輔助篩選秈稻和粳稻的方法

2023-06-16 23:56:16 1

專利名稱：：輔助篩選秈稻和粳稻的方法
技術領域：
：本發明涉及一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。技術背景栽培稻是世界上最重要的糧食作物之一，在其11，500多年的栽培稻馴化歷史中為適應不同的農業生態環境，栽培稻形成了豐富的遺傳多樣性和明顯的遺傳分化，產生了秈稻(眾o7c3)和粳稻Opow'cs)兩個不同的生態型(MorishimaH，OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.XXII.NumerableevaluationoftheIndica-Japonicadifferentiation.JapaneseJournalofBreeding,1981，31:402-413;GlaszmannJ"C.IsozymesandclassificationofAsianricevarieties.TheoreticalandAppliedGenetics，1987，74:21-30;WangZY，TanksleySD.Restrictionfragmentlengthpolymorphisminasa^VaL.Ge畫e，1989，32:1113-1118;BlairMW，Pa腿d0，McCouchSR.Inter-simplesequencerepeat(ISSR)amplificationforanalysisofmicrosatellitemotiffrequencyandfingerprintinginrice(Orwssa"raL.).TheoreticalandAppliedGenetics，1999,98(5):780-782.))。它們之間在許多形態和生理性狀上存在著明顯的差異(MorishimaH，OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.Numericalevaluationsofthe_//7<y_z'c<g-j'spc/7iC3differentiation.J"pn.J".Breed,1981，31:402-413;WANGXiang-Kun,CHENGKan-Sheng,靈NNai-Wei，LU0un，LUYi-Xuan，LIUGuang-Rong.StudyontwoimportantricetypesconcerningtheoriginanddifferentiationofAsiancultivatedrice.ActaGeneticaSinica，1987，14(4):262-270.)。然而，水稻的秈粳分化是一個緩慢的進化過程，在許多水稻地方種中存在著典型的秈稻或粳稻，但也存在秈粳分化不明顯的中間型，對於這些類型很難用傳統的方法來鑑定，更難研究水稻的秈粳分化程度。因此，開發新型的Marker基因及其分子標記來準確鑑定秈稻和粳稻，並用其研究水稻的進化非常必要。過氧化物酶基因是一類與葉片衰老有關的基因(M.KarandD.Mishra，Catalase，Peroxidase,andPolyphenoloxidaseActivitiesduringRiceLeafSenescence,PlantPhysiology.57(1976)315-319.)，在植物抵禦生物脅迫過程中起著重要作用(J.M.Chittoor，丄E.LeachandF.F.White,DifferentialinductionofaperoxidasegenefamilyduringinfectionofricebyXanthomonasoryzaepv.oryzae.MolecularPlantMicrobeInteractions.10(1997)861-871.)。
發明內容本發明的目的是提供一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。本發明所提供的輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測待測水稻中是否缺失GenBankaccessionAP003771中自5'末端第71046-72062位核苷酸序列，若缺失，則待測水稻為候選秈稻，若不缺失則待測水稻為候選粳稻。其中，所述缺失具體可通過PCR擴增進行檢測。所述PCR擴增具體可擴增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列的片段。所述PCR擴增檢測中所用的上遊或下遊引物可與GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列相同或互補。所述PCR擴增中所用的引物，還可為如下的引物:其中一條引物序列如序列表中序列1所示，另一條引物序列如序列表中序列2所示。實際應用中，可採用的一種具體輔助篩選秈稻和粳稻的方法如下以待測水稻的基因組DNA為模板，用核苷酸序列分別是序列表中序列1和序列2的一對引物進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，若所述擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為1200-2000bp之間的一條帶，則待測水稻為候選粳稻，若所述擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為100-250bp之間的一條帶，則待測水稻為候選秈稻。