻到20℃，30分鐘內加入飽和碳酸氫鈉溶液(3000mL)結束反應(當加入最初的幾毫升碳酸氫鈉溶液時觀察到放熱)。分次加入固體碳酸氫鈉(1350g)以避免發泡。檢測混合物以確保其pH≥7。停止攪動，使各層分離20分鐘。排除水層，與乙酸乙酯(1500ml)一同攪拌，使混合物分離(30分鐘)。分離有機層，與乙腈溶液合併。有機溶液用鹽水(500ml)洗，然後除去溶劑，體積達到ca.750ml。產物可用於隨後的反應。也可進一步除去溶劑得到定量產率的白色沫狀固體。化合物(2)的結構由1H NMR分析確認。
實施例64-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(化合物3)向化合物(2)(416g，0.73mol)的甲醇(2000ml)溶液中，加入甲醇鈉(13.8g，0.26mol)。反應混合物在室溫下攪拌，並由TLC(矽膠，10％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物1的Rf0.53)以及(矽膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物3的Rf0.21)監控。30分鐘後，產物開始沉澱，TLC表明兩小時後反應完成。反應也由HPLC進行監控(方法#2)。減壓下除去甲醇至體積ca.500ml，再使用乙醇驅趕(2×500ml)，使體積達到ca.500ml。殘餘的稠厚漿液用750ml乙醇稀釋，混合物在20℃攪拌1小時。過濾收集產物，濾餅用乙醇(100ml)和叔丁基甲醚(100ml)洗，乾燥後得到168g(兩步的產率為90％)產物(3)，純＞97％(HPLC/AUC)。產物也經過了1H和13C NMR的分析。
實施例7N-[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(化合物4)向化合物3(19g，0.0738mol)在無水N，N-二甲基甲醯胺(150ml)的懸浮液中，加入N，N-二甲基甲醯胺二甲基乙縮醛(98ml，0.7385mol)，在20-22℃攪拌混合物。一小時後，TLC(矽膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物3的Rf是0.21，產物4的Rf是0.55)表明反應完成。減壓下除去溶劑和試劑(保持溫度在40℃以下)。向得到的油狀殘渣中加入乙醇(50ml)，減壓下除去溶劑。該過程重複兩次，粗產物得以固化。粗產物與190ml乙醇在20℃下一同攪拌1小時，在5℃保持12小時。過濾收集固體，濾餅用30ml的冷乙醇和30ml的冷叔丁基甲基醚洗。減壓乾燥固體，得到14.7g(64％)化合物(4)，作為第一產物。TLC(矽膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，產物(4)的Rf是0.55)以及(矽膠，10％甲醇的二氯甲烷溶液，產物(4)的Rf是0.1)只顯示出化合物(4)的一個點。乙醇提純後的母液被蒸發乾燥，殘渣與乙醇(80ml)在20℃下攪拌1小時，並在5℃保持12小時。過濾收集固體，濾餅用15ml的冷的乙醇和15ml的冷的叔丁基甲醚洗。真空乾燥固體後，獲得3.5g(15％)固體，作為第二產物。TLC(矽膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，產物(4)的Rf是0.55)以及(矽膠，10％甲醇的二氯甲烷溶液，產物(4)的Rf是0.1)只顯示出化合物(4)的一個點；m.p.201-209℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.62(s，1H，N＝CH)，8.17(d，1H，H-6，J5-6＝7.3Hz)，5.91(m，2H，H-1′，H-5)，5.16(t，1H，OH-5′，D2O可交換)，5.06(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，3.8-3.5(m，4H，H-3′，H-4′，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，6H，N(CH3)2)，0.92(s，3H，CH3)；FAB＞0(GT)625(2M+H)+，313(M+H)+，167(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z 419(M+T-H)-，403(M+G-H)-，311(M-H)-，165(B)-。
實施例8N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(化合物5)化合物(4)(42.9g，0.137mol)通過懸掛式攪拌器攪拌30分鐘而分散到無水二氯甲烷(200ml)中。然後，使用旋轉蒸發器將混合物蒸發至乾燥，在ca.30℃)。將該乾燥的化合物(4)、咪唑(37.4g，0.55mol)和無水二氯甲烷(800ml)在氬氣氛圍下加入到2L的4-口圓底燒瓶中，叔丁基二苯基氯矽烷(43.1g，0.156mol，分為若干次加入)被轉移到連接於反應燒瓶的附加通道中。反應混合物冷卻到10℃，在20分鐘內從附加通道加入叔丁基二苯基氯矽烷(13.74g，0.05mol)，邊攪拌邊維持反應溫度在10～12℃。反應通過HPLC監控(方法#2)。1.5小時後，在20分鐘內加入第二部分的叔丁基二苯基氯矽烷(14.76g，0.053mol)，邊攪拌邊維持反應溫度在10～12℃。再過1小時候，在20分鐘內加入剩餘的叔丁基二苯基氯矽烷(14.8g，0.053mol)，邊攪拌邊維持反應溫度在10～12℃。然後，在12-15℃再攪拌1.5小時。HPLC表明有95.40％的產物，3.00％的二-甲矽烷基衍生物以及未反應的原料。加入飽和碳酸氫鈉溶液(150ml)結束反應，並在15℃攪拌15分鐘(pH在8附近)。分離水層和二氯甲烷層。用水(2×150ml)和鹽水(1×200ml)洗二氯甲烷層，用無水硫酸鈉乾燥(60.0g，30分鐘)。然後，減壓下過濾除去溶劑。殘餘的沫狀固體用於下步的反應。
