特異性人EWS‑FLI1融合蛋白抗體的製備方法及在製備尤文肉瘤診斷抗體試劑的應用與流程

2023-12-01 09:03:01 2

本發明專利涉及一種人類融合蛋白的抗體製備及應用方法。具體涉及到一種特異性人ews-fli1融合蛋白抗體的製備方法及其在製備惡性腫瘤--尤文肉瘤診斷抗體試劑中的應用。本方法製備的抗體，只對人ews與fli1蛋白融合後的人ews-fli1融合蛋白有特異反應，對人ews或fli1蛋白無反應。

技術背景

尤文肉瘤是一種高度惡性骨腫瘤，其發病率在兒童及青少年原發惡性骨腫瘤中僅次於骨肉瘤。尤文肉瘤根治術後較高的復發與轉移率已成為制約尤文肉瘤（ewing'ssarcoma）療效提高的關鍵性障礙。目前發現，尤文肉瘤具有特異的染色體易位t（11；22）（q24；q12），重排的22號染色體上ews基因的3』端與fli1基因的5』端相結合，產生一個新的融合基因，編碼的融合蛋白ews-fli1誘導一系列基因的異常表達導致了尤文肉瘤的發生和發展。95%的尤文肉瘤家族具有特異的融合蛋白ews-fli1，此蛋白是尤文肉瘤發生、發展的關鍵，同時也是治療尤文肉瘤理想的特異性靶點。實驗證實ews-fli1基因修飾的樹突狀細胞對尤文肉瘤細胞具有特異性殺傷作用，提示ews-fli1可能是ews細胞的特異性抗原成分。

ews-fli1融合蛋白是由ews的氨基末端和fli1的羧基末端組合而成，作為調節異常的轉錄因子ews-fli1發揮著強大的致癌基因作用。除了ews氨基末端的反式激活結構域之外，富含脯胺酸結構域的fli1羧基末端能顯著增強ews-fli1融合蛋白的轉錄活性（rekhib,etal.jpostgradmed,2010,56(3):201-205.）。然而目前對於ews-fli1融合蛋白的非轉錄功能還缺乏研究。研究表明，ews-fli1的致癌過程是與dna結合而非依賴的方式來實現的，因為在尤文肉瘤細胞中發現ews-fli1與dna結合併不能增加前者的致癌潛能。另外有研究發現，ews-fli1還能結合靶基因啟動子的ggaa衛星重複序列（ggaa-microsatelliterepeatsequences），cav1和gstm4參與ews-fli1介導的腫瘤形成，進一步證實在尤文肉瘤的腫瘤形成過程中，ews-fli1的轉錄活性是通過衛星重複序列來完成的。ews-fli1融合蛋白有多種類型（type），其中兩種佔絕大多數。其中最普通的類型為型1（ews-fli1type1），約佔60%。與其它的融合類型相比，ews-fli1型1編碼功能較弱的反式激活因子，對預後有利。其次是型2（ews-fli1type2），約佔25%，編碼功能較強的反式激活因子，對預後不利。

融合基因是指將兩個或多個基因的編碼區首尾相連．置於同一套調控序列（包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等）控制之下，構成的嵌合基因，融合基因的表達產物為融合蛋白。融合基因大部分在腫瘤中被發現，並在腫瘤診斷中佔有重要的意義。比如早期發現的bcr-abl融合基因在白血病分型中就極為重要。目前，融合基因的檢測方法，主要通過在位雜交螢光(fish)，反轉錄pcr（rt-pcr）等方法。這些方法主要基於分子生物學法，無法檢測表達產物即融合蛋白。而在生物體內，正是其表達產物即融合蛋白在起著生物學效應。本發明基於免疫學方法，可以對表達產物，即融合後的蛋白進行準確地鑑定，可以定性或定量，特異性好，與未融合的蛋白無反應，可以為尤文肉瘤的科研、診斷與治療提供新的工具。

