檢測ncRNA的方法

2024-01-19 10:20:15

專利名稱：檢測ncRNA的方法
背景技術：
通常來說，癌症的基本原理是細胞生長控制機理的失控以及由此而導致的細胞非正常增殖。傳統上，腫瘤形成和發展的普遍範例是細胞基因的編碼區和調控區的變異累積比如致癌基因和腫瘤抑制基因。這些變異導致正常細胞中控制細胞增殖與發育的信號程序混亂。然而，最近有研究揭示了一類新的RNA，被稱作非編碼RNA(ncRNA)(也被稱作功能RNA，或者fRNA)。ncRNA包括一系列的RNA分子，包含但不限於miRNA(微小RNA)、rRNA(核糖體RNA)、siRNA(小型幹擾RNA)、snRNA(小型核RNA)、snmRNA(小型非信使RNA)、snoRNA(小型核仁RNA)和stRNA(小型暫時RNA)，這些ncRNA的功能多種多樣並且正在確定中。許多ncRNA分子與蛋白質結合形成核蛋白(RNP)複合體。
miRNA是ncRNA系統中比較令人感興趣的成員之一。現已經確認miRNA對細胞的生長、發育和動態平衡很重要，研究表明這些miRNA與多種疾病狀態相關，例如癌症。miRNA是由大型髮夾前體剪切而成的小型核苷酸轉錄子。在某些實施例中，miRNA的長度是19-23核苷酸。研究表明，Dicer蛋白以及相關蛋白參與RNA髮夾前體的剪切以形成miRNA(Hutvagner et al.，Science 293834-838，2001；Ketting et al.，Genedevelopment.152654-2659，2001)。許多miRNA通常具有高度保守序列，存在於生物體的基因組中，例如線蟲、果蠅、兔子、小鼠和人，但不限於這些(Lagos-Quintata et al.，Science 294853-8582001；Lagos-quintata etal.，Curr Biol 12，735-739，2002；Lee and Ambros Science 294862-86 2001；Mourelatos et al.Gene Development.16720-7282002；Dostie et al.RNA9180-186，2003)。在某些情況下，miRNA在基因組中成簇分布，有時被間隔分離成短的核苷酸片斷。
關於miRNA的作用，有多種意見。miRNA被假定為參與調節mRNA的穩定性和翻譯、異染色質的形成、基因組的重組以及DNA的切除(Baulcombe Science 2972002-2003，2002)。線蟲miRNA調整異染色基因的翻譯(banerjee et al.，BioEssays，24119-129，2002)。線蟲的兩個miRNA即lin-4和let-7，通過與目標mRNA 3』UTR內的元素形成非完全鹼基配對和削弱它們的翻譯，來控制發育時間(Lee et al.，Cell 75843-854，1993；Wightman et al.，Cell.75(5)855-62，1993)。已知擬南芥中的一個特殊的miRNA能指引那些編碼幾個公認轉錄因子的轉錄子的剪切(Llave et al.，Science，297；2053-2056，2002)。Drosophila bantam基因編碼一種能調節細胞增殖和前凋亡基因(pro-apoptotic gene)隱藏的miRNA(Brennecke et al.，Cell，11325-36，2003)。越來越多的證據證明，miRNA是一類重要的調節分子。
假設miRNA調節基本生物程序，並且多種人體症狀改變了很多這些程序，那麼確定miRNA是否在這些症狀中起作用就非常重要。例如，最近發現miRNA涉及到眾多類型細胞的癌變、發育以及分化。
Metzler等人(Gene Chromosomes Cancer，39(2)167-9，2004)近來報導，在患Burrkitts淋巴癌的小孩中mir-155/bic RNA表達很明顯地被上遊調節(up-regulated)。Michael等人的最近研究顯示，在結腸直腸癌中特定miRNA累積減少。Calin等人(Proc Natl Acad Sci USA.，99(24)15524-9，2002)發現慢性淋巴細胞白血病(CLL)與13號染色體的一個區域缺失有關，該區域包含miRNA的miR-15和miR-16的編碼區。在大多數CLL樣本中(～68％)，他們發現這些miRNA要麼缺失要麼下遊調節(down-regulated)。CLL中最頻繁的染色體異常是13q14半合子和/或純合子的缺失。在大約50％的披風淋巴細胞瘤、16-40％的多樣骨髓瘤和60％的前列腺癌中也出現這個區域的缺失，表明此位點與一個或多個腫瘤抑制基因有關。儘管有多個小組進行了詳細的遺傳分析，包括雜合性缺失(LOH)拓展分析、變異、表達研究，並沒有證明缺失區域中的任何基因有穩定的聯繫。如果13q14miRNA的R-15和R-16位點的缺失對CLL的形成很關鍵，那麼Calin等人提供的數據與下述觀點相一致，即一種miRNA可能抑制一種腫瘤。
癌症也有可能是因致癌基因轉移到miRNA位點而產生。一個可能的例子就是MYC轉移至miRNA的mir-142位點，MYC表達的強上遊調節引發了一種侵略性B細胞白血病(Gauwerky et al.，Proc Natl Acad Sci USA86，8867-8871，1989)。MYC基因轉位於mir-1423』末端下遊的4個核苷酸處，很有可能受上遊miRNA啟動子的控制。小鼠和人包含EST序列的mir-142基因比對顯示，mir-142髮夾下遊大約有20個核苷酸保守序列元素在遷移過程中丟失(Lagos-Quintana et al.，Curr.Biol.12735-739，2002)。這就表明在假定的mir-142/MYC融合中的保守下遊序列元素的缺失，阻止了將轉錄子識別為miRNA前體從而被正確剪切，由此可能導致融合轉錄子的大量累積和MYC的過量表達。因此，miRNA通過多種方式影響疾病症狀例如癌症，鑑定miRNA將有可能幫助了解疾病症狀生化機理中miRNA機理的協同作用。
根據Sempere等人(Genome Biol，5(3)R13.Epub 2004Feb 16，2004)最近報導，已經鑑定出一類表達腦的miRNA，它們的表達行為在小鼠和人的分化神經元中很保守。這些數據表明這些miRNA在正常哺乳動物的神經元發育和/或功能中起作用。此外，Houbavity(Dev Cell.5(2)351-8，2003)從沒有分化和已經分化的小鼠胚胎幹細胞中鑑定了一組miRNA分子，其中有些miRNA分子特別局限於幹細胞。這些胚胎特異性miRNA分子在胚胎幹細胞將要分化時被抑制。這表明miRNA分子在維持多能細胞狀態和指導早期的哺乳動物發育中起作用。
從人類中大約鑑定出220miRNA，大多數被鑑定的miRNA與重要的生物學功能相關(http//www.sanger.ac.uk)。通過生物信息學的方法，Bartel和Burge(2003)估計可能有高達1％的人類基因組編碼miRNA。我們剛剛開始探討miRNA分子在正常組織發育和細胞功能中的作用。然而因缺乏有效地分析工具，嚴重阻礙了ncRNA領域的研究。為了促進對ncRNA分子例如miRNA的研究，需要及時發展有力的工具。本發明提供了多種鑑定和分析miRNA的方法。本發明方法也適用於其它ncRNA，對本領域技術人員來說，這是顯而易見的。


圖1所示為本發明miRNA檢測方法中的一個實施例。在該實施例中，所獲得的寡核苷酸連接到中心彩色編碼的實心(solid)微球體(它作為底物並且包含第一信號標籤)。
圖2所示為從同一個體的正常乳房組織和乳房癌組織所獲得的兩對匹配樣本(5386N和5386T；31828N和31828T)RNA中挑選的miRNA分子種類的輪廓圖。上半圖中，Y軸表示所檢測的每個miRNA的MFI；在下半圖中，Y軸表示每種所檢測miRNA的標準讀數，X軸表示所檢測miRNA分子的種類。
圖3所示為從正常乳房組織和乳房癌組織中所得的RNA中挑選的miRNA族的輪廓圖。上半圖中，Y軸表示所檢測的每個miRNA的MFI；在下半圖中，Y軸表示所檢測的每種miRNA的標準讀數。X軸表示所檢測的miRNA的種類。
圖4所示為從正常神經元細胞和挑選的神經膠質瘤細胞系中所得的RNA中挑選的miRNA族的輪廓圖。Y軸表示所檢測的每個miRNA的MFI，X軸表示所檢測miRNA的種類。
圖5所示為從正常神經元細胞和挑選的神經膠質瘤細胞系中所得的RNA中挑選的miRNA族的輪廓圖。Y軸表示所檢測的每種miRNA的MFI標準讀數，X軸代表所檢測miRNA的種類。