本發明的另一個目的是提供一種輔助篩選秈稻和粳稻的引物。本發明所提供的輔助篩選秈稻和粳稻的引物，具體可為在所述PCR擴增中擴增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列片段的引物。其中，所述引物擴增粳稻時，擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為1200-2000bp之間的一條帶，所述引物擴增秈稻時，擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為100-250bp之間的一條帶。所述引物具體可為如下的引物其中的一條序列如序列表中序列l所示，另一條序列如序列表中序列2所示。本發明發明人通過晶片數據挖掘、RT-PCR驗證和基因組測序分析發現，過氧化物酶基因LOC—0s06g48030不僅在秈粳稻間存在基因組水平上的差異，而且由於這種差異，此基因在秈粳稻間還存在可變剪切現象。LOC—0s06g48030基因的發現和解析可能為秈粳亞種間不同表達模式的機理研究提供重要的理論基礎。另外，對此基因進一步的功能分析和驗證，將為研究秈粳亞種間抗逆性的差異和逆境響應機理提供重要的基礎。本發明輔助篩選水稻秈粳亞種的方法可在發育早期篩選秈稻和粳稻品種或地方種，了解秈稻和粳稻的遺傳分化程度，對秈、粳稻雜種優勢的利用和培育高產、優質的雜交稻具有重要指導作用，從而優化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適於推廣應用，為水稻秈粳亞種種質的鑑定提供了一種快捷的選擇方法。圖1為Marker基因LOC—0s06g48030在晶片中所對應的3組探針在粳稻日本晴和秈稻IR64中的表達譜。圖2為基因L0C—0s06g48030所在區域的基因組信息。A為過氧化物酶基因LOC—0s06g48030的3個不同剪切模式；B為RT-PCR引物在基因組上的相對位置；C為引物CS—1和CS—2在低溫處理0h，12h，24h和48h的93-11和日本晴中的RT-PCR分析圖；D為FS引物引導下分別以93-11和日本晴的cDNA為模板的RT-PCR分析圖；E為秈稻93-11和粳稻日本晴的全長cDNA比對示意圖。圖3為基因L0C—0s06g48030在秈粳稻間的InDel分析。A為日本晴與93-11的基因組比對結果(來自TIGR);B為InDel引物在基因組上的位置；C為用GS引物擴增8個水稻品種的基因組DNA的結果。圖4為秈粳稻間的InDel差異引起的基因L0C一0s06g48030可能存在的剪切模式。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。下述實施例中的水稻品種和地方種均來自國家種質資源庫。實施例1、基因LOC—Os06g48030在秈粳亞種中不同表達模式的發現和驗證通過對秈粳稻在不同發育階段和不同組織部位的晶片數據的挖掘分析，發現基因LOC—Os06g48030在GengChip數據中對應有3組探針Os.11547.1.SI—s—at(PS1)，OsAffx.28164.1.SI—at(PS2)和OsAffx.28164.2.Sl一at(PS3)，其中探針組PS1在秈粳稻中均有較高的表達量，沒有明顯差異，而探針組PS2和PS3在秈粳稻中的表達模式卻相反，PS2僅在秈稻中有較高的表達量，在粳稻中幾乎不表達，而PS3僅在粳稻組織中表達量極高，而在秈稻中表達量卻很低，甚至不表達(圖l，其中，A為0s.ll547.1.Sl一s—at(PS1)在秈粳稻不同組織部位的表達譜分析圖；B為OsAffx.28164.l.Sl—at(PS2)在秈粳稻不同組織部位的表達譜分析圖；C為0sAffx.28164.2.S1—at(PS3)在秈粳稻不同組織部位的表達譜分析圖。)。根據前人的研究結果，造成基因表達量差異的主要原因可能是鹼基序列的差異(InDel)，或受其它基因的調控。利用比較基因組學的方法，對秈稻93-11和粳稻日本晴的序列進行了核苷酸序列比對(Blast)分析，結果發現在93-11中，此基因存在一段序列的缺失。與此同時，將3組探針所在的基因組序列與基因的基因組序列進行了Blast分析，結果發現探針組PS1存在於基因LOC—Os06g48030的3個isoform的共有區域(圖2A，其中，L0C—0s06g48030.1為isoform1，L0C—0s06g48030.2為isoform2，L0C—0s06g48030.3為isoform3)，PS3存在於InDel區域，橫跨isoforml和isoform2的末端，而PS2被定位在isoform2的末端序列區域。為進一步驗證基因LOC一Os06g48030在秈粳稻中表達模式的不同，依據日本晴的序列信息，分別在探針所在的區域設計引物CS—1(包括CS一F和CS—Rl，對應探針PS3)，CS—2(包括FS—F和CS—R2，對應探針PS2)，引物位置如圖2B所示，引物序列見表l。以低溫處理後的秈粳水稻材料的cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，結果CS一1僅在日本晴材料中有擴增條帶，大小300bp左右，而93-11中卻無表達，而CS—2僅在93-ll材料中有擴增條帶(圖2C，其中，1-4分別為93-110h、93-1112h、93-1124h、93-1148h;5-8分別為日本晴0h、日本晴12h、日本晴24h、日本晴48h;Actin為內參照。)，此結果與晶片數據的分析結果相同，從而說明此基因在秈粳稻間確實存在不同的表達模式。