BALF4多肽的克隆、表達和應用的製作方法
2023-05-29 07:22:31 2
本發明涉及分子生物學技術領域，尤其是涉及一種balf4多肽的克隆、表達和應用。
背景技術：
eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)屬於人類皰疹病毒第四型，於1964年由epstein和barr在研究非洲兒童惡性淋巴瘤時發現。eb病毒是一種嗜淋巴細胞病毒，是人類普遍感染的病毒之一，感染全球超過90％的人群。eb病毒因兼具較高感染率和致癌性，已於1997年被國際癌症研究中心定為i類致癌物。
eb病毒經唾液或密切口腔接觸傳染。eb病毒主要感染b細胞和上皮細胞，其中口咽部上皮細胞是eb病毒感染與複製的首要位點。eb病毒感染主要分為四個階段：(1)通過口頭傳播的eb病毒在口咽部易感細胞(一般為鱗狀上皮細胞及侵潤b淋巴細胞)中進行複製；(2)在口咽部淋巴組織中eb病毒通過潛伏感染b細胞而定植於宿主體內；(3)大多數情況下，eb病毒以沉默的潛伏感染方式永久存在於循環的記憶b細胞群中(主要發生在健康攜帶者中)；(4)eb病毒偶爾也會被激活，從潛伏感染狀態轉換至裂解感染狀態，導致病毒再次在口咽部複製並成為傳染源。eb病毒蛋白通過模擬b細胞增殖和生存信號保障病毒複製，同時又不被宿主的免疫系統識別，從而建立終生感染，這種免疫逃逸方式還有利於病毒傳播。
eb病毒通過包膜糖蛋白gp350/gp220與b細胞2型補體受體cd21(cr2)結合進入並感染b細胞。三種糖蛋白(gp42，gh和gl)組成的複合物與mhcii(主要組織相容性複合物ii)結合促進病毒包膜與細胞膜的融合。病毒進入上皮細胞是由病毒bmrf2與β1整聯蛋白的結合介導；與b細胞膜融合過程類似，gh與gl組成的複合物也參與了病毒包膜與上皮細胞膜的融合。gp110能夠提高病毒感染靶細胞的效率。此外，eb病毒還能感染t細胞，巨紅細胞，粒細胞和自然殺傷(nk)細胞。eb病毒感染這些細胞的機制尚不明確，病毒包膜蛋白可能參與eb病毒感染t細胞及其它免疫細胞的過程。
eb病毒感染能夠導致傳染性單核細胞增多症，25％以上的青少年感染者患有eb病毒誘發的傳染性單核細胞增多症，美國每年新增約125,000例傳染性單核細胞增多症病例。該症患者會出現發熱、咽喉炎、頭痛、淋巴結腫大、肝臟及脾臟腫大等症狀；若不及時接受治療，患者病情將進一步加重並發展為無菌性腦膜炎與重度肝炎，嚴重危害了青少年的健康。eb病毒還與淋巴細胞腫瘤及上皮細胞腫瘤的發生密切相關，例如，eb病毒相關的淋巴細胞腫瘤包括伯基特淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤和t細胞淋巴瘤。eb病毒相關的淋巴瘤惡性程度高，發展快，並且常規化療效果差。研究顯示，全球每年新增約28,000例eb病毒相關的霍奇金淋巴瘤。eb病毒相關的上皮細胞腫瘤主要包括鼻咽癌和胃癌，數據顯示，全球每年新增約78,000例eb病毒陽性鼻咽癌病例和約84,000例eb病毒陽性胃癌病例。我國的eb病毒相關鼻咽癌的發病率較高；在我國華南地區，每十萬名中年男性中有50人患eb病毒陽性鼻咽癌。此外，eb病毒還與免疫缺陷或免疫抑制病人中的惡性腫瘤發生密切相關。eb病毒與愛滋病毒共感染極大地增加感染者患淋巴瘤的風險，研究表明，30％-40％愛滋患者攜帶有eb病毒，通過抗病毒藥物治療不會降低愛滋病人中eb病毒相關淋巴瘤的發生率；因器官移植而導致免疫抑制病人中b細胞淋巴瘤發病率極高，且移植病人中b細胞淋巴瘤的致死率高達50％。
鑑於eb病毒及其誘發的相關疾病的危害，現有的研究主要集中在抗eb病毒感染及其誘發腫瘤治療兩方面。針對抗病毒感染的策略主要為抗病毒藥物治療方法，抗eb病毒藥物多為廣譜性抗皰疹藥物。eb病毒誘發腫瘤的治療策略包括應用eb病毒特異性細胞毒性t淋巴細胞(ctl)的治療方法和採用單克隆抗體的治療方法。t細胞介導的抗腫瘤治療策略是通過將ctl注入患者體內，激活機體免疫系統，從而達到殺傷腫瘤的效果；cd20單克隆抗體療法對eb病毒誘發的cd20陽性惡性腫瘤具有較好的治療效果。然而，抗病毒藥物不能有效治療eb病毒誘發腫瘤；eb病毒相關腫瘤的治療方法尚處於研究階段，eb病毒特異性ctl對於器官移植後病毒誘發的惡性腫瘤治療效果不理想，cd20單克隆抗體療法的有效性還有待明確。因此，抗病毒疫苗成為防治eb病毒及其誘發疾病的最佳策略。
