藥劑、牙科材料及篩選方法

2024-04-02 22:53:05 1

專利名稱：藥劑、牙科材料及篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種用於治療牙髓炎及/或促進象牙質形成的藥劑及其使用，特別涉 及利用基質金屬蛋白酶-3對牙髓及其附近組織損傷及缺損時的修復。
背景技術：
以往，在齲齒等治療方法中，當發生齲齒並深入牙髓時，通常通過拔除全部牙髓， 然後在空隙處填充根管充填材料進行封閉處置。然而，近年來，由於拔髓產生的弊端(如象 牙質脆化、喪失咬合感覺而引起再度齲齒)，期望儘可能保留牙髓組織。保留牙髓的方法有 直接蓋髓術和活髓切斷術(vital pulpotomy)，其中，直接蓋髓術用覆髓劑覆蓋露出的牙髓 表面，活髓切斷術只去除一部分牙髓並用覆髓劑覆蓋根部牙髓組織。在考慮到牙髓的保存時，在牙髓外側形成象牙質很重要。為此，如文獻1、2、3所 述，嘗試以提高象牙質促進作用為目的的覆髓劑。另外，在考慮到牙髓的保存時，抑制牙髓炎症及疼痛，且促進血管新生及牙髓再生 很重要。為此，如非文獻1所述，嘗試以抗炎症作用為目的的覆髓劑。文獻1 特開2002-363084號公報文獻2 特開平6-256132號公報文獻3 特開2005-263681號公報非文獻 1 Kawanishi HN, Kawashima N, et al. , Effects of an iNOS inhibitor onexperimentalIy induced rat pulpitis, J.Oral. Sci. ,112,332-337,2004.

發明內容
但，這些現有覆髓劑的促進象牙質形成的作用還不十分令人滿意。文獻1所記載 的覆髓劑是以血液抽提物為有效成分的，然而，文獻1所記載的覆髓劑其促進象牙質形成 的功效還不足，而且還存在安全方面的問題。另外，文獻2所記載的覆髓劑是以N-乙醯葡 萄糖胺(Ο-GlcNAc)為有效成分的。然而，如文獻2所記載的覆髓劑不包含成齒質細胞分化 誘導所必須的形態形成因子、細胞增殖分化因子、細胞遷移因子，所以只不過是間接吸附遊 離在局部的因子而已。因此，文獻2所記載的覆髓劑在促進象牙質形成以及象牙質-牙髓 複合體再生方面的功效不足。文獻3所記載的覆髓劑是以聚磷酸為有效成分的，然而使促 進象牙質形成的功效發揮不足。非文獻1中記載的覆髓劑是以一氧化氮誘導酶抑制劑為有 效成分的，非文獻1所記載的覆髓劑通過阻斷一氧化氮誘導酶、破壞炎症介質網絡的一端 來發揮消炎作用的。然而，促進新生血管及牙髓再生的作用不足。因此，本發明以提供一種用於治療牙髓炎及/或促進象牙質形成的藥劑為目的。 另外，本發明還以提供一種用於治療牙髓炎及/或促進象牙質形成的牙科材料為目的。另 外，本發明還以提供一種治療牙髓炎及/或促進象牙質形成的藥劑的有效成分的篩選方法 為目的。本發明人從含有豐富牙髓幹細胞的SP細胞(CD31_ ；CD146_SP細胞)中採集具有高血管再生能力的細胞，同時對牙髓SP細胞進行基因表達譜分析。其結果為本發明人發現， 涉及細胞外基質及基底膜分解的細胞外基質分解酶的基質金屬蛋白酶-3(MMP-:3)為高表 達。進一步，本發明人還發現這些蛋白質可促進牙髓創傷的癒合，同時有利於牙髓、象牙質 的形成 再生以及牙髓炎的治癒，本發明人基於上述發現完成了此項發明。S卩，本發明具有 如下步驟。根據本申請發明的第一實施方式的藥劑，其含有有效成分，其中，該有效成分至少 包括具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一 個。本發明的藥劑可以作為牙髓損傷或部分缺失時的藥劑使用。尤其，本發明的藥劑可以 作為牙髓炎及/或根尖性牙周炎等牙髓相關疾病的預防或治療劑使用。優選地，有效成分的含量比例為12ng/ml-1000ng/ml之間，其中，該有效成分為至 少含有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一 種。根據本申請發明的第二實施方式的牙科材料，其含有有效成分，其中，該有效成分 至少含有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種。優選地，所述牙科材料含有機體親和性載體。該載體為符合藥理學的載體。優選地，所述載體具有的一側縱向排列多個同一指向的凹形結構，由氧透過性及/ 或物質透過性的材料製成的膜狀載體。優選地，所述載體至少含有膠原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖 (glycosaminoglycan)、明膠、水凝膠、纖維素、磷酸膽鹼(phosphocholine)、透明質酸、幾丁 質、氨基葡萄糖、纖連蛋白、海藻酸、硫酸乙醯肝素(h印aransulfate)、肝素、層粘連蛋白、 磷酸鈣、羥基磷灰石、β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、DL-聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚 乙二醇、多晶矽、聚已酸內酯(poIycapro 1 actone)、碳酸鈣、鈦、金、陶瓷、矽樹脂、矽水凝膠 (silicone hydrogel)中的任意一禾中。優選地，本發明的牙科材料中至少還含有牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞、 能分化為牙髓細胞的細胞、成齒質細胞(odontoblast)以及能分化為成齒質細胞的細胞中 的任意一種。優選地，所述牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞、可分化為牙髓細胞的細胞、成 齒質細胞(odontoblast)以及可分化為成齒質細胞的細胞含量在1 X IO3個/ μ 1 1 X IO6 個/μ 1之間。優選地，本發明的牙科材料含有血管內皮細胞或血管內皮前體細胞。優選地，本發明的牙科材料含有上皮細胞。優選地，本發明的牙科材料含有象牙質基質即牙本質基質(dentin matrix) 0另外，優選地，在本發明的牙科材料中，所述基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質 以及基質金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種所構成的有效成分的含量比例在12ng/ ml-1000ng/ml 之間。優選地，所述牙髓幹細胞至少包含牙髓SP細胞、⑶3Γ ；⑶146—SP細胞、⑶M+細胞、 ⑶105+細胞、⑶150+細胞中的任意一種。根據本申請發明的第三實施方式的篩選方法，一種用於治療牙髓炎及/或促進象牙質形成的藥劑有效成分的篩選方法；在牙髓幹細胞或血管內皮細胞中添加被檢驗化合 物，然後測定牙髓幹細胞或血管內皮細胞基質金屬蛋白酶-3編碼基因的表達量；在牙髓幹 細胞或血管內皮細胞中沒有添加被檢驗化合物時，測定基質金屬蛋白酶-3編碼基因的表 達量；將兩者基質金屬蛋白酶-3編碼基因的表達量進行比較，以將基質金屬蛋白酶-3編碼 基因表現量所增加的被檢驗化合物作為所述藥劑的有效成分進行選擇。根據本發明的藥劑，能夠達到減輕牙髓炎的炎症狀態，促進血管內皮細胞的遷移， 防止血管內皮細胞凋亡的效果，並促進牙髓幹細胞以及血管內皮細胞在創面的增殖，同時 促進新生血管，從而促進象牙質的形成，因此在牙髓炎的治療效果方面優秀。另外，通過將 根據本發明的牙科材料填充至活體牙窩洞處，可減輕牙髓炎的炎症狀態，並促進牙髓幹細 胞以及血管內皮細胞在創面的增殖，促進新生血管，從而促進象牙質的形成。並且，根據本 發明提供的篩選方法，通過比較基質金屬蛋白酶-3編碼基因的表達量，從被檢驗化合物中 可篩選出能夠促進牙髓炎以及/或象牙質形成的藥劑的有效成分。


圖IA為具有凹狀部的膜狀載體的平面圖。圖IB為具有凹狀部的膜狀載體的側面圖。圖IC為將凹狀部擴大的說明圖。圖2A為嚴重齲齒引起牙髓裸露的牙齒的說明圖。圖2B為表示牙齒模具的說明圖。圖2C為對將帶有間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)的凹狀部載體置入牙形 模具中的牙窩洞內的情況進行說明的說明圖。圖2D為對將帶有MMP3活性蛋白的載體以及凹面載體置入牙形模具中的牙窩洞的 情況進行說明的說明圖。圖2E為對在培養裝置中培養幹細胞的情況進行說明的說明圖。圖2F為對垂直加壓後，幹細胞分化為成齒質細胞以及成釉細胞(enameloblast) 的情況進行說明的說明圖。圖2G為對將帶有凹狀部的載體移植至牙窩洞後的情況進行說明的說明圖。圖3A為對大鼠上顎切齒情況進行說明的說明圖。圖:3B為對使用鑽石牙鑽(diamond point bur)去除大鼠上顎切齒牙冠上部的情 況進行說明的說明圖。圖3C為使用球鑽(round bur)切斷大鼠上顎切齒牙髓的情況進行說明的說明圖。圖3D為對清洗、止血處理斷面的情況進行說明的說明圖。圖3E為對在斷面開口處填充明膠、樹脂的情況進行說明的說明圖。圖4為對牙髓創傷處進行說明的低倍圖片。圖5A為創傷出現1小時後的情況的顯微照片。圖5B為圖5A中方框區域的顯微照片。圖5C為創傷出現M小時後的情況的顯微照片。圖5D為圖5C中方框區域的顯微照片。圖5E為創傷出現72小時後的情況的顯微照片。