對於普通的人ews或fli1蛋白的抗體，現有技術中已有標準的生產程序，但是，所生產的這些抗體只能識別未融合前的人ews或fli1蛋白，或者只能在識別融合前的ews或fli1蛋白的眾多異構體的同時，附帶識別ews-fli1融合蛋白，造成檢測結果不可靠，非特異性極高。在報導中，ews至少有6種異構體，fli1至少4種異構體，ews-fli1融合蛋白至少有12種異構體。同時，因為無法準確識別ews-fli1融合蛋白的類型，就無法對臨床提供準確的預後的判斷。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種特異性人ews-fli1融合蛋白抗體的製備方法。本發明還將提供這種特異性人ews-fli1融合蛋白抗體在製備惡性腫瘤--尤文肉瘤診斷抗體中的應用。本發明針對融合蛋白的特定拼接方式，來進行多肽抗原設計，製備的抗體是針對融合後的人ews-fli1蛋白。目標抗體經過融合前ews或fli1蛋白序列的純化過濾後，可以達到只對ews-fli1融合蛋白有特異性，檢測中做到結果準確可靠，有利於診斷應用。具體可以通過免疫學檢測的手段，如酶聯免疫法（elisa）、免疫印跡法（wb）、免疫組化法（ihc）等方法將本發明抗體進行應用。本發明任務還包括，該製備方法能夠實現規模化工業生產。

完成上述發明任務的技術方案是一種特異性人ews-fli1融合蛋白抗體的製備方法，共提供兩種類型（ews-fli1type1與type2）的製備方法，步驟如下：

1）多肽設計：設計兩組多肽序列，每組三條，分別為：

組1：多肽1：cys-sssygqqnpsydsvr；多肽2：sssygqq-cys；多肽3：cys-psydsvr；

組2：多肽4：cys-sssygqqssllayn；多肽5同多肽2；多肽6：cys-ssllayn；

說明：

a)多肽1為15aa肽，對應人ews-fli1type1融合蛋白位置aa264-278。多肽序列選擇恰為人ews-fli1type1融合蛋白的拼接位置，其中sssygqq序列來自人ews，psydsvr序列來自人fli1，中間n為拼接位點。多肽序列在n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人ews-fli1type1融合蛋白信息如圖1所示。

b)多肽2為7aa肽，對應融合前人ews融合蛋白aa258-264，對應多肽1的n端序列，並在多肽2的c端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人ews蛋白信息如圖2所示。

c)多肽3為7aa肽，對應融合前人fli1融合蛋白aa220-226，對應多肽1的c端序列，並在多肽3的n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人fli1蛋白信息如圖3所示。

d)多肽4為14aa肽，對應人ews-fli1type2融合蛋白位置aa264-278。多肽序列選擇恰為人ews-fli1type2融合蛋白的拼接位置，其中sssygqq序列來自人ews，ssllayn序列來自人fli1。多肽序列在n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人ews-fli1type2融合蛋白信息如圖4所示。

e)多肽5序列同多肽2，對應多肽4的n端序列。

f)多肽6為7aa肽，對應融合前人fli1融合蛋白aa197-203，對應多肽4的c端序列，並在多肽6的n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人fli1蛋白信息如圖3所示。

g)其中多肽2與多肽3，多肽5與多肽6的cys（半胱氨酸）添加在多肽上的位置不同，以便於抗體純化。

2）多肽合成：多肽純度≥85%，分子量正確。通常在免疫實驗中，對多肽純度的要求可以降低至70%。

3）抗原製備：將多肽1、多肽4分別與klh偶聯，偶聯物作為抗原用於免疫動物。klh使用琥珀醯亞胺基4-[n-馬來醯亞胺甲基]環己烷-1-羧化物（smcc）雙功能偶聯劑預先活化成klh-smcc，通過cys（半胱氨酸）與多肽1相聯接。

4）免疫：選用紐西蘭兔，每隻兔子以300μg劑量進行基礎免疫，以後每隔21天進行一次加強免疫，在經過三次加強免疫後，再經7天，取血樣，對血清進行elisa檢測。收集經elisa檢測陽性的兔子血清。

