包含含有皂苷的佐劑的新疫苗製劑的製作方法

2024-01-29 18:03:15

本申請是申請日為2010年9月9日、發明名稱為「包含含有皂苷的佐劑的新疫苗製劑」的中國發明專利申請no.201080047645.0的分案申請。【
技術領域：
】本發明涉及水包油乳劑，它們作為佐劑的使用，及包含所述乳劑的藥學，免疫學或疫苗組合物。【援引加入】本申請要求2009年9月10日提交的美國臨時專利申請no.61/241,171的優先權，且還參考下列專利申請：2008年2月7日提交的美國專利申請no.12/027,776，2004年7月26日提交的美國專利申請no.10/899,181，現在授權的美國專利7,371,395，及2003年7月24日提交的美國臨時專利申請no.60/490,345。上述申請，及它們中或它們的審查期間引用的全部文獻(「申請人引用的文獻」)和申請人引用的文獻中引用的或參考的全部文獻，及本文引用的或參考的全部文獻(「本文引用的文獻」)，及本文引用的文獻中引用的或參考的全部文獻，以及本文或通過引用併入本文的任何文獻中提及的任何產品的任何製造商的使用說明，描述，產物說明書，及產物印刷品均通過引用併入本文，且可在本發明的實踐中採用。
背景技術：
：熟知疫苗中佐劑的使用。佐劑是當與疫苗抗原組合時，相比由疫苗抗原單獨誘導的應答，增加對疫苗抗原的免疫應答的化合物。促進抗原免疫原性的策略之中尤其是：致使疫苗抗原成粒子的策略，多聚化或乳化疫苗抗原的策略，包裹疫苗抗原的方法，增加宿主先天性細胞因子應答的方式，及使疫苗抗原靶向抗原呈遞細胞的方法(nossal,1999,in:fundamentalimmunology.paul(ed.),lippincott-ravenpublishers,philadelphia,pa.；vogel和powell,1995,in:vaccinedesign.thesubunitandadjuvantapproach.powell和newman(eds.),plenumpress,ny,n.y.p.141)。因為佐劑在改善疫苗抗原的免疫原性中起到必要的作用，疫苗製劑中佐劑的使用已實際上是普遍存在的(nossal,1999,見上；vogel和powell,1995,見上；也見pct公開wo97/18837,將它們的教導通過引用併入本文)。本領域中熟知的常規佐劑性質多樣。它們可，例如，由水不溶性無機鹽，脂質體，微團或乳劑組成，即弗氏佐劑。其他佐劑可見於以上提及的vogel和powell，1995。儘管無佐劑作用的單一機理，必要的特徵是它們相比由疫苗抗原單獨誘導的應答顯著增加對疫苗抗原的免疫應答的能力(nossal,1999,見上；vogel和powell,1995,見上)。在這點上，一些佐劑在增加體液免疫應答中更有效；其他佐劑在增加細胞-介導的免疫應答中更有效(vogel和powell,1995,見上)；及再一組的佐劑增加針對疫苗抗原的體液和細胞-介導的免疫應答(vogel和powell,1995,見上)。一般而言，疫苗製劑中使用的乳劑包含油，水溶液和表面活性劑的混合物。一些乳劑合併親脂性表面活性劑諸如span和親水表面活性劑諸如tween但是，可用作為疫苗佐劑使用的乳劑觀察到穩定性問題，尤其是存儲或運輸期間。當這些組合物含有濃縮的免疫原，尤其非-純化的濃縮的免疫原時尤其如此。一般而言，這是在滅活的(殺的)疫苗中使用的佐劑的情況。此問題在多價疫苗組合物中甚至更顯著，因為免疫原在相同體積的稀釋劑中更濃縮。佐劑使用的另一問題與不利的事件諸如毒性或在注射位點處局部發炎的風險關聯。例如，可在注射之後產生局部炎性應答和/或肉芽腫。為了限制該不利的反應，可減少乳劑中的表面活性劑和其他組分；但是，所述減小可然後導致疫苗組合物的穩定性的降低。因此，有對含有該具有增加的安全性和穩定性的佐劑的新佐劑和疫苗組合物的需求。【發明概述】在第1實施方式中，本發明提供在細菌或病毒懸浮液，尤其濃縮的及非-純化的或弱地純化的那些的存在下具有增加的穩定性的新水包油(o/w)乳劑。本發明的另一實施方式提供穩定的，安全和容易可施用的，尤其是可注射的，作為用於包含至少一種活性成分的藥物組合物的遞送的媒質的o/w乳劑，所述活性成分可為，更具體而言，免疫原。本發明的再一實施方式提供穩定的，安全和可注射的作為用於增加由免疫原誘導的免疫應答的佐劑的o/w乳劑。尤其是，本發明提供當在含有免疫原的疫苗組合物中使用時，增加受疫苗接種者的對於免疫原的細胞免疫應答，體液免疫應答或，優選二者的新佐劑。本發明的再一實施方式提供包含o/w乳劑的穩定的，安全和免疫原性組合物或疫苗。本發明的進一步實施方式提供使用本發明的佐劑製造疫苗組合物的方法；由此獲得的疫苗組合物；及使用所述疫苗組合物的方法。本發明的再一實施方式提供包含一或更多瓶的試劑盒。在一實施方式中，試劑盒包含含有本發明的佐劑和免疫原或其他藥物產物的1瓶。在再一實施方式中，試劑盒在第1瓶包含免疫原或其他藥物產物，及在第2瓶包含根據本發明製備的佐劑，佐劑被設計為在使用之前與免疫原或其他疫苗產物混合。在一實施方式中，本發明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的任選的水溶液(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(通常具有11和13之間的hlb值)。在另一實施方式中，本發明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)礦物油；(4)非-離子親脂性表面活性劑；(5)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(通常具有11和13之間的hlb值)。在另一實施方式中，本發明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的任選的水溶液(4)具有大於13和小於40，尤其是hlb≥13.5，及優選hlb≥14的高親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(5)礦物油；(6)非-離子親脂性表面活性劑；(7)具有低hlb值(約9～約13的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。在另一實施方式中，本發明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)具有大於13和小於40，尤其是hlb≥13.5，及優選hlb≥14的高親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；(6)具有低hlb值(約9～約13的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。在再一實施方式中，本發明提供包含含有適合於在受疫苗接種者中引發免疫學應答的至少一種免疫原的新乳劑的疫苗組合物。本發明還提供乳劑作為用於增加由免疫原誘導的免疫應答，尤其是，用於增加細胞應答，體液應答或優選二者的佐劑的組合物。在另一實施方式中，本發明提供製造疫苗組合物的方法，其中將免疫原，尤其幹形式的免疫原，其可例如，通過冷凍乾燥或通過玻璃化獲得，或在水溶液中的免疫原，尤其其中所述幹形式或所述水溶液額外地包含離子表面活性劑，例如皂苷，及任選地額外地包含氫氧化鋁，與本發明的佐劑混合。免疫原可選自：滅活的病原體，減毒的病原體，亞-單元抗原，純化的抗原，未純化的抗原或使用細菌，酵母，植物，昆蟲或動物細胞，包括質粒的表達載體，等重組產生的抗原。抗原可通過本領域中熟知的手段純化，包括但不限於超濾，超速離心，大小排阻凝膠-過濾，離子-交換層析，及peg-純化。病原體可源於細菌，病毒，原生動物或真菌，或免疫原可構成抗毒素。在另一實施方式中，本發明提供在受疫苗接種者中誘導針對病原體的免疫應答的方法，包括給受疫苗接種者施用本發明的疫苗組合物。在另一實施方式中，本發明提供包含含有純化的本發明的免疫原和乳劑的單個瓶的試劑盒。在一該實施方式中，單個瓶之內含有的免疫原包含純化的fmd病毒抗原。在另一實施方式中，本發明提供包含至少2個瓶的試劑盒，在第1瓶中，免疫原，尤其幹形式或在水性介質中的溶液中的免疫原，尤其其中所述幹形式或所述水溶液額外地包含離子表面活性劑，有利地皂苷和任選地額外地包含氫氧化鋁，且在第2瓶中是本發明的佐劑或乳劑。