發明內容
ncRNA檢測的現有技術現有技術採用各種傳統方法來檢測ncRNA。目前所採用的方法包括Northern印跡、點陣法(array based methods)和RNA酶保護法。採用Northern印跡來檢測ncRNA分子，通常每次分析需要15-20微克的總RNA，主要用於研究某種特定的ncRNA。總RNA(或者通過大小分級而富集的RNA)跑標準凝膠後被轉移到膜上。與待測RNA族互補的標記探針例如放射性標記探針，和特定檢測中的目標RNA種類進行雜交。這種方法耗時、費力，需要大量的總RNA。另外，如果這些miRNA在長度上能夠分開的話，一個雜交只能研究某個特定的ncRNA分子或者少量的ncRNA分子的表達。儘管將膜剝開後能夠再用於其它RNA種類的研究，但多次使用同一塊膜使得這些試驗結果難以比較。
Krichevsky等人(RNA，9(10)1274-81，2003；Erratum inRNA，10(3)551，2004)報導了採用印跡排列(printed array)來研究ncRNA尤其是miRNA的表達。將長度為54-72個核苷酸的最終濃度為7微摩爾的三聯寡核苷酸(與待分析的miRNA分子互補)點於GeneScreen Plus(NEN)膜上。每個實驗中取5-10微克來自腦組織的miRNA作探針。該miRNA探針通過T4多聚核苷酸激酶進行γ33P dATP(3000Ci/mmole)標記。進行雜交反應通常需要過夜，需要大量清洗以獲得最佳特異性。雖然印跡排列法能在同一個實驗中分析多種miRNA的表達，但它的特異性和靈敏度受到樣品製備、探針標記效率、雜交和清洗的限制。由於許多miRNA、尤其是那些屬於同一家族的都具有大量同源性保守序列，印跡排列法檢測的特異性受到嚴重限制。
RNA酶保護法是基於溶液雜交方法來分析ncRNA，例如miRNA分析(www.ambion.com)。在該方法中，miRNA可以用體外轉錄(IVT)而成的由29個核苷酸組成的放射性標記探針來檢測。該探針的5』端有10個核苷酸序列與miRNA序列不互補，並且可以被RNA酶剪切。在42℃培養15個小時，反應用RNA酶A和T1在37℃處理至少30分鐘。沉澱，回收被保護的片斷，在改性聚丙烯醯胺凝膠上進行分析。溶液雜交法比Northem法的敏感性高10倍，能從1微克總RNA中檢測到miRNA分子。然而，它依然需要準備放射性體外轉錄探針，而且讀數這一步可能需要跑多塊改性聚丙烯醯胺凝膠，因為每塊凝膠只能分開大小不同的miRNA。
以上所述的三種常用方法都具有相同的局限性。每種方法都很麻煩，因為都需要採用耗時費力的步驟，比如探針的放射性標記、過夜雜交、改性凝膠電泳、大量的清洗步驟、X射線膠片曝光以及定量分析的圖像數位化。此外，除印跡排列法之外，這些方法都同時在分析多種miRNA方面受到限制，而且並不適合於表達圖譜的分析。本發明方法不像上述方法那樣費力，比如需要製備探針，而且整個實驗能夠在一個小時以內完成。
另外，上述方法在檢測少量ncRNA時敏感性低。檢測一種特定的ncRNA族，通常需要10-20微克的總RNA。在這個靈敏度上，一個實驗室將不得不分配用於準備樣品RNA的重要資源。下面實施例部分的結果顯示，所公開的ncRNA檢測方法只需要50ng的總RNA就能檢測到RNA族的表達。
最後，上述方法和當前技術在要求區分高度同源ncRNA族時缺乏特異性。許多ncRNA例如miRNA具有大量的序列同源性，被分成不同的家族。在ncRNA家族成員中通常只有一個核苷酸鹼基不同。這種同源性使得Northen印跡或者點陣法(array-based methods)很難區分高度保守的ncRNA家族成員。如以下所描述的，採用釘入(spiked)短LAN的寡聚核苷酸極大增加了檢測的特異性，即使只有單個核苷酸鹼基差異的ncRNA種類也能檢測出來。
ncRNA檢測方法概述本發明公開了一種能有效檢測ncRNA分子(在此特指目標RNA)的方法。說明書中的ncRNA是指所有的小型RNA分子，尤其包括但不限於miRNA、siRNA以及stRNA。在一個實施例中，ncRNA長度為5到500個核苷酸。在另一個實施例中，ncRNA長度為5到100個核苷酸。在又一個實施例中，ncRNA長度為5到40個核苷酸。本發明所公開的方法能夠檢測所有已知和未知的ncRNA分子。在一個實施例中，所公開的方法用於檢測miRNA分子。為了例證權利要求中的方法，公開的方法用於檢測miRNA分子。但是，該方法並不僅限於檢測miRNA分子，而應當理解為可以應用於檢測所有的ncRNA分子。
該檢測方法可以應用於許多場合。在一個實施例中，該檢測方法能夠用來生成目標樣本中所含有的各種各樣ncRNA族的圖譜。在一個具體的實施例中，ncRNA是miRNA。本申請中所公開的新穎獨特的ncRNA檢測方法，首次實現了高效、輕鬆地對多種ncRNA族圖譜的分析。
在另一實施例中，所公開的檢測方法能夠用於生成某種疾病或症狀的各種ncRNA圖譜，例如但不限於癌症，為這種疾病或症狀創建ncRNA標籤。一種途徑是，先得到具有該種疾病或症狀的第一個樣品並確定它的ncRNA圖譜；再得到不具有這種特定疾病或症狀的第二個樣品並確定它的ncRNA圖譜。如果需要的話，可以獲得多個第一和第二個樣本。比較第一和第二樣本的ncRNA圖譜，標出有差異(例如表達增加或表達減少)的ncRNA。這些ncRNA族組成了這種疾病或症狀的ncRNA分子標籤。在一個實施例中ncRNA就是miRNA。第一和第二樣本可以來自同一個體或者不同個體。在一個實施例中，第一和第二樣本都是從同一個體中獲得。一個獨特的應用就是，通過挑選呈現期望特徵的第一和/或第二樣本，ncRNA分子標籤可能與這種疾病或症狀的特徵相關聯。疾病或症狀的特徵包括但不限於疾病或症狀的進展/發展狀態、這種疾病或症狀對某一特別藥物、療法或治療的反應。例如，假設這種疾病或症狀是乳腺癌。第一樣品可以來自對藥物A有反應的乳腺瘤，第二個樣品是正常乳腺組織。確定ncRNA分子標籤。重複以上步驟，除非從乳腺瘤中獲得的第一樣品對藥物B起反應。通過比較所獲得的兩類樣品的ncRNA圖譜，就可獲得與藥物反應相關的ncRNA分子標籤。
疾病或症狀的分子標籤可以應用於很多方面。可以將從個體中所獲得的分子圖譜和該種疾病或症狀的分子標籤進行比較。通過這種比較的方式，可以將該個體分類為已經具有這種疾病或症狀或者是正面臨這種疾病或症狀的危險。另外，也可以用這種比較方式來確定對藥物、療法或治療的潛在反應。而且，也可以用這種比較方式來確定該種疾病或症狀在該個體的發展狀態。另外，疾病或症狀的ncRNA標籤也可以用於監控該疾病或症狀的進展。疾病或症狀的ncRNA標籤還可以用來監控藥物、療法或治療的效率。
在另一實施例中，所公開的檢測方法可以用來鑑別治療某種疾病或症狀的潛在藥物耙標。如以上討論，可以產生某種疾病或症狀的ncRNA標籤。通過確定表現某種特殊疾病或症狀的特徵ncRNA族的特性，就可以識別引起這種疾病或症狀的分子途徑中的分子耙標。這些分子耙標為治療和/或預防某種疾病或症狀的藥物開發提供了新的治療侯選物。在此方法中，某種疾病或症狀的分子標籤可以按以上描述獲得。標出表現這種疾病或症狀特徵的ncRNA分子。ncRNA分子的特性可以用來確定參與這種疾病或症狀的分子途徑的分子耙標。在一個實施例中，ncRNA就是miRNA。
在所描述的檢測方法中，可以採用經過修飾的核苷酸來提高與目標RNA序列互補的俘獲及檢測寡核苷酸的Tm。在本領域中已經公知足夠的用於該目的的多種修飾核苷酸。在一個實施例中，修飾的核苷酸是鎖定核酸或者LNATM。在另一個實施例中，修飾核苷酸包含肽核酸(PNA)。也可以採用本領域中公知的或開發的其它的修飾核苷酸。如下所述，採用修飾的核苷酸來提高俘獲及檢測寡核苷酸的Tm，能夠提高目標RNA檢測的特異性和敏感性。而且，通過將一個或修飾的核苷酸結合進本發明的俘獲與檢測寡核苷酸(下文詳述)，可以將俘獲及檢測寡核苷酸與目標RNA互補序列結合的Tm值設計成大約一致。這裡所述的LNA鹼基或核苷酸特指核苷在2』-氧和4』-碳原子與亞甲基相聯接的雙環核苷酸。包含LNA核苷酸的寡核苷酸對互補DNA和RNA呈現空前的熱穩定性。平均起來，每個修飾(釘入spiked)的LNA核苷增加LNARNA雜交的Tm值7.3℃。包含LNA的寡核苷酸的高結合親和力允許用更短的寡核苷酸序列作為探針，而且使得包含LNA的寡核苷酸成為辨別錯配的優秀探針。
可以用DNA合成器採用標準的磷醯胺化學法合成LNA寡核苷酸。LNA可以和DNA、RNA以及其它核酸類似物混合。可以用生物素、cy染料或現有技術中公知的其它染料合成。含LNA的寡核苷酸是水溶性的，與DNA和RNA鹼基配對具有異常的高熱穩定性。Exiqon(丹麥)開發了一種軟體，用於預測包含LNA的寡核苷酸的融化行為和Tm值，以及幫助設計包含LNA的寡核苷酸。而且，由於含有LNA的寡核苷酸既能和DNA又能和RNA分子進行雜交，因此可以用該方法檢測所有類型的核苷酸。當要檢測一個雙鏈RNA或DNA分子時，在雜交之前需要將雙鏈分子變性。
ncRNA檢測方法的全面描述本檢測方法使用俘獲寡核苷酸和檢測寡核苷酸。俘獲寡核苷酸包含第一信號發生器，用來生成可檢測的第一信號；檢測寡核苷酸包含第二信號發生器，用來生成可以檢測的第二信號。第一和第二可檢測信號是可用商購設備檢測的任何信號。第一和第二可檢測信號可以是發射已知波長(例如但不限於能產生光學信號的光線)、電學性質例如導電性的變化、或者是電磁或化學特性的變化。在一個實施例中，第一和第二可檢測信號是光學信號。在一個實施例中，光學信號是由發色團、螢光色團或者任何其它能產生光學信號的試劑來產生。通過混合不同發色團或者螢光色團或者它們的不同濃度(強度)，可以產生許多光學信號。在另一個存在時，也可以檢測到第一和第二可檢測信號。第一和第二可檢測信號可能分別與俘獲寡核苷酸和檢測寡核苷酸有直接或間接的聯繫。在一個實施例中，在俘獲寡核苷酸上的第一可檢測信號是能產生所述第一檢測信號的微球體。具體應用中，微球體是一個彩色編碼的微球體，例如由Luminex(Austin，Texas)生產的微球體。現有技術和美國專利6,524,473、6,514,295、6,449,562、6,441,904、6,336,354、6,268,222、6,139,800、6,057,107、6,046,807和5,736,330闡述了Luminex技術及相關技術。俘獲寡核苷酸通過共價和非共價的方式與微球體結合。俘獲和檢測寡核苷酸對目標RNA(例如miRNA)具有特異性，利用適當設計的俘獲和檢測寡核苷酸檢測任何已知的目標RNA。以下詳細描述這種方法各個步驟。
任何目標RNA族可以作為檢測對象。唯一的要求就是目標RNA的序列至少有一部分是已知的。目標RNA的全部序列不需要知道，只要已知的序列長度足夠與以下所述的探測和俘獲寡核苷酸進行雜交。在一個實施例中，目標RNA的整個序列是已知的。
對於每個用於檢測的目標RNA族，設計特異性的俘獲寡核苷酸。在整個方法中，由第一信號發生器產生的第一檢測信號用來識別俘獲寡核苷酸，從而確定與俘獲寡核苷酸結合的目標RNA的特性。在一個實施例中，第一檢測信號包括光學信號。在一個實施例中，當第一檢測信號是光學信號時，光學信號可以被包含在一個微球體中。在另一個實施例中，第一檢測信號是預先確定的位置，例如俘獲寡核苷酸被貼在前印跡陣列(pre-printed array)中或者類似的情況。