5）抗體純化：

a.組1層析柱製備：多肽與膠的劑量按2mg：2mg，將多肽1、多肽2與多肽3分別偶聯在預先活化好的巰基瓊脂糖凝膠(sulfolink-gel)上，製備一組共三根親和層析柱。

b.組1純化：

血清按10：1體積比例加入1mtris·hclph7.5緩衝液調節ph值，再用0.45μm膜過濾。處理過血清再與多肽1偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時。用10mmpbsph7.4清洗層析柱後，再用100mm甘氨酸(glycine)ph2.8緩衝液洗脫，收集od280≥0.2部分洗脫液。收集液立即用1mtris·hclph7.5緩衝液調節ph。

將收集液與多肽2偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時，收集穿透液，此步驟可以重複1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。

再將經多肽2純化過的收集液與多肽3偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時，收集穿透液，此步驟可以重複1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全。

穿透液即含有純化組1目標抗體（ews-fli1type1抗體）。

c.組2的層析柱製備與純化的步驟與組1類似，不同的是多肽1，2，3對應換成多肽4，5，6，最後得到純化組2目標抗體（ews-fli1type2抗體）。

6）濃縮：將純化好的穿透液濃縮成特定濃度目標抗體濃液，通常1mg/ml以上。可根據各種應用的需要調製相應濃度。

7）抗體鑑定：製備的目標抗體經過酶聯免疫法（elisa）、斑點雜交法（dot-blot）法鑑定，證明組1目標抗體只對多肽1有特異反應，對其它多肽均無反應。組2目標抗體只對多肽4有特異反應，對其它多肽均無反應。檢測方法如下：

a.間接酶聯免疫法（elisa）：將所設計的多肽分別偶聯bsa的偶聯物同作為檢測抗原。以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。經間接elisa檢測，證明組1目標抗體只對多肽1有極強反應，對其它多肽均無反應。組2目標抗體只對多肽4有極強反應，對其它多肽均無反應。結果如圖5所示。

b．斑點雜交法（dot-blot）：將多肽與bsa的偶聯物作為檢測抗原。經dot-blot法檢測，證明組1目標抗體只對多肽1有極強反應，對其它多肽均無反應。組2目標抗體只對多肽4有極強反應，對其它多肽均無反應。結果如圖6所示。

本發明工藝流程圖如圖6所示。

完成本申請第二個發明目的的技術方案是，上述特異性人ews-fli1融合蛋白抗體在製備惡性腫瘤--尤文肉瘤診斷抗體試劑中的應用。具體方法是：

免疫；通常選用balb/c小鼠以10μg/只的劑量進行基礎免疫，以後每隔21天進行一次加強免疫，在經過三次加強免疫後，再經3天，取血樣，對血清進行elisa檢測。

細胞融合：取經elisa檢測陽性血清的小鼠，取小鼠脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞sp20進行融合，製備雜交瘤細胞。

選擇培養：將雜交瘤細胞用96孔板鋪板培養，再加選擇培養基進行選擇培養。

篩選克隆：對雜交瘤細胞進行篩選，使雜交瘤細胞克隆化，形成單克隆細胞株。

單克隆抗體的鑑定：

a.間接酶聯免疫法（elisa）：將所設計的多肽分別偶聯bsa，偶聯物作為檢測抗原。單克隆抗體採用間接elisa檢測，對多肽1有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type1目標抗體。對多肽4有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type2目標抗體。

b．斑點雜交法（dot-blot）：採用多肽與bsa的偶聯物作為檢測抗原。單克隆抗體經dot-blot法檢測，對多肽1有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type1目標抗體。對多肽4有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type2目標抗體。

本發明專利的方法可以應用於各種融合蛋白特異性抗體的製備。具體為依據本發明中的方法，選擇融合蛋白拼接位置左右兩端的序列進行多肽設計，再根據本發明中多肽合成，抗原製備，免疫，elisa檢測，收集血清步驟，再根據本發明中純化原理與方法，採用設計的多肽分別製備的層析柱進行親和層析，得到目標抗體。