包含至少2個瓶的試劑盒的使用在離散組分的組合(即至少2個瓶的內容物混合到單個瓶中)會導致減小的穩定性的疫苗製劑的情況中特別有效。需知，在本公開和特別在權利要求中，術語諸如「包含(comprises)」，「包含(comprised)」，「包含(comprising)」等可具有美國專利法中該術語的含義；例如，它們可表示「包括(includes)」，「包括(included)」，「包括(including)」，等；且術語諸如「基本上由…組成(consistingessentiallyof)」和「基本上由…組成(consistsessentiallyof)」具有美國專利法中規定的含義，例如，它們允許未明確地敘述的要素，但排除見於現有技術或影響本發明的基本或新特徵的要素。這些和其他實施方式被下列詳述公開或通過下列詳述顯而易見及被下列詳述包括。【附圖說明】本發明的全部及可能公開，包括其對本領域普通技術人員的最佳模式，更特別在以下說明書，包括參照附圖說明，其中：圖1提供在第7，22，121和330天(1年穩定性研究)，對試驗1&2的疫苗製劑的轉相溫度(pit)確定(通過導電率測量的)的圖。pit確定是疫苗製劑穩定性的一個量度。圖2提供在產生後多天(1年穩定性研究)對試驗3&4的疫苗製劑的pit確定的圖；圖3提供在產生後多天(1年穩定性研究)對試驗5&6的疫苗製劑的pit確定的圖；圖4提供在產生後多天(1年穩定性研究)對試驗7&8的疫苗製劑的pit確定的圖；圖5提供在產生後多天(1年穩定性研究)對試驗9的疫苗製劑的pit確定的圖；圖6提供對根據本發明產生，及存儲36個月的疫苗製劑(試驗1～9)的pit確定的圖；圖7提供顯示根據在實施例6中公開的材料和方法處理的豬的直腸溫度的時間-依賴性變化的圖；圖8提供顯示對根據在實施例6中公開的材料和方法處理的豬觀察的最大溫度變化的圖；圖9提供顯示根據在實施例7中公開的材料和方法處理的豬的疫苗效力(pd50)對比淨荷(μg)的圖。【發明詳述】本發明的其他目的，特徵和方面公開於下列詳述，或自下列詳述顯而易見。本領域普通技術人員明白，本文僅描述例示實施方式，且不旨在限制本發明的更廣方面，該更廣方面在例示實施方式中具體化。實際上，本領域技術人員明白，可在本發明中進行各種修飾和變異而不離開本發明的範圍或精神。例如，作為一實施方式的部分例證的或描述的特徵可用於另一實施方式中，以產生再進一步實施方式。期望本發明含蓋該修飾和變異在隨附的權利要求和它們的相當體的範圍之內。將貫穿本申請引用的全部參考文獻，出版的專利和專利的內容通過引用整體併入本文。為了便利，將說明書，實施例和隨附的權利要求中採用的特定術語收集於此。如本文所用，術語「動物」包括全部脊椎動物，包括人。其也包括全部發育階段，包括胚胎和胚胎階段的個體動物。尤其是，術語「脊椎動物」包括但不限於人，狗(例如,狗)，貓(例如,貓)；馬(例如,馬)，牛(例如,牛(cow)，牛(cattle))，豬(例如,豬)，以及禽。如本文所用，術語「牛(cow)」或「牛(cattle)」通常用於指稱任何齡的牛來源的動物。可互換的術語包括「牛」，「牛犢」，「食用牛」，「公牛」，「小母牛」，「牛」等。可互換的術語包括「小豬」，「母豬」等。本文所用的術語「禽」指稱分類學類ava的任何物種或亞種，諸如但不限於雞(種雞,肉雞和產蛋雞)，火雞，鴨，鵝，鵪鶉，雉雞，鸚鵡，雀，鷹，烏鴉和包括鴕鳥，鴯鶓和鶴鴕的平胸鳥。術語「豬」或「小豬」是指豬來源的動物，而「母豬」指稱在育齡和有生殖能力的雌性。如本文所用，術語「強毒」是指保留其在動物宿主中的感染性的能力的分離物。如本文所用，術語「滅活的疫苗」是指含有不再能複製或生長的感染性生物或病原體的疫苗組合物。病原體可為細菌，病毒，原生動物或真菌來源。滅活可通過各種方法實現，包括凍融，化學處理(例如，用福馬林處理)，超聲處理，輻射，加熱或足以防止生物複製或生長而維持其免疫原性的任何其他常規手段。如本文所用，術語「免疫原性」是指能在宿主動物中產生針對抗原的免疫應答。此免疫應答形成由針對特定感染性生物的疫苗引發的保護性免疫的基礎。如本文所用，術語「免疫應答」指稱在動物中引發的應答。免疫應答可指稱細胞免疫(cmi)；體液免疫或可涉及二者。本發明也涵蓋限於一部分免疫系統的應答。例如，本發明的疫苗組合物可特別誘導增加的γ幹擾素應答。如本文所用，術語「抗原」或「免疫原」是指在宿主動物中誘導特定免疫應答的物質。抗原可包含全生物，殺死的，減毒的或活的；生物的亞基或部分；含有具有免疫原性性質的插入物的重組載體；呈遞到宿主動物後能誘導免疫應答的dna的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何組合。替代性地，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。如本文所用，術語「多價」是指含有多於一種無論來自相同的物種(即，fmd病毒血清型的不同分離物)，還是來自不同物種(即,分離自溶血性巴斯德菌(pasteurellahemotylica)及多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida))的抗原的疫苗，或含有來自不同屬的抗原的組合的疫苗(例如，包含來自多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)，沙門氏菌屬(salmonella)，大腸埃希氏菌(escherichiacoli)，睡眠嗜血桿菌(haemophilussomnus)及梭菌屬(clostridium)的抗原的疫苗)。如本文所用，術語「佐劑」是指添加到疫苗而增加疫苗的免疫原性的物質。不完全知道佐劑如何作用的機理。一些佐劑被認為通過緩慢釋放抗原來增強免疫應答，而其他佐劑是它們自身就強烈免疫原性，且被認為協同發揮功能。知道的疫苗佐劑包括，但不限於，油和水乳劑(例如,完全弗氏佐劑和不完全的弗氏佐劑)，短小棒桿菌(corynebacteriumparvum)，卡介苗，氫氧化鋁，葡聚糖，硫酸葡聚糖，氧化鐵，藻酸鈉，細菌佐劑，特定合成聚合物諸如聚胺基酸，以及胺基酸的共聚物，皂苷，"regressin"(vetrepharm,athens,ga.)，"阿夫立定"(n,n-二-十八烷基-n',n'-雙(2-羥乙基)-丙烷二胺)，石蠟油，胞壁醯二肽等。如本文所用，術語「乳劑」指稱至少2種物質的組合，其中第1物質分散到第1物質不溶的第2物質中。本發明的乳劑的一例是分散到水相的油相。如本文所用，術語「不完全的乳劑」指稱必需加入至少一種額外的組分來製造「完全乳劑」的組合物。如本文所用，術語「完全乳劑」可被認為相當於本發明的「即用」免疫學組合物。完全乳劑的一例是根據本發明的方法容易施用於動物的本發明的免疫學組合物。如本文所用，術語「藥學可接受的載體」和「藥學可接受的媒質」可互換且指稱含有可無不利效果地注入宿主的疫苗抗原的流體媒質。本領域知道的適合的藥學可接受的載體包括，但不限於，無菌水，鹽水，葡萄糖，右旋糖或緩衝溶液。載體可包括輔助劑包括但不限於稀釋劑，穩定劑(即,糖和胺基酸)，防腐劑，潤溼劑，乳化劑，ph緩衝劑，粘度增強添加劑，顏料等。如本文所用，術語「疫苗組合物」包括在宿主中誘導免疫應答中有用的藥學可接受的媒質中的至少一種抗原或免疫原。疫苗組合物可以劑量及通過醫療或獸醫學領域熟練的技術人員熟知的技術，考慮因素如受者動物的齡，性別，重量，物種和情況，及施用途徑來施用。施用途徑可為經皮，經黏膜施用(例如,口腔,鼻,肛門,陰道)或經腸胃外途徑(真皮內,肌內,皮下,靜脈內或腹膜內)。疫苗組合物可單獨施用，或可與其他治療或治療共施用或依次施用。施用形式可包括懸浮液，糖漿或酏劑，及腸胃外，皮下，真皮內，肌內或靜脈內施用製劑(例如,可注射的施用)諸如無菌懸浮液或乳劑。疫苗組合物可作為噴霧劑施用或混合進食品和/或水或遞送到與適合的載體，稀釋劑或賦形劑諸如無菌水，生理學鹽水，葡萄糖，等的混合物中。組合物可含有輔助物質諸如潤溼或乳化劑，ph緩衝劑，佐劑，膠凝或粘度增強添加劑，防腐劑，調味劑，顏料，等，依賴於施用途徑和期望的製劑。可諮詢標準物藥學教科書，諸如「remington'spharmaceuticalsciences」，1990來製備適合的製劑，無需過度實驗。本文所用的術語「純化的」不需要絕對純度；其旨在表示相對術語。由此，例如，純化的免疫原製劑，諸如蛋白或滅活的病毒，是免疫原相比天然的環境中的免疫原更富集的免疫原製劑。