抗eb病毒疫苗以包膜糖蛋白gp350為研究重點。gp350是eb病毒及其感染細胞表面最豐富的糖蛋白，也是中和抗體的首要靶標，是抗eb病毒感染的關鍵分子。現有研究表明，gp350能夠有效誘導中和抗體反應，並能夠保護免疫動物免於病毒感染及其相關腫瘤的發生。為了驗證gp350的預防保護效果，美國國立衛生研究院(nih)開展了gp350疫苗的臨床試驗，結果顯示，重組gp350能夠誘導gp350特異性抗體產生，並具有較好的安全性和免疫原性。另一項gp350疫苗的i期臨床試驗表明，該疫苗能夠誘導igg抗體與中和抗體產生。ii期臨床試驗結果顯示，gp350疫苗能夠保護78％的接種者免於eb病毒誘發的傳染性單核細胞增多症，並在98.7％的接種者血清中檢測到gp350特異性抗體；而在疫苗接種18周後，仍能在接種者血清中檢測到特異性抗體。然而，該gp350疫苗雖然能夠有效降低傳染性單核細胞增多症的發生率，但不能預防eb病毒的感染。
綜上所述，eb病毒疫苗的研製已取得一定進展，然而在疫苗研發過程中仍存在一些問題。eb病毒疫苗對實驗動物具有較好的保護效果，但其臨床試驗結果並不理想。因此，亟需研製能夠增強抗eb病毒疫苗預防保護效果的免疫佐劑。
技術實現要素：
本發明的第一個目的在於提供編碼balf4多肽的核苷酸序列，本發明的第二個目的在於提供重組表達載體，本發明的第三個目的在於提供重組細胞，本發明的第四個目的在於提供balf4多肽，本發明的第五個目的在於提供balf4多肽的表達方法，本發明的第六個目的在於提供balf4多肽的應用，以緩解現有技術中抗eb病毒疫苗免疫原性差的技術問題。
本發明提供了一種編碼balf4多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如seqidno.1所示的序列。
另外，本發明還提供了包含所述核苷酸序列的重組表達載體。
進一步的，所述重組表達載體源始於真核表達載體，優選的，源始於ppiczαa。
另外，本發明還提供了包含所述重組表達載體的重組細胞。
進一步的，所述重組細胞源始源真核細胞，優選的，源始於畢赤酵母。
另外，本發明還提供了一種balf4多肽，所述balf4多肽具有如seqidno.2所示的序列。
進一步的，所述balf4多肽具有b細胞抗原表位和t細胞抗原表位，其中所述balf4多肽中的19-26位胺基酸序列，34-41位胺基酸序列，70-81位胺基酸序列，112-137位胺基酸序列，146-172位胺基酸序列，257-264位胺基酸序列以及279-288位胺基酸序列為b細胞抗原表位；所述balf4多肽中的22-30位胺基酸序列，32-40位胺基酸序列，68-76位胺基酸序列，91-107位胺基酸序列，171-179位胺基酸序列，185-193位胺基酸序列，216-224位胺基酸序列，311-319位胺基酸序列，287-295位胺基酸序列以及328-336位胺基酸序列為t細胞抗原表位。
進一步的，所述balf4多肽具有免疫原性。
另外，本發明還提供了所述balf4多肽的表達方法，所述表達方法包括以下步驟：
(a)優化基因得到編碼balf4多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如seqidno.1所示的序列；
(b)將所述核苷酸序列插入ppiczαa載體中，得到重組表達載體；
(c)將所述重組表達載體導入畢赤酵母中，得到重組酵母細胞；
(d)培養並誘導所述重組酵母細胞，並採用親和層析方法純化得到所述balf4多肽。
另外，本發明還提供了所述的balf4多肽作為免疫佐劑的應用。
本發明通過優化基因，得到了優化的編碼balf4多肽的核苷酸序列，構建了重組balf4多肽高效表達的酵母細胞，優化了純化方法，最終得到了balf4多肽；本發明提供的balf4多肽能夠刺激高水平抗原特異抗體產生，誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應，能夠有效刺激機體免疫系統，具有較強的免疫原性，能夠作為免疫佐劑，用於製作疫苗，從而達到防治eb病毒及其相關疾病的目的。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為ppiczαa-balf4287-623的菌液pcr檢測結果；