圖5F為圖5E中方框區域的顯微照片。圖5G為創傷出現7天後的情況的顯微照片。圖5H為圖5G中方框區域的顯微照片。圖6A為創傷下部牙髓處的mRNA表達的經時變化示意圖；MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、 MMP14的表達示意圖。圖6B為創傷下部牙髓處的mRNA表達的揭示變化示意圖；VEGF、SDFl以及CXCR4 的表達示意圖。圖7A為活髓切斷M小時後，經MMP3及BSl-血凝素(BSl-Iectin)雙重免疫螢光 染色後的MMP3顯微照片。圖7B為活髓切斷M小時後，經MMP3以及BSl-Iectin雙重免疫螢光染色後 BSl-Iectin的顯微照片。圖7C為活髓切斷M小時後，經MMP3以及BSl-Iectin雙重免疫螢光染色後Merge 處理的顯微照片。圖7D為活髓切斷M小時後，經MMP3以及CXCR4雙重免疫螢光染色後MMP3的顯 微照片。圖7E為活髓切斷M小時後，經MMP3以及CXCR4雙重免疫螢光染色後CXCR4的顯 微照片。圖7F為活髓切斷M小時後，經MMP3以及CXCR4雙重免疫螢光染色後經Merge處 理的顯微照片。圖7G為經MMP3及CXCR4雙重免疫螢光染色後，MMP3的放大顯微照片。圖7H為經MMP3及CXCR4雙重免疫螢光染色後，CXCR4的放大顯微照片。圖71為經MMP3及CXCR4雙重免疫螢光染色後，Merge處理的放大顯微照片。圖7J為活髓切斷M小時後，牙髓創面經HE染色後的顯微照片。圖7K為活髓切斷M小時後，牙髓斷面新生毛細血管以及新生大血管經HE染色後 的顯微照片。圖7L為活髓切斷72小時後，新生毛細血管以及新生大血管經HE染色後的顯微照 片。圖7M為活髓切斷M小時後，經原位雜交，MMP3 mRNA在血管內皮細胞以及血管內 皮前體細胞中表達情況的顯微照片。圖7N為活髓切斷72小時後，經原位雜交，MMP3 mRNA在血管內皮細胞以及血管內 皮前體細胞中表達情況的顯微照片。圖8A為在體外，MMP3促進血管內皮細胞增殖的示意圖。圖8B為在體外，MMP3促進血管內皮細胞遷移的示意圖。圖8C為在體外，MMP3促進血管內皮細胞抗凋亡的示意圖。圖9A為大鼠活髓切斷M小時後，添加MMP3後經BSl-Iectin染色的顯微照片。圖9B為大鼠活髓切斷M小時後，未添加MMP3 JSBSl-Iectin染色的顯微照片。圖9C為大鼠活髓斷面處的上部牙髓組織，在添加MMP3後，新生血管密度定量增加 的示意圖。圖9D為大鼠活髓切斷M小時後，添加MMP3 JSPCNA免疫染色時的顯微照片。
圖9E為大鼠活髓切斷M小時後，未添加MMP3，經PCNA免疫染色後的顯微照片。圖9F為大鼠活髓切斷72小時後，添加MMP3，經HE染色的顯微照片。圖9G為大鼠活髓切斷72小時後，未添加MMP3，經HE染色時的顯微照片。圖9H為大鼠活髓切斷72小時後，添加MMP3，經馬松染色(Masson' sTrichrome Stain)的顯微照片。圖91為大鼠活髓齒切斷72小時後，添加MMP3，原位雜交的顯微照片。圖9J為大鼠活髓齒切斷72小時後，未添加MMP3，經馬松染色的顯微照片。圖9K為大鼠活髓切斷72小時後，添加MMP3及NNGH，經馬松染色的顯微照片。圖9L為大鼠活髓切斷7天後，未添加MMP3，經馬松染色的顯微照片。圖9M為大鼠活髓切斷7天後，添加MMP3及NNGH，經馬松染色的顯微照片。圖9N為大鼠活髓切斷72小時後，添加MMP3，膠原蛋白基質增加情況示意圖。圖90為大鼠活髓齒切斷7天後，添加MMP3，膠原蛋白基質增加情況示意圖。圖IOA為狗活髓切斷14天後，添加MMP3，狗上顎臼齒象牙質的形成情況的顯微照 片。圖IOB為狗活髓切斷14天後，添加MMP3，狗上顎臼齒象牙質的形成情況的高倍顯 微照片。圖IOC為狗活髓切斷14天後，添加MMP3，狗上顎臼齒象牙質的形成情況的超高倍 顯微照片。圖IOD為狗上顎臼齒活髓切斷14天後，PBS控制時的顯微照片。圖IOE為狗上顎臼齒活髓切斷14天後，PBS控制時的高倍顯微照片。圖IlA為發生牙髓炎的狗上顎臼齒添加MMP3 14天後，炎症治療情況的顯微照片。圖IlB為發生牙髓炎的狗上顎臼齒添加MMP3 14天後，炎症治療情況的高倍顯微 照片。圖IlC為發生牙髓炎的狗上顎臼齒的PBS控制時的14天後的顯微照片。圖IlD為發生牙髓炎的狗上顎臼齒的PBS控制時的14天後的高倍顯微照片。圖12A為將源於豬牙髓的CD31_ ；CD146_SP細胞附著於帶有凹狀部的矽氧樹脂 (silicone)膜載體上，培養12小時後的相差顯微照片。圖12B為垂直加壓6小時，培養48小時後，β -肌動蛋白(β -actin)、Dspp以及 釉質溶解素(Enamelysin)的mRNA表達的示意圖。附圖標記說明100帶有凹狀部的載體；110凹狀部；200牙齒；210牙髓;290模具;300吸附有MMP3蛋白的載體；400培養設備；500大鼠上顎切齒；510鑽石牙鑽(diamond point bur)
520 球鑽(round bur)；540 斷面；550:明膠;560 樹脂。
具體實施例方式以下將參照添加的圖片來具體說明本發明的實施方式。本發明涉及一種可促進牙髓炎治癒及/或象牙質的形成的藥劑、牙科材料及有效 成分的篩選方法，其中，至少含有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白 酶-3前體蛋白中的任意一種。本發明的各種實施方式均是利用基質金屬蛋白酶-3對牙髓炎的進行治療以及/ 或促進象牙質的形成。基質金屬蛋白酶-3屬於基質金屬蛋白酶(MMP)族，相關細胞外基質 的分解。但是，每種MMP的特性還不完全知曉。本發明人根據從牙髓細胞中採集的特定SP細胞的表達圖譜，在SP細胞內大量表 達的蛋白質中，發現了 MMP3具有特異地促進象牙質形成的作用。關於MMP3已進行了多方 面的研究，示出了 MMP3對相關各種軟骨基質成分的分解作用，從而MMP3作為破壞軟骨的蛋 白，已被認為是作為風溼症(rheumatism)的參與因子或標誌使用。另外，在相關牙周病引 起的牙周組織，現在已嘗試使用MMP3編碼基因的表達抑制劑作為預防或治療牙周病(特開 2006-298913號公報)。但，有關對MMP3的牙髓炎的治癒參與還完全不清楚。同時，對MMP3 的牙髓及/或象牙質的形成、再生也完全不清楚。本發明的藥劑和牙科材料將具有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質直接應用 於創傷部位及/或炎症部位，根據本發明的藥劑及牙科材料，可以促進牙髓炎治療。另外， 根據本發明的藥劑和牙科材料，可以促進牙髓及/或象牙質的形成並再生。本發明的效果 並不限於發明，推測MMP3作用於血管內皮細胞或血管內皮前體細胞遷移、增殖、抗凋亡，通 過新生血管，在促進牙髓的再生以及象牙質形成、再生方面具有獨特的功效。下面，將說明本發明的各種實施方式。(牙髓炎治療及/或促進象牙質形成的藥劑)本藥劑含有具有MMP3活性的蛋白質(以下稱MMP3活性蛋白)、MMP3前體蛋白 或這些蛋白的混合物為其有效成分。以下將MMP3活性蛋白、MMP3前體蛋白或它們的混 合物定義為MMP 3蛋白。MMP 3屬於MMP族中的一種蛋白質成分，也被稱為基質降解因子 (stromelysin) 1。MMP3可來源於各種生物，例如，人類MMP3的胺基酸序列以及鹼基序列可 在 GenBank 中，通過 Accession 號碼 NP_002413. 1 獲得。MMP3活性蛋白可採用重組MMP3，即可來源於大腸桿菌、昆蟲或人纖維組織母細 胞(fibroblast)。MMP3活性蛋白是指天然MMP3的胺基酸序列中，具有任何1個或多個 胺基酸發生替換、缺失、插入以及增加的任何一種或2種以上的胺基酸序列，具有MMP3 活性的尤佳。也就是說，可以是一種天然MMP3的突變體。這些突變體的獲得，除了本領 域技術人員中公知的方法以夕卜，還可參照Molecular Cloning :A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY. ,2001(以下簡 禾爾為 Molecular Cloning 第三版)或 Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-38, John Wiley &Sons (1987-1997)(以下簡稱為 Current Protocols in Molecular Biology)獲得。MMP3的活性可通過MMP3活性測定系統(Nagase et al.， J. Biol. Chem. 1994269 =20952-20957)等進行測定，其中，MMP3活性測定系統使用明膠酶譜 (Gelatin-zymography) > Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)或焚光月太。另夕卜， 對於突變體中MMP3的活性程度無特殊限制。MMP3前體蛋白是由結締組織細胞分泌的一種 無活性前體(pro MMP3)，是前體肽(Pro-p印tide)被有限分解前的前體，還包含天然MMP3 前體的突變體。MMP3活性蛋白是將MMP3前體蛋白利用人工胰朊酶、纖溶酶(plasmin)、絲氨酸蛋 白酶(serine proteinase)等切斷得到。也就是說，MMP3前體蛋白通過其他或自身的蛋白 酶酶解活性，前體肽經有限分解，從而具有了酶活性。因此，使藥劑中含有MMP3前體蛋白質 可防止藥物在用於活體前藥效發生劣化，MMP3前體蛋白進入機體後，會自然地或因其他作 用而被激活。若使用MMP3活性蛋白和MMP3前體蛋白的混合物，二者混合的比例無特別限 制，可適當配比。本發明的藥劑中的MMP3蛋白，在允許藥理學以及藥劑學原理的情況下，可與其他 添加物混合，製作成適用於患處的各種製劑。