免疫原製劑在本文廣泛地指稱為「純化的」使得免疫原表示製劑總免疫原含量的至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少98％。「粗製劑」，其代表最低程度的純化，可含有少至小於60％，小於20％，小於10％，小於5％，或小於1％的免疫原性組分。本文所用的術語「高度純化的」旨在表示相比術語「中度純化的」的「更高程度的純度」。此「更高程度的純度」可包括，但不以任何方式限於，已「高度純化的」免疫學製劑對比已「中度純化的」免疫學製劑中減少的百分率的汙染物。如本文所述，「高度純化的」免疫學製劑會具有最低到不可檢測的百分率的汙染物，其可導致：減少的期望的免疫應答，增加的不期望的免疫應答(例如超敏反應)，或減少的製劑穩定性。類似地，已「中度純化的」免疫學製劑對比已「最低限度純化的」免疫學製劑含有相對減少的百分率的汙染物，其如同，對比稱之為「粗製劑」的製劑減少了百分率的汙染物。免疫學製劑中的汙染物可包括，但不以任何方式限於，負面地貢獻於本發明的免疫學組合物的物質。負面地貢獻的汙染物的幾例之一是減少本發明的免疫學組合物在動物中引發免疫應答的能力的汙染物。可使用各種方法達到改變水平的純度(例如「高度純化的」,「中度純化的」等)。例如，層析和大小排阻凝膠過濾的組合可導致「高度純化的」或"中度純化的"免疫學製劑。免疫原的源/類型差異，以及純化過程的輕微變化可顯著影響免疫原純度的最終程度。一般而言，如本文所用，具有最低到最高百分率的汙染物的免疫學製劑會分別描述為(1)「高度純化的，(2)「中度純化的」，(3)「最低限度純化的」，(4)「粗製劑」。「高度純化的」製劑會全部類型的汙染物都具有最低水平。「中度純化的」製劑會具有相對低水平的多數類型的汙染物，但可具有相比會在可比較的「高度純化的」製劑觀察的更高豐度的一種類型的汙染物。同樣，「最低限度純化的製劑」會具有相對低水平的一些類型的汙染物，但可具有相比可比較的「中度純化的」製劑更高豐度的多於一種類型的汙染物。如所預期，「粗製劑」相比本文討論的其他類型的製劑，全部汙染物類型都具有最高水平的汙染物。本發明提供新水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含能在宿主中誘導免疫應答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)包含離子表面活性劑的水溶液；(3)非-離子親水表面活性劑；(4)礦物油；在一實施方式中，新水包油(o/w)乳劑包含：(1)包含能在宿主中誘導免疫應答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)包含離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液；(3)具有大於13和小於40(hlb>13,尤其是hlb≥13.5,及優選hlb≥14)的親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；以及(6)具有低hlb值(9和13之間的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。在另一實施方式中，本發明提供新水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含能在宿主中誘導免疫應答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)包含離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的任選的水溶液(4)具有大於13和小於40(hlb>13,尤其是hlb≥13.5,及優選hlb≥14)的親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(5)礦物油；(6)非-離子親脂性表面活性劑；以及(7)具有低hlb值(9和13之間的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。一些根據本發明製備的乳劑基於從4個不同組的表面活性劑的成員之中選擇的至少4種表面活性劑的組合，且可能使用屬於各組的一種或更多表面活性劑。這些組中的3組包含非-離子表面活性劑，這些組之一包含離子表面活性劑，例如皂苷。在幾個實施方式之一，乳劑(除非另外說明，在本說明書中，這是指包含全部成分的最終乳劑)中離子表面活性劑(2)的濃度是約0.01％～約10％。在幾個實施方式之一，乳劑(除非另外說明，在本說明書中，這是指包含全部成分的最終乳劑)中非-離子親水表面活性劑(7)的濃度是1％～8％，尤其是1.5％～6％，優選2％～5％，更優選2.5％～4％，以重量比乳劑體積(w/v)的百分率表示。此組表面活性劑包含具有低hlb值(9和13之間的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。此組包括但不限於乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯(尤其是5個乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(尤其是20個乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯諸如tween)，乙氧基化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯諸如tween乙氧基化的脂肪醇(尤其是5～10個乙氧基)(例如brijbrijbrij)，乙氧基化的脂肪酸(尤其是5～10個乙氧基)(例如simulsolmyrj)，乙氧基化的蓖麻油(尤其是25～35個乙氧基)(例如arlatonearlatone)和其組合。優選乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯，以及兩種物質的組合。脂肪酸優選選自：油酸，棕櫚酸，硬酯酸，異硬脂酸，月桂酸和其組合。優選的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯包含乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，諸如tween或乙氧基化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯，諸如tween在幾個實施方式之一，非-離子親水表面活性劑(4)的濃度通常是0.1％～1.5％，尤其是0.2％～1.4％，優選0.3％～1.3％，更優選0.4％～1.2％，以重量比乳劑體積(w/v)的百分率表示。此第2組表面活性劑包含具有高親水-親脂性平衡(hlb)值(hlb>13,尤其是hlb≥13.5,及優選hlb≥14)的非-離子親水表面活性劑。此組包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯(尤其是20個乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐單月桂酸酯，諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐單棕櫚酸酯，諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐單硬脂酸酯，諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯，諸如tween乙氧基化的脂肪醇(尤其是15～30個乙氧基)(例如brijbrijbrij)，乙氧基化的脂肪酸(尤其是15～30個乙氧基)(例如myrjmyrjmyrjmyrj)，非-離子嵌段共聚物(例如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(poe-pop)，諸如lutrollutrol)和其組合。對於非-離子嵌段共聚物，百分率可更低，且尤其是0.1％～0.5％，更特別是0.2％～0.4％(重量比乳劑體積(w/v))。