圖2為western雜交方法檢測重組balf4287-623的表達；
圖3a為elisa檢測balf4287-623免疫小鼠血清的igg水平；
圖3b為elisa檢測balf4287-623免疫小鼠血清的igm水平；
圖4為mtt方法檢測balf4287-623誘導的小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
本發明提供了編碼balf4多肽的核苷酸序列，編碼balf4多肽的核苷酸序列包含seqidno.1所示的序列。本發明提供的編碼balf4多肽的核苷酸序列可包括：僅seqidno.1所示的序列，或者在seqidno.1所示的序列的5』端或者3』端添加起始密碼子、終止密碼子、蛋白純化標籤或者酶切位點等序列得到的核苷酸序列。即，編碼balf4多肽的核苷酸序列可能不僅包含seqidno.1所示的序列，還可能包含其他的功能性核苷酸序列。
另外，本發明還提供了包含編碼balf4多肽的核苷酸序列的重組表達載體。重組表達載體的製備方法包括，通過在seqidno.1所示的序列的5』端與3』端分別添加起始密碼子和終止密碼子，並引入特異性酶切位點等操作，然後將編碼balf4多肽的核苷酸序列連接到表達載體上，得到重組表達載體。此處涉及的表達載體，表示尚不包含seqidno.1所示序列的載體。其中，表達載體可以是真核表達載體，優選的，表達載體是ppiczαa。
另外，本發明還提供了包含上述重組表達載體的重組細胞。重組細胞通過將上述重組表達載體導入到表達宿主中製備而成。表達宿主可以是真核細胞，優選的，表達宿主是畢赤酵母。
發明人通過研究發現，將編碼balf4多肽的核苷酸序列連接到ppiczαa載體，並導入畢赤酵母中，得到的重組細胞能夠高效表達具有較強免疫原性的balf4多肽。
另外，本發明還提供了balf4多肽，balf4多肽包含如seqidno.2所示的序列。其中，seqidno.2所示的胺基酸序列，由seqidno.1所示的核苷酸序列編碼。此外，本發明中涉及的「重組balf4多肽」與「balf4多肽」意義相同。
本發明提供的balf4多肽具有b細胞和t細胞抗原表位，且具有較強的免疫原性。
另外，本發明還提供了balf4多肽的表達方法，發明人通過研究發現，將編碼balf4多肽的核苷酸序列連接到ppiczαa載體，並導入畢赤酵母中，得到的重組細胞能夠高效表達具有較強免疫原性的balf4多肽。
由於本發明提供的balf4多肽能夠刺激高水平抗原特異抗體產生，誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應，具有較好的免疫原性，因此本發明提供的balf4多肽能夠用作免疫佐劑，用於治療eb病毒引起的相關疾病。
為了有助於更清楚的理解本發明，現通過具體的實施例對本發明的內容進行詳細的介紹。如未明確指出，以下實施例中涉及的實驗操作方法為常用的分子生物學操作方法，涉及的試劑、儀器為常規的市售試劑或者儀器。
實施例1重組蛋白的表達及純化
一、試劑
大腸桿菌dh5α：在5ml含50-100mg/ml卡那黴素的lb中培養過夜，取0.85ml培養液加0.15ml滅菌甘油完全混勻，轉入凍存瓶中，凍在液氮或乾冰/酒精浴中，存於-80℃。
畢赤酵母重組表達載體ppiczαa：在seqidno.1所示序列的5』端加上his6標籤，3』端加上終止密碼子，在5』端和3』端分別引入ecori和xbai酶切位點；α-factor分泌信號分泌表達目的蛋白。表達時，目的基因插入信號序列起始密碼的讀碼框中。
畢赤酵母gs115菌株購自takara。
rpmi-l640培養基，反轉錄試劑盒，pcr試劑，限制性內切酶、t4連接酶、質粒提取試劑盒、pcr產物回收試劑盒、膠回收試劑盒等均購自takara。
ypd培養基：1.0％酵母粉，2.0％蛋白腖，2.0％葡萄糖，1.5％瓊脂，121℃滅菌20min，畢赤酵母培養用。