實施例92-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-5[-4(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(化合物6)25℃下氬氣氛圍中攪拌化合物(5)(58g，0.1053mol)的二氯甲烷(500ml)溶液。加入N-(叔丁氧基羰基)-L-纈氨酸(29.7g，0.1367mol)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二醯亞胺氯化氫(26.2g，0.1367mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(1.3g，0.0106mol)，25℃下攪拌反應混合物，通過HPLC監控(方法#2)。4小時後，HPLC表明含7.9％的起始原料。加入N-(叔丁氧基羰基)-L-纈氨酸(4.57g，0.0210mol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二醯亞胺氯化氫(4.03g，0.0210mol)，持續在25℃再攪拌2小時。然後，經HPLC檢測到0.7％的起始原料。向反應混合物中加入甲醇(60ml)，減壓蒸發除去溶劑(溫度保持在40℃以下)，得到化合物(6)，為稠厚的油。該材料(93％純度，HPLC/AUC)被用於下步的反應。
實施例10叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H 嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(化合物7)將化合物(6)(0.3mol)、MeOH(1650ml)和EtOAc(265g，3.0mol)加入到3L的5-口圓底燒瓶中，攪拌混合物使化合物(6)溶解。加入氟化胺(45.0g，1.21mol)，回流下使溫度達到64.5℃，攪拌4小時。HPLC(方法#2)表明反應在4小時後完成。然後，減壓下於40-45℃除去溶劑，並用EtOAc(300ml)驅趕。殘餘泡沫與EtOAc(400ml)、水(600ml)和叔丁基甲醚(300ml)合併，室溫下粉碎混合物2.5小時。過濾收集分離的白色固體，用水(200ml)、1∶1的EtOAc/叔丁基甲醚(120ml)和叔丁基甲醚(120ml)洗。然後，真空乾燥固體超過20小時，得到化合物(7)，為白色固體。產率為71.54g，三步為52％。化合物(7)的純度是99.08％(HPLC，方法#3)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.99(d，1H，H-6，J6-5＝7.42Hz)，7.3-7.1(m，3H，CH和NH2，D2O可交換)，5.9(s，1H，H-1′)，5.75(d，1H，H-5，J6-5＝7.43Hz)，5.43(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，5.24(t，1H，OH-5′)，5.04(d，1H，H-3′，J3′-4′＝9.1Hz)，4.1-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.4(2m，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.0(m，1H，CB)，1.40(s，9H，(CH3)3C)，1.0(s，3H，CH3)，0.9-0.8(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B)-；FAB＞0(GT)913(2M+H)+，457(M+H)+，112(B+2H)+，57(CH3)3C)+；FAB＜0(GT)911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocVal)-，110(B)-。