優選的表面活性劑(4)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯，諸如上述那些。在幾個實施方式之一，非-離子親脂性表面活性劑(6)的濃度是0.1％～2.5％，尤其是0.2％～2％，優選0.2％～1.5％，更優選0.2％～1.2％，以重量比乳劑體積(w/v)的百分率表示。此組表面活性劑包含山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如山梨糖醇酐單月桂酸酯,如span山梨糖醇酐單棕櫚酸酯,諸如span山梨糖醇酐單硬脂酸酯,諸如span山梨糖醇酐三硬脂酸酯,諸如span山梨糖醇酐單油酸酯,如span山梨糖醇酐三油酸酯，如span山梨糖醇酐單異硬脂酸酯，諸如arlacel山梨糖醇酐異硬脂酸酯，諸如crill)，二縮甘露醇脂肪酸酯(例如montanide二縮甘露醇單油酸酯(諸如arlacel)，二縮甘露醇二油酸酯,二縮甘露醇三油酸酯,二縮甘露醇四油酸酯)，乙氧基化的二縮甘露醇脂肪酸酯(2,3或4個乙氧基)(例如montanidemontanide乙氧基化的二縮甘露醇單油酸酯,乙氧基化的二縮甘露醇二油酸酯,乙氧基化的二縮甘露醇三油酸酯,乙氧基化的二縮甘露醇四油酸酯)，及其組合。脂肪酸優選選自：油酸，棕櫚酸，硬酯酸，異硬脂酸，月桂酸和其組合。優選的表面活性劑(6)包含山梨糖醇酐脂肪酸酯，尤其是上述那些，及其組合。本發明的表面活性劑可具有來自動物或植物來源的脂肪酸。一種來源到另一來源的變化(例如動物tween到植物tween)可用僅乳劑製劑中的微小調節來簡單進行。根據本發明的乳劑可具有總體濃度的表面活性劑，以重量/乳劑體積計，1.2％～10％，尤其是2％～8％，優選3％～7％，更優選4％～6％。一般而言，根據本發明的乳劑可具有轉相溫度(pit)，其為≥33℃，尤其是33℃～65℃，更特別是36℃～60℃，優選37℃～55℃，及更優選38℃～50℃。pit是油包水乳劑變化為水包油乳劑或退相(乳劑分層和2相分離)的溫度。pit值可通過各種手段，如例如通過目視現象(例如見實施例2)或通過導電率測量。乳劑放在乳劑pit以下的溫度，例如在水-浴中約25℃。將溫度進行性地升高。對比對照乳劑觀察乳劑的視覺方面的變化，明顯的是，流動性，粘度，2相中的分離，由於油相向表面的遷移的表面方面的變化。觀察此視覺方面的變化的溫度是乳劑的pit值。或者，pit通過由放進乳劑，接近其表面的探針測量的約5～8millisiemens/cm(ms/cm)的導電率值(水包油乳劑)到約0ms/cm的值(油包水乳劑)的快速轉變來測定。觀察轉變的溫度是乳劑的pit值。本領域普通技術人員無需過度實驗就能測定表面活性劑和油的組合，包括它們的相應濃度，以便產生本發明的乳劑，及尤其是具有以上定義的範圍之內的pit值的乳劑。一般而言，根據本發明的乳劑可含有，以體積/乳劑體積計，3％～55％的油，尤其是5％～50％的油，優選10％～40％的油，及更優選地，20％～40％的油。通過定義，除非另外說明，在本說明書中的值的範圍，總是包括範圍的限值。使用的油可為礦物油，包括但不限於石蠟油諸如異石蠟油和/或環烷油，角鯊烷，姥鮫烷，聚異丁烯油，氫化的聚異丁烯油，聚癸烯油，聚異戊烯油，聚異丙烯油等。在本發明中有用的一種有利的礦物油可包括包含線性或分支的具有大於15，優選15～32的碳原子數，且無芳族化合物的碳鏈的油。該油可為，例如，以名稱"marcol"或「marcol」(產自esso,法國)或"drakeol"或"drakeol""drakeol"(產自penreco,usa)，(產自sonneborn,usa)，「石蠟油codex」(產自aiglon,法國)，blandol(產自sonneborn,usa)，ondina915(產自shell,uk)銷售的那些。油也可為包含在本文所述的油之中選擇，且以任何比例的至少2種油的油混合物。油混合物也可包含至少一種在上述油之中選擇的油和至少一種植物油，且此植物油佔約0.1％～約33％的油相，優選約10％～約25％v/v。這些植物油是可生物降解且優選在存儲溫度(約+4℃)是液體或至少使提供在此溫度是液體的乳劑成為可能的富含油酸的不飽和的油。例如植物油可為花生油，堅果油，葵花油，紅花油，大豆油，橙油等。在幾個實施方式之一，親水表面活性劑(4)和(7)優選包括具有分子的相同的親水部分的表面活性劑。例如，使用用於各親水表面活性劑(4)和(7)的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸酯。例如如果選擇tween為具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑，具有高hlb值的非-離子親水表面活性劑會有利地具有用乙氧基化的山梨糖醇酐，諸如tween構成的親水部分。一般而言，本發明考慮使用水溶液，其包含適合的獸醫學或藥學可接受的媒質，賦形劑或稀釋劑，其包括但不限於無菌水，生理學鹽水，葡萄糖，緩衝劑等。媒質，賦形劑或稀釋劑也可包括多元醇，糖族或ph緩衝劑。媒質，賦形劑或稀釋劑也可，例如，包含胺基酸，肽，抗氧化劑，殺菌劑和抑菌劑化合物。以獲得本發明的乳劑的100％的體積的量將水溶液加入油和表面活性劑。乳劑的親水-親脂性平衡(hlb)允許表面活性劑的親水或親脂性力的估計。兩性分子的hlb通常如下計算：hlb可具有0(對於最親脂性分子)～20(對於最親水分子)的值。根據表面活性劑的化學組成(顯著地例如乙氧基或烯氧化物的添加)，此估計可變化，且hlb值域可增加(例如，具有29的hlb的lutrol)。隨著表面活性劑的混合，混合物的hlb是各表面活性劑的hlb的累加，被其重量比平衡：在根據本發明製備的乳劑的一實施方式中，乳劑的最終hlb是約9～約12，優選約9.5～約11.5和更優選約10～約11.5。本發明涵蓋乳劑，其包含：石蠟油(尤其是以約10％～約40％和優選約20％～約40％的濃度,以體積/乳劑體積(v/v)表示)；山梨糖醇酐脂肪酸單酯(作為非-離子親脂性表面活性劑)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(作為具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑)；及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯(作為具有高hlb值的非-離子親水表面活性劑)。尤其是山梨糖醇酐脂肪酸單酯是山梨糖醇酐單油酸酯(尤其是以0.2％～1.5％,優選0.2％～1.2％的濃度，以重量/乳劑體積(w/v)表示)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯是乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯(尤其是以2％～5％,優選2.5％～4％w/v的濃度)及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯是乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯(尤其是以0.3％～1.3％,優選0.4％～1.2％w/v的濃度)。例如，乳劑包含：約29.3％以體積/乳劑體積計的石蠟油，0.6重量％/乳劑體積的山梨糖醇酐單油酸酯，3.4重量％/乳劑體積的乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，及0.75重量％/乳劑體積的乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯。在本發明的第2實施方式中，乳劑包含石蠟油(尤其是以10％～40％,優選20％～40％v/v的濃度)，山梨糖醇酐脂肪酸單酯(作為非-離子親脂性表面活性劑)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(作為具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑)，及非-離子嵌段共聚物(作為具有高hlb值的非-離子親水表面活性劑)。