lb培養基：1.0％胰蛋白腖，0.5％酵母粉，1.0％nacl，1.5％瓊脂，ph7.0，121℃滅菌20min，加入100mg/ml的卡那黴素。
bmgy培養基：1％酵母粉，2％蛋白腖，0.34％酵母氮源鹼，1％(nh4)2so4，100mmol/l磷酸鉀緩衝液(ph6.0)，1％甘油。
bmmy固體培養基：1％酵母粉，2％蛋白腖，0.34％酵母氮源鹼，1％(nh4)2so4，100mmol/l磷酸鉀緩衝液(ph6.0)，1％甲醇，1.5％瓊脂。
主要溶液：
1)質粒抽提溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖，5mmol/ltris-hcl(ph8.0)10mmol/ledta(ph8.0)；
2)質粒抽提溶液ⅱ：1體積0.4mmol/lnaoh，1體積2％sds，8體積水，使用前混合；
3)質粒抽提溶液ⅲ：5mol/lkac(60ml)，hac(11.5ml)，水(28.5ml)
4)te緩衝液：10mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta(ph8.0)；
5)50×tae電泳緩衝液：tris鹼242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/ledta(ph8.0)100ml用雙蒸水定容至1000ml，室溫儲存，用時再稀釋50倍；
6)裂解緩衝液：200mmol/ltris-hcl，ph8.5；0.5％(w/v)sds，250mmol/lnacl，25mmol/l，edta；
7)dna抽提緩衝液：100mmol/ledtana2，100mmol/ltris-hcl，1.5mol/lnacl，ph8.0；
8)depc處理的水(簡稱depc水)：雙蒸水按0.1％(v/v)的量加入depc於4℃儲存過夜，高壓滅菌後備用；
9)tb緩衝液：10mmol/lpipes，55mmol/lmncl2，15mmol/lcacl2，250mmol/lkcl，用koh調ph至6.7；
10)畢赤酵母轉化用buffera：1.0mol/l山梨糖醇，10mmol/lbicine(ph8.35)，30％(v/v)乙二醇；
11)畢赤酵母轉化用bufferb：40％(w/v)peg1000，0.2mol/lbicine(ph8.35)；
12)畢赤酵母轉化用bufferc：0.15mol/lnacl，10mmol/lbicine(ph8.35)；
13)2×sds凝膠加樣緩衝液：0.5mol/ltris-hcl(ph6.8，2ml)；甘油2ml；20％sds(2ml)；0.1％溴酚藍(0.5ml)；β-巰基乙醇(1.0ml)；雙蒸水(2.5ml)；
14)5×sds-page電泳緩衝液：tris7.5g；甘氨酸36g；sds2.5g；溶於500ml雙蒸水，使用時用去離子水稀釋5倍；
15)sds-page膠染色液：0.25g考馬斯亮藍r250溶於90ml甲醇：水(1：1，v/v)和10ml冰乙酸中，濾紙過濾備用；
16)sds-page膠脫色液：90ml甲醇：水(1：1，v/v)和10ml冰乙酸；
17)誘導劑：甲醇。
二、實驗
1.序列優化與合成
1)使用mega4分析balf4蛋白序列的同源性，選定保守balf4序列，下載其核苷酸序列(genbank序列號：ln831023.1)；
2)通過生物信息學分析，選定balf4多肽(287-623位胺基酸，命名為balf4287-623)作為候選抗原，進行後續檢測分析。
3)根據畢赤酵母密碼子偏好性，使用jcat程序對balf4287-623核苷酸序列進行密碼子優化，得到seqidno.1所示的序列；
4)設計併合成balf4287-623序列：在seqidno.1所示序列的5』端加上his6標籤，3』端加上終止密碼子，在優化序列的5』端和3』端分別引入ecori和xbai酶切位點，並將合成序列連接到puc57上獲得重組載puc57-balf4287-623。
2.真核表達載體的構建
1)載體酶切體系(50μl)如下：
反應條件：37℃，酶切過夜。
