一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法

2023-06-08 03:48:56 2

一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，包括以下步驟：（1）根據CPV-VP2基因序列，設計一對引物，PCR擴增CPV-VP2基因，連接至pMD18-T載體，轉化DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選後，提取質粒，酶切分析，陽性質粒測序，對測序結果進行比較分析；（2）VP2蛋白在大腸桿菌中的表達、純化:pMD18-T-VP2和pET-32a載體使用BamH?I和Xho?I雙酶切，目的片段連接，構建pET-32a-VP2表達載體，轉化Bal21（DE3）pLysS感受態細菌，酶切和PCR鑑定後，優化IPTG誘導濃度和時間，進行大量誘導表達，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進行純化；（3）抗VP2-IgY抗體的製備：純化的VP2蛋白免疫產蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，並進行SDS-PAGE分析。本發明提取的抗VP2-IgY抗體可較好地結合VP2蛋白，而與降解片段無交叉反應。
【專利說明】一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種特異性IgY的製備和應用，具體涉及一種抗酸性橙II卵黃抗體的製備方法。
【背景技術】
[0002]犬細小病毒(Canine parvovirus, CPV)可引起犬發生出血性腸炎和心肌炎，以6月齡動物發病較多，佔全年發病數的65.7%。流行季節差異不大，以春秋季節略多(劉大飛等
2009)。在中國，犬細小病毒病首次報導時間為1983年，嚴重危害我國養犬業，並造成了嚴重的經濟損失。[0003]CPV為單鏈DNA病毒，含有5323個核苷酸，包含兩個ORF (Open readingframe, 0RF)，3』端ORF編碼非結構蛋白NSl和NS2，5』端ORF編碼結構蛋白VPl和VP2(Zhaoet al.2011)。病毒空衣殼蛋白含有VPl (83ku)和VP2 (67ku)兩種蛋白質。CPV粒子由60個亞單位裝配而成，VP2佔90%，而VPl只佔10% (Reed et al.1988)。VP2構成CPV衣殼蛋白的主要成分，是CPV的主要保護性抗原蛋白，且具有識別宿主受體、決定病毒感染不同組織細胞的功能。CPV衣殼由8個反向平行的β-摺疊組成，在摺疊間的四個環，環1、3、4來自VP2，構成了衣殼的表面，形成2.2nm纖突，該纖突的頂部和肩部為病毒衣殼的功能部分，包含了 CPV的兩個主要中和位點，同時為病毒識別受體的部位(Agbandje et al.1995)。使用全病毒粒子進行免疫吸附試驗顯示可能有6-10個抗原表位位於衣殼表面，3個抗原位點位於VP2蛋白的氨基端，3個抗原表位位於VP2蛋白中環所形成的纖突上，且可能是病毒誘導機體產生中和抗體的主要目標位點(Langeveld et al.1993)。使用軟體分析，CPV病毒的B細胞表位主要位於VP2蛋白上，同時VP2蛋白有兩個親水性區域，分別位於VP2蛋白氮端第5-30胺基酸和第340-420位胺基酸，如1_38，73-83，294-326等，但其最終效果還需通過試驗進一步證實(蘇建青等2007;王淨等2011)。
[0004]犬心肌炎和出血性胃腸炎是CPV感染的不同表現形式，3-4周齡的幼犬感染後易患急性心肌炎，而成年犬和10周齡以上的犬易患腸炎症候群。CPV感染細胞後可使細胞線粒體腫脹，造成細胞損壞，病死犬剖檢出現小腸壞死現象，有時伴有心肌淤血、變薄(周雲朵等2011)。CPV在感染不同時期，病毒通過腸道排出數量不同，HA檢測發現，犬在感染CPV後，在第5-8天可檢測出相應的病毒，感染4天後，可分離出相應的病毒，實時螢光定量PCR檢測顯示其排毒持續時間達I月左右(Decaro et al.2005)。
[0005]CPV實驗室檢測方法主要包括免疫層析(Immunochromatography, 1C)、血凝實驗(Hemagglutination test, HA)、PCR等，各檢測方法的檢測限不同。實時螢光定量PCR靈敏度最高，檢測限可達到102拷貝/ μ L左右，且具有較好的重複性(李英俊等2010;劉海防等
2010)。將IC、HA、PCR和敏感性較高的實時螢光定量PCR比較，符合率分別為56.2%,68.5%、93.2% (Decaro et al.2010)。臨床普遍使用CPV膠體金檢測試劑盒進行檢測，在樣品病毒含量大於105/mg時，檢出率可達70%，且對各亞型檢出率基本相同(Decaro et al.2010)。劉忠華等(2003)建立的PCR診斷方法，可以區別疫苗株和野毒株，具有較好的敏感性和特異性。PCR檢測方法敏感性較高，但需特殊儀器，不適合基層檢測的需要。楊慧等(2010)建立的環介導等溫擴增技術，不需要相應的PCR儀，且檢測時間短暫，敏感性達到9.3 X 10-5ng/μ L，具有較好的特異性，適合基層推廣使用。