尤其是山梨糖醇酐脂肪酸單酯是山梨糖醇酐單油酸酯(尤其是以0.2％～1.5％,優選0.2％～1.2％w/v的濃度)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯是乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯(尤其是以2％～5％,優選2.5％～4％w/v的濃度)，非-離子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(poe-pop)(尤其是以0.1％～0.5％,優選0.2％～0.4％w/v的濃度)。例如乳劑包含：約29.3％v/v的石蠟油，0.6％w/v的山梨糖醇酐單油酸酯，3.4％w/v的乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，及0.25％w/v的乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯。在特定實施方式中，本發明涵蓋可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含活性成分諸如藥物或免疫原，優選免疫原的水溶液；(2)包含皂苷的水溶液(3)礦物油；(4)非-離子親脂性表面活性劑；以及(5)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(其可具有11和13之間的hlb值)。在另一特定實施方式中，本發明涵蓋可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含活性成分諸如藥物或免疫原，優選免疫原的水溶液；(2)包含皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的水溶液(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；以及(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(其可具有11和13之間的hlb值)。根據此實施方式的乳劑包含可含有達20個乙氧基的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯。脂肪酸可來自動物或植物來源，且可選自：油酸，棕櫚酸，硬酯酸，異硬脂酸，月桂酸和其組合。在一實施方式中，乙氧基化的脂肪酸優選為油酸。其他成分，以及乳劑的一般性質，諸如pit，可相比上述那些具有相同的特徵。優選地，表面活性劑(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，諸如乙氧基化的山梨糖醇酐二油酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二硬脂酸酯或乙氧基化的山梨糖醇酐二異硬脂酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二棕櫚酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二月桂酸酯，及其組合。可將任選地其他化合物作為輔佐劑添加到乳劑，包括但不限於礬；cpg寡核苷酸(odn)，尤其是odn2006，2007，2059或2135(pontarollor.a.etal.,vet.immunol.immunopath,2002,84:43-59；wernettec.m.etal.,vet.immunol.immunopath,2002,84:223-236；mutwirig.etal.,vet.immunol.immunopath,2003,91:89-103)；多聚a-多聚u(「vaccinedesignthesubunitandadjuvantapproach」,editedbymichaelf.powellandmarkj.newman,pharmaceuticalbiotechnology,6:03)；二甲基二-十八烷基銨溴化物(dda)(「vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach」,editedbymichaelf.powellandmarkj.newman,pharmaceuticalbiotechnology,volume6:157)，n,n-二-十八烷基-n』,n』-雙(2-羥乙基)丙烷二胺(諸如)(ibid,p.148)，卡波姆，殼聚糖(例如見美國專利系列no.5,980.912)。本發明也提供製造包含至少一種抗原或免疫原組合物和根據本發明製備的佐劑或乳劑的疫苗組合物或免疫學組合物的方法。抗原或免疫原組合物可在乳劑形成期間合併，或在替代實施方式中，可將抗原或免疫原組合物，其優選額外地包含皂苷和任選地額外地包含氫氧化鋁，在之後，例如，恰在使用之前加入乳劑。使用的水溶液的整個量可存在於首先產生的乳劑中。或者，其可為僅一部分此水溶液用於形成乳劑，及餘下量的水溶液在併合免疫原之後添加。免疫原或抗原可為幹形式或以一些其他適當的固體形式存在，然後與乳劑混合或，交替，抗原可為溶液，尤其是以水溶液存在，且將此溶液與乳劑混合。優選將表面活性劑根據它們的溶解度添加到油或水溶液。例如，將非-離子親脂性表面活性劑加入根據本發明的油，而將具有高hlb值的非-離子親水表面活性劑加入水溶液。可根據本領域普通技術人員知道的常規方法製備乳化。例如，在本發明的一實施方式中，可在乳劑pit以下的溫度，尤其是於室溫，例如於約25℃製備乳劑。將水相和油相通過機械攪拌，例如用裝備能創建高剪力的轉子-定子的渦輪混合在一起。優選以低旋轉速度開始攪拌，並隨著通常漸進地將水溶液添加進油而緩慢增加。優選將水溶液漸進地添加到油。可調整油/水溶液的比，以獲得油包水(w/o)乳劑，例如，以約40％～約55％濃度的油(v/v)。當攪拌停止時，乳劑漸進地變化為o/w乳劑(轉相)。轉相之後，且如果需要，將乳劑通過添加以獲得期望的濃度的油的水溶液來稀釋為最終乳劑。可於約5℃存儲乳劑。在另一實施方式中，可於高於乳劑pit的溫度製備乳劑。在第1步驟中，將水相和油相於高於乳劑pit的溫度混合在一起。優選將水溶液漸進地添加到油。可調整油/水溶液比，以獲得油包水(w/o)乳劑，例如以約40％～約55％濃度的油(v/v)。乳化可通過用低或無剪力，例如用靜態混合器或海洋螺旋或用非常低旋轉速度的渦輪攪拌來進行。獲得的乳劑是油包水(w/o)乳劑。在第2步驟中，將乳劑漸進地冷卻到pit以下。此步驟期間，乳劑變化為o/w乳劑(轉相)。轉相之後，且如果需要，將乳劑通過添加以獲得期望的濃度的油的水溶液來稀釋為最終乳劑。可於約5℃存儲乳劑。乳劑中滴的尺寸可約100nm～約500nm。乳劑可，例如，作為佐劑使用，以配製疫苗組合物或藥物組合物。也可將乳劑用作溶劑，以溶解乾燥的產品，尤其是含有，例如，減毒的微生物或活重組載體的乾產品。在特定實施方式中，用僅一部分水溶液產生預製乳劑。此預製乳劑可通過添加活性成分諸如藥物或免疫原，優選免疫原的懸浮液來稀釋，以獲得最終組合物。或者，預製乳劑可用水溶液稀釋，及用於溶解乾燥的產品諸如乾產品。適合於在本發明中使用的免疫原或抗原可選自：滅活的病原體，減毒的病原體，免疫原性亞-單元(例如蛋白,多肽,肽,表位,半抗原)或重組表達載體，包括具有免疫原性插入子的質粒。在本發明的一實施方式中，免疫原是滅活的或殺死的微生物。在本發明的另一實施方式中，疫苗組合物包含選自禽病原體的免疫原，所述病原體包括但不限於鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)，腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritidis)，感染性支氣管炎病毒(ibv)，新城疫病毒(ndv)，蛋產量下降症候群病毒(eds)，或感染性法氏囊病病毒(ibdv)，禽流感病毒，等，及其組合。替代性地，疫苗組合物包含選自貓病原體的免疫原，所述病原體諸如但不限於貓皰疹病毒(fhv)，貓杯狀病毒(fcv)，貓白血病病毒(felv)，貓免疫缺陷病毒(fiv)，狂犬病病毒等，及其組合。