實施例112-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(二鹽酸鹽)(化合物8)在配備了懸掛式攪拌器、溫度探頭、氬氣通道和氯化氫鼓泡器的圓底燒瓶中，攪拌化合物(7)(21.0g，0.046mol)的乙醇(168ml)溶液。向澄清的溶液中鼓入氯化氫氣體(22g)1小時。用冰水浴使反應溫度保持在30℃以下。通入氯化氫氣體後幾分鐘開始有固體形成。4小時後，HPLC(方法#3)表明只有0.8％的起始原料。過濾收集固體，濾餅用乙醇(20ml)和二乙醚(100ml)洗。減壓乾燥產物16小時後，得到19.06g(96.5％)產物(8)，純度為97.26％(HPLC，方法#3)；m.p.210℃(變為褐色)，248-250℃(熔融)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.0(s，1H，1/2NH2，D2O可交換)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交換)，8.42(d，1H，H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′＝8.8Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m，1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+，357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+Cl)-，391(M+Cl)-，355(M-H)-，116(Val)-，110(B)-，35(Cl)-。
實施例12HPLC測試方法上述所有的方法均使用反向色譜柱；Waters部分編號#WAT086344；Nova-PakC18，60′孔大小，4μm顆粒大小，3.9×150mm。所有的色譜均使用Waters2695 HPLC和996 PDA監測器獲得。
流動相HPLC級乙腈和水從JT Baker購得，1M的醋酸三乙胺溶液從Fluka購得。
方法#1用於測試化合物4，圖4流速1.00ml/min。乙腈/水的線性梯度如下。
每次測試前系統都平衡5分鐘。
波長254nm。
化合物4的保留時間＝12.8分鐘。

方法#2用於測試化合物2、4、5、6和7，圖4流速1.00ml/min。乙腈/20mM醋酸三乙胺緩衝液的線性梯度如下。
每次測試前系統都平衡5分鐘。
波長320和272nm。

對比表化合物與保留時間，方法#2


方法#3用於測試化合物3、7和8，圖4流速1.00ml/min。乙腈/20mM醋酸三乙胺緩衝液的線性梯度如下。
每次測試前系統都平衡5分鐘。
波長272nm。

對比表化合物與保留時間，方法#3

現有技術方法實施例13N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-β-D 2′-C-甲基-胞苷(4)的製備用N，N-二甲基甲醯胺二甲基乙縮醛(8.2ml，61.73mmol)處理β-D-2′-C-甲基-胞苷(3)(1.65g，6.43mmol)在DMF(32ml)中的溶液，室溫下攪拌約1.5小時。溶液在減壓下與乙醇共蒸發。從乙醇/乙醚中結晶，產生迄今未知的化合物(4)(第一產物，1.21g，60％產率，第二產物，輕微不純，0.46g，23％產率)，為結晶狀。
以下的物理-化學特性是由第一產物的結晶體獲得。F＝201-209℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.62(s，1H，N＝CH)，8.17(d，1H，H-6，J5-6＝7.3Hz)，5.91(m，2H，H-1′，H-5)，5.16(t，1H，OH-5′，D2O可交換)，5.06(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，3.8-3.5(m，4H，H-3′，H-4′，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，6H，N(CH3)2)，0.92(s，3H，CH3)；FAB＞0(GT)625(2M+H)+，313(M+H)+，167(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z419(M+T-H)-，403(M+G-H)-，311(M-H)-，165(B)-；室溫下進行HPLC 5.96分鐘(從0到50％的CH3N在20mM醋酸三乙胺中的緩衝液，程序為30分鐘，流速為1ml/min)，λmax＝316.1nm。
實施例14N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-5′-O-叔丁基二苯基甲矽烷基-β-D 2′-C-甲基-胞苷(5)的製備向化合物(4)(1.167g，3.73mmol)在幹吡啶(15ml)的溶液中，持續加入咪唑(760mg，11.19mmol)和叔丁基二苯基氯矽烷(0.66ml，2.53mmol)。室溫下攪拌溶液。4小時後，反應混合物中補入叔丁基二苯基氯矽烷(0.40ml，2.28mmol)並在室溫下攪拌2小時。接著用碳酸氫鈉萃取，水洗有基層，硫酸鈉乾燥，減壓下蒸發。將粗混合物與幹乙腈(30ml)和幹二甲基甲醯胺(15ml)混合。
實施例15N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-5′-O-叔丁基二苯基甲矽烷基-β-D 2′-C-甲基-胞苷的3′-O-L-N-(叔丁氧羰基)纈氨酸酯(6)的製備向前步得到的化合物(5)中持續加入N-(叔丁氧羰基)-L-纈氨酸(Boc-Val-OH，400mg，1.87mmol)，N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二醯亞胺氯化氫(DEC，715mg，3.73mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，68mg，0.56mmol)，室溫下攪拌所得混合物。反應過程由HPLC監視。反應混合物中補入3次Boc-Val-OH(400mg×3)，DEC(715mg×3)和DMAP(68mg×3)，最後再補入一次Boc-Val-OH(200mg)，DEC(357mg)和DMAP(34mg)。兩天後，起始物質全部消耗，減壓下除去DMF。殘餘物化合物(6)加入到幹乙醇(70ml)中。