俘獲寡核苷酸包含一段與待測的目標RNA的至少部分序列(稱為「俘獲序列」)互補的短核酸序列。在一個實施例中，俘獲寡核苷酸的長度是6到14個核苷酸。在更具體的實施例中，俘獲寡核苷酸的長度是8到12個核苷酸。在另一個實施例中，俘獲寡核苷酸的長度是12個核苷酸。俘獲序列的長度對應於俘獲寡核苷酸的長度。俘獲寡核苷酸可能包含一個或多個修飾的核苷酸，例如LNA核苷酸，用來增加結合的特異性和效率。在一個實施例中，俘獲寡核苷酸的至少1個核苷酸鹼基是修飾的核苷酸。在另一個實施例中，俘獲寡核苷酸的至少2-4個核苷酸鹼基是修飾的核苷酸。在又一個實施例中，俘獲寡核苷酸的至少5個核苷酸鹼基是修飾的核苷酸。在俘獲寡核苷酸的核苷酸序列內，修飾的核苷酸可能被隔開，也可能相鄰近，或者是上述兩種情況的結合。但是，在另一個實施例中，俘獲寡核苷酸不包含任何修飾的核苷酸。在某些情況下，當俘獲寡核苷酸的GC含量足夠高時，具有上述長度的俘獲寡核苷酸的Tm值足夠用來獲得雜交的特異性和敏感性。
在一個實施例中，俘獲寡核苷酸的核苷酸序列與待測的目標RNA族的俘獲序列有100％的互補性。在另一個實施例中，俘獲寡核苷酸的核苷酸序列與待測的目標RNA族的俘獲序列相比，至少包含一個錯配鹼基。
俘獲寡核苷酸可能還包含間隔序列，以便有效接近底物。這段間隔序列與俘獲序列並不互補，可以由核苷酸成分、非核苷酸成分或者是核苷酸與非核苷酸成分的結合所組成。在一個實施例中，間隔區是與待測序列並不互補的核苷酸序列。在另一實施例中，間隔序列是6-15個碳原子長的基於碳原子的間隔序列。俘獲序列位於待測的目標RNA分子的任何方便位點。在一個實施例中，俘獲序列位於待測RNA分子的5』末端。確定朝向目標RNA分子的5』末端的位置，使俘獲序列包含目標RNA分子最5』端核苷酸，或者使俘獲序列遺漏目標RNA分子最5』端的一個或多個核苷酸。在另一個實施例中，俘獲序列位於待測RNA分子的3』末端。確定朝向目標RNA分子的3』末端的位置，使俘獲序列包含目標RNA分子最3』端核苷酸，或者使俘獲序列遺漏目標RNA分子最3』端的一個或多個核苷酸。如上所述，俘獲寡核苷酸的長度與俘獲序列的長度相對應。但是，在另一個實施例中，俘獲序列位於目標RNA分子的中間位置。
檢測寡核苷酸包含一段短的與待測的目標RNA族的至少部分核苷酸序列(稱為檢測序列)互補的核苷酸序列。在一個實施例中，檢測寡核苷酸的長度是6到14個核苷酸。在更具體的實施例中，檢測寡核苷酸的長度是8-12個核苷酸。在另一個實施例中，檢測寡核苷酸的長度是10個核苷酸。檢測寡核苷酸可以包含一個或多個修飾的核苷酸，比如LNA核苷酸，以增強結合的特異性和效率。在一個實施例中，檢測寡核苷酸至少有一個核苷酸鹼基是修飾的核苷酸。在另一個實施例中，檢測寡核苷酸至少有2-4個核苷酸鹼基是修飾的核苷酸。在另一個實施例中，檢測寡核苷酸至少有5個核苷酸鹼基是修飾的核苷酸。在檢測寡核苷酸的核苷酸序列中，被修飾的核苷酸可以是被隔開的，也可能是鄰近的，或者前述二者的結合。但是，在另一個實施例中，檢測寡核苷酸不包含任何修飾的核苷酸。在某些情況下如檢測序列的GC含量非常高，上述長度的檢測寡核苷酸的Tm值足夠獲得雜交的特異性和敏感性。
檢測寡核苷酸的末端包含能生成第二可檢測信號的第二信號生成器。在第一檢測信號存在的情況下，也可以檢測到第二檢測信號。對已知目標RNA進行肯定的確認，需要同時檢測第一和第二可檢測信號。第二可檢測信號可以包含光學信號。第二信號生成器可以直接連接在檢測寡核苷酸上。或者，第二信號生成器可以間接連接在檢測寡核苷酸上。比如通過互補結合對。互補結合對是指生物素/鏈黴抗生物素、生物素/抗生素蛋白和其它已知的類似複合物。互補結合對也包括化學的(chemical moieties)、有機的(organic moieties)或者是互補的胺基酸和核苷酸序列。混合不同的發色團、瑩光色團或者它們的不同濃度(強度)，可以產生許多光學信號。
在一個實施例中，檢測寡核苷酸的核苷酸序列與待測目標RNA族的核苷酸序列有100％的互補性。在另一個實施例中，檢測寡核苷酸的核苷酸序列與待測目標RNA族的核苷酸序列相比較，至少存在一個錯配鹼基。檢測序列可以位於目標RNA分子的任何方便位點。在一個實施例中，檢測序列位於目標RNA分子的5』末端。確定朝向目標RNA分子的5』末端的位置，使檢測序列包含目標RNA分子最5』端核苷酸，或者使檢測序列遺漏目標RNA分子最5』端的一個或多個核苷酸。在另一個實施例中，檢測序列位於待測RNA分子的3』末端。確定朝向目標RNA分子的3』末端的位置，使檢測序列包含目標RNA分子最3』端序列，或者使檢測序列遺漏目標RNA分子最3』端的一個或多個核苷酸。如上所述，檢測序列的長度與選擇的檢測寡核苷酸的長度相對應。但是，在另一個實施例中，檢測序列位於目標RNA分子的中間部分。
在一個實施例中，通過挑選檢測序列使得選擇序列和俘獲序列兩者之間沒有重疊。因此在一個實施例中，如果俘獲序列位於目標RNA分子的5』末端附近，檢測序列就位於目標RNA分子的3』末端。同樣地，在另一個實施例中，如果俘獲序列位於目標RNA分子的3』末端，檢測序列就位於目標RNA分子的5』末端。
在一個實施例中，俘獲寡核苷酸和檢測寡核苷酸各自分別與俘獲和檢測序列結合時具有基本上相同的Tm值。基本上相同的結合Tm值意味著俘獲寡核苷酸與俘獲序列結合的Tm值和檢測寡核苷酸與檢測序列結合的Tm值之間相差1-5攝氏度。在一個實施例中，Tm值相差1-3攝氏度。在另一個實施例中，Tm值相差1-2攝氏度。在又一個實施例中，Tm值相差1攝氏度。由於俘獲寡核苷酸與俘獲序列的結合以及檢測寡核苷酸與檢測序列的結合的Tm值基本上相同，極大的增加了檢測反應的靈敏度又不犧牲檢測的特異性。Exiqon(丹麥)開發了一種軟體，用於預測包含LNA的寡核苷酸的融化行為和Tm值，同時用於輔助設計包含LNA的寡核苷酸。在一個實施例中，通過挑選俘獲和檢測寡核苷酸的長度和組成成分(包括摻入修飾核苷酸，如果使用的話)，使得俘獲和檢測寡核苷酸分別與目標RNA的俘獲和檢測序列雜交時具有相似的Tm值。
在某些實施例中，通過一個反應檢測一類相關目標RNA家族非常有好處。這樣的家族成員在目標RNA的相當長度上通常具有高度同源性(檢測相關miRNA族的實施例見下文)。當需要檢測相關目標RNA家族時，俘獲寡核苷酸或者檢測寡核苷酸對於一個或多個待測的相關目標RNA種類可能具有相同的核苷酸序列(見實施例1表1)。在另外一些實施例中，待測目標RNA分子種類不具有同源性，俘獲寡核苷酸和/或檢測寡核苷酸對每個目標RNA分子可能具有不同的核苷酸序列。
本方法著眼於用一個檢測反應來檢測多個目標RNA分子。因此，在同一個檢測反應中，可以用多個俘獲寡核苷酸和檢測寡核苷酸來對多個目標RNA分子的俘獲序列和檢測序列進行分別識別。在同一個檢測反應中檢測多個目標RNA分子時，俘獲寡核苷酸和/或檢測寡核苷酸的長度可以不同或者相同；與俘獲寡核苷酸和/或檢測寡核苷酸的核苷酸序列結合的修飾核苷酸的數目可以不同或者相同；俘獲寡核苷酸和/或檢測寡核苷酸在待測的目標RNA種類的位置可以不同或者相同。
在所公開的檢測方法中，樣品RNA來自一個來源。樣品RNA至少包含一個要分析的目標RNA族。這個來源可以是任何含有RNA的來源。來源可以是人、植物、動物(包括真核和原核生物)或者病毒。樣品RNA可以從組織、血液、唾液或者其它排洩物中獲得。來源也可以是源自動植物或人的細胞系。在一個實施例中，從該來源中可以獲得多個樣品。在這個實施例中，可以從患病組織獲得一個樣品，從不患病組織獲得另一個樣品。在本領域中分離RNA的方法已經公知。樣品RNA可以是總RNA，或者被分離、純化或者部分純化。在一個實施例中，根據大小對樣品RNA進行分離以除去大分子量的RNA成分。可以按照本領域公知的任何方法進行分離，例如色譜層析法。在另一個實施例中，可以使用整個細胞裂解液而不要求純化RNA。
該檢測方法可以在不同的實施例中進行。在一個實施例中，含有待測目標RNA分子的樣品RNA可以與俘獲寡聚核苷酸和檢測寡聚核苷酸混合溫浴，使得俘獲寡聚核苷酸和待測目標RNA分子上的俘獲序列、檢測寡聚核苷酸和待測目標RNA分子上的檢測序列兩者之間同時雜交。反應產物是混合物(檢測混合物)，即俘獲寡聚核苷酸和檢測寡聚核苷酸分別通過俘獲和檢測序列與目標RNA分子結合。在另一個實施例中，含有待測目標RNA的樣品RNA與俘獲寡聚核苷酸混合溫浴，使得俘獲寡聚核苷酸和待測目標RNA種類上的俘獲序列進行雜交。可能需要進行清洗步驟。然後，檢測寡聚核苷酸和俘獲寡核苷酸/目標RNA分子複合物進行溫浴，使得檢測寡聚核苷酸和待測目標RNA分子上的檢測序列兩者之間進行雜交，形成檢測複合物。
可以使用多種雜交條件。在一個實施例中，雜交反應在有雜交緩衝液的溶液中發生(意味著俘獲和檢測寡聚核苷酸序列和目標RNA在溶液中是自由的)。在另一個實施例中，至少一個檢測或俘獲寡聚核苷酸與底物結合，比如晶片或其它固體支持物。在一個實施例中，雜交條件包括在1×TMAC緩衝液中(3M TMAC，0.1％Sarkosyl，50mM Tris-HCl pH 8.0，4mM EDTApH8.0)進行適當溫度、適當時間的溫浴(比如52℃、一個小時)。TMAC緩衝液提供了有利條件，即雜交特性主要由寡聚核苷酸長度來決定而不受鹼基組成的影響，因此在標準條件下很容易檢測到單個鹼基的錯配。當然，可以使用其它的雜交緩衝液。在另外一些實施例中，雜交緩衝液可以是1×SSCT(1×SSC含0.05％(v/v)吐溫20)或者磷酸鈉緩衝液(50mmol/L磷酸鈉緩衝液，pH7.0，0.1mL/100mL吐溫20)，或者是該領域中已知的其它緩衝液。另外，根據如下討論以及本領域現有技術，可以對雜交時間(見實施例1表4)和雜交溫度進行調整。例如，雜交時間可以減少到10分鐘或者更少(見下文實施例1表5)。10分鐘雜交時間產生的信號是1小時雜交時間產生的可觀察信號的大約70％。因此，可以根據檢測反應所要求的靈敏度對雜交時間進行調整，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。
在一個實施例中，當俘獲寡核苷酸與微球體或者底物(比如晶片或其它固體支持物)相結合，俘獲寡聚核苷酸在微球體或底物上的密度可以是變化的。俘獲寡聚核苷酸在微球體或底物上的密度可能會影響俘獲效率。俘獲寡聚核苷酸的密度可以在104到109俘獲寡聚核苷酸/微球體或者底物之間變化。在一個實施例中，俘獲寡聚核苷酸的密度在106到108變化。與較大的核苷酸分子相比，對較短的目標RNA分子比如miRNA而言，俘獲寡聚核苷酸密度的重要性要低，因為較小的RNA分子更容易與結合了底物的俘獲寡聚核苷酸接近。同樣地，檢測寡核苷酸的濃度可以變化。在一個實施例中，與miRNA目標分子種類相比，檢測寡聚核苷酸過量使用。在以下實施例部分所描述的實驗中，檢測寡聚核苷酸濃度為10pmol。當然，對本領域技術人員而言，毫無疑問可以採用其它的濃度。通常，通過選擇檢測寡聚核苷酸的濃度，以便將過量檢測寡聚核苷酸引起的背景最小化。
為了提高或降低檢測反應的靈敏度，可以調整俘獲和檢測寡聚核苷酸的濃度。例如，如果需要檢測多種目標RNA分子，可以採用極大不同濃度的一種或多種這些目標RNA分子。為了使檢測信號保持線性範圍，可以通過降低適當的俘獲和檢測寡聚核苷酸的濃度，來達到減弱特定目標RNA分子產生的信號的目的。同樣地，也可以達到增強特定RNA分子信號的目的。在這種情況下，可以提高用於適當目標RNA的俘獲和檢測寡聚核苷酸的濃度。
待測目標RNA分子與俘獲和檢測寡聚核苷酸雜交之後，將得到的檢測複合物離心，形成檢測複合體小球(pellet)。通過這種方式，可以清除過量的檢測寡聚核苷酸和RNA成分。除去過量液體。如果需要的話，可以用常規的清洗緩衝液進行清洗。然而，以下實施例部分並沒有進行清洗。對檢測複合物進行檢測。需要的話，在檢測反應之前加入能使第一和/或第二可檢測信號觀察得到的試劑。在一個實施例中，螢光基團(比如PE)與互補結合對(比如鏈黴菌抗生素)相結合，並且與檢測寡聚核苷酸上的互補結合對的其它成分(比如生物素)相結合。檢測反應檢測第一可檢測信號和第二可檢測信號。所以，俘獲寡聚核苷酸的特性可以由可檢測信號給出(由此給出與俘獲寡聚核苷酸結合的目標RNA族的特性)；檢測複合物中目標RNA分子由與檢測寡聚核苷酸相聯的第二可檢測信號來檢測。對每個檢測寡聚核苷酸而言，第二可檢測信號可能相同。第一和第二信號標籤的檢測方法取決於該領域中所述已知標籤的性質。在一個實施例中，第一和第二可檢測信號是螢光信號；檢測方法包括高通量的自動化檢測平臺。