[0006]抗體的檢測可以為免疫接種程序的制定和臨床診斷提供依據。相比其它抗體檢測方法，膠體金試紙條和ELISA試劑盒操作簡便，價格低廉，在臨床上被廣泛應用，膠體金試紙條和傳統的HI相比，其敏感性和特異性達到97.1%，76.6%，而ELISA試劑盒陽性檢出率達到85%，和HI符合率達到80% (Oh et al.2006;劉劍鬱等2006)。
[0007]IgY技術，即通過對禽類(雞)免疫注射特定抗原，從卵黃中獲得特異性多克隆抗體。相對於哺乳動物抗體，IgY技術避免了常規的動物採血，滿足動物福利要求，且抗體產量大，製備相對簡單，經濟優勢明顯，更為重要的是，IgY還具有一系列生物學與抗體特性與優勢。近年來，IgY抗體在醫藥、生物【技術領域】都呈現出良好的發展勢頭。IgY已廣泛應用於細菌、病毒等病原體檢測，特異性、敏感性較好，同時能夠降低CPV治療成本和基於IgY檢測試劑盒的研製奠定基礎。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在於針對現有技術中的不足，提供一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法。
[0009]為了解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案實現:
[0010]一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟:
[0011](I)犬細小病毒VP2基因的克隆與序列分析:根據CPV-VP2基因序列，利用primerprime5.0軟體，設計一對引物，PCR擴增CPV-VP2基因(1755bp)，連接至pMD18_T載體，轉化DH5ci感受態細胞，經藍白斑篩選後，`提取質粒，酶切分析，陽性質粒測序。結果表明，實驗所獲西安分離株為CPV-2a，和國外參考株核苷酸相似性在92.4%以上。
[0012](2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達、純化。pMD18-T-VP2和pET-32a載體使用BamHI和Xho I雙酶切，目的片段連接，構建pET-32a-VP2表達載體，轉化Bal21 (DE3)pLysS感受態細菌，酶切和PCR鑑定後，優化IPTG誘導濃度和時間，進行大量誘導表達。表達產物經SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進行純化。結果表明，構建成功pET-32a-VP2表達載體，重組VP2蛋白在0.75mmol/L的IPTG誘導5h，主要以包涵體形式存在，除89ku的VP2目的蛋白外，在50ku和40ku附近出現2個低分子量片段，表達產物經Ni+柱純化後，出現89ku和50ku兩個片段。Western blot表明重組蛋白具有良好的反應原性。
[0013](3)抗VP2_IgY抗體的製備。純化的VP2蛋白免疫產蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，並進行SDS-PAGE分析。間接ELISA測定免疫後抗VP2_IgY抗體效價，Westernblot鑑定所獲抗VP2-1gY的特異性。結果表明，IgY抗體經SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈(65ku)和輕鏈(19ku);四免後，抗VP2-1gY效價達到1:40560, Western blot表明，所製備IgY抗體可特異性結合VP2蛋白。
[0014]所述製備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300 μ g/只,初次免疫21天之後,進行4次加強免疫,間隔時間為21天,免疫劑量為250 μ g/只，所屬禽類為雞。
[0015]所述提取IgY的方法如下；
[0016](I)將所述收集的蛋進行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS (pH7.4)按照體積比1:2進行稀釋；
[0017](2)向稀釋液加入質量體積比為3.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘；
[0018](3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質量體積比為8.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘；
[0019](4)將經過攪拌後的混合液離心，棄去上清液，沉澱使用10毫升的PBS懸浮，加入質量體積比為12%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘，再進行離心，獲得沉澱物；
[0020](5)將所述沉澱物使用1.2毫升PBS溶解後，使用透析帶進行透析，使用PBS透析過夜，獲得IgY，並保存在-20°C備用。
[0021]本發明的有益效果:
[0022](I)本發明的方法提取的重組蛋白具有良好的反應原性；
[0023](2 )本發明提取的抗VP2_IgY抗體可較好地結合VP2蛋白，而與降解片段無交叉反應；
