一種靈芝漆酶的清潔高效生產方法
2023-12-01 06:43:16 1
專利名稱：一種靈芝漆酶的清潔高效生產方法
技術領域：
本發明涉及一種工業用酶製劑的製備方法，特別涉及工業用漆酶的製備方法，確切地說是一種靈芝漆酶的清潔高效生產方法。
背景技術：
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物發生氧化，同時伴隨有氧還原成水。漆酶廣泛存在於植物、細菌、昆蟲，特別是白腐真菌中。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物製漿、食品風味的改良、飼料營養的改善、紡織染料的降解與轉化、紡織纖維的柔化、新型藥物開發、新型生物傳感器的研製及新型能源開發等領域具有重要(潛在)應用價值[洪宇植等(2005)生物工程學報21547-552；Xiao YZ et al(2006)Appl Microbiol Biotechnol 71493-501]，近年來成為國際酶工程學和環境科學交叉領域研究的一個熱點。
目前，真菌漆酶的生產大多在人工合成培養基中進行，需要芳香類化合物和(或)重金屬離子的誘導[Xiao YZ et al(2004)Mycologia 9626-35]。這些誘導物具有毒性，添加後使得發酵液後處理難度大、成本高，易造成環境汙染。多年來，國內外學者一直關注和致力於漆酶合成方法的探索，並取得了進展(如固態發酵和異源表達)。固態發酵技術能夠緩解酶生產的汙染問題，然而其發酵周期過長(一般超過20天)；漆酶基因在多個不同宿主中異源表達的產量也普遍低於野生菌[Hong YZ et al(2006)FEMS Microbiol Lett 25896-101]，這些限制了漆酶的產業化進程。
靈芝(Ganoderma)具有重要的藥用價值和保健功能，以往的研究主要圍繞這兩個功能展開，而關於靈芝漆酶的應用研究尚不多見。在國內，張曉昱等將平菇(Pleurotus sp.)與靈芝(Ganoderma sp.)混合培養進行固態發酵，漆酶酶活達到2,165U/g(ABTS法)[黃慧豔等(2004)中國食用菌2331-33]；王歲樓等將Ganoderma lucidum Karst No.1進行突變，突變株G301的最高漆酶產量為355U/L(愈創木酚法)[王歲樓等(2006)食品科學2753-57]。國際上也有關於靈芝漆酶的研究報導[Trevor M et al(1999)Appl Environ Microbiol 655307-5313]，較為突出的是，Ganoderma adspersum液體發酵14天的漆酶產量達到34,000U/L(ABTS法)[songulashvili G et al(2006)Biotechnol Lett 281425-1429]。在這些研究中，漆酶的產量較低，難以達到商業化應用的需求。
發明內容
鑑於已有技術存在的不足，本發明旨在提供一種高效、環保、廉價地生產真菌漆酶的方法，所要解決的技術問題是選擇優良的真菌菌株為材料在環保、廉價的培養基中高效地發酵生產靈芝漆酶。
所述的優良菌株為真菌菌株樹舌靈芝ST(Ganoderma applanatum ST)，由申請人自主選育。
所述的環保、廉價的培養基是用天然農副產品配製得到的液體培養基。
本生產方法包括培養基配製、種液製備、滅菌、接種、發酵、酶分離和後處理，其特徵在於將樹舌靈芝ST種液接種在發酵培養基中於22～35℃培養3～8天，最後分離得到工業用漆酶製劑。發酵培養基有以下組分和重量百分數玉米粉0.1％～5％，糧食麩皮1％～7％，花生餅粉1％～7％，餘量為自來水，培養基pH3～8。