在一個更具體的實施例中，第一可檢測信號是內部彩色編碼的微球體，利用Luminex開發的X-Map技術用內部彩色編碼的微球體作為第一可檢測信號；第二可檢測信號是螢光鏈黴抗生素-PE標記，高通量自動檢測平臺是Luminex平臺(例如但不限於Luminex 100設備)。用一次試驗至少可以分析100個目標RNA。通過多次實驗，可以分析大量的目標RNA。
通過螢光強度函數可以測定樣品中的目標RNA。在一個實施例中，Luminex平臺採用微流體控制將微球體排縱向排列，將反應混合物注入Luminex平臺，雷射照亮微球體內部(也就是第一可檢測信號)和每個微球體的表面(也就是第二可檢測信號)的顏色。對每個彩色編碼的微球體，Luminex平臺記錄了100個獨立的數據來產生報告數據的平均值。從統計學的角度看，每個待測目標有100個數據點。先進的光學儀器俘獲顏色信號。最後，通過數位訊號處理將每個反應的信號翻譯成實時定量的數據。
在檢測方法中還可以增加適當的對照。可以採用該領域已知的各種類型的內部(internal)和外部(external)對照。一個內部對照允許調查人就目標RNA水平在不同的時間點(比如在實驗步驟的前後)的數據進行標準化和比較，並且將因樣品操作程序引起的變化進行標準化。可以選擇內部對照以模擬待測目標RNA分子的特性。在一個實施例中，內部對照是5S或者5.8SrRNA。5S和5.8S rRNA都被普遍地表達並且都是小型RNA分子。按照用於目標RNA分子相同的方式來製備用於內部對照的俘獲與檢測寡聚核苷酸。此外，如果內部對照的表達水平太高而無法與待測的目標RNA分子進行比較時，需要修改系統使內部對照的檢測靈敏度降低(也就是說，通過在反應中加入更多的內部對照特異性的珠子，通過減少內部對照/底物特異性的俘獲寡聚核苷酸的數量，或者在反應混合物中加入沒有標記、沒有結合的俘獲寡聚核苷酸)。
也可以包括外部對照(標準)。外部對照用於數據標準化以及消除Luminex儀器和監測系統引起的變化。在一個實施例中，4到5種特異性寡聚核苷酸與不同的底物分子(比如不同顏色編碼的微球體)結合。這類寡聚核苷酸要麼包含第二信號標籤，要麼能結合第二信號標籤，如以上所討論的。按照不同的標準，每個寡聚核苷酸需要添加不同的量。例如，按照標準A(StdA)，需要使用探針標記的0.1fmol的生物素；按照標準B是1fmol；按照標準C是10fmol；按照標準D是100fmol。得到每個標準下螢光強度的平均數以及所有待測的目標RNA分子。由此測定各標準的相對濃度和目標RNA分子。
以下實施例描述的結果顯示所公開的方法是一種非常有效的檢測小型目標RNA分子的工具。該方法結合了高通量檢測平臺、修飾核苷酸的增強雜交特異性與靈敏性。通過適當設計俘獲和檢測寡聚核苷酸，在一個實驗中可以研究多個目標RNA分子。因此，可以研究許多目標RNA分子的表達類型或圖譜。與現有的方法相比，該檢測方法比常規使用的Northen印跡法的靈敏度高100倍。一個多重(multiplexed)分析只需要50-100ng的總RNA。同時，由於採用了修飾寡聚核苷酸和液體雜交，該檢測方法與現有的方法相比更具特異性。該檢測方法也容易使用，不需要標記寡聚核苷酸或樣品核苷酸序列，不需要擴增目標RNA分子，可以在短短的一小時內完成。
定義在此所用的術語「預防」、「抑制」是指疾病臨床症狀開始之前開始的一種行為過程(比如給予一種化合物或者藥劑)，用於防止或者減少這種疾病狀態或症狀的臨床表現。這類預防和抑制並不需要絕對有益。
在此所用的術語「治療」是指一種疾病臨床症狀開始之後開始的行為過程(比如給予一種化合物或者藥劑)，用於消除或者減少這種疾病狀態或狀況的臨床表現。這類治療並不需要絕對有益。
在此所用的術語「需要治療」是指醫生作出的病人需要或將從治療中受益的判斷。這個判斷是醫生根據專業技術領域的多種因素做出的，包括判斷已經患病或即將患病，根據公開的方法或化合物可以進行治療。
在此所用的術語「診斷」是指醫生判斷出病人患有某種疾病或症狀。這個判斷是醫生基於專業技術領域的多種因素而做出的，包括使用在此公開的方法。
在此所用的術語「需要預防」是指醫生判斷出病人需要或者將從預防中受益。這個判斷是醫生基於專業技術領域的多種因素而做出的，包括判斷已經患病或即將患病，根據公開的方法或化合物可以進行治療。
在此所用的術語「個體」、「受實驗者」、「患者/病人」是指任何動物，包括哺乳動物，比如小鼠、大鼠、其它齧齒動物、兔子、狗、貓、豬、牛、羊、馬或靈長類的動物和人。該術語可能特指雄性或者雌性或者雌雄，或者排除雄性或者雌性。
具體實施例方式
實施例1-合成miRNA分子的檢測當前公開的方法用於分析4個緊密相關的ncRNA分子，在本實施例中的miRNA即Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g(表1給出了每個miRNA分子的序列以及相應的序列編號)。Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g miRNA屬於保守的miRNA家族，每個miRNA的5』末端的10個核苷酸是保守的，miRNA 3』末端存在較小的序列差異。
通過MWG(高尖端NC)合成Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g miRNA並確認序列。按照Phoenix生物工藝(Huntsville，AL)，為Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g製備釘有LNA的俘獲寡聚核苷酸和檢測寡聚核苷酸。表1還給出了每個miRNA分子所用的俘獲和檢測寡聚核苷酸的序列以及相應的序列編號。各序列中的大寫字母表示LNA鹼基。值得注意的是，俘獲寡聚核苷酸的核苷酸序列可以通過加入間隔基團被修飾，所述間隔基團是基於碳原子的連接物(例如但不限於C6或者C12連接物)、核苷酸序列(例如但不限於aacgcgtata和tacgcgtata，序列編號94和95)，或者是二者的結合。在一個實施例中，C6和C12連接物與前句中公開的序列聯合使用。可以預測俘獲寡聚核苷酸/俘獲序列與檢測寡聚核苷酸/檢測序列的Tm值。通過使用Exiqon(丹麥)提供的電腦程式，為這些複合體選擇基本上相等的Tm。彩色編碼的微球體從Luminex公司(奧斯汀，德克薩斯)購買。
在本實施例中，俘獲寡聚核苷酸能與目標miRNA的3』末端雜交，檢測寡聚核苷酸能與目標miRNA的5』末端雜交。在本實施例中，檢測寡聚核苷酸的3』末端被標記了生物素標籤，以便與第二可檢測信號(它鏈黴抗生素基團相連)相互作用。此外，每條俘獲寡聚核苷酸5』末端加有一條C12連接物序列，以便檢測寡聚核苷酸與微球體(第一可檢測信號)結合。通過廠家推薦的實驗方法(以下方法部分將進行描述)，將俘獲寡聚核苷酸與微球體結合。
本實施例所用的檢測方法如下。將樣品RNA(在本實施例中即合成產生的Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g miRNA)按下表中所示的不同濃度，加入1×TMAC緩衝液(3M TMAC，0.1％Sarkosyl，50mM Tris-HCl pH8.0，4mM EDTA pH8.0)。在反應試管中加入與Luminex微球體配對的俘獲寡聚核苷酸，以及表1中具體顯示的每個待測目標miRNA的檢測寡聚核苷酸。加入與俘獲寡聚核苷酸配對的相同數量的微球體(3000)，每個微球體大約有106到108俘獲寡聚核苷酸(俘獲寡聚核苷酸的總濃度大約是0.5pmol)。在10pmol的濃度加入各檢測寡聚核苷酸。混合物在52℃溫浴1小時，或者按照以下所示的時間，在1×TMAC緩衝液裡以便俘獲寡聚核苷酸的序列與它們各自的俘獲序列、檢測寡聚核苷酸的序列與它們各自的檢測序列之間進行雜交。雜交1小時後，混合物以15,000RPM離心2分鐘(室溫)，形成檢測複合物小球。吸出多餘的液體，加入60微升經過稀釋的鏈黴素抗生素-PE共軛體。鏈黴素抗生素-PE共軛體與檢測複合物一起在52℃溫浴10分鐘，以便鏈黴素抗生素-PE共軛體與檢測寡聚核苷酸上的生物素標籤相結合。溫浴結束後，在Luminex 100平臺對該混合物進行讀數。所述整個檢測反應可以在90分鐘內完成。如以上討論，可以修改反應條件。
表2-5所示為公開的miRNA檢測方法的特異性和靈敏性。表2-5中豎行代表加入到反應混合物中的特定俘獲和檢測寡聚核苷酸，用於檢測具體的目標RNA(標示為Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g)。表2-5中橫行代表加入到反應混合物中的具體目標RNA以及目標RNA的濃度(每行代表一個單獨的檢測反應)。表1示出了每條俘獲和檢測寡聚核苷酸的序列和合成的miRNA的序列。標有「沒有模板」的行表示反應中沒有加入合成的miRNA(目標RNA)，當作一個陰性對照和背景讀數。為了使數據規格化，將從某個特定目標miRNA反應所得的特定信號除以從該樣品所得的總信號，來計算目標miRNA信號的百分值(稱為「標準化比值」)。突出表示了那些大於總信號35％的信號。
在表2所示的結果中，Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g每個合成miRNA按100、80、60和40fmol添加。各檢測寡聚核苷酸在10pmol濃度加入。第2-5行，Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g合成miRNA按100fmol加入；第6-9行，Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g合成miRNA按80fmol加入；第10-13行，Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g合成miRNA按60fmol加入；第14-17行，Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g合成miRNA按40fmol加入。從表2可以看出，每個miRNA族的檢測是非常特異的，在待測具體目標miRNA的反應中可以檢測到60％到91％的信號。陰性對照/背景反應在表2第1行顯示最小。
目標miRNA族的濃度在40fmol時，就可以觀察到靈敏性和特異性檢測。對於Let-7a，樣品中觀察到的81％信號來自於待測特定目標miRNA。對於Let-7b和Let-7c，樣品中觀察到的76％信號來自於待測特定目標miRNA。對於Let-7g，樣品中觀察到的91％信號來自於待測特定目標miRNA。即使反應中待測miRNA族存在高度的序列同源性，都可以觀察到靈敏而且特異的檢測。Let-7b和Let-7c的序列僅有1個核苷酸的差異。Let-7b和Let-7a的序列有2個核苷酸不同。Let-7b和Let-7g的序列有5個核苷酸不同。
40fmol miRNA濃度的數據可預示在其它miRNA濃度的數據，如表2中所示。表2的數據表明，通過降低目標miRNA的濃度，特異性略有增加。
表3所示為目標miRNA濃度為10、1以及0.1fmol的檢測結果。表3的結果印證了表2的結果，表明在目標miRNA濃度低至0.1fmol時仍可以保持檢測的特異性。對0.1fmol的Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g而言，各樣品中觀察到的信號分別有70％、81％、77％和91％來自待測的特定目標miRNA。