表l、RT-PCR所用引物序列tableseeoriginaldocumentpage7實施例2、基因LOC—Os06g48030在秈粳亞種中不同表達模式的機理探索及用於輔助篩選秈稻和粳稻的引物的設計為探索基因L0C一0s06g48030在秈粳稻間不同表達模式的機理，對此基因的結構進行分析。鑑於此基因缺少秈稻中的全長cDNA序列，首先利用Primer3軟體設計引物FS(FS的引物序列為FS—F:5，-ATGGGGCAGAGGAGGAGGTC-3，;FS—R:5'-CAAAAAGGAATGGCATATGTATGGGA-3，)，分別以秈稻93-11和粳稻日本晴的cDNA為模板進行PCR擴增，結果僅在秈稻93-11中檢測到一條1300bp左右的條帶(圖2D)。隨後，對此產物進行克隆測序，序列如序列表中序列3所示，並將測得的序列與日本公布的日本晴中的全長cDNA序列進行Blast分析，結果表明秈粳亞種在此基因的3'末端存在差異(圖2E)。進一步驗證93-ll與日本晴間是否存在基因組水平上的差異，依據日本晴序列，在二者可能存在基因組差異的區域設計引物GS(如圖3A所示，引物序列如序列表中序列1和序列2所示)，弓I物GS在基因組中的位置如圖3B所示。利用引物GS分別以日本晴和93-11的基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增的反應體系為水稻基因組DNA模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.OWlOXPCR緩衝液(lOOmMTris'HClpH9,0，500mMKC1，15mMMg2+，1%TritonX-100)，IOOMMdNTPs，正向引物4MM，反向引物4PM，用DEPC水補充反應體系至20W。PCR反應條件為先94°C3min;隨後94°Clmin，58°Clmin30sec，72°C2min，共35個循環；再72°C10min。通過濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物中是否有目的條帶。檢測結果表明引物GS擴增日本晴得到的產物在瓊脂糖凝膠上顯示為1200-2000bp之間的一條帶，但擴增93-11得到的產物在瓊脂糖凝膠上顯示為100-250bp之間的一條帶(圖3C，泳道1-5分別為日本晴亞種中一些變種的擴增產物，泳道6-IO分別為93-11亞種中一些變種的擴增產物，Marker為天根生化科技有限公司的DL2000，貨號Cat共HT402-01)。進一步驗證基因LOC—Os06g48030在秈粳稻間是否存在缺失現象，對93-11和日本晴中的擴增產物進行了克隆測序和BLAST分析(測序公司為北京奧科生物技術有限責任公司)。用GS引物擴增93-11獲得的序列如序列表中序列4所示，用GS引物擴增日本晴獲得的序列如序列表中序列5所示。BLAST分析結果表明93-11中存在1017bp，此缺失為GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046位至72062位核苷酸序列。進一步對GS引物擴增的序列進行分析發現，在這段序列中存在poly(A)信號。因此，推測秈粳稻間不同的剪切模式可能是由這段序列的插入/缺失引起的。由於曰本晴中存在這段序列，而這段序列中存在poly(A)信號，因此轉錄在此區域提前終止，前體mRNA轉錄成isoforml和isoform3，而秈稻中無此終止信號，轉錄可繼續進行，轉錄到3'末端，從而包含3'末端的一段小的外顯子序列，即形成isoform2(圖4，A:粳稻中具有含有PolyA結構1017bp的片段，因此轉錄在此區域被阻止，使基因轉錄成L0C—0s06g48030.1和L0C—0s06g48030.3兩種結構模式；B:秈稻中無此PolyA結構，而使轉錄繼續進行，從而使基因轉錄成L0C—0s06g48030.2的結構模式)。實施例3、用引物GS輔助篩選水稻秈粳亞種的可行性驗證用於驗證的水稻品種均來自國家種質資源庫93-11，IR24，03A-11,03A-9,中優13，日本晴，花l，746，雲峰7號和香粳糯。首先利用形態指標及相關文獻檢索並隨機挑選8個品種和地方種(4秈4粳)，如表2:表2、8個水稻水稻品種和地方種的秈粳亞種鑑定結果tableseeoriginaldocumentpage8分別提取上述不同水稻品種的基因組DNA，在引物GS的引導下進行PCR擴增。反應體系如下水稻基因組DNA模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.OWlOXPCR緩衝液(100mMTrisHC1pH9.0，500mMKCl，15raMMg2+，1%TritonX-100)，IOO幽dNTPs，正向引物4MM，反向引物4幽，用DEPC水補充反應體系至20^1。反應結束，利用濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。實驗設3次重複。三次重複實驗的結果一致，檢測結果如圖3C所示(泳道l-5分別為日本晴、花1、746、雲峰7號、香粳糯的擴增產物電泳結果；泳道6-10分別為93-11、IR24、03A-11、03A-9、中優13的擴增產物電泳結果)。結果表明，引物GS在4個粳稻品種中，均擴增出與日本晴相同的帶型，得到的產物在瓊脂糖凝膠上顯示為1200-2000bp之間的一條帶；在4個秈稻品種中，均能擴增出與93-11相同的帶型，得到的產物在瓊脂糖凝膠上顯示為100-250bp之間的一條帶。以上結果表明，InDel引物GS鑑定秈稻和粳稻的準確性均達到了100%。因此，GS可用於水稻秈粳亞種輔助篩選標記。