在再一實施方式中，本發明的疫苗組合物包含選自狗病原體的免疫原，所述病原體包括但不限於狂犬病病毒，狗皰疹病毒(chv)，狗細小病毒(cpv)，狗冠狀病毒，犬鉤端螺旋體(leptospiracanicola)，黃疸出血型鉤端螺旋體(leptospiraicterohaemorrhagiae)，感冒傷寒型鉤端螺旋體(leptospiragrippotyphosa)，博氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)，支氣管炎博德特菌(bordetellabronchiseptica)等，及其組合。在本發明的再一實施方式中，組合物包含選自馬病原體的免疫原，所述病原體諸如馬皰疹病毒(1型或4型)，馬流感病毒，破傷風，西尼羅河病毒，等或其組合。在本發明的再一實施方式中，組合物包含選自牛病原體的免疫原，所述病原體諸如口蹄疫病毒(fmdv)，狂犬病病毒，牛輪狀病毒，3型牛副流感病毒(bpiv-3)，牛冠狀病毒，牛病毒腹瀉病毒(bvdv)，牛呼吸道合胞體病毒(brsv)，感染性牛鼻氣管炎病毒(ibr)，大腸埃希氏菌(escherichiacoli)，多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)，溶血性巴斯德菌(pasteurellahaemolytica)等和其組合。在本發明的再一實施方式中，組合物包含選自豬病原體的免疫原，所述病原體諸如但不限於豬流感病毒(siv)，2型豬圓環病毒(pcv-2)，豬生殖呼吸性症候群病毒(prrs)，假性狂犬病病毒(prv)，豬細小病毒(ppv)，fmdv，豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)，紅班丹毒絲菌(erysipelothrixrhusiopathiae)，多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)，支氣管炎博德特菌(bordetellabronchiseptica)，大腸埃希氏菌(escherichiacoli)等，及其組合。本發明的另一實施方式提供包含藥學可接受的媒質中的至少一種免疫原和乳劑的疫苗組合物。包含病毒，細菌，真菌等的免疫原可通過體外培養方法使用適當的培養基或宿主細胞系和本領域普通技術人員熟知的常規方法產生。例如，prrs可在適當的細胞系，諸如ma-104細胞系中培養(尤其見美國專利系列no.5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。以類似方式，pcv-2可使用pk-15細胞系培養(見美國專利系列no.6,391,314)；siv可培養於蛋(美國專利系列no.6.048.537)；及豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)可培養於適當的培養基(美國專利系列no.5,968,525；us5.338.543；rossr.f.等人,am.j.vet.res.,1984,45：1899-1905)。為了獲得滅活的免疫學，或疫苗組合物，病原體優選在收穫之後滅活及，任選地，利用化學處理使用，例如，福馬林或甲醛，β-丙內酯，乙烯亞胺，二元乙烯亞胺(bei)，和/或物理處理(例如熱處理或超聲處理)來使經歷澄清。本領域技術人員熟知滅活方法。例如，fmd病毒可通過乙烯亞胺(cunliffe,hr,appliedmicrobiology,1973,p.747-750)或通過高壓(ishimaruetal.,vaccine22(2004)2334–2339)滅活，prrs病毒可通過β-丙內酯處理(plana-duran等人,vet.microbiol.,1997,55：361～370)或通過bei處理(美國專利系列no.5,587,164)滅活；pcv-2病毒的滅活可使用乙烯亞胺處理或通過β-丙內酯處理來實現(美國專利系列no.6,391,314)；豬流感病毒可使用去汙劑如triton，或用甲醛處理來滅活(美國專利系列no.6,048,537)；豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)細菌可通過甲醛處理(rossr.f.見上)，通過乙烯亞胺或bei處理來滅活(見wo91/18627)。滅活的病原體可通過常規濃度技術，尤其是通過超濾濃縮，和/或通過常規純化手段純化，尤其是使用層析技術包括但不限於凝膠-過濾，在蔗糖梯度上的超速離心，或選擇性沉澱，尤其是在聚乙二醇(peg)的存在下。在根據本發明的疫苗組合物中有用的免疫原也包括表達載體。該載體包括，但不限於，體內重組表達載體諸如多核苷酸載體或質粒(ep-a2-1001025；chaudhurip,res.vet.sci.2001,70:255-6)，病毒載體諸如但不限於腺病毒載體，痘病毒載體諸如雞痘(美國專利系列no.5,174,993；5,505,941；及5,766,599)或金絲雀痘載體(美國專利系列no.5,756,103)或細菌載體(大腸埃希氏菌(escherichiacoli)或沙門氏菌屬(salmonellasp.))。本發明也包括多價免疫學組合物或組合疫苗組合物的製劑。例如，根據本發明製備的組合牛細菌苗中有用的抗原包括，但不限於，牛支原體(mycoplasmabovis)，巴斯德菌屬(pasteurellasp.)，特別多殺巴斯德菌(p.multocida)及溶血性巴斯德菌(p.haemolytica)，嗜血桿菌屬(haemophilussp.)，特別睡眠嗜血桿菌(h.somnus)，梭菌屬(clostridiumsp.)，沙門氏菌屬(salmonella)，棒桿菌屬(corynebacterium)，鏈球菌屬(streptococcus)，葡萄球菌屬(staphylococcus)，莫拉菌屬(moraxella)，大腸埃希氏菌(e.coli)等。本發明還提供在宿主，例如，動物中誘導免疫應答的方法，包括給宿主施用本發明的免疫學組合物或疫苗組合物。以此方式引發的免疫應答顯著地是抗體和/或細胞免疫應答，及尤其是，γ-幹擾素應答。尤其是，本發明提供針對，或防止或減少通過動物被病原性生物的感染(例如,通過病毒,細菌,真菌或原生動物寄生蟲感染)導致的症狀免疫的方法。本發明的方法在下列脊椎動物中有用，包括但不限於人，狗(例如,狗)，貓(例如,貓)；馬(例如,馬)，牛(例如,牛)和豬動物(例如,豬)，以及禽，包括但不限於雞，火雞，鴨，鵝，鵪鶉，雉雞，鸚鵡，雀，鷹，烏鴉和平胸鳥(鴕鳥,鴯鶓,鶴鴕,等)。在本發明的特定方面，這些方法由在分娩之前通過施用根據本發明製備的疫苗組合物給懷孕的雌性疫苗接種組成。這些方法還包括：通過疫苗接種流程引發的保護性抗體的誘導和這些保護性抗體從免疫接種的懷孕的雌性到它們的後代的轉移。該母源抗體的轉移隨後保護後代免於疾病。根據本發明製造的疫苗組合物的劑量會依賴於待免疫接種的動物的物種，品種，齡，尺寸，疫苗接種歷史，及健康狀態。其他因素如抗原濃度，額外的疫苗組分，及施用途徑(即,皮下,真皮內,口腔,肌內或靜脈內施用)也會影響有效劑量。待施用的疫苗劑量可基於疫苗的抗原濃度，施用途徑，及待免疫接種的動物的齡和病情容易測定。各批的抗原可個別校準。或者，無需過度實驗，不同劑量的系統免疫原性試驗，以及ld50研究和其他篩選過程可用於測定根據本發明的疫苗組合物的有效劑量。從以下顯示的實施例，容易得知何近似的劑量及和何近似的體積對於使用本文所述的疫苗組合物適當。關鍵因素是劑量提供至少部分針對天然的感染的保護性效應，如通過與天然的感染關聯的死亡率和病態的減小所證明。適當的體積同樣由本領域普通技術人員容易查明。例如，在禽物種中，劑量體積可約0.1ml～約0.5ml及，有利地，約0.3ml～約0.5ml。對於貓，狗和馬物種，劑量體積可約0.2ml～約3.0ml，有利地約0.3ml～約2.0ml，及更有利地，約0.5ml～約1.0ml。對於牛和豬物種，劑量體積可約0.2ml～約5.0ml，有利地約0.3ml～約3.0ml，及更有利地0.5ml～約2.0ml。重複的疫苗接種可優選為周期性時間間隔，以起初增強免疫應答或當自最後劑量起長時間逝去。在本發明的一實施方式中，作為腸胃外注射(即,皮下,真皮內或肌內)施用疫苗組合物。組合物可作為一個劑量施用，或在替代實施方式中，以約2～約6周，優選約2～約5周的間隔提供的約2～約5個劑量的重複的劑量施用。但是，本領域技術人員會真可，劑量數和疫苗接種之間的時間間隔依賴於許多因素，包括但不限於免疫接種的動物齡；動物情況；免疫途徑；每劑量可利用的抗原量；等。對於初始疫苗接種，周期通常會相比1周更長，且優選會在約2～約5周之間。