2)酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳確認酶切完全後，回收純化酶切產物；
3)連接反應體系(40μl)如下：
反應條件：22℃，連接1h。
3.重組表達載體的鑑定
1)取5μl連接產物加入100μl感受態細胞中，輕輕混勻，冰上放置30min；
2)42℃熱激90s，立即於冰上放置1-2min；
3)加入500μllb液體培養基，37℃，150rpm搖菌50min；
4)離心，收集菌體沉澱，重懸菌體；
5)在超淨工作檯中，將細胞懸液均勻塗布在含25μg/mlzeocin的低鹽lb平板上，37℃培養過夜。
4.重組質粒的提取與鑑定
1)挑取轉化單菌落，接種至5mllb液體培養基中(含25μg/mlzeocin)，37℃，300rpm培養8h；
2)取150μl細菌懸液接種至100ml液體lb中擴大培養，37℃，300rpm培養12-16h；
3)提取重組質粒，經質粒雙酶切和測序分析鑑定重組表達載體(如圖1)。
5.重組多肽在畢赤酵母中的誘導表達
挑取待表達的重組畢赤酵母單菌落於25mlbmgy液體培養基中(按10％裝瓶)，28℃，200rpm搖床培養至od600＝4-6。收集菌體，去上清，細胞沉澱全部轉移至25mlbmmy液體培養基中，200rpm，25℃搖床培養。每隔24h補加甲醇至終濃度5％進行誘導，0，12h，24h，36h，48h，72h，96h取樣分析表達水平，以確定最佳誘導時間。結果表明誘導72h小時表達水平最佳。
6.sds-page和western雜交方法檢測重組多肽的表達
待重組畢赤酵母經誘導表達後，取少許培養上清，離心，取上清，通過sds-page和western雜交方法檢測重組蛋白表達。
7.重組蛋白的純化
將已鑑定的重組畢赤酵母進行甲醇誘導表達後，離心收集上清液，加入80％飽和度硫酸銨沉澱過夜。4℃，10000rpm離心10min，棄上清，蛋白沉澱用0.1倍體積的0.05m磷酸緩衝液(ph6)溶解，並採用0.05m磷酸緩衝液(ph6)進行透析去鹽。將蛋白液過濾後，上到ni-nta親和層析柱(gehealthcare)中。採用0.05m磷酸緩衝液(ph6)進行平衡，再採用含200mm咪唑的0.05m磷酸緩衝液進行梯度洗脫，收集目的蛋白，重組蛋白的純化結果如圖2所示。
實施例2重組表達蛋白免疫刺激活性檢測
一、試劑
elisa包被緩衝液(ph9.6，1l)：溶解1.59gna2co3和2.93gnahco3於1l雙蒸水中。
elisa洗滌緩衝液(ph7.4，1l)：稱取0.2g固體kh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，8gnacl和0.2gkcl溶解於1l雙蒸水中，再加入0.5ml吐溫20，混勻備用。
二、實驗
1.小鼠免疫實驗
balb/c小鼠(雌性，4-6周齡)購自青島市食品藥品檢驗所，按照山東省動物管理條例在青島大學動物中心飼養，動物實驗室為spf級。將小鼠分為三組，每組10隻，第一組為對照組，每隔兩周每隻小鼠皮下注射100μlpbs一次，共免疫三次；第二組為balf4287-623免疫組，每隔兩周每隻小鼠皮下注射10μgbalf4287-623(溶於100μlpbs)一次，共免疫三次；第三組為balf4287-623+fa免疫組，第一次每隻小鼠皮下注射10μgbalf4287-623(溶於50μlpbs)與等體積弗式完全佐劑(sigma)混合液，此後每隔兩周每隻小鼠皮下注射10μgbalf4287-623(溶於50μlpbs)與等體積弗式不完全佐劑(sigma)混合液，免疫兩次。每次免疫前及最後一次免疫兩周後採集小鼠血樣。
2.elisa檢測
採用elisa檢測小鼠免疫血清中igg和igm水平，結果如圖3a和圖3b所示。
1)包被抗原：包被緩衝液稀釋抗原至濃度為50ngbalf4287-623/100μl，每孔加入100μl，4℃孵育過夜；
2)洗滌：移去包被液，加入250μl洗滌緩衝液，洗板3次，每次5min；
3)封閉：每孔加入200μl3％bsa，37℃封閉1h；
4)洗滌：加入250μl洗滌緩衝液洗板5次，每次4min；
5)加入待檢測血清：每孔加入100μlpbst稀釋的待測血清，置於37℃孵育1-2h；