序列表〈160>51<211〉22腿〈400〉1catgttcacaagtccaccgcgc22<210〉226膽人工序列〈220〉〈223〉〈400>2caaaaaggaatggcatatgtatggga26〈210>3<211〉1347<212〉腿稻屬水稻秈稻C(9irzasubsp.j'/2力'ca)<400〉3atggggcagaggaggaggtcggggccgcggcgtcagagccagagcgtggtggtggtggtg60gtcgccgtgttgctggcgacggcgtcctgcgcggcggcgcagctgagccagagctactac120gcgtcgacgtgccccaacgtggagacgctcgtccgcggcgccgtcacgcagaagctcaag180gagaccttcaacgccgcgcctgggacgctccgcctcttcttccacgactgcttcgtcagg240gggtgcgacgcgtcggtgctga/tcgcggggccggacgacgagcacagcgcgggcgcggac300acgacgctgtcgccggacgcgctggacctcatcacccgcgccaaggccgccgtcgacgcc360gacgcccagtgcgccaacaaggtctcctgcgccgacatcctcgccctcgccgcccgcgac420gtcgtctcccaggcaggaggaccctactaccaggtggagctggggcggcttgacggcaag480gtcgggacgcgcgccgtggtgaagcacagcctccccggcgccgccttcgacctcgaccag540ctcaacaagctcttcgccaccaacggcctcacccagaccgacatgatcgccctctcagga600gggcacacgataggggtgacgcactgcgacaagttcgtgcggcggctgtaccagttcaag660ggggcggcgccgcagtacagcccgccgatgaacctggcgttcctgcggcagatgaggcag720acgtgcccgctcagctacagcccgaccaccgtcgccatgctcgacgccgtctcgcccaac780aagttcgacaatggctacttccaggcgctgcagcagctcaagggcctcctcgcctccgac840caggtgctcctcgccgaccgccgctcgcgcgccaccgtcaactacttcgccgccaaccag900accgccttcttcgacgccttcgtcgccgccatcaccaagctcggccgcgtcggcgtcaag960acggccgccggctccgacgccgagatccggcgagtctgcaccaaggtcaactaatagcgt1020agagcagtatagctcacatttgggtggtagagagggtaaattggtgaattcttctctgtg1080tctctcttcttcttcctcttcttctccatgatggtcttcgattctcactgtccaagttca1140caagtccaccacgcacagttgttgtatttgttcccgccaattcttttcttgattcttata1200atcataaaaagtgtcatacattaattaggatatattttcagggcccctacccatgtgata1260tgatagaaggtacacttacaatgatgtaaatgtttacagctggtccagttaatcaagtat1320atcccatacatatgccattcctttttg1347〈210〉4215DNA〈213〉稻屬水稻秈稻(<2rj^safirasubsp.眾o7ca)<400〉4catgttcacaagtccaccgcgcacagttgttgtatttgttcccgccaattcttttcttga60ttcttataatcataaaaagtgtcatacattaattaggatatattttcagggcccctaccc120atgtgatatgatagaaggtacacttacaatgatgtaaatgtttacagctggtccagttaa180tcaagtatatcccatacatatgccattcctttttg2151232DNA稻屬水稻粳稻(&丁zasaWrasubsp.yapo/7ica)<400〉5catgttcacaagtccaccgcgcacaigttgt:tgtatttgttcccgccaattcttttcttga60ttcttataatgtcatacatttattttcagggcccctaccc120atag犯ggtacacttacaatgatgtaa^ctsgcgtggtggcccacgcaga180ttgcgcggctaacattattatattttctctca^t83tagcatatatgttttctcattat240attat11aaatatattaaaaattttaa^ttttgtaataactttacaaaac300tatt犯tgtgtaatattcatattatattttatatacgtgttagttattaattatttttaa360tatca^ttttagttatttg"taaattatatatattcctatatga^ctcteigactcgtctt420ttaatatttctttttttttaattttgaattttctgtaaattgtatttctatatagactct■atgctcttcttcta^tsttatttatttttatttxtgaatttttattatttataattgtat540ttctatgtgcactctaaactcatctttcaatattctttaatttttaatttcgaatttcag600ttacttctaaattgtattcatatattgaccttaaactcttcttcccatgtttttcttaat660ttcgaattttag"ttatttgtaaattgtatctttatatggactctaaactctacttttaat720tttattatgtttattccaaattttagttagttttaaattcctatatagattctatactct780acttctaatattccttattttttaattccgaatttctatttttttttaaattgtatttct840atacggactctagcctcctcttctaatatttcttattttttaattccgaatttcaattat900ttcttaatcgtatttctatacggactctagtatcctcttttaatattcctttttttttaa960ttccgaatttcagttatttcctaattgtatttctatatggactctagtctcctcttctaa1020tattctttattttttaattctgaatttcagctatttctaaattgtatttctatatggact1080ctgttttttctttttctccgattaatgtgag犯tttctatgccatgagagcgaacgtgga1140ggcttctttttctattcctttaataatataatagatgtttacagctggtccagttaatca1200agtatatcccatacatatgccattcctttttg123權利要求1、一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測待測水稻中是否缺失GenBankaccessionAP003771中自5』末端第71046-72062位核苷酸序列，若缺失，則待測水稻為候選秈稻，若不缺失則待測水稻為候選粳稻。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述缺失通過PCR擴增檢測。3、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述PCR擴增為擴增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列的片段。4、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增檢測中所用的上遊或下遊引物與GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列相同或互補。5、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增中所用的引物，其中一條引物序列如序列表中序列l所示，另一條引物序列如序列表中序列2所示。6、根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增檢測中，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，若所述擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為1200-2000bp之間的一條帶，則待測水稻為候選粳稻，若所述擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為100-250bp之間的一條帶，則待測水稻為候選秈稻。7、輔助篩選秈稻和粳稻的引物，是在所述PCR擴增中擴增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列片段的引物。8、根據權利要求7所述的引物，其特徵在於所述引物擴增粳稻時，擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為1200-2000bp之間的一條帶，所述引物擴增秈稻時，擴增產物在瓊脂糖凝膠上顯示為100-250bp之間的一條帶。9、根據權利要求8所述的引物，其特徵在於所述引物中，其中的一條序列如序列表中序列1所示，另一條序列如序列表中序列2所示。全文摘要本發明公開了一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。本發明所提供的輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測待測水稻中是否缺失GenBankaccessionAP003771中自5』末端第71046-72062位核苷酸序列，若缺失，則待測水稻為候選秈稻，若不缺失則待測水稻為候選粳稻。本發明輔助篩選水稻秈粳亞種的方法可在早期用於鑑定秈稻和粳稻品種或地方種，了解秈稻和粳稻的遺傳分化程度，對秈、粳稻雜種優勢的利用和培育高產、優質的雜交稻具有重要指導作用，從而優化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適於推廣應用，為水稻秈粳亞種種質的鑑定提供了一種快捷的選擇方法。文檔編號C12Q1/68GK101220394SQ20081005691公開日2008年7月16日申請日期2008年1月25日優先權日2008年1月25日發明者劉鳳霞,孫傳清,徐文英,震蘇,薛勇彪,譚祿賓申請人:中國農業大學