對於之前免疫接種的動物，追加疫苗接種，懷孕之前或期間，可以約每年間隔進行。本發明也涵蓋使用無針注射器諸如或(bioject,oregon,usa)施用疫苗組合物。本領域普通技術人員能無需過度實驗，關於因素諸如待免疫接種的動物的物種；動物的齡和重量，等需要調整注射器的規格。在本發明的一實施方式中，方法包括用本發明的乳劑配製的疫苗組合物的單次施用。例如，在一實施方式中，疫苗組合物是滅活的fmd病毒組合物，而替代實施方式提供包含滅活的pcv2病毒組合物的疫苗。其他免疫學組合物或疫苗適合於在單劑量方案中使用，包括但不限於滅活的豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)，prrs和siv。本發明還涉及治療宿主，例如，動物的方法，包括給宿主施用根據本發明製備及包含至少一種選自下列的免疫原的藥物組合物：蛋白或肽，滅活的或減毒的病毒，抗體，過敏原，cpgodn，生長因子，細胞因子或抗生素，及尤其是cpgodn或細胞因子。這些藥物組合物可用於改善動物諸如雞，豬，牛(cow)或牛(cattle)的生長性。本發明還涉及試劑盒，起包含含有與根據本發明製備的乳劑組合的成分諸如純化的免疫原的單個瓶。試劑盒可替代性地包含第1瓶，起含有與皂苷和氫氧化鋁組合的成分諸如免疫原或藥物組合物，及第2瓶，起含有根據本發明製備的乳劑。免疫原可為本文所述的幹形式，乾燥的形式或水溶液。以下通過下列非限制性實施例的方式進一步描述本發明。【實施例】【實施例1：乳劑製備方法】通過轉相方法製備乳劑。在第1步驟中，將水相和油相於+40℃混合在一起。在第2步驟中，將乳劑漸進地冷卻到+5℃pit以下，以便獲得o/w乳劑。轉相之後，將最終乳劑(即疫苗製劑)混合及隨後存儲於+5℃(總結於表1)。表1*濃度/量範圍○氫氧化鋁-約0.0％～約1.0％(w/v)，相對於疫苗製劑體積○皂苷-約0.1mg～約2mg/ml疫苗製劑○抗原-約0.1μg～約200μg/ml疫苗製劑○m102&磷酸鹽到體積將山梨糖醇酐單油酸酯(span)和山梨糖醇酐三油酸酯(20oe)(tween)引入油相。山梨糖醇酐單油酸酯(20oe)(tween)在石蠟油中不混溶。在相同的緩衝劑(例如，磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑(ph7.8))中作為疫苗製備tween的20％(w/v)溶液。當攪拌停止時，乳劑變化為水包油乳劑。將乳劑放入5℃的冷室至少4小時。在此階段，乳劑是含有50％的油相的預製乳劑。第2步驟：用含免疫原(滅活的fmdv,豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)免疫原,或pcv-2免疫原,以上描述的)，皂苷和氫氧化鋁的120ml的磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑ph7.8製備水相#2。將在第1步驟中製備的預製乳劑冷卻到約5℃，通過添加半體積的水相#2，於相同的溫度稀釋，及通過旋轉磁條1分鐘來混合。tsap乳劑中的最終表面活性劑濃度是4.75％(w/v)。一般而言，以下列順序加入本文公開的疫苗製劑的組分：(1)介質102於5℃，(2)皂苷，(3)氧化鋁氫氧化物，(4)抗原和(5)不完全的乳劑(即油相加水相#1的組合)。如本文製備，tsap疫苗於5℃穩定達36個月。使用相同的製備方法，其他乳劑可如以下預示例中描述獲得：【tsap-2乳劑】tsap-2乳劑是含有33％的油相的o/w乳劑。油相(120ml)含有marcol88％v/v，span1.8％w/v和tween10.2％w/v。水相#1(120ml)含有磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑(ph7.8)97.75％v/v，及lutrol0.75％w/v。水相#2(120ml)由磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑(ph7.8)，皂苷，氫氧化鋁構成，及任選地含有免疫原。tsap-2乳劑中的最終表面活性劑濃度是約4.25％w/v。【tsap-3乳劑】tsap-3乳劑是含有50％的油相的o/w乳劑。油相(160ml)含有marcol92％v/v，span1.8％w/v和brij6.2％w/v。水相#1(160ml)含有磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑(ph7.8)98.5％v/v，及lutrol0.5％w/v，皂苷，氫氧化鋁，及任選地含有免疫原。tsap-3乳劑中的最終表面活性劑濃度是約4.25％w/v。【tsap-4乳劑】tsap-4乳劑是含有10％的油相的o/w乳劑。油相(120ml)含有marcol60％v/v，span17.2％w/v和arlatone22.8％w/v。水相#1(120ml)含有磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑(ph7.8)97.5％v/v和tween2.5％w/v。用400ml的磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩衝劑ph7.8，皂苷，氫氧化鋁，及任選地含有免疫原的製備水相#2。將100ml的預製乳劑用400ml的水相#2稀釋而獲得tsap-3乳劑。tsap-4乳劑中的最終表面活性劑濃度是4.25％w/v。【實施例2：乳劑的轉相溫度(pit)的確定】將10ml的tsap乳劑放入在約25℃溫度的水-浴中的玻璃管。tsap乳劑是白色均質乳劑。水浴中的溫度漸進地增加。視覺觀察乳劑中的變化(乳劑由於黃-棕色油相向表面的遷移而成為2個分離的相)。此變化是乳劑分層的特徵。觀察到此變化的溫度是乳劑的pit值。對於tsap乳劑，pit是約36℃～46℃。圖1～5提供對根據本發明製備的疫苗製劑的pit確定圖(1年穩定性研究)。圖6提供對根據本發明製備及存儲36個月的疫苗製劑的pit確定圖(3年穩定性研究)。【實施例3：研究#1：根據實施例1製備的疫苗製劑的穩定性】此表顯示根據在實施例1中描述的方法製備的疫苗製劑的穩定性(即製劑保持水包油乳劑的以月計算的時間)。製劑包含指示的成分(見製劑1～13)，及用於各這些製劑的抗原包含被認為中度到高度純化的滅活的fmd病毒分離物。如表2顯示，氫氧化鋁的存在提供增加的疫苗穩定性，尤其當使用抗原的最高濃度時(將製劑9,11和13的增強的穩定性與在12個月的製劑3,5和7相對減少的穩定性比較)。平均起來，含有更高抗原的製劑(即製劑9,11和13)中氫氧化鋁的存在增加油/水穩定性時間從約3～6個月(即對於製劑3,5和7觀察到的油/水穩定性)到約12個月(即對製劑9,11觀察到的油/水穩定性)，或甚至到約24個月(即對於製劑13觀察到的油/水穩定性)。表2試驗12345678910111213抗原(μg/劑量)0156015601560156015601560皂苷(mg/劑量)0000.50.511000.50.511al(oh)3(％最終)00000000.3.3.3.3.3數劑量75757575757575757575757575t0moso/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wt3moso/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wt6moso/wo/ww/oo/ww/oo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wt9moso/wo/ww/oo/ww/oo/ww/oo/wo/wo/wo/wo/wo/wt12moso/wo/ww/oo/ww/oo/ww/oo/wo/wo/wo/wo/wo/wt24moso/wo/ww/oo/ww/oow/w/oo/ww/oo/ww/oo/wo/w【實施例4：研究#2：根據實施例1製備的疫苗製劑的穩定性】如在實施例1中所述及根據表3中顯示的組分量製備疫苗製劑。如前所述，組分的添加順序是：(1)介質102，(2)皂苷，(3)氧化鋁氫氧化物，(4)純化的抗原，及(5)不完全的乳劑(在實施例1中，不完全的乳劑定義為油相加水相#1)。