表4所示為改變檢測寡聚核苷酸與微球體的配對雜交時間、改變俘獲寡聚核苷酸與待測miRNA雜交時間的影響，表2和表3中雜交時間為1小時。在表4所示的結果中，將溫浴時間10分鐘、30分鐘和60分鐘進行比較。在這個實驗中目標miRNA Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g的濃度是50fmol。從表4中可以看出，將雜交時間減少至10分鐘依然產生很好的特異性和靈敏性。在10分鐘雜交反應中所檢測的信號大約是1小雜交信號的70％。
為了核實檢測方法的可重複性，將樣品如上所述重複處理三次後比較結果。在這個實驗中目標miRNA Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g的濃度是50fmol，檢測寡聚核苷酸濃度10pmol，雜交時間60分鐘。表5所示為檢測結果。可以看出檢測反應的重複性非常好，平均變異係數(CV)僅為1.7％。
實施例2-大鼠腦組織總RNA的miRNA分子圖譜在本實施例中，驗證了採用所公開的檢測方法來檢測天然RNA來源中的多種miRNA的能力。在本實施例中，RNA來源於大鼠腦部。實施例2實驗中的檢測方法與實施例1完全相同，但是樣品RNA是使用標準方法從大鼠腦部抽提的RNA而不是合成產生的miRNA。俘獲與檢測寡核苷酸的序列如表1所示。樣品RNA可以採用過柱純化以豐富小miRNA的百分比，也可以採用沒有經過純化步驟的總RNA。同上，表6-7的縱行代表加入到某種特定目標RNA(標示為Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g)的特異的反應混合物中的特定俘獲和檢測寡聚核苷酸。表6-7的橫行代表加入反應混合物中的樣品RNA以及所加入樣品RNA的濃度(每行代表一個單獨的檢測反應)。檢測結果在表6和7中列出。
表6的結果顯示該檢測方法能檢測經過大小分級(指純化)的miRNA分子和總RNA。第1行是一個陰性對照(反應中沒有加入RNA)，第2-4行顯示總RNA分別以4ug、400ng和40ng加入反應混合物中。第5-7行中，富含小RNA的經柱純化RNA分別以400ng、40ng和4ng加入反應混合物中。第8-11行是陽性對照，有50fmol的合成的特定目標miRNA加入到反應混合物中。檢測寡聚核苷酸以10pmol加入。表6的結果顯示既能檢測富含小RNA的RNA製劑中的miRNA，也能檢測總RNA(不需要小RNA的豐度)中的miRNA。隨著該檢測方法靈敏度的增加，對來源中RNA的豐度沒有要求。
為了探索該miRNA檢測方法靈敏度的限度，將所準備的總RNA分別被稀釋成第1-6行中的濃度1600ng、800ng、400ng、200ng、100ng和50ng。同上，檢測寡聚核苷酸以10pmol的濃度加入。在表7中可以看出，在低到50ng總RNA的濃度情況下還可以保持檢測方法的靈敏度。通過比較表6和表7中的標準化比值可以看出，反應的特異性也可以保持。
實施例3-合成miRNA混合物的miRNA圖譜在本實施例中，驗證了採用該檢測方法檢測合成miRNA混合樣品中的多種miRNA的能力。如實施例1一樣，合成產生miRNA，各miRNA的序列在表1中列出。實施例3中實驗的檢測方法與例1中所用的方法完全相同。同上，表8的的縱行代表加入到某種目標RNA(標示為Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g)的特異性反應混合物中的特定俘獲和檢測寡聚核苷酸。表8的橫行代表加入到反應混合物中的樣品RNA以及所加入樣品RNA的濃度(每行代表一個單獨的檢測反應)。每條俘獲和檢測寡聚核苷酸和合成miRNA的序列在表1中列出。
表8所示為以合成miRNA混合物來測試該實驗方法的特異性和靈敏性。第1行是陰性對照。第2-4行分別代表Let-7a、Let-7b和Let-7c(每個在10fmol加入)。第5行代表10fmol的Let-7a和10fmol的Let-7b的混合物。第6行代表10fmol的Let-7a和5fmol的Let-7b的混合物。第7行代表5fmol的Let-7a和10fmol的Let-7b的混合物。進行類似的組合來檢測Let-7a和Let-7c(第8-10行)以及Let-7b和Let-7c(第11-13行)。從表8中可以看出，檢測信號與反應中目標miRNA的含量相關聯。但是，結果確實顯示一些交叉雜交(尤其是高度同源的miRNA之間，比如在序列上僅相差一個核苷酸的Let-7b和Let-7c)，這個結果表明可以用該方法來監控多種miRNA的表達水平。
實施例4-乳腺癌的ncRNA標籤的製備如上所討論的，本發明的方法可用於製備針對疾病或症狀的ncRNA標籤。本實施例描述了乳腺癌ncRNA標籤，其中ncRNA是miRNA。在本實施例中，病人RNA樣本購自Asterand(密西根州·底特律；www.asterand.com)。病人RNA樣本中含有目標miRNA。依據廠家說明對病人的組織樣本進行雷射微解剖處理，並提取總RNA。在兩個實例中購買了配對樣本，這表明除癌症樣本外，還獲得了乳腺(採自同一個體)的非癌RNA樣本。非癌RNA樣本作為miRNA表達的基線。用於以下實施例中的配對樣本被命名為5386N(第5386號病人的正常乳腺RNA樣本)、5386T(第5386號病人的乳腺癌RNA樣本)、31828N(第31828號病人的正常乳腺RNA樣本)和31828T(第31828號病人的乳腺癌RNA樣本)。除配對樣本外，還購買了乳腺腫瘤RNA樣本，分別命名為5387T、17260T、591T、11793T、12595T、14292T和17054T。檢測每個RNA樣本的miRNA圖譜。
初篩時，對獲得的各RNA樣本的100多個miRNA分子進行篩選，並對每個樣本建立miRNA圖譜。經過分析的miRNA包括let-7a、let-7b、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、mirR-101b、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、mir-122a、miR-124a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-125b、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-131、miR-132、miR-133、miR-134、miR-135、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146、miR-147、miR-148a、miR-149、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-178、miR-18、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-185、miR-197、miR-188、miR-189、miR-190、miR-191、miR-192、miR-193、miR-194、miR-195、miR-196、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199b、miR-19b、miR-20、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-201、miR-202、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-207、miR-208、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-290、miR-291-3p、miR-291-5p、miR-292-3p、miR-292-5p、miR-293、miR-294、miR-295、miR-296、miR-297、miR-298、miR-299、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-300、miR-301、miR-30、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e、miR-31、miR-32、miR-320、miR-321、miR-322、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-337、miR-338、miR-339、miR-340、miR-341、miR-342、miR-344、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-350、miR-351、miR-7、miR-7b、miR-9、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a、miR-99b、miR-336和miR-349。還檢查了5sRNA。
此外，還合成了特異性檢測每個miRNA分子的檢測和俘獲寡核苷酸對。每個寡核苷酸長度為10-12個核苷酸，平均含有3-4個LNA修飾的核苷酸。俘獲序列位於目標miRNA分子的3』末端。合成俘獲核苷酸，並且共價結合於顏色編碼的Luminex珠子(根據廠家的說明)。每個檢測寡核苷酸長度為8-10個核苷酸，平均含有2-3個LNA修飾的核苷酸。每個檢測寡核苷酸在3』末端包含生物素標籤。檢測序列位於目標miRNA分子的5』末端。依據Exiqon提供的在線軟體工具(http//lna-tm.com/)設計各俘獲寡核苷酸和檢測寡核苷酸的LNA殘基的位置和數目，使得Tm滿足45℃雜交。
將114對俘獲和檢測寡核苷酸分為10個獨立的多重反應(multiplexreactions)。每個多重反應包含10套對10個不同的目標miRNA分子特異的俘獲和檢測寡核苷酸，以及1微克來自於上述病人RNA樣本的總RNA。對於每個待測目標miRNA，在雜交緩衝液(1X TMAC緩衝液，Sigma)中加入大約3000個珠(含有～0.5pmol俘獲寡核苷酸)和0.5pmol檢測寡核苷酸。俘獲和檢測寡核苷酸同時加入。45℃反應1小時。離心收集目標miRNA/俘獲寡核苷酸/檢測寡核苷酸複合物，除去多餘液體。根據廠家說明，加入鏈黴素-PE溶液(Prozyme PJ/70S)，45℃溫育10分鐘。隨即在Luminex-100檢測平臺(德克薩斯·奧斯汀·Luminex)上讀取樣本。
從上述各RNA樣本獲取獨立的miRNA圖譜。對miRNA圖譜分析中獲得的數據進行分析。鑑定出目標miRNA分子的亞族，供進一步分析。供進一步分析的miRNA分子的核苷酸序列和這些miRNA分子對應的俘獲和檢測寡核苷酸的核苷酸序列，以及相關序列編號如表1所示。各序列中的大寫字母表示LNA鹼基。應該注意的是，如上述實施例1一樣，所示各俘獲寡核苷酸的核苷酸序列可以通過加入間隔基團進行修飾。
表9所示為這些miRNA族的原始數據示(數據以平均螢光強度表示，MFI)。從表9可以看出，幾個miRNA族在正常乳腺組織樣本和乳腺癌樣本之間具有不同的表達。此外，還有幾個miRNA族在正常和乳腺癌樣本中的表達較為一致。如果需要的話，這些miRNA族可用作內部參考或內部對照，以校正數據。表10所示為mir-130a miRNA校正後的數據。為獲得校正後數據，將各待測miRNA的平均螢光強度都除以相應的mir-130a平均螢光強度值。雖然不是必須的，但是使用內部參考可計算樣本間的差異。