本發明中的覆髓劑可採用多種劑型如注射劑、 外用液劑(注入劑、搽劑)、固體製劑(顆粒劑、細粒劑、散劑、軟膏劑、錠劑)、軟膏劑等。藥理學以及藥劑學範圍內容許的添加物包括如賦形劑、崩解劑或崩解助劑、等張 化劑(isotonization)、酸度調節劑、穩定劑、防腐劑、保護劑、分散劑、乳化劑、膠化劑、增稠 劑、粘合劑、增味劑等。關於膠化劑，如吸收牙齒的浸出液，能使之膠化即可。粉劑以及液劑 等劑型，使用時可混合或攪拌。本發明藥物中可含有殺菌劑、抗生素、消炎藥物等其他有效成分。本發明藥物除可用於治療齲齒時的牙科修復以及修補處置外，還可用於外傷引起 的牙髓裸露以及拔髓後用於露髓面或其附近。例如，可將本發明藥物塗抹或填充於髓腔擴 大、拔髓後的牙窩洞處、象牙質、活髓齒的斷面處。另外，在拔髓或根管清創擴創後的牙髓再 生治療時，也可將本藥物用於再生牙髓表面或根管內及其附近處。本發明藥物可單獨使用，也可與直接覆髓劑或間接覆髓劑配伍使用。在使用直 接覆髓劑或間接覆髓劑前後均可使用本發明藥物，也可將本藥物與直接覆髓劑或間接覆 髓劑混合使用。在本發明中，「直接覆髓劑」是指部分牙髓暴露時，用於保護牙髓的藥劑， 如氫氧化鈣等製劑。「間接覆髓劑」是指象牙質變薄而牙髓未裸露時，用於阻斷外來刺激、 殺菌等目的的藥劑，如氧化鋅丁香油酚(zinc oxide eugenol)、鋅化雜酚油(zinc oxide Creosote)。本發明藥物中MMP3蛋白的含量可在12ng/ml lOOOng/ml之間，適宜含量為 50ng/ml 500ng/ml，最佳含量為 80ng/ml 200ng/ml。若其含量低於 10ng/ml，則 MMP3 對HUVEC遷移的促進作用不明顯。若MMP3的含量高於lOOOng/ml，則本發明藥物用於人體 時可能會產生不可預期的副作用。本發明藥物的用量無特別限制，可根據患者的症狀(齲 齒的程度、牙髓損傷·缺損程度)、年齡、劑型酌情處置。本發明藥物中有效成分MMP3活性 蛋白的每次用量可在Ing IOOyg之間，適宜用量為IOng 10 μ g，最佳用量為IOng 1 μ g，所述用量均指乾重。本發明藥物可促進牙髓及/或象牙質形成，在其損傷或缺損時還會促進其再生。因此，將藥物用於裸露的牙髓表面或其附近可較好的發揮保存牙髓的功效。另外，在發生牙髓炎時，本發明藥物還有利於牙髓或其附近炎症的治癒或改善其 症狀。因此，本藥物可用於包括牙髓炎或根尖性牙周炎等牙髓及其附近炎症疾病在內的牙 髓相關疾病的預防或治療。(牙科材料)本發明提供的牙科材料中，除含有MMP3蛋白外，也可含有機體親和性、MMP3蛋白 的支撐載體。將本材料用於牙髓缺損部位及其附近處，可促進牙髓及/或象牙質的形成，能 較好地保留牙髓或促進其再生。(載體)在本牙科材料中，由於載體的作用可使本牙科材料中的MMP3蛋白更易於到達患 處。另外，在牙髓及象牙質再生或形成時載體還可將MMP3蛋白長期地保留於患處。同時， 載體還可成為富集各種細胞，促進組織再生的支架或充填材料而發揮作用。載體既可事先 與MMP3蛋白組成複合物，也可與MMP3蛋白分別獨立製成試劑盒使用。MMP3蛋白與載體可通過某種相互作用而被保留在載體表面。載體最好由具有機體親和性材料製成。機體親和性材料如I型及III型膠 原蛋白、缺端膠原(atelocollagen)等各種膠原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖 (glycosaminoglycan)、明膠、/K凝膠(hydrogel)、纖維素、磷酸膽鹼(phosphocholine)、透 明質酸、幾丁質、氨基葡萄糖、纖連蛋白、海藻酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、 層粘連蛋白、三磷酸鈣、羥磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP等天然材料及其衍生物，除所 述物質外還可使用PLA (聚乳酸)、PGA (多聚葡萄糖酸)、PDLLA (DL-聚乳酸)、PLGA (乳酸 葡萄糖共聚物)、PEG(聚乙二醇)、聚矽氧烷(poly silicone) ,PCL(caprolactone)等高分 子材料。機體親和性載體材料可採用如碳酸鈣、鈦、金及陶瓷等無機材料。另外，蛋白聚糖 是蛋白質與糖苷鍵共價結合的一種複合糖蛋白。考慮到細胞的粘附性及細胞的增殖性，可 在聚矽氧烷等高分子材料載體表面使用等離子塗層材料(Plasma-Coating)、膠原蛋白溶液 或纖連蛋白等天然材料及其衍生物製成載體材料層。為了提高細胞的粘附性，可對載體表 面採取等離子(plasma)處理、製作膠原蛋白塗層(Collagen Coat)等措施。I和III型膠原蛋白系將I型膠原蛋白和III型膠原蛋白混合組成的混合膠原蛋 白。I型膠原蛋白是一種基礎性膠原，屬於纖維性膠原蛋白。III型膠原蛋白與膠原纖維不 同，會形成細網狀的構型即網狀纖維，可成為細胞的支架。III型膠原蛋白在混合膠原蛋白 中的比例最好在30% 50% (重量比)，III型膠原蛋白的重量比若大於50%，混合膠原 蛋白可能不發生凝固。若III型膠原蛋白的重量比低於30%，多量的I型膠原蛋白有可能 引起象牙質的再生而影響新生血管的形成。I型和III型膠原蛋白的重量比最好為1 1。 機體親和性載體可使用平均直徑在Inm lOOOnm、海綿狀的具有三維立體結構的納米纖維 (一種熱塑性高分子)製成。三維立體結構納米纖維的孔隙率最好在80% 99. 99%之 間。另外，納米纖維的平均直徑可通過下列方法求得使用掃描電鏡觀察海綿狀三維立體結 構的橫斷面或縱斷面，用圖像處理軟體分析在同一斷面內隨機選取的150根單纖維的斷面 積，計算圓周換算直徑，從而求得平均直徑。載體的三維立體結構無特別限制，長纖維狀(filament)、薄膜狀、纖維集合體狀、 網狀、海綿狀、微粒狀等各種形狀均可。另外，載體既可塗於牙髓表面，也可製成牙窩洞的形狀(拔髓或牙髓切斷後所產生的三維立體空隙的形狀)。載體的表面最好既能成為MMP3蛋白的支架，又有利於細胞的粘附，最理想的載體 是具有一定表面積與空隙的多孔材質或網狀骨架材質。也可將具有不同三維立體結構的載體組合使用，如將多孔材質的載體(適合用於 覆蓋在裸露牙髓表面和填充於裸露牙髓上側的空隙處)與用於象牙質再生支架的載體組 合使用。這樣使用時，兩種載體上都可吸附有MMP3蛋白，若牙髓側的載體中也有MMP3蛋白 的話，促進組織再生的效果會更好。牙科材料含有載體時，可將MMP3蛋白事先吸附於載體上。將MMP3蛋白吸附於載 體上時，若二者依靠相互作用較易粘附的話，只要將二者混合、浸泡等相互接觸即可。用於象牙質再生的支架載體，如圖IA所示，可使用表面具有微小凹陷結構110的 載體100。這種微小凹陷結構110可模擬象牙質的象牙細管(或齒細管)的形態來製作。 凹陷結構110不需完全模仿象牙質的象牙細管形態，最好參照象牙細管的尺寸(直徑與深 度)、方向及空隙(即節距(pitch))來製作。載體上之所以準備凹陷結構110是為了促進 象牙質的再生。如圖IB所示，凹陷結構110在載體100的一側需設有開口。凹陷結構110的深 度d可製成Iym至幾十μπι，深度d的較好範圍值在Iym 15 μ m之間，最好在1 μ m 13 μ m之間，最理想在2 μ m 10 μ m之間。如圖IC所示，凹陷結構110的直徑t及傾斜度ρ 可在數μπι至數十μ m之間，其中直徑t可在Iym 12μπι之間，較好的範圍值為Iym 10 μ m,更好的範圍值為2 μ m 8 μ m。凹陷結構110的傾斜度ρ值可在2μπι 30μπι之 間，較好的範圍值為3 μ m 30 μ m，最好在4 μ m 26 μ m之間。牙髓的斷面積大約為1mm2。 對於牙髓(露髓面)來說，凹陷結構110最好在5000個 50000個左右。另外，凹陷結構 110既可製成非貫通型的(未貫穿至開口面的對側)，也可製成貫通型的。不過，凹陷結構 110製成非貫通型的較好。具有凹陷結構110的載體100的厚度無特別限制，可在200 μ m 1000 μ m 之間。具有凹陷結構的載體100最好由氧透過性或物質透過性的材料製成，這樣可促 進成齒質細胞及象牙質的形成。這種載體最常用矽樹脂材料製成。矽樹脂載體不需採用 雷射及一些後加工工藝形成凹陷結構，在參照牙窩洞形態加工成立體三維結構時即可形 成凹陷結構。例如，參照牙窩洞形態的母模(cavity)模具在加工成形的同時，凹陷結構 也隨之形成了。矽樹脂材料製成的載體在用於病灶部位後，在規定的時間內比較容易清 除。矽水凝膠(siliconehydrogel)也可製成的凹面載體100。矽水凝膠是由含有聚碳 酸酯(Polycarbonate)骨架的共聚物(copolymer)和由親水性單體聚合而成的親水性高 聚物(Polymer)構成的，是共聚物與高聚物相互形成的網狀結構組成的一種透明膠狀物。 除矽水凝膠外，矽橡膠(PDMS)、Poly(dimethylacrylamide-co-glycidyl methacrylate) (PDMA-co-GMA)、甲基丙烯酸羥乙酯(hydroxyethyl methacrylate)也可製成凹面載體 100。將細胞接種至凹面載體100進行培養時，培養基通常採用動物細胞培養中常用 的血清培養基或無血清培養基，培養條件一般選擇動物細胞的培養條件(例如，37°C、5% C02)。具體培養方法如下準備凹陷結構載體100，從牙髓等組織中採集牙髓細胞，然後使 之附著於載體凹陷結構開口的一面，再將載體置於適當的支撐物上，在適當的培養基中進行培養。進行細胞培養時，將凹面載體100的開口面朝下浸泡在液體培養基中，從液體培養 基的表面沿載體凹陷結構的縱深方向實施反覆加壓操作，通過所述培養後，附著於載體上 的細胞會排列生長、分化為成齒質細胞。