本發明專利製備產生的抗體，採用但不限於以下多種免疫學檢測方法進行應用。結果可以用於定性或定量實驗，用於科研或診斷用途。

1)夾心酶聯免疫法（elisa）

採用本發明專利製備產生的抗體，再選取人ews-fli融合蛋白或ews蛋白或fli1蛋白抗體進行配對，形成一對夾心elisa抗體。可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織的裂解液，細胞培養液，患者血樣及體液等樣品進行夾心elisa檢測。

2)免疫印跡法（wb）

採用本發明專利製備產生的抗體，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織的裂解液，表達蛋白等樣品進行免疫印跡法（wb）檢測。

3)免疫組化法（ihc）

採用本發明專利製備產生的抗體，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織進行免疫組化法（ihc）檢測。

4)免疫沉澱法（ip）

採用本發明專利製備產生的抗體，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織，患者血樣及體液進行免疫沉澱法（ip）檢測。

5)免疫螢光法（if）

採用本發明專利製備產生的抗體，通過直接螢光標記，或通過螢光標記二抗法，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織，患者血樣及體液進行免疫螢光法（if）檢測。

6)流式細胞術（fcm）

採用本發明專利製備產生的抗體，通過流式細胞術（fcm），可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織，患者血樣及體液進行檢測。

在分子生物學檢測法中，因只能檢測融合基因而無法檢測具體發揮功能作用的ews-fli1融合蛋白，故無法對表達產物即融合蛋白表達與否及表達量進行分析，鑑定結果明顯有缺陷。本發明能克服與彌補這些缺陷。本發明還克服了現有技術生產方法所製備的人ews或fli1蛋白的抗體，只能識別未融合前的人ews或fli1蛋白，或者只能在識別ews或fli1蛋白的眾多異構體的同時，附帶識別ews-fli1融合蛋白，造成檢測結果不可靠，非特異性極高等不足；本發明專利製備的抗體，針對融合蛋白的特定拼接方式進行多肽抗原設計，製備的抗體是針對融合後的人ews-fli1蛋白。目標抗體經過融合前ews或fli1蛋白序列的純化過濾後，可以達到只對ews-fli1融合蛋白有特異性，檢測中做到結果準確可靠，有利於診斷應用。同時，本發明能夠進一步明確鑑定出ews-fli1融合蛋白的類型，給臨床預後提供了有力的依據。

表1為elisa檢測結果。

基於本發明目標抗體直接測定的是融合後的人ews-fli1蛋白，且具有高準確率與特異性的檢測結果的優勢，大大提高了應用的方便性與檢測速度。通常抗體診斷應用中，一次性得到檢測結果。比如在應用於患者細胞或組織的免疫印跡（wb）、免疫組化（ihc）或免疫螢光（if）檢測中體現尤其明顯，通過本發明抗體的檢測就可以一次性得到明確結果。這對於普通的人ews或fli1蛋白抗體的檢測是無法做到的。本發明的工藝步驟經過嚴格生產程序與鑑定程序的標準化，可以應用於規模化工業生產。

附圖說明

圖1為人ews-fli1type1蛋白信息；

圖2為人ews蛋白信息；

圖3為人fli1蛋白信息；

圖4為人ews-fli1type2蛋白信息

圖5為dot-blot檢測結果；

圖6為本發明工藝流程圖。

具體實施方式

本發明專利可以應用於單克隆抗體的製備，具體實施方式為：

實施例1，一種特異性人ews-fli1融合蛋白抗體的製備方法

a、提供兩種類型ews-fli1融合蛋白（type1與type2）的製備方法，步驟如下：

1)多肽設計：設計兩組多肽序列，每組共三條，分別為：

組1：多肽1：cys-sssygqqnpsydsvr；多肽2：sssygqq-cys；多肽3：cys-psydsvr；

組2：多肽4：cys-sssygqqssllayn；多肽5：同多肽2；多肽6：cys-ssllayn；

說明:

a.多肽1為15aa肽，對應人ews-fli1type1融合蛋白位置aa264-278。多肽序列選擇恰為人ews-fli1type1融合蛋白的拼接位置，其中sssygqq序列來自人ews，psydsvr序列來自人fli1，中間n為拼接位點。多肽序列在n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人ews-fli1type1融合蛋白信息如圖1所示。