在表9和10中，橫行表示檢測的miRNA目標，豎行表示分析的病人RNA樣本。Neg表示陰性對照，未加樣本RNA；Pos表示陽性對照(表9)。如表9和10所示，下述miRNA靶分子在正常和癌變樣本中表達不同mir-107、mir-15b、mir-103、mir-17-5p、mir-126、mir-141、mir-142-3p、mir-143、mir-193、mir-199a、mir-29a、mir-195、mir-26a、mir-20、mir-128b、mir-217以及mir-219。如上面所討論的，在正常和癌變樣本之間mir-122a、mir-299、mir-7b以及mir130a的表達基本一致。
此外，含有乳腺癌miRNA標籤的miRNA靶分子可進一步細分。例如，如圖2和3所示，mir-107、mir-15b和mir-103在所有乳腺癌樣本中的表達均不同於(在這種情況下是高於)正常樣本。然而，mir-17-5p、mir-16、mir-126、mir-141、mir-142-3p、mir-143、mir-193、mir-199a、mir-29a、mir-195、mir-26a、mir-20、mir-128b、mir-217以及mir-219的結果因所分析的癌變樣本而不同。Mir-17-5p、mir-16、mir-126、mir-141、mir-142-3p、mir-143、mir-193、mir-29a、mir-195、mir-26a、mir-20、mir-128b、mir-217和mir-219在5386T、12595T、14292T、11793T和17054T乳腺癌樣本和正常樣本中的表達不同。例如，mir-142-3p在上述乳腺癌樣本中的表達增高，而mir-219在上述乳腺癌樣本中的表達下降。相比之下，mir-17-5p、mir-16、mir-126、mir-141、mir-142-3p、mir-143、mir-193、mir-199a、mir-29a、mir-195、mir-26a、mir-20、mir-128b、mir-217和mir-219在5387T、17260T和4591T乳腺癌樣本中的表達基本上與正常乳房組織樣本的miRNA圖譜對應。
該數據顯示乳腺癌mirRNA標籤至少包括mir-107、mir-15b和mir-103。如表9、10和圖2、3所示，乳腺癌miRNA標籤還可以包括其它miRNA族。觀察到的其它miRNA族的差異可能是由於樣本的乳房癌變處於不同的發展階段或者是由於其它分子而產生的差異。由於miRNA圖譜分成兩個不同的組，因此，可以將表達類型的差異作為有用的診斷工具，對乳腺癌病人進行亞分類。樣本11793T、12595T、14292T和17054T的miRNA圖譜和5386T類似，而樣本5387T、17260T和4591T的miRNA圖譜和31828T類似。
本實施例證明了通過採用本發明的ncRNA檢測方法，可產生ncRNA(該實例中是miRNA)圖譜，ncRNA圖譜可用於創建特定疾病或症狀(該實例中是乳腺癌)的ncRNA標籤。此外，如圖3所示，基於ncRNA族(該實例中是miRNA)的表達圖譜，利用ncRNA標籤可對乳腺癌樣本進行亞分類。按照所述方法產生病人ncRNA圖譜，和該疾病的ncRNA標籤進行比較，從而診斷該病人是否患有某種疾病或症狀，或者是有患該疾病或症狀的危險。檢測ncRNA標籤中的各ncRNA，並和病人ncRNA圖譜進行比較，以作出診斷。通過將病人圖譜中的ncRNA水平和ncRNA標籤中的ncRNA水平進行比較，可進行診斷。因而，可根據各ncRNA值、或者一個或多個ncRNA值作出診斷結果。可以對各ncRNA設定截斷值/閾值，或使用統計模型(例如但不限於下面的實施例6中描述的模型)，通過對數據進行可視分析(visual analysis)來作出判斷。
實施例5-製備神經膠質瘤的ncRNA標籤本實施例描述了神經膠質瘤ncRNA標籤的製備，其中ncRNA是miRNA。本實施例中，RNA樣本採自一系列神經膠質瘤細胞系和正常神經元細胞系。採用標準方法提取RNA。使用的神經膠質瘤細胞系是LN-215、LN-340、U343MG、U373MG、LN401、LN405、LN464和U87MG。Ishii等人(Brain Pathol.9469-479，1999)描述過這些細胞系。此外，使用一種被稱為HA的正常神經元細胞系作為miRNA表達的基線。本實施例採用實施例4中所述miRNA檢測方法。
從上述各細胞系的RNA樣本獲取miRNA圖譜。對在miRNA圖譜分析中獲得的數據進行分析。鑑定出114種miRNA靶分子的亞族，供進一步分析。表11所示為這些miRNA族的原始數據(數據以平均螢光強度表示，MFI)。如表11所示，幾個miRNA族在正常細胞系和神經膠質瘤細胞系中的表達不同。此外，還有幾個miRNA族在正常和神經膠質瘤樣本之間的表達較為一致。如果需要的話，這些miRNA族可用作內部參考或內部對照，用於校正數據。表12顯示的是mir-130a miRNA校正後的數據。為獲得校正後讀取數據，將各被測的miRNA MFI都除以相應的mir-130aMIF值。雖然不是必須的，但是使用內部參考可計算樣本間的差異。
在表11和12中，橫行表示被測的miRNA靶標，縱行表示分析的RNA樣本。Neg表示陰性對照即未加樣本RNA，Pos表示陽性對照(表11)。如表11和12所示，下述miRNA靶分子在正常神經元細胞系和神經膠質瘤細胞系中的表達不同mir-141、mir-143、mir-23b、mir-15b、mir-293、mir-17-p3以及mir-320。在正常神經元細胞系和神經膠質瘤細胞系之間，mir-17-5p，mir-214和mir130a的表達基本一致。
圖4和5以圖形的形式顯示了本實施例中檢測的細胞系的miRNA圖譜。圖4中顯示的是繪製成MFI函數(y軸)的數據，而圖5中顯示的是用mir-130a(y軸)校正後的MFI值繪製的相同數據。兩個圖形中的x軸均表示所檢測的miRNA族。與正常神經元樣本比較後可以看出，mir-141、mir-143、mir-23b、mir-15b、mir-293、mir-17-p3和mir-320在幾乎所有神經膠質瘤細胞系中的表達都有所不同(都增加和降低)。
這些數據表明，神經膠質瘤的miRNA標籤至少包含mir-141、mir-23b、mir-293、mir-17-3p和mir-320。如表11、12和圖4、5所示，神經膠質瘤的miRNA標籤可能還包括其它miRNA族。在其它miRNA族中(例如，mir-143和mir-15b)觀察到的差異可能是由於樣本的神經膠質瘤處於不同的發展階段或者是由於其它分子而產生的差異。
本實施例證實了可以通過採用所公開的ncRNA檢測方法獲得ncRNA圖譜(本實例中即miRNA)，ncRNA譜可用於創建特定疾病或症狀(本實例中即神經膠質瘤)的ncRNA標籤。
實施例6-ncRNA標籤的統計方法為了有效發揮所述ncRNA標籤的作用，對得到的數據進行統計處理。大量統計方法可供採用。在一個實施例中，對某疾病或症狀的ncRNA標籤採用概率描述，和/或將某研究對象進行患有/易患或不患有/不易患某疾病或症狀的歸類。在該方法中，假設miRNA水平的人口分布遵從高斯分布函數。在計算概率時，採用高斯「高度」而不是概率 等式1中，f(x)是對應於參數x(x可以是正常或異常人群)的高斯高度；μ是參數x的人口平均值，δ是人口標準偏差。等式1在3部分中檢驗。在等式1左手邊，1/(δ√2π)控制高斯峰的最大高度。包含『e』的中間部分將等式第3部分的結果轉化為正確成形的封閉部分。最後部分計算標準偏差，說明x值離人口分布中心的距離。該值也被稱為「Mahalanobis距離」。
計算出「正常」和「異常」參數的各標籤miRNA的高斯高度(參見下圖)。注意，μ1和μ2是人口特異性均值。μ1值用於計算正常人群miRNA水平的高斯高度，μ2用於計算異常人群miRNA水平的高斯高度。
上圖顯示了兩種情形在第一種情形中，「正常」曲線和「異常」曲線的高度比(N1/A1)約為4；而第2種情形中(N2/A2)，比率約為0.25。換句話說，假若測量到病人的miRNA水平接近「正常」均值，很有可能該病人正常(不具有患有某疾病或症狀的特徵)；然而，假如miRNA水平接近「異常」人群均值，該病人可能很有可能異常(具有患有或易患某疾病或症狀的特徵)。因而，根據在研究對象圖譜中測定的某些ncRNA分子水平，概率揭示了某研究對象患有或易患某種疾病或症狀的可能性。
採用高斯高度的一個好處是可以將在某研究對象的圖譜中獲得的多個獨立的miRNA水平的預測效力進行結合。採用等式(2)計算某研究對象患有或易患某疾病或症狀的結合後的概率或可能性。等式(2)中，LRt代表異常人群的高斯高度總和，LRn代表正常人群的高斯高度總和。
可能性＝(LRt)/(LRt+LRn) 2其中，LRt＝LR1t*LR2t*LR3t...LRnt，LRn＝LR1n*LR2n*LR3n...LRnn。
使用實施例4(表10)中所述mir-130a、mir-107、mir-15b和mir-103校正後的數據，來演示該統計方法的應用。對校正後的數據求出癌變和正常樣本(人群)的平均值和標準偏差。在本實施例中，將正常樣本的標準偏差設定為0.2000。計算每個樣本mir-107、mir-15b和mir-103高斯高度值。首先，用正常樣本的平均值和標準偏差值求得「正常」高斯高度，接著，用乳腺癌樣本的平均值和標準偏差值求出「異常」高斯高度。通過異常高斯高度(GH)與正常高斯高度(GH)的比值求出概率。一旦求得單獨的概率，就可通過將研究對象圖譜中測到的各miRNA族的單獨概率相乘，求出綜合危險因子或可能因子(揭示某個體是否患有或易患某疾病/症狀)。上述計算示於表13。
實施例7-測試由ncRNA圖譜所識別出的潛在的治療靶標如上所述，所公開的檢測方法可用於識別治療疾病或症狀的潛在藥物靶標。可創建特定疾病或症狀的ncRNA標籤。通過鑑定特定疾病或症狀特有的ncRNA族的特徵，可以確定引起該疾病或症狀的分子通路所涉及的分子靶標的特徵。例如，已知miRNA通過降解某蛋白的mRNA和/或幹涉蛋白轉錄來調控基因表達。這些分子靶標可以為針對該疾病或症狀的藥物開發提供新的治療候選物。在這種方法中，通過上述手段獲得該疾病或症狀的ncRNA標籤。注意該疾病或症狀的特徵ncRNA分子。利用這些ncRNA分子的特徵來確定參與該疾病或狀況的分子通路的分子靶標。在具體實施例中，ncRNA是miRNA。
採用電腦程式將ncRNA標籤中的一個或多個ncRNA分子序列與含有基因信息的商業資料庫或專有資料庫進行比較，以確認ncRNA分子可能結合的靶標。對藥物開發而言，這種靶標是潛在治療候選物。能夠進行此種比較的任何程序/軟體都可以採用。在本實施例中，採用公開的運算法則(algorithm)進行比較(Enright等人PloS Biol 2(11)e363)。
採用實施例4(表9、10和圖2、3)中描述的mir-107、mir-15b和mir-103的校正後數據來演示本方法的實際應用。實施例4鑑定出乳腺癌miRNA標籤含有mir-107、mir-15b和mir-103。將這些miRNA分子序列放在含有核酸序列信息的基因資料庫中搜尋，識別出那些經過鑑定的miRNA分子可能結合的包含序列的靶標。已經發現了大量的潛在靶標，列於表14。值得注意的是，表14隻是候選治療靶標的部分名單而已。
如表14所示，對於每個mir-107、mir-15b和mir-103而言，都有一些蛋白(例如TAR DNA-結合蛋白43)被鑑定為治療靶標，而其它的蛋白則被鑑定為這些miRNA分子亞類的候選治療靶標(例如MAP-1A是被mir-103和mir-107而不是被mir-15b識別出的)。通過使用本方法來確認靶標可對疾病或症狀的分子機理所涉及的靶標進行深入解析，並且可以為藥物開發提供新的候選物。
表1所示為miRNA分子的核苷酸序列，以及它們各自的俘獲和檢測寡聚核苷酸。大寫字母表示核苷酸序列中相應的LNA核苷酸。