實施例16β-D-2′-C-甲基-胞苷(7)的3′-O-L-N-(叔丁氧羰基)纈氨酸酯(6)的製備向含殘餘物化合物(6)的幹乙醇(70ml)中加入氟化胺(1.38g，37.30mmol)，回流混合物3小時。過濾混合物並減壓除去溶劑。將殘餘物加入乙酸乙酯並用水萃取幾次。真空蒸發有機相，在矽膠色譜柱上純化(洗提液MeOH(20％)EtOAc(80％))。分離出期望的化合物(7)(1.37g，3步的產率為78％)，為白色泡沫。
物理-化學數據包括1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.99(d，1H，H-6，J6-5＝7.42Hz)，7.3-7.1(m，3H，CH和NH2，D2O可交換)，5.9(s，1H，H-1′)，5.75(d，1H，H-5，J6-5＝7.43Hz)，5.43(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，5.24(t，1H，OH-5′)，5.04(d，1H，H-3′，J3′-4′＝9.1Hz)，4.1-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.4(2m，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.0(m，1H，CH)，1.40(s，9H，(CH3)3C)，1.0(s，3H，CH3)，0.9-0.8(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B-；FAB＞0(GT)913(2M+H)+，457(M+H)+，112(B+2H)+，57(CH3)3C)+；FAB＜0(GT)911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B)-。
實施例17β-D 2′-C-甲基-胞苷(二鹽酸鹽，(8)的3′-O-L-纈氨酸酯的製備用20％HCl/乙酸乙酯溶液(75ml)處理化合物(7)(1.32g，2.9mmol)在幹乙酸乙酯(75ml)中的溶液。室溫下攪拌反應混合物2小時。標題化合物(8)從反應混合物中沉澱出，過濾並用Et2O(1.01g，81％產率)洗。物理-化學數據包括F＝210℃(發褐)，234-241℃(熔融)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.0(s，1H，1/2NH2，D2O可交換)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交換)，8.42(d，1H，H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′＝8.8Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m，1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+，357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+Gl)-，391(M+Cl)-，355(M-H)-，116(Val)-，110(B)-，35(Cl)-；HPLC rt＝7.26min(從0到50％的CH3N在20mM醋酸三乙胺中的緩衝液，程序為30分鐘，流速為1ml/min)，λmax＝273.5nm；UV(H2O)λmax＝271nm(ε7500)，λmin＝249nm(ε5200)，λs＝234nm(ε6200)。
實施例18β-D-2′-C-甲基-胞苷的合成(圖6)製備β-D-2′-C-甲基-胞苷的另一合成路線見圖3。在該方法中，加熱尿嘧啶(2.1eq.)和BSA(1.1mL/mmol)在乙腈(7mL/mmol)中的混合物至回流約30分鐘。所得溶液用1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1)的乙腈(7mL/mmol)溶液以及SnCl4(3.5eq.)的溶液處理。所得溶液加熱至回流約4小時。反應物的深色混合物用乙酸乙酯(2.5甲苯體積)稀釋，並用與乙酸乙酯等體積的冷NaHCO3飽和溶液在室溫下處理。通過寅式鹽(celite)過濾全部的混合物，用乙酸乙酯洗固體材料。從濾液分離出有機層，用水及鹽水洗，用Na2SO4乾燥，減壓下蒸發。通過使用50％乙酸乙酯的己烷溶液的矽膠柱色譜得到產率為65％的化合物(9)，β-D-2′-，3′-，5′-苯甲醯-2′-C-甲基-尿苷，為白色固體。
通過使(9)溶解在以MeONa(3.3eq.)處理的甲醇(12.5ml/mmol)中並在室溫下攪拌所得黃色溶液約4.5小時，將苯甲醯保護基從β-D-2′-，3′-，5′-苯甲醯-2′-C-甲基-尿苷(9)上除去。加入預先用甲醇洗過的Dowex H+50wX4使溶液中和。過濾混合物，用熱的甲醇萃取樹脂幾次。合併濾液並在減壓下蒸發。殘渣加入水中，用二氯甲烷洗3次。水層減壓下蒸發。從水中結晶生成(10)，β-D-2′-C-甲基-尿苷，產率87％。