加壓操作可以使用機械裝置進行，機械壓力的大小 無特別限制，不過，壓力過大的話，對幹細胞或成齒質細胞可能會產生損傷，所以，壓力可選 在0. 75N/cm2 1. 5N/cm2之間，壓力較好的範圍值為0. 85N/cm2 1. 25N/cm2，最好在0. 95N/ cm2 1. ON/cm2之間。另外，加壓操作的頻率為每分鐘1次-10次左右，最好在3次-8次/ 每分鐘，每次持續數秒至數十秒，壓力應施加於置於容器中的液體培養基。加壓的原則應以 不影響細胞的增殖為原則。經過所述的加壓操作後，成齒質細胞就會形成象牙質。將上皮細胞粘附於載體100凹陷結構110開口方向的對側面時，通過加壓操作，上 皮細胞會分化為成齒質細胞，同時也能分化為成釉細胞(enameloblast)。當凹面載體100的凹狀部開口面一側接種並培養齒髓幹細胞時，也可以在該開口 面處以與吸附有MMP活性3蛋白質的其他載體(吸附有MMP3蛋白的載體)相接觸的狀態 下進行培養。這樣，該其他載體變成重新產生的成齒質細胞的支架的同時，MMP3活性蛋白 質速進成齒質細胞的生長。凹面載體100可直接覆蓋在拔髓或牙髓切斷後裸露的牙髓表面。將凹面載體100 直接覆蓋在拔髓或牙髓切斷後裸露的牙髓表面時，可根據拔髓後所留空隙的形狀，特別是 對於象牙質處空隙的三維立體形狀，將載體製成合適的形狀使用。另外，可以將吸附有MMP3 蛋白的載體置於進行拔髓或牙髓切斷處置後產生空隙的牙髓側面(通常在裡面)，而將凹 面載體100置於該空隙的表面。同時，還需儘可能將載體100的象牙細管狀的凹陷結構100 的開口面朝向牙髓側放置。凹面載體100和MMP3蛋白載體可分別製作，然後移植在處置後 的部位。凹面載體100和MMP3蛋白載體也可做成預定的形狀成為一體後，再移植至處置後 的部位。下面將參照圖2A-圖2G說明凹面載體100與MMP3載體的使用。圖2A-圖2G為 使用凹面載體(膜)100，形成象牙細管及牙釉質的模式圖。首先，如圖2A所示，以牙齒200 為治療對象，因嚴重齲齒牙髓210已裸露，進行活髓切斷處置。如圖2B所示，用物理法取牙 形，製作模型四0，也可以不使用物理法取牙形，而通過計算機測量後製作模型。如圖2C所 示，將源於牙髓的幹細胞或前體細胞等間葉幹細胞附著於凹面載體100的凹面結構110的 表面，然後再放入牙形模具290的牙窩洞內。在所述操作過程中，也可事先將口腔黏膜上皮 等上皮細胞吸附於凹面載體100的凹面結構110表面。如圖2D所示，也可將MMP3蛋白載 體300放入牙形窩洞的牙髓側(內側)。另外，有時也將源於牙髓的幹細胞 前體細胞注入 MMP3蛋白載體300內。如圖2E所示，在培養裝置400內，沿凹面結構110的縱深方向垂直加 壓，進行間葉幹細胞的三維細胞培養。如圖2F所示，三維細胞培養一段時間後，細胞會排列 分布，分化為成齒質細胞及成釉細胞，從而形成象牙質及牙釉質。如圖2G所示，將凹面載體 的凹面部分110朝下，移植至牙窩洞內，再用樹脂封閉。這種情況下，有時也可將MMP3蛋白 載體置於牙髓裸露面或活髓斷面上，在其上面再直接放置未粘附有源於牙髓的幹細胞·前 體細胞的凹面載體300。通過上面的一系列操作，牙髓、象牙細管及牙釉質(牙釉質是在口 腔黏膜上皮等上皮細胞粘附於凹面載體100的凹面對側的時候形成的)即可形成。也可以只將凹面載體100覆蓋在裸露的牙髓表面。牙髓斷面較淺時，只將MMP3蛋 白吸附在載體上然後覆蓋在牙髓表面即可見效。
(牙髓細胞)本發明提供的牙科材料可單獨含有牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞、能分化 為牙髓細胞的細胞、成齒質細胞及能分化為成齒質細胞的細胞中1種或2種以上的細胞成 分，也可與載體共同含有所述細胞成分。將這些細胞置於缺損部位時，會進一步促進牙髓及 /或象牙質的形成·再生。其中，牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞及能分化為牙髓細胞 的細胞能促進牙髓及象牙質的形成及再生，而成齒質細胞及能分化為成齒質細胞的細胞能 促進象牙質的形成及再生。本牙科材料以載體為支持物，成為這些細胞的支架，使之粘附其 上，細胞才能得以增殖。這些細胞(牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞、能分化為牙髓細 胞的細胞、成齒質細胞及能分化為成齒質細胞的細胞)的含量最好在IXIO3個/μ I-IXlO6 個/μ ι之間。若其含量低於IXIO3個/μ 1，則促進牙髓及象牙質形成、再生的效果可能不 理想。若其含量高於IXlO6個/μ 1，在填充至牙窩洞內時則會產生無法預期的副作用。牙髓幹細胞來源於恆齒或乳齒。特別是在源於人乳齒的牙髓細胞中，CD105+細胞 含量較多，大約佔50%左右(在源於人恆齒的CD31_ ；SP細胞中，CD105+細胞的含量約為 20% )，源於人乳齒的牙髓細胞在試管內的實驗表明，這種細胞具有誘導血管再生、恢復下 肢缺血部位的血流、促進新生血管形成的功能。牙髓幹細胞包括人牙髓SP細胞、⑶3Γ ；⑶146—細胞、⑶M+細胞、⑶105+細胞、 CD150+細胞等。例如，人牙髓SP細胞在促進血管新生等組織再生方面的功能較強。在促進 下肢缺血部位血管新生能力上，人牙髓SP細胞與人乳齒牙髓細胞比較，前者是後者的1. 2 倍；人牙髓SP細胞是人恆齒牙髓細胞的2. 6倍。這些細胞可從拔掉的人齒中採集。人牙髓細胞可參照Nakashima M. Archs oral boil. 36(9)，655-663，1991文獻中記載的方法採集。能分化為人牙髓細胞的細胞可按照下 列方法採集無菌取出阻生牙(impacted tooth)，在Phosphate Buffered Saline(以下簡 稱PBQ溶液等適當的保持液中保存。清除牙齒中的鈣化部分，再將組織切成小塊，用PBS 溶液清洗。接著用膠原酶(Collagenase)或中性蛋白酶(dispase)酶解組織。酶解後，通 過過濾和離心操作以分離細胞。所得細胞為均質的同類細胞較好，最好為自體細胞。也可 以是經細胞培養所得的細胞。成齒質細胞的採集方法如下將重組子Bone MorphogeneticProteins (BMPs)(從 BMP2、BMP7及BMPll中選擇1種或2種以上)加入至牙髓細胞、牙髓幹細胞或牙髓前體細 胞內或導入其編碼基因，在Dulbecco 『sModified Eagle Medium(DMEM)中進行二維或三維 培養，使所述細胞發生分化即可得到成齒質細胞。能分化為成齒質細胞的細胞是指牙髓細 胞、牙髓幹細胞或牙髓前體細胞等細胞。牙髓細胞是通過膠原酶酶解牙髓組織後，分離得到 的(參照文獻 Nakashima M. Archs oral boil. 36 (9)，655-663，1991)。牙髓前體細胞及牙 髓幹細胞是經流式細胞儀，從大量排出Hoechst33342的組分Side population (SP)中分選 後得到的。另外，牙髓前體細胞及牙髓幹細胞也可用⑶對、⑶；34、⑶105、⑶133或⑶150抗 體來分選⑶24+、⑶34+、⑶105+、⑶133+或⑶150+細胞進而得到所需細胞。本發明牙科材料還可含有血管內皮細胞或血管內皮前體細胞。因MMP3活性蛋白 可促進這些細胞向損傷部位遷移增殖、促進新生血管的形成，同時還能促進牙髓及/或象 牙質的形成。這些細胞為同類細胞較好，最好為自體細胞。這二種細胞也可通過細胞培養 的方法獲得。
本發明牙科材料還可含有上皮細胞或其前體細胞。上皮細胞或其前體細胞隨著成 齒質細胞的成齒質形成及再生，分化為成齒質細胞及成釉細胞，從而形成象牙質及牙釉質。 這樣的上皮細胞或其前體細胞可以從口腔黏膜上皮或羊膜上皮採取。相比同種細胞，這種 細胞更加優選同族細胞。另外，這種細胞可以是培養細胞。本發明牙科材料含有牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞及能分化為牙髓細胞 的細胞、成齒質細胞、能分化為成齒質細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、上皮細胞或 其前體細胞，也可在所述細胞中添加從骨髓、胎盤及臍帶血等組織中採集的間葉幹細胞或 未分化的間葉幹細胞。另外，也可通過下列方法將採集的細胞作為本牙科材料中含有的細胞成分即 用CD31、⑶146、⑶105及VEGFR2抗體標記牙髓細胞，利用流式細胞儀分選⑶3Γ及/或 ⑶146_及/或⑶105+及/或VEGFR2+細胞，進而獲得所需細胞。本發明發明人通過所述方 法，分離得到一種大量分泌MMP3活性蛋白的SP細胞，這種細胞中可能富含牙髓幹細胞。牙科材料中若含有細胞成分，無論是否添加MMP3活性蛋白，只要含有細胞培養增 殖後產生的細胞培養物即可。另外，如果牙看材料中含有細胞，有無載體均可。如果牙科材 料中含有載體，只要將細胞(或培養細胞)接種至載體上即可，也可將其培養物接種至載 體。在牙科材料包含細胞和載體時，MMP3蛋白最好吸附於載體上。MMP3蛋白既可在細 胞接種前吸附於載體上，也可在細胞接種的同時、細胞培養時或細胞培養後吸附於載體上。本發明牙科材料中也可含有象牙質基質。象牙質基質可促進損傷部位象牙質的形 成。膠原蛋白、羥磷灰石(hydroxyapatite)、三磷酸鈣等均可作為象牙質基質。象牙質基 質中也可含有蛋白質成分，如dentin sialophosphoprotein(Dspp)、人造蛋白聚糖、dentin matrix protein(Dmpl)等。本發明牙科材料中還可含有形態形成因子，該因子可促進細胞分化誘導為成齒 質細胞。