優選的發酵培養基為玉米粉0.2％～3％、糧食麩皮2％～5％、花生餅粉2％～5％、餘量為自來水，培養基pH3～8。
所述的糧食麩皮選自麥麩皮、大米皮糠等，可單獨使用，也可混合使用，優選麥麩皮。
進一步優選的發酵培養基為玉米粉0.7％，麥麩皮3％，花生餅粉3％，餘量為自來水，培養基pH5～6。
所述的種液製備就是將樹舌靈芝ST接種在上述培養基中於22～35℃、100～200r/min培養3～6天，然後將種液按1～15％(體積分數)接種量接入同樣的培養基中繼續發酵培養製備漆酶。
分離得到的漆酶製劑或凍幹貯藏，或經稀釋後直接應用於食品、飲料、紡織印染、汙水處理等工業領域。但若應用於生物傳感器等高技術領域則需進一步純化製備純漆酶製劑。
所述的純化在低溫下進行，將粗酶製劑經離心分離、超濾濃縮、透析和柱層析處理製備純漆酶製劑。
本發明在漆酶生產過程中使用的菌株為靈芝(具有保健功能)，所用的培養基成分為常見的農副產品，其發酵廢渣可用作高蛋白類飼料。本發明發酵獲得的漆酶活力在9,000U/L以上(愈創木酚法)，目前該產量處於漆酶液態發酵生產法的國際領先水平。與其它研究相比，本發明生產漆酶具有以下優點(1)培養基組分簡單、廉價且來源廣泛；(2)酶合成無需毒性物質誘導，發酵產物可循環利用，後加工處理簡便，基本無環境汙染；(3)酶產率高、發酵周期短，適於工業化生產。
申請人自主選育的樹舌靈芝ST(Ganoderma applanatum ST)已於2006年09月18日送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM206100。
四.
具體實施例方式
1、發酵培養基的製備玉米、麩皮和花生餅用粉碎機粉磨成粉末，過60～200目篩後使用效果更佳。
(1)取玉米粉0.2份、糧食麩皮2份、花生餅粉2份，自來水95.8份，檸檬酸調pH4，121℃滅菌30～50min，備用。
(2)取玉米粉3份、糧食麩皮5份、花生餅粉5份，自來水87份，檸檬酸調pH5，121℃滅菌30～50min，備用。
(3)取玉米粉0.2份、麥麩皮5份、花生餅粉5份，自來水89.8份，檸檬酸調pH5，121℃滅菌30～50min，備用。
(4)取玉米粉3份、大米皮糠2份，花生餅粉2份，自來水93份，氨水調pH8，121℃滅菌30～50min，備用。
(5)取玉米粉0.3份、麥麩皮3份、大米皮糠1份，花生餅粉3份，自來水92.7份，氨水調pH8，121℃滅菌30～50min備用。
(6)取玉米粉2份、大米皮糠2份，麥麩皮1份，花生餅粉4份，自來水91份(自然pH)，121℃滅菌30～50min備用。
(7)取玉米粉0.7份、麥麩皮3份，花生餅粉3份，自來水93.3份(自然pH)，121℃滅菌30～50min備用。
2、樹舌靈芝ST種液的製備在土豆培養基(1L培養基20％土豆汁、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、0.4g維生素B，加1.5％瓊脂製成固體培養基)斜面上4℃保存的樹舌靈芝ST接種於已高溫滅菌的上述(1)～(7)的任一發酵培養基中，22～35℃、100～200r/min培養3～6天，即製成種液。
3、接種與發酵培養將製備的樹舌靈芝ST種液按1～15％體積分數接種於已滅菌的上述(1)～(7)的任一發酵培養基中，100～200r/min、22～35℃培養3～8天至產酶高峰。以愈創木酚為底物測定漆酶活力的方法參照文獻[洪宇植等(2005)生物工程學報21547-552]。