然後，由β-D-2′-C-甲基-尿苷(10)、1-甲基吡咯烷(1ml/mmol)、氯代三甲基矽烷的(3eq.)的乙腈(10ml/mmol)溶液組成的溶液在室溫下攪拌約3.5小時。將溶液冷卻到0℃，用三氟乙酸酐(3eq.)處理，在相同溫度下攪拌30分鐘。加入4-硝基苯酚(3eq.)，攪拌溶液約3小時。向溶液中加入水結束反應，減壓下蒸發溶劑。將殘渣加入二氯甲烷，用飽和NaHCO3溶液和水洗。減壓下蒸發有機層。將粗殘渣加入二噁烷(25ml/mmol)，並用28％NH4OH(5ml/mmol)水溶液處理。溶液加熱到50℃過夜。然後，減壓蒸發溶劑，使用梯度甲醇(5-20％，在二氯甲烷中)的色譜分離。產生了β-D-2′-C-甲基-胞苷(11)作為期望的產物，產率75％。產物進一步在EtOH中結晶。
實施例5和6中的試劑來源包括N，N-二甲基甲醯胺二甲基乙縮醛，購自Fluka，編號No.40271；N，N-二甲基甲醯胺，過分子篩，購自Fluka，編號No.40248；純乙醇，購自Carlo Erba ACS，分析用，編號No.414607；二乙醚購自Merck，編號No.1.00921.5000；叔丁基二苯基氯矽烷，購自Avocado，編號No.12721；咪唑，購自Fluka，編號No.56750；吡啶，過分子篩，購自Fluka，編號82704；碳酸氫鈉，購自Fluka，編號No.71628；無水硫酸鈉，購自Fluka，編號No.71960；乙腈，過分子篩，購自Fluka，編號No.00695；N，N-二甲基甲醯胺，過分子篩，購自Fluka，編號No.40248；N-(叔丁氧羰基)-L-纈氨，購自Aldrich，編號No.35,972-6；4-二甲基氨基吡啶，購自Aldrich，編號No.10,770-0；N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二醯亞胺氯化氫，購自Aldrich，編號No.16,146-2；氟化胺，購自Fluka，編號No.09742；經鈉蒸餾的甲醇；經過五氧化二磷無水氯化氫蒸餾的乙酸乙酯，購自Praxair，編號No.1741100；以及二乙醚，購自Merok，編號No.1.00921.5000。
以上僅是對本發明進行了示例性說明，並不限於公開的方法和反應條件。對於本領域技術人員而言顯而易見到各種變化均包括在本發明權利要求所定義的範圍和精神之內。
權利要求
1.製備3′-O-胺基酸酯核苷的方法，包括以下步驟(a)使任選保護的、任選取代的呋喃核糖與未保護的核苷鹼基和甲矽烷化試劑在路易斯酸存在下偶聯，形成任選保護的核苷；(b)如需要，任選使步驟(a)中的保護的核苷與脫保護試劑反應，提供未保護的核苷；(c)如果核苷有胺基，任選使保護的或未保護的核苷的胺基與胺保護試劑反應；(d)任選使保護的或未保護的核苷與甲矽烷化試劑反應，得到5′-O-甲矽烷基保護的核苷；(e)任選使保護的或未保護的核苷與保護的胺基酸衍生物在一種或多種偶聯劑下反應，形成保護的3′-O-胺基酸酯；(f)如果需要，任選使步驟(e)中的產物與從5′-C除去甲矽烷基保護基和從核苷胺除去甲脒保護基的試劑反應；和(g)任選使步驟(f)中的產物與從3′-O-胺基酸酯除去保護基的試劑反應，產生取代的或未取代的3′-O-酯-取代的核苷。
2.權利要求1的方法，其中，步驟(a)中的任選保護的呋喃核糖在2′-C位包含甲基。
3.權利要求1的方法，其中，步驟(a)中的路易斯酸選自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl4、FeCl3和SnCl2組成的組。
4.權利要求3的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
5.權利要求1的方法，其中，步驟(a)中的甲矽烷化試劑選自由BSA、HMDS、TMSC1和TBDPSC1組成的組。
6.權利要求5的方法，其中，甲矽烷化試劑是BSA。
7.權利要求1的方法，其中，步驟(a)中的偶聯反應在乙腈溶劑中進行。
8.權利要求1的方法，其中，步驟(b)中的脫保護試劑是NaOMe或NH3。
9.權利要求1的方法，其中，步驟(c)中的胺保護試劑選自由N，N-二甲基甲醯胺二甲基乙縮醛和N-1，1-二甲基硫代亞甲基胺組成的組。
10.權利要求9的方法，其中，胺保護試劑是N，N-二甲基甲醯胺二甲基乙縮醛。
11.權利要求1的方法，其中，步驟(d)中的甲矽烷化試劑選自由TBDPSC1、TMSC1、和TBDMSC1組成的組。
12.權利要求11的方法，其中，甲矽烷化試劑是TBDPSC1。
13.權利要求1的方法，其中，步驟(e)的胺基酸衍生物是纈氨酸衍生物。
14.權利要求1的方法，其中，步驟(e)的胺基酸保護基選自BOC、-(C＝O)-芳烷基、-(C＝O)-烷基或-(C＝O)-芳基。
15.權利要求14的方法，其中，胺基酸保護基是BOC。
16.權利要求1的方法，其中，步驟(e)中的偶聯劑之一是EDC。
17.權利要求1的方法，其中，步驟(f)中的甲矽烷基-除去試劑是NH4F。
18.權利要求1的方法，其中，步驟(g)中的3′-O-胺基酸酯保護基除去試劑是HCl。
19.製備核苷的方法，包括以下步驟(a)使1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶在BSA和SnCl4存在下偶聯，形成4-氨基-1-(3，4-二苯甲醯氧基甲基-5-苯甲醯氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮；(b)使由步驟(a)中得到4-氨基-1-(3，4-二苯甲醯氧基甲基-5-苯甲醯氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮與甲醇鈉反應，除去苯甲醯保護基，得到4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮；(c)使由步驟(b)中得到的4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮與N，N-二甲基甲醯胺二甲基乙縮醛反應，保護N4-氨基，產生N-[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒；(d)使由步驟b)或c)中得到的核苷與甲矽烷化試劑TBDPSC1反應，得到N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲脒；(e)使N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒與N-BOC-L-纈氨酸和EDC在二氯甲烷中反應，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯；(f)通過回流化合物與NH4F，除去步驟(e)中的2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-矽烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯的甲矽烷基保護基和甲脒基；形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，以及(g)通過使步驟(f)中的2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯與HCl反應，從3′-O-纈氨酸酯取代基上除去BOC-保護基，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(二鹽酸鹽)。
20.製備呋喃糖的方法，包括以下步驟(a)使CaO溶液與環醚反應，該環醚在與環上氧原子鄰接的碳上具有羥基和CH2OH，從而形成呋喃基內酯；(b)如果需要，用保護基任選保護呋喃基內酯；(c)使任選保護的呋喃基內酯與還原劑反應，將內酯還原為羥基，產生呋喃糖產物化合物；以及(d)任選使呋喃糖產物化合物與保護基反應。
21.權利要求20的方法，其中，與CaO反應的環醚是D-果糖。
22.權利要求20的方法，其中，呋喃基內酯是2-C-甲基-D-核糖酸-內酯。
23.權利要求20的方法，其中，保護的呋喃基內酯是2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸-內酯。
24.權利要求20的方法，其中，呋喃糖是2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
25.權利要求20的方法，其中，保護的呋喃糖是1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
26.權利要求20的方法，其中，保護基選自由甲矽烷基、苯甲醯基、p-甲苯醯基、p-硝基苯甲醯基、p-氯苯甲醯基、醯基、乙醯基、-(C＝O)-烷基和-(C＝O)-芳基組成的組，任選被一個或多個不受步驟(c)中還原劑影響的基團取代。
27.權利要求26的方法，其中，保護基是苯甲醯基。
28.權利要求26的方法，其中，保護基是-(C＝O)-烷基。
29.權利要求20的方法，其中，還原劑選自由Red-Al/乙醇、NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氫催化劑和LiAI(OtBu)3H組成的組。
30.權利要求29的方法，其中，還原劑是Red-Al/乙醇。
31.權利要求20的方法，其中，反應在溶劑中進行，該溶劑選自由TEA、DMAP、DME、甲苯和乙醇組成的組。
32.權利要求20的方法，其中，對於第一產物化合物內酯，反應溫度在約-5℃到約50℃間變動。
33.權利要求20的方法，其中，總的合成時間是從約5天到約14天。
34.權利要求33的方法，其中，總的合成時間是從約5天到約10天。
35.權利要求33的方法，其中，總的合成時間是約60小時。
36.一方法，包括以下步驟(a)使CaO溶液與D-果糖在溫度約23℃到約40℃下反應約5小時到約25小時；(b)使步驟(a)中的產物與CO2和草酸反應約8小時到約12小時，形成2-C-甲基-D-核糖酸內酯；(c)使2-C-甲基-D-核糖酸內酯與苯甲醯氯反應約3小時到約6小時，得到2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸內酯；(d)在約5℃到約0℃下，用Red-Al/乙醇還原2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-D-核糖酸內酯約30到約60分鐘，得到2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖；(e)在約0℃到約50℃下，在溶劑中苯甲醯化2，3，5-三-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖約4小時到約14小時，形成1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖；以及(f)任選分離1，2，3，5-四-O-苯甲醯-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