表2所示為miRNA檢測反應的特異性和靈敏性，以合成miRNA作為RNA樣本。表2中的縱行代表加入到特定miRNA(標示為Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g)特異性檢測混合物中的特定俘獲和檢測寡聚核苷酸。表2中的橫行表示加入反應混合物中的miRNA以及所加入各miRNA濃度(每行代表一個單獨的檢測反應)。各俘獲和檢測寡聚核苷酸以及合成miRNA的序列在表1中列出。

表3以合成miRNA作為RNA樣本，進一步證明miRNA檢測反應的特異性和靈敏性。表3的縱行與橫行和表2中所述的一致。

表4所示為雜交時間對miRNA檢測反應的特異性和靈敏性的影響，以合成miRNA作為RNA樣本。7A、7B、7C和7G分別代表Let-7a、Let-7b、Let-7c和Let-7g。時間代表雜交時間。縱行與表2所述的一致。

表5所示為miRNA檢測反應的重複性，以合成miRNA作為RNA樣本。

表6用從大鼠大腦中抽提的總RNA，或者是從大鼠大腦中抽提的經過大小分級的總RNA，檢測miRNA的結果。縱行表示俘獲和檢測寡聚核苷酸的種類，而橫行代表樣品RNA的種類和樣品RNA的濃度。

表7說明了總RNA樣品濃度對檢測的特異性和靈敏性的影響。總RNA從大鼠大腦中獲得並採用所示的濃度，縱行表示俘獲和探測寡聚核苷酸的種類。

表8所示為採用合成miRNA混合物的miRNA檢測結果。縱行與表2所示的一致。橫行表示反應混合物中的合成miRNA分子的種類以及各自的濃度。

表9所示為採用所公開的檢測方法從正常和乳腺癌組織中所得的RNA樣品中的miRNA分子圖譜結果。橫行表示待測miRNA族，豎行表示分析的樣品。Neg表示陰性對照，Pos表示陽性對照。

表10所示為表9中的數據mir-130A MFI值標準化後的MFI值

表11所示為從正常神經元和細胞系中所獲得的RNA樣品的miRNA圖譜結果，採用所公開的檢測方法。橫行表示被檢測的miRNA族，縱行表示分析的樣品。Neg表示陰性對照，Pos表示陽性對照。