[0024](3)提取方法相對簡單，抗體產量大，製備成本低。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例對本發明的技術方案作詳細說明。
[0026]一種抗犬細小病毒VP2蛋白IgY的製備方法，所述方法包括以下步驟:
[0027](I)犬細小病毒VP2基因的克隆與序列分析。根據GenBank報導的有關CPV-VP2基因序列，利用primer prime5.0軟體，設計一對引物，PCR擴增CPV-VP2基因(1755bp)，連接至pMDlS-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，經藍白斑篩選後，提取質粒，酶切分析，陽性質粒測序。
[0028](2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達、純化。pMD18-T-VP2和pET_32a載體使用BamHI和XhoI雙酶切，目的片段連接，構建pET-32a-VP2表達載體，轉化Bal21 (DE3)pLysS感受態細菌，酶切和PCR鑑定後，優化IPTG誘導濃度和時間，進行大量誘導表達。表達產物經SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進行純化。結果表明，構建成功pET-32a-VP2表達載體，重組VP2蛋白在0.75mmol/L的IPTG誘導5h，主要以包涵體形式存在，除89ku的VP2目的蛋白外，在50ku和40ku附近出現2個低分子量片段。表達產物經Ni+柱純化後，出現89ku和50ku兩個片段。Western blot表明重組蛋白具有良好的反應原性。
[0029](3)抗VP2_IgY抗體的製備。純化的VP2蛋白免疫產蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，並進行SDS-PAGE分析。間接ELISA測定免疫後抗VP2_IgY抗體效價，Westernblot鑑定所獲抗VP2-1gY的特異性。結果表明，IgY抗體經SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈(65ku)和輕鏈(19ku);四免後，抗VP2-1gY效價達到1:40560, Western blot表明，所製備IgY抗體可特異性結合VP2蛋白。[0030]實施例
[0031]本實施例擬對CPV-VP2結構蛋白進行克隆，構建原核表達載體pET-32a_VP2，表達和純化VP2蛋白，並將其作為免疫原，免疫產蛋雞，生產抗VP2重組蛋白特異性IgY抗體。
[0032]1、引物設計與合成
[0033]根據GenBank登記的犬細小病毒參考株(FJ011098)序列，使用軟體PrimerPrime5.0設計一對引物，用於擴增VP2基因全長DNA序列(1755bp)。上遊引物P:5,-ATGGATCCCCAATGAGTGATGGAGCAG-3,(下劃線處為 BamH I 酶切位點)，下遊引物R:5,-CCGCTCGAGATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG-3，(下劃線處為Xho I酶切位點)。引物由上海生工公司合成，雙蒸水稀釋為IOpmol/μ L，-20°C保存。
[0034]2、VP2基因的PCR擴增
[0035]模板製備:取病毒上清50 μ L，沸水煮IOmin後，12000rpm離心lOmin，取上清。
[0036]PCR反應體系如下:
[0037]
試劑體積 模板15 μ L 10X緩衝液5 UL
MgCI2 (25 mmol/L)3 μ L
dNTPs (2.5 mmol/L)4 uL
上、下遊引物 P，R (20 uraol/L) I μ L
TaqTM 酶(5 U/μ L)0.25 μ L
雙蒸水至50 μ L
[0038]反應參數:951:預變性51^11，941:變性lmin，55°C 復性 lmin，72°C 延伸 Imin，35 個循環，72°C延伸IOmin。
[0039]3、PCR產物的回收與純化
[0040]PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，100V, 50min。凝膠呈像系統進行觀察，拍照。
[0041]紫外燈下，使用刀片切下含目的片段的凝膠，吸水紙吸乾後，置於離心管中，稱重。按照北京百泰克生物技術有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明書進行操作如下:
[0042]( I)加入三倍體積的溶膠/結合液；
[0043](2)56°C水浴放置IOmin (至膠完全溶解)，2-3分鐘渦旋震蕩數次，幫助加速溶解；
[0044](3)將溶解的膠溶液加入到收集管中的吸附柱，12000rpm離心30_60s ；
[0045](4)將700 μ L漂洗液加入到吸附柱中，12000rpm離心Imin ；
[0046](5)將吸附柱置於空收集管中，12000rpm離心2min ；