37.權利要求36的方法，其中，步驟(a)中的反應時間是從約6到約22小時。
38.權利要求36的方法，其中，步驟(a)中的反應溫度是從約23到約40℃。
39.權利要求36的方法，其中，步驟(c)中的溶劑是DME。
40.權利要求36的方法，其中，步驟(c)中的反應進行約4小時。
41.權利要求36的方法，其中，步驟(d)中的還原進行約40分鐘。
42.權利要求36的方法，其中，步驟(d)中的溶劑包括甲苯。
43.權利要求36的方法，其中，步驟(e)中的溶劑包括DME。
44.權利要求36的方法，其中，步驟(e)中的溫度是從約5到約50℃，反應進行約4到約12小時。
45.權利要求36的方法，其中，步驟(f)中的分離是通過現有技術中已知的方法進行。
46.權利要求1的方法，其中，苯甲醯保護的、任選取代的呋喃核糖是通過權利要求20的方法製備的。
47.權利要求1的方法，其中，苯甲醯保護的、任選取代的呋喃核糖是通過權利要求36的方法製備的。
48.製備呋喃基內酯的方法，包括(a)使CaO溶液與環醚反應，該環醚在與環上氧原子鄰接的碳上具有羥基和CH2OH，形成呋喃基內酯。
49.製備2-C-甲基-D-核糖酸內酯的方法，包括以下步驟(a)在溫度為約23℃到約40℃下，使CaO溶液與D-果糖反應約5小時到約25小時；(b)使步驟(a)的產物與CO2和草酸反應約8小時到約12小時，形成2-C-甲基-D-核糖酸內酯。
50.製備任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖化合物的方法，包括(a)用Red-Al/乙醇還原任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸內酯，得到任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
51.製備任選保護的核苷的方法，包括(a)使任選保護的、任選取代的呋喃核糖與未保護的核苷鹼基和甲矽烷化試劑在路易斯酸存在下偶聯，形成任選保護的核苷。
52.製備任選保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷的方法，包括以下步驟(a)使任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶在BSA和SnCl4存在下偶聯，形成任選保護的β-D-2′-C-甲基-胞苷。
53.製備2′-C-甲基-胞苷的方法，包括以下步驟(a)使胞嘧啶與活化劑、任選在路易斯酸存在下與任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖反應，形成任選保護的2′-C-甲基-胞苷 其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或適當的氧保護基；然後，(b)如需要，任選脫去前步反應中的的任選保護的2′-C-甲基-胞苷的保護，形成2′-C-甲基-胞苷(VI)。
54.權利要求53的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或醯基。
55.權利要求53的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或苯甲醯基。
56.權利要求53的方法，其中，活化劑是甲矽烷化試劑。
57.權利要求56的方法，其中，甲矽烷化試劑是BSA、HMDS、TMSC1或TBDPSC1。
58.權利要求56的方法，其中，甲矽烷化試劑是BSA。
59.權利要求53的方法，其中，反應步驟(a)在路易斯酸下完成，路易斯酸選自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3和SnCl2組成的組，或它們的任意混合物。
60.權利要求53的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
61.權利要求53的方法，其中，該方法進一步包括用酯部分對2′-C-甲基-胞苷的3′-位進行酯化的步驟。
62.權利要求61的方法，其中，酯部分為胺基酸。
63.權利要求62的方法，其中，胺基酸是L-纈氨酸。
64.製備任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的方法，包括以下步驟(a)使任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸內酯與還原劑反應 其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基；然後，(b)選擇性地保護前步反應中的呋喃核糖衍生化合物，形成任選保護的-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨立地為氫或適當的氧保護基。