這種形態形成因子包括1，25 二羥維生素D3、地塞米松(dexamethasone)、Bone morphogenetic proteins (BMPs)、Insulin-like growthfactors(IGFs) > Fibroblast growth factors (FGFs)等。(篩選方法)本發明提供的篩選方法是指下列所述工藝即在牙髓幹細胞或血管內皮細胞中添 加被檢化合物，然後測定牙髓幹細胞或血管內皮細胞中的基質金屬蛋白酶-3編碼基因的 表達量，與未添加被檢化合物時進行比較，通過此種方法來篩選能夠增加金屬蛋白酶-3編 碼基因表達量的被檢化合物並以此作為治療牙髓炎及/或促進象牙質形成藥物的有效成 分。根據此篩選方法來選擇能促進牙髓幹細胞或血管內皮細胞表達MMP3蛋白的被檢化合 物。這些被檢化合物可與MMP3蛋白同時或代替MMP3蛋白作為所述藥物的有效成分。MMP3基因的表達量，按照下述方法測定，即從接觸被檢化合物的細胞中採集全 RNA，逆轉錄得到的cDNA後進行PCR擴增，從擴增產物中得出MMP3基因的表達量。MMP3 活性蛋白的表達量可通過測定牙髓細胞的上清培養液中的MMP3活性來獲得。MMP3的活 性可通過 MMP3 活性測定系統(Nagase et al.，J. Biol. Chem. 1994 269 :20952-20957) 進行測定，這些測定系統主要是基於明膠酶譜(Gelatin-zymography)、Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA)或焚光妝等方法。
以下，將通過應用實例具體說明本發明。本發明並不只限於以下幾個應用實例。應用實例(應用實例1牙髓創傷治癒過程中，MMP3的表達情況)1.大鼠活髓切斷模型的製作首先準備大鼠上顎切齒500，如圖3A所示。大鼠體重在220g ^Og之間，為8周 齡雄鼠(購於日本東京CLEA公司)。如圖:3B所示，使用鑽石牙鑽510，將大鼠上顎左右切 齒的牙冠上部除去2mm。如圖3C所示，用#1/2球鑽520疏通，然後對大鼠上顎左右切齒進 行活髓切斷處置。如圖3D所示，用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗斷面540並止血。如圖3E所 示，將含有50ng MMP3的明膠和樹脂(Unifil low、GC、東京)填充至斷面開口處。暫封處 置後，分別於1小時、12小時、24小時、72小時及7天後，使用4%的多聚甲醛固定液進行 灌流固定，摘除上顎切齒。將摘除的上顎切齒在4°C下、置於4%的多聚甲醛溶液中浸泡固 定過夜，然後在10%乙酸中脫鈣2周。將所述處理後的上顎切齒使用乙醇進行脫水，石蠟 (Sigma)包埋，製成5μπι厚度的切片，將石蠟切片置於APS Coated slide (Matsunami東京) 上。玻片在進行原位雜交實驗(hybridization)及HE染色之前需4°C保存。將免疫組化 用的sample使用OCT複合物進行包埋處理，製成12 μ m厚的冷凍切片後，置於APS Coated slide 上。圖4為創傷出現12小時後的低倍圖片，在箭頭處進行斷髓操作。圖5A為1小時 後的創傷狀態，圖5B為圖5A方形區域的放大圖片。如圖5A和圖5B所示，在創傷出現1小 時後，圖中可觀察到出血及血管擴張現象。大鼠覆髓後，創傷表面出現壞死、變性現象，在創 傷面下可見以嗜中性粒細胞為主的炎症性細胞浸潤，整個牙髓組織出現浮腫。圖5C為創傷M小時後的情況，圖5D為圖5C中方框區域的放大圖片。ν表示新生 血管。如圖5C和圖5D所示，在創傷出血M小時後炎症性細胞浸潤減輕，在變性牙髓正下 方，可見斷面下的牙髓組織內出現很多成纖維細胞樣細胞、多角形細胞及新生血管。圖5Ε為創傷72小時後的情況，圖5F為圖5Ε中方框區域的放大圖片。OD表示骨 樣象牙質。如圖5Ε及圖5F所示，創傷72小時後，斷面下牙髓組織內的上部附近，紡錘形細 胞周圍有膠原蛋白基質並形成了 一些骨樣象牙質。圖5G為創傷7日後的情況，圖5Η為圖5G中方框區域的放大圖片。OB表示成齒質 細胞，TD表示細管象牙質。如圖5G及圖5Η所示，創傷7日後，出現了具有一定方向性的、 1 2層成齒質細胞(0Β :odontoblast-like cells)，骨樣象牙質下形成了細管象牙質(TD tubular dentin) 0如圖5G所示，新生血管已延伸至成齒質細胞層附近，顯示牙髓創傷已治 愈。所述情況說明，在牙髓創傷治癒過程中，此模型有助於研究分析MMP3的表達情況並推 測其功能。2.牙髓創面中mRNA表達的變化情況在形成創傷後的0(剛創傷後)、12、M、48、72小時，分離牙髓組織。從上顎切齒 中採集的正常牙髓組織做對照。從切碎的牙髓組織中，使用TRIzoI(R)試劑(invitrogen) 分離全RNA，取2 μ g的RNA用ReverTra Ace- α (購於東洋紡，東京)進行逆轉錄。通過實 BiRT-PCRj^MLightCycler FastS tart DNAMaster SYBR Green I (Roche diagnostics, Pleasanton)對cDNA進行擴增。在95 "C，10秒、62 "C 15秒、72 "C 8秒條件下，以經 LightCycler FastStart DNA MasterSYBR Green I (Roche diagnostics, Mannheim)標記的 β-肌動蛋白(3-actin)、MMPl、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14、VEGF、CXCR4、SDFl 為 引物(如表1所示)，在LightCycler(Roche Diagnostics)中進行實時RT-PCR擴增。根 據GenBank中大鼠基因序列來設計引物。根據對解鏈曲線的分析和PCR產物的電泳結果， 來確認擴增片段的大小，另外，將各自的RT-PCR產物亞克隆至pGEM-Easy Vector (Τ載體) (Promega, Madison, WI，美國)上，在資料庫中確認基因序列，從而進行PCR產物特異性分 析。β-actin值標準化後，用與大鼠切齒牙髓正常組織的比值來表示各產物的表達量。結 果如圖6A和圖6B所示。基因名#5' ~ K' ^ !i —3*(bp)GenBankβ凋A蛋力Forward ReverseAAGTACCCCATTGAACACGG ATCACAATGCCAGTGGTACG257NM 一031144MMPIForward ReverseTTGATGGACCTGGAGGAAAC GGTACATCAAAGCCCCAATG192EU597482ΜΜΡ2forward ReverseGATGGCAAGGTGTGGTGTG AATCGGAAGTTCTTGGTGTAGG191NM.031054ΜΜΡ3Forward ReverseTGGCAGTGAAGAAGATGCTG GCTTCCCTGTCATCTTCAGC167NMJ 33523ΜΜΡ9Forward ReverseCGCTTGGATAACGAGTTCTCTC GCAGGAGGTCATAGGTCACG163NM.031055AfMPfOForward ReverseACCCCACTCACATTCTCCAG CATCGAAGTGAGCATCTCCA163NMJ 33514ΜΜΡ14Forward ReverseAGTCAGGGTCACCCACAAAG GGTATCCGTCCATCACTTGG204NM-031056VEGFForward ReverseCTACCTCCACCATGCCAAGT ACACAGGACGGCTTGAAGATt83NM.031836CXCR4Forward ReverseTCCGTGGCTGACCTCCTCTT CAGCTTCCTCGGCCTCTGGC210NM.022205SDFIForward ReverseGCTCTGCATCAGTGACGGTA TAATTTCGGGTCAATGCACA184NM.022177DsppForward ReverseGGAACCGCAGCACAGAATGA CACTGTTCCCCTGTGCGTTT199NM—012790濰意溶.解第Forward ReverseGGCGAGATGGTGGCAAGA GGAAGAGGCGGTAGTTAG163NM.OOt 106800表1在創傷產生後的0小時、12小時、M小時、48小時、72小時，利用real-timeRT_PCR 來分析 MMPl、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14、VEGF、SDFl、CXCR4mRNA 的表達情況。如圖 6A 所示， 在大鼠牙髓創傷的治癒過程中，MMP3mRNA的表達量在切斷牙髓M小時時開始上升，其表達 量是正常牙髓組織的9倍。MMP3 mRNA的表達量在切斷牙髓M小時時開始減少，其表達量 是正常牙髓組織的4倍，72小時後是正常牙髓組織的2倍。MMP9 mRNA的表達量在12小時 後為牙髓組織的2倍，其表達水平較低，但在牙髓創傷治癒過程中均維持此低水平表達。在 牙髓創傷的治癒過程中，MMP1、MMP2、MMP14/MTI-MMPmRNA的表達量與正常牙髓組織基本相 同，未見表達水平的變化。MMPlOmRNA在正常和創傷牙髓組織中均未表達。由此可見，MMP3 的表達情況與創傷治癒的關係最為密切。另一方面，如圖6B所示，VEGF的表達量在經治療處置後上升了 3. 5倍，M小時後， 上升了 5倍，然後其表達量開始減少，72小時後，其表達量與正常牙髓組織相同。SDFl在M 小時後開始上升以至表達高峰，其表達量是正常組織的3. 