純化的抗原是fmdv抗原o1campos，a24cruzeiro和c3indaial。使用介質102(m102,以下顯示的處方)調整總體積。表3表4組分描述1l的m102濃儲物溶液mgcl295170mmkcl190400mmcacl2238260mmchcl35ml純丙氨酸276g-葡萄糖18804500mm碳酸氫鈉21802540mm腖3000g-乳清蛋白水解產物4000g-根據表5測定疫苗穩定性。表5*對於無氧化鋁凝膠的疫苗**在穩定性研究結尾實施的對照對於各疫苗製劑，如在實施例2中所述測定轉相溫度(pit)。以「血紅細胞凝集素單位」(uh)/疫苗劑量顯示添加的抗原量。表6總結pit數據及顯示，pit保持基本穩定達36個月。圖6提供對試驗1～10的疫苗製劑的通過導電率的pit確定的圖(總結於表6)。用皂苷-輔佐的制(即試驗3,4,6,7,9和10)劑觀察到的pit的增加獨自構成相對於非-皂苷-輔佐的製劑(即試驗2,5和8)的穩定性的改善。表6乳劑的粒子粒度分布(表7)在36個月時期保持在研究標準設定的範圍之內。表7【實施例5：在施用多劑量的用tsap乳劑輔佐的口蹄疫(fmd)病毒疫苗之後的血清學結果-牛研究】材料和方法：將12～14月齡，未免疫接種及無fmd抗體的90頭牛選擇，隨機化及分配為待免疫接種的9隻動物的10個組。將動物用指示的疫苗製劑(9807-9814)在第1天免疫接種。根據實施例1製備表8，9，10和11中列的各製劑，並包含在實施例1中提到的全部組分，如下改變皂苷和氫氧化鋁量：皂苷的量為0，0.7，1.3或2.7mg/劑量，且algel氫氧化鋁的量為0％或0.37％。將8組通過肌內途徑免疫接種(im組)，將2組通過皮下途徑免疫接種(sc組)。將im組的各動物用相應疫苗在第56天通過肌內途徑及在第84天通過皮下途徑再疫苗接種。將sc組的各動物用相應疫苗在第56和84天通過皮下途徑再疫苗接種。表8總結疫苗製劑的穩定性。表8通過肌內途徑第1疫苗接種之後無任何損傷。通過肌內途徑第2疫苗接種之後有一些損傷，但全部這些損傷在通過肌內途徑第2疫苗接種之後28天後退去。表9總結疫苗製劑的安全性，如在特定的日期通過動物體重測量顯示。表9結果：表10總結實驗試驗期間收集的血清學數據。o1campos，a24cruzeiro和c3indaial是fmd病毒的3個獨立血清型，且o1，a24和c3抗體的存在是疫苗製劑在受疫苗接種者中引發免疫應答的陽性指示。「g1」表示肌內施用疫苗製劑，「g2」表示皮下施用疫苗製劑。對於本發明，特別對於fmd病毒抗原，有抗體滴度(即o1campos,a24cruzeiro和c3indaial的血清水平)和相當的群保護(epp)數之間的強的，直接關聯。簡言之，當抗體滴度高時，免疫接種動物被相應地高度保護免於病毒感染。意外地，氫氧化鋁的存在相關於依賴於施用途徑的免疫應答中的顯著差異。當氫氧化鋁存在時，如在製劑9812g1和9812g2中，當皮下施用疫苗製劑時，有受疫苗接種者免疫應答的顯著增加，如通過抗體滴度測量。對於不含有氫氧化鋁，即9811g1和9811g2的對應疫苗製劑，無由於施用途徑的功效的類似顯著差異。目前不知道此由於氫氧化鋁存在同時皮下施用途徑的使用的增強的免疫應答的原因，但本發明的有效實施方式可包括，但不以任何方式限於，依賴於當前和未來功效(例如抗體滴度)數據改變疫苗施用途徑。相比非-皂苷-輔佐的對照疫苗製劑(即9807&9808)，皂苷-輔佐的疫苗製劑在研究動物中引發針對全部3種fmd病毒抗原的更快速免疫應答，如在第21天皂苷-輔佐的製劑的更高平均抗體滴度顯示。總之，證據表明，本發明提供改善的穩定性及致使相比非-皂苷輔佐的製劑更快速免疫應答。表10g1-疫苗製劑肌內施用g2-疫苗製劑皮下施用【實施例6：在施用2劑量的用tsap乳劑輔佐的口蹄疫(fmd)病毒疫苗之後的血清學結果-豬研究】材料和方法：將未免疫接種及無fmd抗體的57頭豬選擇，隨機化及分配為待免疫接種的6隻動物的9個組及不待免疫接種的3隻動物的1個組(非-免疫接種的動物)。將動物用指示的疫苗製劑(a-i)在第1天免疫接種。根據實施例1製備表11中列的各製劑，並包含在實施例1中提到的全部組分，皂苷和氫氧化鋁如下改變：皂苷的量是0，0.7，1.3或2.7mg/劑量，algel氫氧化鋁的量是0％或0.37％。通過測量包括直腸溫度和動物對疫苗接種的反應的視覺標誌的幾個參數來評定疫苗製劑安全性。表11結果：全部含有抗原的疫苗製劑(表11中描述的製劑b-i)在測試動物中誘導顯著大於由無抗原對照(表11中描述的製劑i)誘導的抗體應答的抗體應答。含有皂苷的製劑相比不含有皂苷的製劑誘導相對更大抗體應答。表12總結抗體滴度數據，及重述各製劑的抗原，皂苷和氫氧化鋁的量。尤其是，抗體滴度數據表明，相對於不含有皂苷的疫苗製劑，疫苗製劑中存在約0.7mg/劑量和約2.7mg/劑量之間的皂苷增加抗體應答。表12【實施例7：豬中3種實驗fmd疫苗的保護性劑量50％(pd50)的確定】概觀.研究的目的是測試本發明的3種實驗fmd疫苗製劑的在豬中針對fmd強毒攻擊的功效。分別用無抗原(a)，及改變劑量的用本發明的佐劑配製的滅活的純化的fmdo1manisa抗原(疫苗b,c和d)製備4種疫苗(a,b,c和d)。疫苗提供為填充到25ml的30ml瓶，劑量是2ml/劑量。攻擊株是fmdo1manisa，4494024d：911，20-07-1994(起已原本分離為o1manisaturkey1/78)，且次級豬腎細胞中的滴度是7.67log10tcid50/ml。用於攻擊株的稀釋劑是含標準抗生素的hanksmem，2％胚胎牛血清(fbs)。過程.將無fmdv及未之前針對fmd免疫接種的豬用於研究。在實驗過程前將10周(加或減1周)齡的各47頭豬習服至少24小時。將豬每室圈養2～3隻動物，及飼餵標準顆粒飼料及使隨意飲水。在第1天(d1)，將豬(無論性別)分配到3隻動物的15個組和2隻動物的1個組。將各組在一特定室內圈養，及在各室內，將動物用木板(1.5m)個別隔離免於攻擊，直到完成研究。在d0，將動物在左側耳之後用個體注射器根據表13和14肌內免疫接種。疫苗接種之前，將疫苗瓶輕輕倒置約10次，以確保均質懸浮液。表13-疫苗組合物表14-疫苗接種總結組疫苗劑量注射的疫苗體積(ml)#豬b1b劑量2.03b2b1/2劑量13b3b1/4劑量0.53b4b1/8劑量0.253b5b1/16劑量0.133c1c劑量2.03c2c1/2劑量13c3c1/4劑量0.53c4c1/8劑量0.253c5c1/16劑量0.133d1d劑量2.03d2d1/2劑量13d3d1/4劑量0.53d4d1/8劑量0.253d5d1/16劑量0.133(對照)122攻擊.在d28，稀釋o型fmd病毒以獲得100,000tcid50/ml(將病毒濃儲物稀釋2.67log10,或468倍)。在同日，通過施用stressnil(1ml/20kg)和氯胺酮(2ml/20kg)通過im途徑麻醉全部動物，及用10,000tcid50的病毒在0.1ml下通過真皮內途徑攻擊到左後足的外爪足跟小球內。從d0到d28每天檢查動物的一般健康。注意任何臨床觀察和治療。攻擊之後，每天觀察動物持續7天(d29～d35)。以相同的順序進行觀察，開始於有用最高劑量免疫接種的動物的室到有用最低劑量免疫接種的動物的室，及結束於對照(組a)。每天檢查一般健康，特別注意鼻及足上的fmd的跡象。在疫苗接種前(在d1或d0)，攻擊之前及在研究結束時d14和d28自各動物收集血。將樣品熱滅活(56℃持續30分鐘)，並通過vn測試在全部血清中測定o型fmdvab滴度(merialr&d,lelystad)。在d36(觀察時期結束)，將動物安樂死(4～6ml/50kgivt61)和緊密檢查fmdv跡象。將用全劑量的疫苗免疫接種的組(組b1,c1或d1)中觀察到的任何損傷採樣及於-70℃冷凍而用於進一步病毒分型。在鼻，口和/或足(除了接種的足的主爪)上損傷的存在被認為是fmd的證據。由於符合標準，測試被認為有效，這顯示兩個對照豬必顯示fmd臨床體徵。通過spearmankarber方法計算各疫苗的pd50。結果.效力對比淨荷顯示於圖9，並將關聯研究數據數值總結於以下表15和16。表15表16使用邏輯回歸的疫苗效力的計算疫苗淨荷(μg)pd50ic95-ic95+b0.43.5941.60462.896c24.58211.70212.6979d1011.79.53351.55當前第1頁12