b.多肽2為7aa肽，對應融合前人ews融合蛋白aa258-264，對應多肽1的n端序列，並在多肽2的c端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人ews蛋白信息如圖2所示。

c.多肽3為7aa肽，對應融合前人fli1融合蛋白aa220-226，對應多肽1的c端序列，並在多肽3的n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人fli1蛋白信息如圖3所示。

d.多肽4為14aa肽，對應人ews-fli1type2融合蛋白位置aa264-278。多肽序列選擇恰為人ews-fli1type2融合蛋白的拼接位置，其中sssygqq序列來自人ews，ssllayn序列來自人fli1。多肽序列在n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人ews-fli1type2融合蛋白信息如圖4所示。

e.多肽5序列同多肽2，對應多肽4的n端序列。

f.多肽6為7aa肽，對應融合前人fli1融合蛋白aa197-203，對應多肽4的c端序列，並在多肽6的n端人為添加一個cys（半胱氨酸）用於抗原偶聯。人fli1蛋白信息如圖3所示。

g.其中多肽2與多肽3，多肽5與多肽6的cys（半胱氨酸）添加在多肽上的位置不同，以便於抗體純化。

2)多肽合成：多肽純度≥85%，分子量正確。通常在免疫實驗中，對多肽純度的要求可以降低至70%。

3)抗原製備：將多肽1、多肽4分別與klh偶聯，偶聯物作為抗原用於免疫動物。klh使用琥珀醯亞胺基4-[n-馬來醯亞胺甲基]環己烷-1-羧化物（smcc）雙功能偶聯劑預先活化成klh-smcc，通過cys（半胱氨酸）與多肽1相聯接。

4)免疫：選用紐西蘭兔，每隻兔子以300μg劑量進行基礎免疫，以後每隔21天進行一次加強免疫，在經過三次加強免疫後，再經7天，取血樣，對血清進行elisa檢測。收集經elisa檢測陽性的兔子血清。

5)抗體純化：

a.組1層析柱製備：多肽與膠的劑量按2mg：2mg，將多肽1、多肽2與多肽3分別偶聯在預先活化好的巰基瓊脂糖凝膠(sulfolink-gel)上，製備一組共三根親和層析柱。

b.組1純化：

血清按10：1體積比例加入1mtris·hclph7.5緩衝液調節ph值，再用0.45μm膜過濾。處理過血清再與多肽1偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時。用10mmpbsph7.4清洗層析柱後，再用100mm甘氨酸(glycine)ph2.8緩衝液洗脫，收集od280≥0.2部分洗脫液。收集液立即用1mtris·hclph7.5緩衝液調節ph。

將收集液與多肽2偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時，收集穿透液，此步驟可以重複1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。

再將經多肽2純化過的收集液與多肽3偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時，收集穿透液，此步驟可以重複1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全。

穿透液含有純化組1目標抗體。

組2的層析柱製備與純化的步驟與組1類似，不同的是多肽1，2，3對應換成多肽4，5，6，最後得到純化組2目標抗體。具體操作是：

c.組2的層析柱製備：多肽與膠的劑量按2mg：2mg，將多肽4、多肽5與多肽6分別偶聯在預先活化好的巰基瓊脂糖凝膠上，製備一組共三根親和層析柱；

d.組2的純化：

血清按10：1體積比例加入1mtris·hclph7.5緩衝液調節ph值，再用0.45μm膜過濾；處理過血清再與多肽4偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時；用10mmpbsph7.4清洗層析柱後，再用100mm甘氨酸ph2.8緩衝液洗脫，收集od280≥0.2部分洗脫液；收集液立即用1mtris·hclph7.5緩衝液調節ph；

將收集液與多肽5偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時，收集穿透液，此步驟重複1到3次，直至穿透液被多肽5抗原吸收完全；