5倍，表達水平較低。SDFl配體的受體CXCR4的表達量在M小時後達到正常牙髓組織的3. 5倍。3.牙髓創傷模型中，MMP3、SDF1、CXCR4表達的局部性在處置牙髓M小時、72小時後，用4%的多聚甲醛固定液進行灌流固定，然後浸泡 固定過夜。過夜後用OCT複合物(購於sakura，東京)包埋，製作12μπι厚的冷凍切片，最 後置於 APS Coated slide 上(Matsunami Glass ，大阪)。對 CXCR4 和 MMP3、MMP3 和 BSl-血凝素分別進行免疫螢光雙重染色。將切片置於2%的H2A中反應20min，以消除內源性過氧化物酶的活性，再加入 10mg/ml blocking reagent (Invitrogen corporation, carlsbad，CA, USA)在室溫下反 應1小時以消除非特異性反應，然後加入溶於Cangent 1 buffer (東洋紡，大阪)中的一 抗羊抗大鼠CXCR4 (Santa cruze、Santa Cruz，CA) (1 50)，室溫反應1小時。反應完成 後，用PBT(PBS，0. 05% Tween20, ρΗ7· 4)洗滌3次，再加入Alexa488標記的二抗兔抗羊 IgG(Invitrogen) (1 200)，室溫下反應1小時。反應完成後，用PBT洗滌3次，最後將切 片置於一抗小鼠抗大鼠MMP3中(第一化學，富山)(0.5 48/!111)，41過夜。過夜後，用PBT 洗滌3次，再加入HRP標記的羊抗小鼠IgG，室溫下反應1小時。反應結束後，用lOng/ml的 Hoechst 33342 (Sigma,St. Louis,MO,USA)細胞核染色 lOmin，最後用封片劑 prolong Gold antifade reagent (Invitrogen)封片。如圖 7D-圖 71 所示。為進一步研究MMP3與血管之間的關係，將冷凍切片置於20μ g/ml的proteinase K (Invitrogen)中，室溫下反應6min，反應結束後用PBS洗滌3次，再用20 μ g/ml的 Fluorescein Griffonia(Bandeiraea)染色，染色完成後將切片置於 Simplicifolia lectin(BSl-lectin、vector laboratories, Burlingame, CA)中反應 15min。上面的 BSl-Iectin是用於對血管內皮細胞和血管內皮前體細胞進行染色。反應結束後，用PBS洗 滌3次，再按照所述方法對MMP3進行螢光染色。陰性對照只使用一抗和二抗。結果如圖 7A-圖7C所示。在切斷活髓後，MMP3和CXCR4均未表達。圖7J是活髓切斷M小時後的牙髓創傷 面，經HE染色後的情況。圖7K是活髓切斷M小時後，牙髓斷面下新生毛細血管和新生大 血管經HE染色後的情況。圖7L是活髓切斷72小時後，新生毛細血管和新生大血管經HE 染色後的情況。MV表示新生毛細血管，LV表示新生大血管。圖7A為活髓切斷M新生後，對MMP3及BSl-Iectin進行免疫螢光雙重染色後 MMP3的圖片。圖7B為活髓切斷M小時後，對MMP3及BSl-Iectin進行免疫螢光雙重染色 後BSl-Iectin的圖片。圖7C為活髓切斷M小時後，對MMP3及BSl-Iectin進行免疫螢光 雙重染色後，經Merge處理的圖片。如圖7A-圖7C所示，活髓切斷M小時後，在牙髓創面 下，通過BSl-Iectin染色可見新生毛細血管和新生大血管已延伸至血管內皮細胞和血管 內皮前體細胞，且在新生血管周圍表達有MMP3。圖7D為活髓切斷M小時，MMP3和CXCR4經免疫螢光雙重染色後，MMP3的表達情 況。圖7E為活髓切斷M小時時，MMP3和CXCR4經免疫螢光雙重染色後，CXCR4的表達情 況。圖7F為活髓切斷M小時時，MMP3和CXCR4經免疫螢光雙重染色後，經Merge處理的 圖片。圖7G為MMP3和CXCR4經免疫螢光雙重染色後，MMP3的放大圖像。圖71為MMP3和 CXCR4經免疫螢光雙重染色後，經Merge處理的圖片。CXCR4是SDFl配體的受體，在幹細胞 中可表達，如圖7D-圖71所示，可見CXCR4靠近SDF1，表達具有局部性。在血管周圍可見MMP3和CXCR4的重複表達。圖7M為活髓切斷M小時後，經原位雜交，MMP3mRNA在血管內皮細胞和血管內皮 前體細胞中的表達情況。圖7N為活髓切斷72小時後，經原位雜交，MMP3 mRNA在血管內 皮細胞和血管內皮前體細胞中的表達情況。如圖M的箭頭所示，在活髓切斷M小時時，經 原位雜交，可見血管周圍MMP3 mRNA大量表達。如圖7N箭頭所示，在活髓切斷72小時時， MMP3 mRNA的表達量減弱。由此可見，牙髓幹細胞遷移至牙髓創傷處，定居在血管周圍，分泌 MMP3，通過旁分泌(paracrine)作用於血管內皮細胞，促進新生血管的形成。(應用實例2 MMP3在體外對血管內皮細胞和牙髓細胞的作用)1.MMP3促進血管內皮細胞增殖的作用將1000個源於人臍帶血的血管內皮細胞(human umbilical vein endothelialcells、HUVECs) (kurabo公司、大阪)接種至96孔細胞培養板上，在各種 EBM2 (cambrex Bio Science ffalkersville, Inc. ,ffalkersville,MD,USA)中培養(EBM2 中 可分另Ij添力口 MMP3 (50ng/ml、Chemicon，Temecula, CA)、NNGH (N-IsobutyI-N- (4-methoxyphe nylsulfonyl)) -glycylhydroxamic Acid) 0. 13 μ m, Biomol, Plymouth Meeting, PA)、MMP3 和 NNGH、MMPlO (50ng/ml, R&Dsystems, Minneapolis, MN)等共 4 種 EBM2)。添加 10 μ 1 的 Tetra-color one (Seikagaku Kogyo, Co.，東京)後，分別於 2，12，24，36，48，60 小時測定 450nm處的吸光度。未接種細胞的孔值做對照。圖8A為體外，MMP3促進血管內皮細胞增殖情況的圖片。圖8B為體外，MMP3促進 血管內皮細胞遷移情況的圖片。圖8C為體外，MMP3對血管內皮細胞的抗凋亡作用的圖片。 如圖8A所示，添加MMP3後，可促進血管內皮細胞(HUVEC)的增殖。在MMP3添加組中，活髓 切斷48小時的增殖效果與添加2小時進行比較，前者增加了約10倍。在未添加MMP3組中， 活髓切斷48小時的增殖效果與切斷2小時比較，約增加了 5倍。所述數值均具有統計學差 異(P < 0. 01)。另一方面，同時添加NNGH(MMP3的特異抑制劑)時，在各個時間點上，MMP3 刺激細胞增殖的活性均被抑制。添加NNGH組的增殖效果與未添加MMP3組進行比較，結果 顯示二者幾乎無差異。另外，MMP3對HUVEC的增殖促進作用與添加VEGF-A(50ng/ml)組基 本相同。2. MMP3對血管內皮細胞的遷移促進作用在24 孔 PET 膜(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)上，37°C條件下，進行 24 小 時的Modified Boyden Chamber 實驗。分別在 10ng/ml 的MMP3 或 100ng/ml 的MMP3 或 IOOng/ ml 的 MMP3 與 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 MMPlO 或 50ng/ml 的 MMPlO 和 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50 μ g/ml 的 VEGF-A 存在下，將 5 X IO4 的 HUVEC 置於 Chamber 的上部進行培養。0. 02%小牛血清白蛋白(Sigma)做對照。培養完成後，使用胰蛋白酶剝離 遷移至filter下部的HUVEC並進行細胞計數。用橡膠刮刀(Scraper)的將殘留在filter 上部未遷移的細胞刮掉。實驗數據用4個樣品的平均值士SD來表示。結果如圖8B所示。如圖8B所示，在lOng/ml水平下，MMP3對HUVE的遷移促進作用與對照組比較無 統計學差異。在lOOng/ml水平下，MMP3的遷移促進作用是對照組的3. 5倍且有統計學差 異(P < 0. 01)。100ng/ml的VEGF對細胞遷移的促進作用約為對照組的2倍且有統計學差 異(ρ <0.01)。也就是說，MMP3具有濃度依賴性，確實具有遷移促進作用。另外，若在添加 MMP3的同時添加NNGH，其促進遷移作用受到抑制。