6)洗滌：同步驟(4)；
7)加入二抗，37℃孵育1h；
8)洗滌：同步驟(4)；
9)顯色：加入tmb顯色液，室溫顯色5-20min，加入2m硫酸終止反應，酶標儀下測定od450。
3.小鼠脾臟淋巴細胞的分離與培養
1)最後一次免疫兩周後，每組取3-5隻小鼠，頸椎脫臼處死小鼠，在75％酒精中浸泡小鼠後，無菌條件下取出小鼠脾臟；
2)將脾臟置於200目尼龍網上充分研磨至1ml淋巴細胞分離液中，將分離液轉至乾淨離心管中，並沿管壁緩慢加入200μlrpmi-1640培養基；
3)4℃，800×g離心30min後，吸取中間淋巴細胞層；
4)加入rpmi-1640培養基充分清洗細胞後計數；
5)將淋巴細胞懸液加至96孔板中，加入相應抗原後進行體外培養。
4.淋巴細胞增殖實驗
採用mtt檢測小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(如圖4)，具體步驟如下：
1)小鼠脾臟淋巴細胞按照1×106細胞/孔的密度，取100μl細胞懸液加至96孔板中，加入相應抗原後，將96孔板置於37℃，5％co2無菌培養箱中；
2)培養72h後，每孔加入10μlmtt溶液(5mg/ml，pbs配製)，繼續培養4h；
3)1,000rpm離心10min，小心吸去上清，每孔加入100μldmso後置於搖床低速振蕩10min，使結晶物充分溶解；
4)檢測od570後，計算各組刺激指數(si)。
si計算公式如下：
si＝抗原刺激組od570平均值/陰性對照組od570平均值。
本發明中採用畢赤酵母表達系統獲得重組balf4多肽，具有以下優勢：1)成本低；2)基因操作方便；3)表達穩定；4)生長迅速；5)產量高。畢赤酵母系統能夠將外源蛋白分泌至培養上清中，而畢赤酵母自身分泌較少的內源蛋白，因此，重組細胞誘導上清中的蛋白組分主要為外源重組蛋白，便於後續的蛋白純化工作。此外，通過大規模發酵，在畢赤酵母系統中可獲得高產量的重組蛋白，從而有利於重組蛋白的工業化生產。
本發明從體液與細胞免疫水平檢測重組多肽的免疫原性。重組多肽能夠刺激高水平抗原特異抗體的產生，誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應。這些結果表明，重組balf4多肽能夠有效誘導體液免疫和細胞免疫反應，能夠作為eb病毒疫苗佐劑，提高eb病毒疫苗的預防效果，從而達到有效預防eb病毒感染的目的。
最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。
sequencelisting
青島大學
balf4多肽的克隆、表達和應用
2017
2
patentinversion3.5
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1011
dna
人工序列
1
aaacttgagaacagaaccgcttattgtccacttcagcactggcaaacattcgactccact60
atcgctaccgagaccggaaaatctatccattttgttactgatgaaggtacatcttccttc120
gttactaacactacagtcggaattgagttgccagacgcttttaagtgtatcgaagagcaa180
gttaataagacaatgcacgaaaaatacgaggccgtccaggatagatataccaaaggtcaa240
gaagcaattacctacttcatcactagtggtggattgcttttggcatggcttccattgact300
cctagatcattggctactgttaagaaccttacagagttgaccactccaacatcaagtcca360
ccttcttccccttctccacctgctccacctgctgccagaggttctacttccgcagctgtt420
ttgagaagaagaagaagagacgccggaaacgcaacaaccccagtcccacctgccgcacct480
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