[0047](6)將吸附柱置於1.5ml無菌離心管中，將50 μ L洗脫緩衝液加入到吸附膜中間，室溫放置2min, 12000rpm離心Imin,收集物保存於-20 °C。[0048]4、回收產物與pMD18-T-VP2載體連接與轉化
[0049]連接
[0050]按大連寶生物pMD18-T載體操作試劑盒說明書將PCR回收產物與pMD18_T載體連接。連接體系如下:
[0051]pMD18_T VectorIuL
[0052]回收片段4yL
[0053]Solution I5 μ L
[0054]混勻後4°C連接過夜。
[0055]感受態細胞的製備
[0056](I)接種針挑取大腸桿菌(-80°C保存)，在LB培養基平板劃線，37 °C培養；挑取單菌落，接種於LB培養基(5ml),振蕩培養過夜；
[0057](2)菌液接種於100ml LB( 1:100)液體培養基，震蕩培養3h，至0D600 ^ 0.4-0.6 ;
[0058](3)無菌條件下將100ml 細菌培養液轉移到一個用冰預冷的50ml離心管中，冰上放置20min ；
[0059](4) 4°C離心，5000rpm, IOmin ；
[0060](5)棄上清，將離心管倒置lmin，以使最後殘留的痕量培養液流盡；
[0061](6)加 IOml 預冷的 CaCl2 (0.lmol/L)溶液，冰上放置 30min ；
[0062](7) 4°C離心，5000rpm, IOmin,棄上清；
[0063](8)加IOml預冷的CaCl2 (0.lmol/L)溶液重懸細胞，加入20%甘油，_80°C貯存。
[0064]轉化
[0065](I)從_80°C取出製備的DH5a感受態細菌，置冰上，完全解凍後，加入10 μ L連接產物，輕輕混勻，冰上放置30min ；
[0066](2)將混合物42°C加熱45s後，置冰上Imin ；
[0067](3)加入890 μ L LB培養基，37°C振蕩培養60min ;
[0068](4)菌液塗於含有X_gal、IPTG、Amp的LB瓊脂培養基，正向放置30min後，37°C倒置培養過夜，進行藍白斑篩選；
[0069](5)挑選3個白色菌落，接種於含有氨苄青黴素(100μ g/ml)的LB液體培養基進行培養。
[0070]5、重組質粒的提取
[0071]含有重組質粒的DH5 α菌在含有Amp的LB液體培養基培養後，提質粒酶切鑑定:
[0072]參照威格拉斯質粒小量提取試劑盒，提取pMD18-T-VP2質粒，操作如下
[0073](I)收菌:取過夜培養的DH5a細菌2ml，置於2ml離心管中，離心，12000rpm，2min,棄上清,取沉澱；
[0074](2)重懸:加入200 μ L Pl緩衝液，充分混懸震蕩菌體沉澱10_15s，使其完全散開，至無絮狀物存在；
[0075](3)裂解:加入200 μ L P2緩衝液，輕輕點到離心管3-5次，室溫放置2_3min，使細菌完全裂解，溶液透明，裂解時間不超過5min ；
[0076](4)中和:加入300 μ L P3緩衝液，輕輕顛倒離心管4_6次，充分混勻，室溫放置l_5min,可見白色絮狀產生,離心12000rpm,8min ；[0077](5)柱平衡:向插入套管的離心柱內加入300 μ L PE緩衝液，12000rpm，30s ；
[0078](6) DNA結合:中和後離心的質粒粗提物上清小心吸出，轉移至經平衡液處理過的離心柱內，離心，12000rpm, 30s,棄去套管內液體，將離心柱插回套管；
[0079](7)清洗:向離心柱內加入500 μ L PWT緩衝液，離心，12000rpm，30s，棄去套管內廢液；
[0080](8)再清洗:加入700 μ L Pff PWT緩衝液，離心，12000rpm，30s，棄去套管內廢液，再次離心2min ；
[0081](9)收離心柱:小心取出離心柱，不要沾上套管內的廢液，棄去套管；
[0082](10)洗脫DNA:將離心柱插入一個新的1.5ml離心管，在離心管內矽膠膜中心位置加入100 μ L洗脫液，12000rpm, lmin,離心管中即得純化的質粒DNA溶液，-20°C保存。
[0083]6、重組質粒的酶切鑑定
[0084]重組質粒使用BamH 1、XhoI進行酶切鑑定，酶切體系如下。酶切產物進行瓊脂糖凝膠(0.89ODNA電泳，100V，50min。電泳後，凝膠置凝膠呈像系統進行觀察。目的片段使用DNA凝膠回收試劑盒回收(操作如上)，-20°C保存。
[0085]
BamH II μ L
Xho II uL
IOX緩衝液2 UL
質粒5 μ L
加蒸餾水至20 μ L
[0086]37 O酶切反應2h
[0087]7、表達質粒pET_32a擴增
[0088]取實驗室保存的含pET_32a載體的Bal21 (DE3)菌株，按1:100接種於含有氨苄青黴素(100 μ g/ml)的LB培養基，培養過夜。質粒使用試劑盒提取，-20°c貯存備用。
[0089]8、重組表達質粒pET-32a_VP2的構建及鑑定
[0090]克隆載體pMD18-T-VP2及表達載體pET_32a分別使用BamH I及Xho I雙酶切，酶切體系如上所述。將酶切產物進行電泳，目的片段使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，操作如上所述。按照DNA連接試劑盒操作說明，將酶切回收片段pET-32a載體和VP2片段進行連接，連接體系如下。