表12所示為表11中的數據以mir-130A的MFI值標準化後的MFI值

表13

表14

序列表110GENACO BIOMEDICAL PRODUCTS，INC.
120METHOD OF DETECTING ncRNA130P40909WO04GP15060/563,8771512004-04-2016098170PatentIn version 3.2210121123212RNA213Homo sapiens4001uggaguguga caaugguguu ugu23210221112212DNA213Artificial220
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223oligonucleotide40098ccggtattcc c 1權利要求
1.一種同時檢測多種不同的目標ncRNA分子的方法，所述方法包括以下步驟a.提供實驗對象的樣品RNA，所述樣品包含多種目標ncRNA分子；b.使所述樣品和與每個待測目標ncRNA分子對應的第一寡聚核苷酸在適當條件下接觸，以形成所述第一寡聚核苷酸與所述目標ncRNA的複合物，每條所述第一寡聚核苷酸包含第一信號發生器以產生第一可檢測信號，各條所述第一寡聚核苷酸具有基本上相同的結合所述目標ncRNA分子的第一Tm值；c.使所述樣品和第二寡聚核苷酸在適當條件下相接觸，以便與每個待測目標RNA分子相結合，形成所述第二寡聚核苷酸與所述目標ncRNA的複合物，所述第二寡聚核苷酸包含第二信號發生器以產生第二可檢測信號，各條所述第二寡聚核苷酸具有基本上相同的結合所述目標ncRNA分子的第二Tm值；d.通過測定第一、第二可檢測信號來確定所述樣品中的所述多種目標ncRNA。
2.如權利要求1的方法，其中ncRNA是miRNA.
3.如權利要求1的方法，其中與所述多種目標ncRNA分子中的特定ncRNA分子結合的各條所述第一寡聚核苷酸的第一可檢測信號是不同的。
4.如權利要求1的方法，其中同時加入所述第一、第二寡聚核苷酸。
5.如權利要求1的方法，其中先後加入所述第一、第二寡聚核苷酸。
6.如權利要求1的方法，其中各個所述第一Tm和各個所述第二Tm是基本上相同的。
7.如權利要求1的方法，其中至少一條所述第一寡聚核苷酸和所述第二寡聚核苷酸包含至少一個經過修飾的核苷酸。
8.如權利要求7的方法，其中所述經過修飾的核苷酸是鎖定核苷酸。
9.如權利要求8的方法，其中各個所述第一Tm和各個所述第二Tm是基本上相同的。
10.如權利要求1的方法，其中所述第一、第二可檢測信號包括光學信號。
11.如權利要求1的方法，其中所述第一、第二可檢測信號是螢光信號。
12.如權利要求1的方法，其中所述第一信號發生器是微球體，所述微球體產生所述第一可檢測信號。
13.如權利要求12的方法，其中所述第一可檢測信號是光學信號。
14.如權利要求12的方法，其中所述第一可檢測信號是螢光信號。
15.如權利要求1的方法，其中所述第一寡聚核苷酸長度為8-12個核苷酸，所述第二寡聚核苷酸長度為8-12個核苷酸。
16.如權利要求1的方法，其中所述方法用於生成所述樣品中存在的所述目標ncRNA分子圖譜。
17.如權利要求1的方法，其中所述樣本來自人類。
18.如權利要求1中的方法，其中所述RNA樣品沒有經過大小分級來增加較小分子量RNA族的比例。
19.一種確定RNA樣品中多種目標ncRNA分子圖譜的方法，所述方法包含以下步驟a.提供實驗對象的樣品RNA，所述樣品包含多種目標ncRNA分子；b.使所述樣品和與各待測目標ncRNA分子對應的第一寡聚核苷酸在適當條件下相接觸，以形成所述第一寡聚核苷酸與所述目標ncRNA的複合物，每條所述第一寡聚核苷酸包含第一信號發生器以產生第一可檢測信號，各條所述第一寡聚核苷酸具有基本上相同的結合所述目標ncRNA分子的第一Tm值；c.使所述樣品和第二寡聚核苷酸在適當條件下接觸，以便與各待測目標RNA分子相結合，形成所述第二寡聚核苷酸與所述目標ncRNA的複合物，所述第二寡聚核苷酸包含第二信號發生器以產生第二可檢測信號，各條所述第二寡聚核苷酸具有基本上相同的結合所述目標ncRNA分子的第二Tm值；d.通過測定第一、第二可檢測信號來確定所述樣品中的所述多種目標ncRNA。
20.如權利要求19的方法，其中ncRNA是miRNA。
21.如權利要求19的方法，其中與所述多種目標ncRNA分子中的特定ncRNA分子結合的各條所述第一寡聚核苷酸的第一可檢測信號是不同的。
22.如權利要求19的方法，其中同時加入所述第一、第二寡聚核苷酸。
23.如權利要求19的方法，其中先後加入所述第一、第二寡聚核苷酸。
24.如權利要求19的方法，其中每個所述第一Tm和每個所述第二Tm是基本上相同的。
25.如權利要求19的方法，其中至少一條所述第一寡聚核苷酸和所述第二寡聚核苷酸包含至少一個經過修飾的核苷酸。
26.如權利要求25的方法，其中所述經過修飾的核苷酸是鎖定核苷酸。
27.如權利要求26的方法，其中每個所述第一Tm和每個所述第二Tm是基本上相同的。
28.如權利要求19的方法，其中所述第一、第二可檢測信號包括光學信號。
29.如權利要求19的方法，其中所述第一、第二可檢測信號是螢光信號。
30.如權利要求19的方法，其中所述第一信號發生器是微球體，所述微球體產生所述第一可檢測信號。
31.如權利要求30的方法，其中所述第一可檢測信號是光學信號。
32.如權利要求30的方法，其中所述第一可檢測信號是螢光信號。
33.如權利要求19的方法，其中所述第一寡聚核苷酸長度是8-12個核苷酸，所述第二寡聚核苷酸長度是8-12個核苷酸。
34.如權利要求1的方法，其中所述方法用於生成所述樣品中的所述目標ncRNA分子圖譜。
35.如權利要求19的方法，其中所述樣本來自人類。
36.如權利要求19的方法，其中所述RNA樣品沒有經過大小分級來增加較小分子量RNA族的比例。
37.某種疾病或症狀的標籤ncRNA圖譜的一種生成方法，所述方法包括以下步驟a.從具有所述疾病或症狀特徵的樣本中獲得ncRNA圖譜以創造第一個圖譜，所述圖譜通過如權利要求19的方法獲得；b.從具有正常特徵的樣本中獲得ncRNA圖譜以創造第二個圖譜，所述圖譜通過如權利要求19的方法獲得；c.從所述第一個圖譜中鑑定出一個或多個將第一圖譜、第二圖譜區別開來的ncRNA分子。
38.如權利要求37的方法，其中所述ncRNA是miRNA
39.如權利要求37的方法，其中所述疾病是神經膠質瘤或者乳腺癌。
40.如權利要求37的方法，其中的對象是人。
41.一種疾病或症狀的診斷方法，所述方法包括以下步驟a.根據如權利要求19的方法確定實驗對象的ncRNA圖譜；b.將所述實驗對象的ncRNA圖譜與該疾病或症狀的標籤ncRNA圖譜進行比較，通過如權利要求37的方法獲得所述標籤ncRNA圖譜；c.根據所述實驗對象的ncRNA圖譜與該疾病或症狀的標籤ncRNA圖譜之間的比較結果，對所述實驗對象是否患有該疾病或症狀作出診斷。
42.如權利要求41的方法，其中所述ncRNA是miRNA。
43.如權利要求41的方法，其中所述疾病是神經膠質瘤或乳腺癌。
44.如權利要求41的方法，其中所述實驗對象是人。
45.一種用於識別涉及某種疾病或症狀的基因的篩選方法，所述方法包括以下步驟a.獲得該疾病或症狀的標籤ncRNA圖譜，所述標籤ncRNA圖譜通過如權利要求37的方法獲得；b.確定分子靶標，該分子靶標與標籤ncRNA圖譜裡識別的一種所述ncRNA相互作用。
46.如權利要求45的方法，其中所述ncRNA是miRNA。
47.如權利要求45的方法，其中所述疾病是神經膠質瘤或乳腺癌。
48.如權利要求45的方法，其中所述實驗對象是人。
49.如權利要求45的方法，其中所述確定步驟是在運算法則的幫助下完成的。
50.一種乳腺癌的標籤miRNA圖譜，所述標籤miRNA圖譜包括mir-107、mir-15B和mir-13。
51.如權利要求50的標籤miRNA圖譜，進一步包括mir-17-5p、mir-16、mir-126、mir-141、mir-193、mir29a、mir-195、mir-26a、mir20、mir128b、mir217和mir219中的至少一個。
52.如權利要求50或者51的標籤miRNA圖譜，其中所述圖譜用於診斷乳腺癌。
53.如權利要求50或者51的標籤miRNA圖譜，其中所述圖譜在藥物開發中用於確定候選的治療性靶標。
54.神經膠質瘤的標籤miRNA圖譜，所述標籤miRNA圖譜包含mir-141、mir-23b和mir-17-3p。
55.如權利要求50的標籤miRNA圖譜，進一步包含mir-143、mir-15b、mir-293和mir320中的至少一個。
56.如權利要求54或者55的標籤miRNA圖譜，其中所述圖譜用於診斷神經膠質瘤。
57.如權利要求54或者55的標籤miRNA圖譜，其中所述圖譜在藥物開發中用於確定候選的治療性靶標。
58.一種檢測目標ncRNA的方法，所述方法包括以下步驟a.提供實驗對象的RNA樣品，所述樣品包含所述目標ncRNA；b.使所述樣品和與所述目標RNA對應的第一寡聚核苷酸在適當條件下接觸，以形成所述第一寡聚核苷酸與所述目標ncRNA的複合物，所述第一寡聚核苷酸包含第一信號發生器以產生第一可檢測信號；c.使所述樣品和與所述目標RNA對應的第二寡聚核苷酸在適當條件下接觸，以形成所述第二寡聚核苷酸與所述目標ncRNA的複合物，所述第二寡聚核苷酸包含第二信號發生器以產生第二可檢測信號；d.通過測定第一和第二可檢測信號來確定所述樣品中的所述目標ncRNA。
59.如權利要求58的方法，其中所述第一寡聚核苷酸結合所述ncRNA上的第一互補序列，並且具有結合所述第一互補序列的第一Tm值；所述第二寡聚核苷酸結合所述ncRNA上的第二互補序列，並且具有結合所述第二互補序列的第二Tm值；所述第一、第二Tm值基本上相同。
60.如權利要求58的方法，其中同時加入所述第一、第二寡聚核苷酸。
61.如權利要求58的方法，其中先後加入所述第一、第二寡聚核苷酸。
62.如權利要求58的方法，其中至少一條所述第一寡聚核苷酸和所述第二寡聚核苷酸包含至少一個經過修飾的核苷酸。
63.如權利要求58的方法，其中所述修飾核苷酸是鎖定核苷酸。
64.如權利要求58的方法，其中所述第一寡聚核苷酸結合所述ncRNA上的第一互補序列，並具有結合所述第一互補序列的第一Tm值；所述第二寡聚核苷酸結合所述ncRNA上的第二互補序列，並具有結合所述第二互補序列的第二Tm值；所述第一Tm值與所述第二Tm值基本上相同。
65.如權利要求58的方法，其中所述第一和第二可檢測信號包括光學信號。
66.如權利要求58的方法，其中所述第一和第二可檢測信號是螢光信號。
67.如權利要求58的方法，其中所述第一信號發生器是微球體，所述微球體產生所述第一可檢測信號。
68.如權利要求67的方法，其中所述第一可檢測信號是光學信號。
69.如權利要求68的方法，其中所述第一可檢測信號是螢光信號。
70.如權利要求58的方法，其中所述第一寡聚核苷酸長度為8-12個核苷酸，所述第二寡聚核苷酸長度為8-12個核苷酸。
71.如權利要求58的方法，其中所述方法用於生成所述樣品中的所述目標ncRNA分子圖譜。
72.如權利要求58的方法，其中所述樣本來自人。
73.如權利要求58的方法，其中所述方法用於多重檢測反應。
74.如權利要求58的方法，其中所述RNA樣品沒有經過大小分級來增加較小分子量RNA族的比例。
75.如權利要求58的方法，其中所述ncRNA是miRNA。
全文摘要
本發明描述了一種檢測ncRNA分子的新方法。所公開的方法尤其適用於檢測miRNA和siRNA。該方法可以產生樣品中ncRNA分子的輪廓圖。另外，採用本發明所公開的方法可以產生特定疾病或症狀的ncRNA標籤。這種ncRNA標籤可以用作診斷、治療、藥物發現目的，以及其它用途。
文檔編號C12Q1/68GK101056991SQ200580019910
公開日2007年10月17日 申請日期2005年4月20日 優先權日2004年4月20日
發明者韓健 申請人:基因耐克生物醫學製品有限公司