4、酶分離與純化在漆酶活力達到高峰時，發酵液經過濾去除菌體和廢渣，濾液即是漆酶粗製劑。濾液或者冷凍乾燥後貯藏備用，或者加水適當稀釋後直接用於食品飲料業、紙漿漂白、工業染料脫色(特別是紡織染料)、紡織纖維軟化、飼料加工等領域。
粗酶製劑依次按下述步驟可獲得純酶，所有操作在4～10℃進行①6,000g離心10min，上清液超濾濃縮10～50倍；②上清液在2mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩衝液(pH8.0)透析3～6小時，然後10,000g離心10min；③上清液上預先用透析液平衡的DEAE-SepharoseFF離子交換柱，並用0～0.3mol/L的硫酸銨進行梯度洗脫，活性組分脫鹽後用滅菌水(或去離子水)稀釋，即可獲得純酶製劑(純酶製劑除了可用於上述粗酶的應用領域外，還能用於生物傳感器等研究)。
5、發酵後處理由於菌株和培養基對人畜均安全，且過濾出的菌體和廢渣含有豐富的營養成分，因此可用作飼料。
6、具體操作例(1)、玉米、麥麩和豆餅粉碎後過60目篩，按玉米粉0.7％，麥麩皮3％，花生餅粉3％的比例配比，餘量為自來水(自然pH5～6)，配製後於121℃滅菌40min，製成發酵培養基。
(2)、從樹舌靈芝ST的保藏斜面挑取兩塊約1cm2的菌絲塊，接種到裝有150mL發酵培養基的500mL三角瓶中，130r/min、28℃培養4天至漆酶活力達到700～1500U/L，製成種液。按8％的體積分數將種液接種到350mL新鮮的發酵培養基(1L三角瓶)中，繼續培養5天，酶活在9,000U/L(愈創木酚法)以上。
(3)、發酵液用八層紗布過濾去除菌體和廢渣，濾液即是粗漆酶製劑。濾液經超濾濃縮凍幹以便貯存，或加水稀釋直接用於食品飲料業、紙漿漂白、染料脫色、汙水處理、纖維軟化、飼料加工、酒精生產等。若需進一步純化得到純漆酶製劑，按「4、酶分離與純化」中所述的純化步驟進行處理。菌體和廢渣用作飼料。
權利要求
1.一種靈芝漆酶的清潔高效生產方法，以樹舌靈芝ST為出發菌株，包括培養基配製、種液製備、滅菌、接種、發酵、酶分離和後處理，其特徵在於將樹舌靈芝菌株接種在發酵培養基中於22～35℃培養3～6天製備種液，然後將該種液接種到同樣的發酵培養基中於22～35℃繼續培養3～8天，最後分離得到漆酶製劑；所述的發酵培養基有以下組分和重量百分數玉米粉0.1％～5％、糧食麩皮1％～7％、花生餅粉1％～7％，水餘量，pH3～8。
2.根據權利要求1所述的生產方法，其特徵在於發酵培養基各組分重量百分數為玉米粉0.2％～3％、糧食麩皮2％～5％、花生餅粉2％～5％，水餘量，pH3～8。
3.根據權利要求1或2所述的生產方法，其特徵在於發酵培養基各組分重量百分數為玉米粉0.7、麥麩皮3％、花生餅粉3％，水餘量，pH5～6。
4.根據權利要求3所述的生產方法，其特徵在於玉米粉、糧食麩皮、花生餅粉細度過60～200目篩。
全文摘要
一種靈芝漆酶的清潔高效生產方法，以申請人自主選育的樹舌靈芝ST為出發菌株，將其先接種在發酵培養基中製備種液，再將種液接種到同樣的發酵培養基中於22～35℃培養3～8天，分離後得到漆酶製劑。發酵培養基由0.1～5％的玉米粉，1～7％的糧食麩皮、1～7％的花生餅粉和餘量水組成。本方法生產的漆酶活力在9000U/L以上(愈創木酚法)，該產量處於漆酶液態發酵生產法的國際領先水平。培養基為農副產品，無毒、廉價、無汙染。本方法工藝簡單、周期短、產率高，適於工業化生產。
文檔編號C12N1/14GK1935992SQ200610096638
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者洪宇植, 肖亞中, 李妍妍, 王林, 房偉 申請人:安徽大學