[0091]連接產物(IOyL)轉化DH5a感受態細胞(轉化過程如上所述)，菌液塗布於含有氨苄青黴素(100 μ g/L)的LB固體培養基，37°C培養過夜。挑取單菌落，接種於含有氨苄青黴素(100 μ g/L)的LB培養基進行培養。提取質粒，經酶切和PCR鑑定後，陽性質粒命名為pET-32a-VP2，並將陽性質粒轉化Bal21 (DE3)感受態細胞。
[0092]連接體系如下
[0093]pET-32a3 μ L
[0094]VP22 μ L
[0095]Solution I5 μ L[0096]4 °C連接過夜。
[0097]9、VP2基因誘導表達時間的確定
[0098]將含有pET-32a_VP2的Bal21菌接種於含有氨苄青黴素(100 μ g/mL)的LB液體培養基，37°C振蕩培養至0D600達到0.6-1.0時，加入IPTG (lmmol/L)誘導表達，分別收集誘導後0h、2h、3h、4h、5h和6h菌液Iml,離心,8000rpm, 5min,收集沉澱，進行SDS-PAGE電泳分析。pET-32a空載體誘導前、誘導後4h，各取1ml，作為對照。
[0099]SDS-PAGE 電泳:
[0100]制膠:洗淨玻璃板，固定在制膠器上，按分離膠配方，依次加入各試劑，最後加入過硫酸銨，上下顛倒混勻後，快速注入兩玻璃板之間，膠上覆蓋一層雙蒸水，靜置30min。傾去上層雙蒸水，吸水紙吸乾殘留的雙蒸水，加入配置好的5%濃縮膠，水平插入梳子，靜置2h。垂直移去梳子，去掉制膠器，移入電泳槽，在內、外槽加入電泳緩衝液，電泳液沒過膠孔，使用注射器吸取電泳液，衝洗膠孔中殘留膠。
[0101]上樣:樣品按照2:1比例加入電泳上樣緩衝液，渦旋混勻，沸水浴10min，8000rpm離心lmin，取上清。使用移液槍上樣，20 μ L/孔。電泳，濃縮膠電壓為90V，當溴酚藍進入分離膠時，提高電壓至120V，溴酚藍至膠底部1cm，停止電泳。
[0102]染色:電泳結束後，取下凝膠，使用刀片切掉濃縮膠，蒸餾水衝洗後，置於凝膠染色液中，室溫搖床上染色5h。
[0103]脫色:染色結束後，取凝膠置於脫色液中，搖床上進行脫色，其間更換染色液3-4次，直至凝膠背景變淡。
[0104]10、VP2基因IPTG誘導濃度的確定
[0105]培養含有pET-32a-VP`2 的 Bal21 菌，待 0D600 達到 0.6-1.0 時，分別加入 0.5mmol/L、0.75mmol/L、lmmol/L、1.25mmol/L> 1.5mmol/L 和 2mmol/L 的 IPTG 進行誘導。收集各組誘導4h菌液，進行SDS-PAGE分析。
[0106]11、重組蛋白可溶性分析
[0107]在IPTG最佳誘導濃度和誘導時間的條件下，誘導培養含有pET-32a_VP2的Bal21菌(200ml)，4°C離心收集菌液，8000rpm，5min。菌體在冰浴中超聲破碎(120W，IOs/次，間隔5s，20min),離心，12000rpm, 5min,分別取上清和沉澱進行SDS-PAGE分析。pET_32a空載體誘導前、後上清和不溶部分，各取Iml作為對照。
[0108]12、融合蛋白的Western blot分析
[0109]SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，操作如上，電泳後，進行Western blot鑑定，操作如下:
[0110](I)轉膜前準備:凝膠使用去離子水漂洗後，置於轉移緩衝液中。戴上手套，使用刀片分別裁剪與凝膠長、寬相同的6張濾紙，I張PVDF膜。將PVDF膜置於甲醇(100%)中浸泡，與6張濾紙一起浸於轉移緩衝液平衡。
[0111](2)轉膜:按照3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙的順序，將其疊放於半乾轉移裝置的石墨板上，PVDF膜置於正極。使用玻璃棒除去膜與膜，膜與膠之間的氣泡，在濾紙上加入Iml轉移緩衝液，進行轉移，轉移參數:2V，100mA，50min左右。轉膜後的凝膠轉移至盛有考馬斯亮藍染液的託盤中，進行染色，以檢查蛋白質轉移是否完全，同時切去濾膜的左下角作為標記。[0112](3)封閉:帶上手套，將PVDF膜置於可加熱封接的塑膠袋中，加入IOml封閉緩衝液(0.lml/cm2),排除氣泡,搖床上室溫溫育I小時。
[0113](4) 一抗和靶蛋白的結合:棄去封閉液，加入封閉緩衝液稀釋的抗組氨酸標籤一抗(1:5000)，排除氣泡後密封袋口，平放於搖床，室溫溫育1-2小時。
[0114](5)洗膜:剪開塑膠袋，棄去封閉液和抗體，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10分鐘。
[0115](6) 二抗和一抗的結合:經TBST最後一次洗滌後，把PVDF膜轉移至塑膠袋，按濾膜面積加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(1:5000)，37°C平緩搖動、溫育I小時。
[0116](7)洗滌:將PVDF膜轉移至TBST溶液，室溫洗滌3次，IOmin/次。
[0117](8)顯色:暗室中，將魯米唑和雙氧水按照1:1比例混合，製成發光液。將PVDF膜置於發光液進行顯色，直至條帶清晰後，使用鑷子拿出，置於蒸餾水中漂洗，放到定影液中，定影5min。