3. MMP3對血管內皮細胞凋亡的抑制作用為研究MMP3的凋亡抑制作用，將HUVEC置於EGM2中，用；35_ dish培養3天， 接著在分別加有 50ng/ml 的 MMP3 或 50ng/ml 的 MMP3 和 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 MMPlO 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 VEGF-A 的 EBM-2 中添加 IOOnM 的星型胞 菌素(staurosporine) (Sigma)，誘導細胞凋亡。NNGH在添加MMP3的30min前加入。在 Stauroporine存在下，未添加任何成分的EBM-2中培養的細胞做對照。4小時後，剝離 HUVEC，在所得細胞懸液中加入 Annexin V-FITC (Roche)和 Propidium Iodide(Sigma)作用 15min，然後使用flow cytometer JSAN(Bay Bioscience，神戶)測定壞死和凋亡細胞的比 例。每個數據測量3次，取典型數據作為實驗結果如圖8C所示。如圖8C所示，HUVEC中加入IOOnM的Mauroporine誘導細胞凋亡4小時後，52 %的 細胞出現凋亡現象。同時添加Mauroporine與MMP3時，凋亡細胞的比例減少至20%，與添 加VEGF-A的結果相同，均出現了凋亡抑制現象。同時添加NNGH時，其抑制凋亡的作用受到 抑制。MMP10/Stromelysin-2 是MMP3 的異構體。如圖 8A-圖 8C 所示，MMP10/^tromelysin_2 實驗組中未觀察到MMP3實驗組中所見的細胞增殖、細胞遷移、凋亡抑制現象。4. MMP3誘導牙髓細胞分化為成齒質細胞的功能從大鼠上顎切齒中，用酶解法(胰蛋白酶和膠原酶)分離得到的牙髓細胞，在含 有 100 單位 /ml 的 penicillin G> 100 μ g/ml 的 dtreptomycin (Invtrogen, Carlsbad, CA, USA) >50 μ g/ml 的 Magnesium ascorbyl phosphate (禾口光純藥)禾口 10% (v/v)小牛白血i青 (SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas, USA)的 DMEM(Sigma，St. Louis，M0，USA)中培養。二 次傳代細胞鋪滿(confluent)後，添加 100ng/ml 的 MMP3 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 和 50ng/ml 的重組人BMP2。14天或21天後，提取RNA，使用Real time RT-PCR來分析成齒質細胞的分 化標誌、Dentin Sialophosphotein (Dspp)及 enamelysin 的表達情況(如表 1 所示)。所 述物質的表達量，用標準β-actin值η與大鼠第二代牙髓細胞鋪滿(confluent)時的比值 來表示。添加MMP3實驗組與對照組比較，14天和21天後，均未觀察到細胞分化為成齒質細 胞的現象。因此，根據所述實驗結果，在大鼠牙髓創傷治癒過程中，MMP3可促進血管內皮細 胞 血管內皮前體細胞向創傷局部遷移、增殖、抗凋亡，同時在血管新生、象牙質及牙髓再生 過程中可能發揮作用。(應用實例3在大鼠及狗活髓切斷模型中，體內MMP3對象牙質 牙髓再生促進作 用)1.在大鼠活髓切斷模型中添加MMP3切斷大鼠上顎切齒，用生理鹽水清洗斷面，在明膠(gelafusal)內添加50ng的 MMP3,然後用於斷面的牙髓表面上。將50ng的MMP3及30nmol的NNGH加至明膠上，用 於斷面牙髓的表面作為實驗對照。最後將粘合劑塗布於表面，再用光聚合型composite resin (Unifillow flow、GC、東京)暫封。接著分別於M小時、72小時、7天後製作5 μ m 厚的石蠟切片，然後做HE染色或馬松三色染色，進行形態學觀察。新生血管的定量檢測 如下取4顆牙齒分別製作40張切片，經MMP3及PBS處理M小時後，每顆牙齒選取5張 切片用 FluoresceinGriffonia (Bandeirase) Simplicifolia lectin (BSl-Iectin)染色。 在每顆牙齒的5張切片的斷面下方的牙髓組織上，選取面積為0. Imm2的矩形區域。使用KeyenceBZ-9000螢光顯微鏡(Keyence，東京)的BZ-II Anaalyzer (Keyence)軟體對總面積 為1. 5mm2的lectin陽性區域進行定量分析。實驗數據用4顆牙齒所得數據的平均值士SD 來表示。為研究MMP3對細胞增殖的促進作用，通過PCNA(proliferating Cell Nuclear Antigen)法，進行免疫組化分析。將切斷牙髓M小時後製作的石蠟切片進行脫蠟處理，按 照標準操作方法，使用抗原修復液(vectorlaboratories，Burlingame, CA)進行抗原修復。 同時需封閉內源性過氧化物酶活性及非特異性染色。切片中加入抗PCNA抗體(Dako)，4°C 孵育過夜，抗PCNA抗體使用時需用抗體稀釋液進行1 100稀釋。孵育過夜後加入過氧 化物酶標記的二抗(ImmPRESS reagent ；Vector Laboratories)室溫孵育 30min。用 DBA Liquid System顯色後，再用蘇木精進行對比染色，然後用Olympus Vanox-s顯微鏡(購於 Olympus公司，東京)拍照。增殖細胞的定量分析方法如下用MMP3和PBS處理M小時後， 從每個牙齒的3張石蠟切片斷面下方的牙髓組織上部，取3個面積為0. Imm2的矩形區域。 對染色陽性細胞進行細胞計數、定量分析。細胞外基質的定量分析如下分別取4顆切齒 的5張切片，經MMP3、NNGH、PBS處理，7天後，進行馬松三色染色。在陽性區域中，對斷面下 Ornm深)的上部牙髓組織，用BZ-II Analyzer軟體進行定量分析。實驗數據用4顆牙齒的 平均值士 SD來表示。通過實驗來驗證MMP3在機體內是否能誘導牙髓創傷部位產生新生血管。在大鼠 切齒牙髓處分別加入MMP3、MMP3與NNGH，PBS為陰性對照。圖9A為大鼠活髓切斷後加入 MMP3,24小時後再經BSl-Iectin染色後的圖片。圖9B為大鼠活髓切斷後未使用MMP3J4 小時後，再經BSl-Iectin染色後的圖片。添加MMP3的實驗組與未使用MMP3組進行比較， 在M小時後經BSl-Iectin染色，牙髓斷面下形成了大量的新生血管。圖9C為大鼠活髓斷面下的上方牙髓組織，通過使用MMP3使其血管密度增加的定 量顯示圖。如圖9C所示，MMP3使用組與PBS對照組比較，其新生血管的密度增加了 2倍並 有統計學差異。圖9D為大鼠活髓切斷處加入MMP3 24小時後，PCNA的免疫染色圖片。圖9E為 大鼠活髓切斷後未使用時後，PCNA的免疫染色圖片。MMP3使用組細胞密度為 98. 5cells/mm2士 17. 7，MMP 3 未使用組(PBS 對照組)為 36. Ocells/mm2士 14. 1。也就是說， MMP3使用組與PBS對照組比較，在其創面下牙髓組織中，PCNA染色陽性的增殖細胞是對照 組的2. 7倍。另外，在其斷面下方可觀察到大量的PCNA染色陽性細胞。圖9F為大鼠活髓切斷處加入MMP3 72小時後的HE染色圖片。圖9G為大鼠活髓 切斷處未使用MMP3，72小時後的HE染色圖片。如上圖所示，MMP3使用組與未使用組比較， 前者已形成了大量的骨樣象牙質。2組均未出現炎症性細胞浸潤。圖9H為大鼠活髓切斷處加入MMP3 72小時後，經馬松三色染色的圖片。如圖9H 所示，72小時後，在MMP3使用組中，新分化的成齒質細胞/骨樣成齒質細胞周圍可觀察到骨 樣象牙質的形成。圖91為大鼠活髓切斷處加入MMP3 72小時後，原位雜交的圖片。如圖91所示，原 位雜交圖片顯示，在骨樣象牙質基質周圍新近分化的成齒質細胞/骨樣成齒質細胞中已有 DSPP mRNA的表達。圖9J為大鼠活髓齒切斷72小時後，未添加MMP3，經馬松染色的染色圖。如圖9J 所示，PBS添加組及MMP3周圍觀察不到成齒質細胞/骨樣成齒質細胞。
圖9K為大鼠活髓切斷72小時後，添加MMP3及NNGH，經馬松染色的染色圖。如圖 9K所示，MMP3及NNGH添加組周圍觀察不到成齒質細胞/骨樣成齒質細胞。圖9L為大鼠活髓切斷後未加入MMP37天後經馬松三色染色的圖片。如圖9L所示， 未使用MMP3組(PBS對照組)未觀察到成齒質細胞/骨樣成齒質細胞。圖9M為大鼠活髓切斷後加入MMP3和NNGH 7天後經馬松三色染色的圖片。如圖 9M所示，在使用MMP3和NNGH組中，未見成齒質細胞/骨樣成齒質細胞的形成。圖9N為大鼠活髓切斷後加入MMP3和NNGH 72小時後，膠原蛋白基質增加情況的 圖片。如圖9N所示，72小時後，在 斷面下象牙質基質的形成方面，MMP3使用組與PBS對照 組比較，前者增加了 3. 8倍並具有統計學差異(P < 0. 01)。圖90為大鼠活髓切斷後加入MMP3 7天後，膠原蛋白基質增加情況的圖片。如 圖90所示，NNGH添加組與PBS對照組比較，象牙質基質形成受到抑制且有統計學差異(*P < 0. 01)。所述現象可能是由於MMP3可促進修復性象牙質的形成，後者又會促進新生血管 的形成，而不能直接促進成齒質細胞的分化。2.在狗活髓切斷模型中加入MMP3的情況將狗上顎臼齒活髓切斷後，用5%的亞氯酸鈉和3%過氧化氫交替清洗斷面後再 用生理鹽水清洗斷面，把加有IOOng MMP3的明膠塗於牙髓斷面上。接著填充磷酸粘固粉， 再將粘合劑塗布於表面，最後用光聚合型composite resin暫封。14天後拔牙，在4%多聚 甲醛固定液中4°C浸泡、過夜固定後，4°C下在10%蟻酸中脫鈣1周。製作標本縱斷面5μπι 厚的石蠟切片，經HE染色後在光學顯微鏡下觀察象牙質的形成情況，結果如圖IOA-圖IOE 所示。圖IOA為狗上顎臼齒活髓切斷後添加ΜΜΡ3，第14天時，顯示修復性象牙質(tertiary dentin)形成的顯微照片。OD代表骨樣象牙質。圖IOB為狗上顎臼齒活髓切斷後添加MMP3， 第14天時修復性象牙質形成的高倍顯微照片。圖IOC為狗上顎臼齒活髓切斷後添加MMP3， 第14天時修復性象牙質形成的超高倍顯微照片。圖IOD為狗上顎白齒活髓切斷後PBS控 制時第14天時的顯微照片。圖IOE為狗上顎臼齒活髓切斷後加入PBS控制時第14天時的 高倍顯微照片。如圖IOA-圖IOC所示，在MMP3添加組中，牙髓斷面附近可見大量增殖細胞，其上 部可見大量修復性象牙質的形成。可是在PBS對照組中，如圖IOD和圖IOE所示，未見修復 性象牙質的形成。(應用實例4在狗牙髓炎模型中，象牙質·牙髓的再生)將發生牙髓炎的狗上顎白齒活髓切斷後，把棉球置於牙髓斷面上，在開放狀態下 放置M小時。接著用5%亞鹽酸納溶液和3%的過氧化氫溶液交替清洗牙髓斷面，然後用 生理鹽水清洗，洗淨後，把加有100ngMMP3的明膠塗於牙髓斷面上。接著填充磷酸粘固粉， 再將粘合劑塗布於表面，最後用光聚合型composite resin暫封。14天後拔牙，4°C浸泡固 定過夜，4°C下在10%蟻酸中脫鈣1周。脫鈣完成後，製作5μπι厚的石蠟切片、進行HE染 色，最後在光學顯微鏡下觀察修復性象牙質的形成情況，結果如圖IlA-圖IlD所示。圖IlA 為在患有牙髓炎的狗上顎臼齒中加入ΜΜΡ3，14天後，顯示炎症治癒情況的顯微照片。圖IlB 為患有牙髓炎的狗上顎臼齒中加入ΜΜΡ3，14天後，顯示炎症治癒情況的高倍顯微照片。圖 IlC為患有牙髓炎的狗上顎臼齒中PBS控制時14天後的顯微照片。圖IlD為患有牙髓炎的 狗上顎臼齒中PBS控制時14天後的高倍顯微照片。