65.權利要求64的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或醯基。
66.權利要求64的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或苯甲醯基。
67.權利要求64的方法，其中，還原劑是二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑中。
68.權利要求67的方法，其中，溶劑是乙醇。
69.製備任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸內酯的方法，包括以下步驟(a)使D-果糖與CaO反應； 然後，(b)任選保護內酯，形成任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸內酯 其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基。
70.權利要求69的方法，其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或醯基。
71.權利要求69的方法，其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或苯甲醯基。
72.權利要求69的方法，其中，利用沉澱劑來除去在步驟(a)中產生的鈣。
73.權利要求72的方法，其中，沉澱劑是比核糖酸強的有機酸。
74.權利要求73的方法，其中，有機酸選自由草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、馬來酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸組成的組。
75.權利要求73的方法，其中，有機酸是草酸。
76.從D-果糖製備任選保護的2′-C-甲基-D-胞苷的方法，包括以下步驟(a)使D-果糖與CaO反應得到2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內酯； (b)如果需要，任選保護內酯，形成任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸內酯； 其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基；(c)使任選保護的2-C-甲基-D-核糖酸內酯與還原劑反應， 其中，各P1、P2和P3獨立地為氫或適當的氧保護基；(d)如果需要，任選保護前步反應中的呋喃核糖衍生化合物，形成任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨立地為氫或適當的氧保護基；(e)使任選保護的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶和活化劑任選在路易斯酸存在下反應，形成任選保護的2′-C-甲基胞苷 其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或適當的氧保護基；然後，(f)如果需要，任選脫去任選保護的2′-C-甲基胞苷的保護，形成任選保護的2′-C-甲基胞苷
77.權利要求76的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或醯基。
78.權利要求76的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨立地為氫或苯甲醯基。
79.權利要求76的方法，其中，活化劑是甲矽烷化試劑。
80.權利要求79的方法，其中，甲矽烷化試劑是BSA、HMDS、TMSC1或TBDPSC1。
81.權利要求79的方法，其中，甲矽烷化試劑是BSA。
82.權利要求76的方法，其中，反應步驟(e)在路易斯酸下完成，路易斯酸選自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3和SnCl2組成的組，或它們的任意混合物。
83.權利要求82的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
84.權利要求76的方法，其中，還原劑是二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑中。
85.權利要求84的方法，其中，溶劑是乙醇。
86.權利要求76的方法，其中，該方法進一步包括用酯部分對2′-C-甲基-胞苷的3′-位進行酯化的步驟。
87.權利要求86的方法，其中，酯部分為胺基酸。
88.權利要求87的方法，其中，胺基酸L-纈氨酸。
全文摘要
本發明提供製備β－D和β－L 2』－C－甲基－核苷和2』－C－甲基－3』－O－酯核苷的改進方法。
文檔編號C07H19/00GK1744903SQ200380109576
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月12日 優先權日2002年12月12日
發明者理察·斯託勒, 阿德爾·穆薩, 納拉揚·喬杜裡, 弗蘭克·瓦利戈拉 申請人:埃迪尼克斯(開曼)有限公司