[0118]13、表達蛋白的純化
[0119]在最佳IPTG誘導濃度和誘導時間下，誘導培養含有pET-32a_VP2的Bal21菌(1000ml),8000rpm離心5min,收集菌體沉澱。沉澱使用預冷的超聲破碎緩衝液洗漆3次，12000rpm離心IOmin,收集沉澱,按3ml/g溼菌比例加入預冷的超聲波破碎緩衝液,重懸後，冰浴中超聲破碎(120W，IOs/次，間隔5s，20min)。4°C離心，12000rpm, lOmin，取沉澱。沉澱重懸於9倍體積的包涵體洗漆緩衝液I,懸浮後4°C離心，12000rpm, IOmin,取沉澱。沉澱分別使用包涵體洗滌緩衝液I1、III洗滌後，4°C離心，12000rpm, lOmin，取沉澱。將洗滌後的包涵體重懸於包涵體溶解液中(10倍體積),室溫放置,充分裂解。裂解後的包涵體4°C離心，12000rpm, 20min,取上清，0.22 μ m濾膜過濾後，使用Ni+親和層析柱純化，收集洗脫液，進行SDS-PAGE分析。純化過程如下:
[0120](I)將Ni+親和層析柱、注射器、核酸蛋白檢測儀進行連接；
[0121](2)用5倍柱體積蒸餾水洗親和層析柱，使吸光光度值A達到最低，且保持不變；
[0122](3)至少5倍柱體積結合緩衝液平衡親和層析柱，流速控制為lml/min，至吸光光度值A穩定；
[0123](4)處理好的樣品上樣,5ml/次；
[0124](5)上樣完畢，使用結合緩衝液洗親和層析柱，至吸光光度值A穩定；
[0125](6)使用洗脫緩衝液進行洗脫，收集洗脫液各組分進行SDS-PAGE電泳分析；
[0126](7)洗脫完畢後，使用蒸餾水洗親和層析柱，置於15%乙醇，4°C保存。
[0127]親和層析柱Ni+剝離與再生:使用Ni+親和層析柱5次後，進行Ni+的剝離與再生。使用10倍柱體積剝離緩衝液洗滌Ni+親和層析柱後，加入lmol/L的NaOH溶液，緩慢洗滌Ih,然後分別加入10倍柱體積蒸餾水和結合緩衝液進行洗滌，加入2ml0.lmol/L Ni+S04溶液進行Ni+的再生。
[0128]14、包涵體蛋白復性
[0129]透析袋處理:透析袋在大體積2% (W/V)NaHC03中煮沸lOmin，蒸餾水洗滌後，置於lmmol/L EDTA (pH8.0)中煮沸 lOmin，冷卻後，存放於 4°C。
[0130]洗脫蛋白置於透析袋(截留量為8000-10000)進行透析復性。透析袋置於尿素濃度逐漸降低的PBS溶液中,尿素濃度依次為6mol/L, 5mol/L, 4mol/L, 3mol/L, 2mol/L, OmoI/L,換液間隔時間2h。
[0131]VP2基因的擴增
[0132]PCR擴增CPV-VP2基因全長序列，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析後，得到一條與預計大小(1755bp)相符的電泳條帶。
[0133]15、pMD18-T_VP2 酶切鑑定
[0134]重組克隆質粒pMD18-T-VP2經BamH I和Xho I雙酶切分析後，電泳得到兩條片段，與VP2目的基因(1755bp)和pMD18-T載體(2672bp)相符，說明克隆片段連接入pMD18_T載體。
[0135]重組表達質粒pET-32a-VP2的構建及鑑定
[0136]重組表達質粒pET-32a_VP2I和Xho I雙酶切分析鑑定後，使用PCR進行鑑定。酶切產物經電泳後出現兩條條帶，與VP2目的基因(1755bp)和載體片段(5900bp)大小相符，表達質粒經PCR擴增後，出現與VP2大小(1755bp)相似片段，表明VP2目的基因連接至pET-32a載體，表達載體pET-32a-VP2構建成功。
[0137]16、VP2融合蛋白最佳誘導時間的確定
[0138]pET-32a-VP2 在 lmmol/L 的 IPTG誘導下，在80-100ku 間出現目的條帶。VP2(65ku)融合蛋白帶有組氨酸標籤，接近89ku。在誘導的不同時間下，取樣進行SDS-PAGE電泳分析，表明誘導5h，可獲得相對較好的表達，pET-32a-VP2分別經IPTG誘導2h、3h、4h、5h、6h表達產物。
[0139]17、VP2融合蛋白IPTG誘導濃度的確定
[0140]在優化的誘導時間(5h)下，以0.75mmol/L的IPTG誘導pET_32a_VP2進行表達，SDS-PAGE電泳分析可獲得相對較好的表達，分別為pET-32a-VP2在0.5mmol/L、0.75mmol/L、lmmol/L、1.25mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L IPTG誘導 4h 表達產物,表明增加 IPTG 的誘導濃度，表達產量並未顯著增加。
[0141]18、VP2融合蛋白的可溶性分析及鑑定
[0142]沉澱和上清分別進行SDS-PAGE電泳。結果在80_100ku間，pET_32a_VP2經IPTG誘導後，沉澱中出現條帶，與VP2融合蛋白(89ku)相近，而對照在此處無相應目的條帶；沉澱在約50ku及40ku各有一條帶，可見pET-32a-VP2經誘導後，上清與對照相比，無相應目的條帶出現，說明目的蛋白主要以包涵體形式存在於沉澱中。