如圖IlA和圖IlB所示，在MMP3添加組中，牙髓的炎症程度非常輕，在牙髓斷面附 近可見細胞增殖，同時MMP3還促進了新生血管的形成。另外，還可觀察到一些修復性象牙 質的形成。而在PBS對照組中，如圖IlC和圖IlD所示，炎症情況未見好轉。因此，本發明提 供的藥劑和牙科材料不僅具有促進損傷牙髓再生的功效，同時對牙髓炎還具有抗消炎、鎮 靜作用，促進新生血管的形成以及牙髓再生的作用。牙髓出現創傷與牙髓炎出現炎症是兩 種不同的狀態。在創傷(機械性創傷)治療時不會發生感染，局部炎症細胞浸潤一旦開始， 創傷組織則趨向治癒。另一方面，由牙髓炎引起的炎症具有感染症狀，為排除機體異物，機 體的免疫防禦系統被啟動，根據感染物質的質和量，引發了以嗜中性粒細胞、巨噬細胞為首 的炎症性細胞浸潤。牙髓組織的血管處於擴張狀態，毛細血管的通透性增加。毛細血管通 透性的增加，血液成分會滲出(炎症性滲出)，結果引起間質壓力增高。進而，免疫細胞產生 的炎症介質、蛋白酶組成一個複雜的網絡，引起進一步的炎症惡化及組織壞死。在牙髓因創 傷產生的炎症和牙髓炎引起的炎症二種情況下，二者炎症性介質的表達情況是不同的。(應 用實例5 穴加工矽酮膜的成齒質細胞的分化)將機體親和性高、具有氧透過性的矽酮(silicone)膜的表面進行等離子化 (plasma)處理，在其表面製成寬7 μ m、深7 μ m、節距(pitch) 20 μ m的小孔(參照圖IA 圖1C)，然後進行膠原蛋白塗層(Collagen Coat)處理。將源於豬牙髓的⑶31_ ;OT146_SP 細胞高密度地吸附於矽酮膜上，然後在含有10%小牛血清、50yg/ml的抗壞血酸的 Dy lbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM)培養基培養12小時。培養後的細胞形態如 圖12A所示。圖12A為附著在凹面矽酮膜載體上的源於豬的⑶31_;⑶146_SP細胞，培養12 小時後，相差顯微鏡觀察的照片。培養完成後，在Container中注滿培養基，使用氟樹脂封 閉，然後從外部對膜表面進行單方向垂直加壓，加壓時，弱加壓操作(引起弱壓力刺激)與 強加壓操作(引起強壓刺激)分別進行6小時，弱加壓操作和強加壓操作的頻率分別為每 分鐘加壓6次和每分鐘加壓10次以上。另外，牙髓⑶3Γ ；⑶146—SP細胞的採集方法如下將豬牙髓組織摘除後利用膠 原酶解法(Nakashima M. Archs oral Biol. 36 (9)，655-663，1991)酶解、分離細胞。細胞 分離後，用流式細胞儀，通過⑶31和⑶146抗體從強烈排出Hoechst 33342的組分(Side Population(SP))中分選出CD31_ ;CD146_SP細胞。分選後的細胞接種至coated collagen dish 上，在添加 10 % 小牛血清、insulin-likegrowth factor-1 (IGF-I)和 Epidermal Growth factor (EGF)的 EBM2 培養基中培養。圖12B為培養2天後，顯示β -actin、Dspp、Enamelysin的mRNA表達情況 的圖片。如圖12B所示，培養2天時，膜上的細胞排列緊密，Enamelysin和Dentin sialophosphoprotein (Dspp)等的mRNA已表達，已分化誘導為成齒質細胞。尤其是經弱加 壓刺激處理過的細胞，能有效地對其進行分化誘導。產業利用價值本發明具有很好的消炎鎮靜作用，對於發生炎症齲齒的牙髓炎也具有能適當恢復 牙髓功能的作用。另外，因本發明具有很好的促進血管新生、牙髓再生及象牙質形成作用， 所以，完全可以用於創傷性象牙質的治療、修復領域。
權利要求
1.一種用於治療牙髓炎和/或促進象牙質形成的藥劑，其特徵在於，含有有效成分，其 中，該有效成分至少含有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白酶-3前 體蛋白中的任意一種。
2.如權利要求1所述的藥劑，其特徵在於，有效成分的含量比例為12ng/ml IOOOng/ ml，其中，該有效成分至少含有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白 酶-3前體蛋白中的任意一種。
3.一種牙科材料，其特徵在於，含有有效成分，其中，該有效成分至少包括具有基質金 屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種。
4.如權利要求3所述的牙科材料，其特徵在於，含有機體親和性載體。
5.如權利要求4所述的牙科材料，其特徵在於，上述載體的一側縱向排列多個同一指 向的凹形結構，此載體系由氧透過性及/或物質透過性的材料製成的膜狀載體。
6.如權利要求4所述的牙科材料，其特徵在於，所述載體至少含有下列中的任意一種 膠原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、明膠、水凝膠、纖維素、磷酸膽鹼、透明質酸、幾丁 質、氨基葡萄糖、纖連蛋白、海藻酸、硫酸乙醯肝素、肝素、層粘連蛋白、磷酸鈣、羥基磷灰石、 β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、DL-聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、多晶矽、聚已酸 內酯、碳酸鈣、鈦、金、陶瓷、矽樹脂、以及矽水凝膠。
7.如權利要求3所述的牙科材料，其特徵在於，至少還含有牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙 髓前體細胞、可分化為牙髓細胞的細胞、成齒質細胞以及可分化為成齒質細胞的細胞中的 任意一種。
8.如權利要求7所述的牙科材料，其特徵在於，細胞含量在1X IO3個/ μ 1 1 X IO6個 /μ ι之間，其中，該細胞至少含有所述牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞、可分化為牙髓 細胞的細胞、成齒質細胞以及可分化為成齒質細胞的細胞中的任意一種。
9.如權利要求3所述的牙科材料，其特徵在於，還含有血管內皮細胞或血管內皮前體 細胞。
10.如權利要求3所述的牙科材料，其特徵在於，還含有上皮細胞。
11.如權利要求3所述的牙科材料，其特徵在於，還含有象牙質基質。
12.如權利要求3所述的牙科材料，其特徵在於，有效成分的含量比例為12ng/ml lOOOng/ml，其中，該有效成分至少含有具有基質金屬蛋白酶-3活性的蛋白質以及基質金 屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種。
13.如權利要求7所述的牙科材料，其特徵在於，所述牙髓幹細胞至少包含牙髓SP細 胞、⑶3Γ ；⑶146-SP細胞、⑶M+細胞、⑶105+細胞、⑶150+細胞中的任意一種。
14.一種用於治療牙髓炎以及/或促進象牙質形成的藥劑的有效成分的篩選方法，在 牙髓幹細胞或血管內皮細胞中添加被檢驗化合物，然後測定牙髓幹細胞或血管內皮細胞中 的基質金屬蛋白酶-3編碼基因的表達量；牙髓幹細胞或血管內皮細胞中沒有添加被檢驗 化合物時，測定基質金屬蛋白酶-3編碼基因的表達量；將兩者基質金屬蛋白酶-3編碼基因 的表達量進行比較，以將基質金屬蛋白酶-3編碼基因表現量所增加的被檢驗化合物作為 所述藥劑的有效成分進行選擇。
全文摘要
本發明提供了一種用於治療牙髓炎和/或促進象牙質形成的牙科材料。根據本發明的牙科材料至少含有具有基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase，MMP-3)活性的蛋白質以及基質金屬蛋白酶-3前體蛋白(即酶原)的任意一種；另外，根據本發明的牙科材料含有機體親和性載體；根據本發明的牙科材料中至少含有牙髓細胞、牙髓幹細胞、牙髓前體細胞、能分化為牙髓細胞的細胞、成齒質細胞(odontoblast)以及能分化為成齒質細胞的細胞的任意一種。
文檔編號G01N33/50GK102046194SQ20098011224
公開日2011年5月4日 申請日期2009年4月6日 優先權日2008年4月7日
發明者中島美砂子, 中村洋 申請人:獨立行政法人國立長壽醫療研究中心