再將經多肽5純化過的收集液與多肽6偶聯的層析柱室溫下混勻反應2小時，收集穿透液，此步驟重複1到3次，直至穿透液被多肽6抗原吸收完全；

穿透液含有純化組2目標抗體。

6）濃縮：將純化好的穿透液濃縮成特定濃度目標抗體濃液，通常1mg/ml以上。可根據各種應用的需要調製相應濃度。

7）抗體鑑定：製備的目標抗體經過酶聯免疫法（elisa）、斑點雜交法（dot-blot）法鑑定，證明組1目標抗體只對多肽1有特異反應，對其它多肽均無反應。組2目標抗體只對多肽4有特異反應，對其它多肽均無反應。檢測方法如下：

a.間接酶聯免疫法（elisa）：將所設計的多肽分別偶聯bsa的偶聯物同作為檢測抗原。以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。經間接elisa檢測，證明組1目標抗體只對多肽1有極強反應，對其它多肽均無反應。組2目標抗體只對多肽4有極強反應，對其它多肽均無反應。結果如圖5所示。

b．斑點雜交法（dot-blot）：將多肽與bsa的偶聯物作為檢測抗原。經dot-blot法檢測，證明組1目標抗體只對多肽1有極強反應，對其它多肽均無反應。組2目標抗體只對多肽4有極強反應，對其它多肽均無反應。結果如圖6所示。

b、免疫；通常選用balb/c小鼠以10μg/只的劑量進行基礎免疫，以後每隔21天進行一次加強免疫，在經過三次加強免疫後，再經3天，取血樣，對血清進行elisa檢測。

c、細胞融合：取經elisa檢測陽性血清的小鼠，取小鼠脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞sp20進行融合，製備雜交瘤細胞。

d、選擇培養：將雜交瘤細胞用96孔板鋪板培養，再加選擇培養基進行選擇培養。

e、篩選克隆：對雜交瘤細胞進行篩選，使雜交瘤細胞克隆化，形成單克隆細胞株。

f、單克隆抗體的鑑定：

a.間接酶聯免疫法（elisa）：將多肽分別偶聯bsa，偶聯物作為檢測抗原。單克隆抗體採用間接elisa檢測，對多肽1有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type1抗體；對多肽4有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type2抗體。

b．斑點雜交法（dot-blot）：採用多肽與bsa的偶聯物作為檢測抗原。單克隆抗體經dot-blot法檢測，對多肽1有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type1抗體；對多肽4有反應，對其它多肽無反應的抗體即為ews-fli1type2抗體。

本發明專利的方法可以應用於各種特異性融合蛋白抗體的製備。具體為依據本發明中的方法，選擇融合蛋白拼接位置左右兩端的序列進行多肽設計，再根據本發明中多肽合成，抗原製備，免疫，elisa檢測，收集血清步驟，再根據本發明中純化原理與方法，採用設計的多肽分別製備的親和柱進行親和層析，得到目標抗體。

本發明專利製備產生的抗體，採用但不限於以下多種免疫學檢測方法進行應用。結果可以用於定性或定量實驗，用於科研或診斷用途。

1)夾心酶聯免疫法（elisa）

採用本發明專利製備產生的抗體，再選取人ews-fli1融合蛋白或ews蛋白或fli1蛋白抗體進行配對，形成一對夾心elisa抗體。可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織的裂解液，細胞培養液，患者血樣及體液等樣品進行夾心elisa檢測。

2)免疫印跡法（wb）

採用本發明專利製備產生的抗體，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織的裂解液，表達蛋白等樣品進行免疫印跡法（wb）檢測。

3)免疫組化法（ihc）

採用本發明專利製備產生的抗體，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織進行免疫組化法（ihc）檢測。

4)免疫沉澱法（ip）

採用本發明專利製備產生的抗體，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織，患者血樣及體液進行免疫沉澱法（ip）檢測。

5)免疫螢光法（if）

採用本發明專利製備產生的抗體，通過直接螢光標記，或通過螢光標記二抗法，可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織，患者血樣及體液進行免疫螢光法（if）檢測。

6)流式細胞術（fcm）

採用本發明專利製備產生的抗體，通過流式細胞術（fcm），可以應用於尤文肉瘤相關細胞或組織，患者血樣及體液進行檢測。