[0143]19> Western blot 分析
[0144]使用抗His標籤的一抗進行Western blot鑑定,在80_100ku之間及50ku附近出現條帶，40ku及上清中無反應條帶,說明VP2及50ku融合蛋白表達正確,帶有組氨酸標籤，且具有較好的反應原性。
[0145]20、VP2融合蛋白的純化
[0146]VP2融合蛋白使用Ni+色譜柱進行純化，收集洗脫液。結果在89ku及50ku附近出現條帶。
[0147]21、Braford法測定重組蛋白含量
[0148](I)蛋白標準品(lmg/ml)完全溶解於PBS溶液中(0.5mg/ml)；
[0149](2)將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μ L分別加入各孔中，加PBS稀釋液補足至Ij20 μ L ；[0150](3)將樣品進行稀釋，加入到各孔中，加標準品稀釋液到20μ L ;
[0151](4)各孔加入200yL Bradford染色液，輕輕用加樣槍吹打均勻，室溫放置3_5min ；
[0152](5)用酶標儀測定0D630的吸光光度值，繪製標準曲線。
[0153]按照以上步驟加入被測樣品(重組VP2蛋白)，測定A630nm的吸光光度值，使用Origins.0軟體繪製標準曲線，根據標準曲線計算重組蛋白含量。
[0154]22、免疫原製備及免疫[0155]用生理鹽水Iml將純化抗原凍乾粉末(含400 μ g抗原)進行溶解，加入等量的費氏完全佐劑進行乳化，乳化抗原胸肌分點注射海蘭褐產蛋雞(2隻)。初免2周、4周、6周後，加入等量費氏不完全佐劑進行二免、三免和四免。收集免疫前後雞蛋，消毒，標號，4°C保存。
[0156]23、IgY抗體提取與鑑定
[0157]聚乙二醇沉澱法提取IgY抗體,參考Zhang等(2008),操作步驟如下:
[0158](I)使用蛋黃分離器分離卵黃；
[0159](2)卵黃和PBS緩衝液(ρΗ7.5)1:2混合，渦旋，充分混勻；
[0160](3)加入3.5% (W/V，下同)的PEG-6000，渦旋混合，搖床上室溫作用IOmin ；
[0161](4)離心(10000g，4°C，20min，下同)後，出現分層，由上而下為黃色脂肪層、清亮層(IgY)和半固體層；
[0162](5)液體經濾紙過濾，棄去沉澱物，測量所得濾液體積，加8.5%PEG-6000，搖床上室溫作用IOmin ；
[0163](6)離心，如上，棄去上清液，沉澱物加IOml PBS溶解，加12% (1.2g) PEG6000，在搖床上室溫作用IOmin ；
[0164](7)離心，如上，棄去上清液，沉澱物加1.2ml PBS溶解；
[0165](8)溶解液轉移到透析袋中，大容量PBS溶液中(1000ml)透析過夜；
[0166](9)隔天將透析器內IgY抗體液取出，標記，-20°C儲存備用。
[0167]提純IgY抗體經SDS-PAGE電泳分析，以鑑定IgY抗體提取純度。
[0168]24、IgY抗體效價的測定
[0169]間接ELISA法測定抗CPV_VP2IgY抗體效價，操作步驟如下:
[0170](I)重組蛋白使用包被緩衝液進行稀釋(10 μ g/ml), 100 μ L/孔進行包被，4°C孵育過夜；
[0171](2) PBST 洗滌 3 次，5min/次；
[0172](3)加入封閉緩衝液200 μ L/孔，至溼盤中，37°C封閉2H ；
[0173](4) PBST 洗滌，同上；
[0174](5) IgY抗體使用封閉液進行稀釋，倍比稀釋1:10、1:20,1:40，直至1:40960 ;未免疫IgY抗體，PBS分別作為陰性和空白對照，37°C孵育Ih ；
[0175](6) PBST 洗滌，同上；
[0176](7)加HRP標記的羊抗雞二抗(1:6000)，37°C孵育Ih;
[0177](8) PBST 洗滌，同上；
[0178](9)每孔加入 100 μ L 底物，37°C作用 15min ；
[0179](10)每孔加入50 μ L的2Μ H2S04進行終止，讀值0D450。[0180]25、IgY 抗體 Western blot 鑑定
[0181]SDS-PAGE電泳分離VP2重組蛋白，轉膜後進行Western blot鑑定，方法如上。IgY抗體作為一抗，1:1000稀釋，HRP標記的羊抗雞二抗進行稀釋，稀釋度為1:5000。
[0182]26、結果
[0183](I)重組蛋白含量
[0184]重組蛋白洗脫後，經過透析,使用Bradford法測定,繪製標準曲線y=l.63x+0.609(R2=0.998)，VP2重組蛋白純化後濃度接近300 μ g/ml。 [0185](2) IgY抗體的提取及鑑定
[0186]提純IgY經SDS-PAGE電泳後，主要包括兩條帶，65ku和19ku，且在40ku附近出現低分子量片段。
[0187](3) ELISA 效價測定
[0188]抗CPV重組VP2蛋白特異性IgY抗體，使用間接ELISA測定，抗體效價在二免後，開始升高，一周後，緩慢降低，三免加強免疫後，效價繼續升高，四免後，效價達到1:40960。
[0189](4) Western blot 鑑定
[0190]重組蛋白經SDS-PAGE電泳後，進行轉膜，使用抗VP2_IgY抗體作為一抗，檢測抗體特異性。提取的抗VP2-1gY抗體可較好地結合VP2蛋白(89ku)，而與降解片段無交叉反應。
[0191]以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【權利要求】
1.一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟: (1)犬細小病毒VP2基因的克隆與序列分析； (2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達、純化； (3)抗VP2-1gY抗體的製備， 具體的包括以下步驟: (1)犬細小病毒VP2基因的克隆與序列分析:根據CPV-VP2基因序列，利用軟體設計一對引物，PCR擴增CPV-VP2基因，連接至pMD18-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，經藍白斑篩選後，提取質粒，酶切分析，陽性質粒測序，對測序結果進行比較分析； (2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達、純化:pMD18-T-VP2和pET_32a載體使用BamHI和Xho I雙酶切，目的片段連接，構建pET-32a-VP2表達載體，轉化Bal21 (DE3)pLysS感受態細菌，酶切和PCR鑑定後，優化IPTG誘導濃度和時間，進行大量誘導表達，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進行純化； (3)抗VP2-1gY抗體的製備:純化的VP2蛋白免疫產蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，並進行SDS-PAGE分析。
2.根據權利要求1所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:步驟(1)中根據GenBank報導的有關CPV-VP2基因序列,利用primer prime5.0軟體，設計一對引物，PCR擴增CPV-V P2基因，為1755bp，連接至pMD18-T載體，轉化DH5a感受態細胞，經藍白斑篩選後，提取質粒，酶切分析，陽性質粒測序。
3.根據權利要求1所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:步驟(2)中表達產物經SDS-PAGE和Western blot分析後使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進行純化。
4.根據權利要求1所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中，對提取特異性IgY抗體進行SDS-PAGE分析，間接ELISA測定免疫後抗VP2-1gY抗體效價，Western blot鑑定所獲抗VP2_IgY的特異性。
5.根據權利要求1所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:所述製備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進行初次免疫注射,免疫劑量為300 μ g/只，初次免疫21天之後，進行4次加強免疫，間隔時間為21天，免疫劑量為250 μ g/只。
6.根據權利要求5所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:所述禽類為雞。
7.根據權利要求1所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:所述步驟(3)中提取IgY的方法如下； (1)將所述收集的蛋進行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS按照體積比1:2進行稀釋； (2)向稀釋液加入質量體積比為3.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘； (3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質量體積比為8.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘； (4)將經過攪拌後的混合液離心，棄去上清液，沉澱使用10毫升的PBS懸浮，加入質量體積比為12%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘，再進行離心，獲得沉澱物； (5)將所述沉澱物使用1.2毫升PBS溶解後，使用透析帶進行透析，使用PBS透析過夜，獲得IgY，並保存在_20°C備用。
8.根據權利要求7所述的一種抗犬細小病毒蛋白VP2特異性IgY的製備方法，其特徵在於:所述PBS的pH值為7.4。
【文檔編號】C07K16/02GK103570830SQ201310459834
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】張小鶯, 何金鑫, 田澤華 申請人:西北農林科技大學