用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法

2024-04-02 14:28:05 1

用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法
【專利摘要】一種聚氨酯多孔膜，其由簡單方法製成，以用於細胞培養和癌細胞生長抑制中的至少一種應用。用於細胞培養和癌細胞生長抑制中的至少一種應用的聚氨酯膜的製造方法包括：第一步驟，在基材上形成未固化的聚氨酯材料層；以及第二步驟，向形成於基材的聚氨酯材料層中遠離基材的暴露表面供給水蒸汽，從而使聚氨酯材料固化，並且使聚氨酯材料層具有這樣的多孔結構：其具有位於暴露表面上的多個凹凸體。
【專利說明】用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求享有2013年7月9日提交的日本專利申請P2013-143371和2014年5月14日提交的日本專利申請P2014-104225的優先權，這兩件申請的全部內容在此以引用方式併入本文。

【技術領域】
[0003]本發明涉及一種用於細胞培養和癌細胞生長抑制的至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法。

【背景技術】
[0004]作為可用於包括藥物發現和再生醫學在內的多種領域的技術，細胞培養技術近來受到了關注。將作為細胞支架(cell scaffold)的基材(substrate)用於貼壁依賴性細胞的培養。關於細胞培養所使用的基材，如本領域已知的，基材表面上的微小物理結構以及化學性質很重要。已知基材之一是這樣一種基材，其由聚合物材料製成，並且在表面上具有微小的凹凸體。可以採用多種技術來提供帶有微小凹凸體的、由聚合物材料製成的基材，例如，縮合技術、納米壓印技術、光刻或乳膠技術(例如，JP2009-242495A)。


【發明內容】

[0005]然而，細胞培養基材的現有生產方法都是相當複雜的，並且需要許多步驟，因此難以降低製造成本。另外，現有技術方法通常難以製備具有貫通至下表面的孔的多孔膜。在細胞培養使用具有通孔的多孔膜的情況下，多孔膜的上表面和下表面二者都能用於細胞培養。例如，在上前表面和下表面上可以培養不同類型的細胞。這會擴大細胞培養技術的應用。為此目的，需要開發一種具有通孔的細胞培養片材。尤其是，尚未有已知的方法來製備具有孔徑小於10微米的通孔的細胞培養用多孔膜。由於標準細胞尺寸為大約10微米，希望使用具有孔徑小於10微米的通孔的多孔膜，以允許對不同類型細胞之間的相互作用進行分析。因此，需要開發具有孔徑小於10微米的通孔的多孔膜。
[0006]已知的是，一些在其上表面上形成有微小凹凸體的多孔膜對細胞生長抑制是有效果的(例如，JP2005-152526A)。希望對癌細胞生長抑制具有效果(作為對細胞生長抑制的效果的一個例子)的多孔膜能夠用於癌症治療，用於抑制癌症復發或癌症轉移，或者用於癌症研究。因此，需要通過簡單的製造工藝來生產具有這種對細胞生長抑制效果的多孔膜。
[0007]為了解決上述問題中的至少一部分，通過以下方面和實施方式完成了本發明。
[0008](I)根據一個方面，提供了一種用於細胞培養和癌細胞生長抑制中的至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法。這種聚氨酯多孔膜的製備方法包括:第一步驟，在基材上形成未固化的聚氨酯材料層；以及第二步驟，向形成於基材上的聚氨酯材料層中遠離基材的暴露表面供給水蒸汽，以使聚氨酯材料固化，並且向聚氨酯材料層提供具有位於暴露表面上的多個凹凸體的多孔結構。
[0009]根據本方面的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法，該方法通過向聚氨酯材料層供給水蒸汽這樣的簡單工藝，製備了用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。這有利地降低了聚氨酯多孔膜的製造成本。
[0010](2)根據(I)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜製備方法的一個實施方案，在第二步驟中所提供的聚氨酯多孔膜的多孔結構可以包括向暴露表面開放的多個孔，並且僅有單一的孔沿聚氨酯多孔膜的膜厚度方向存在。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法能夠製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。
[0011](3)根據(2)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜製備方法的另一實施方案，聚氨酯多孔膜可以具有0.1?100微米的厚度。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法，使得能夠製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。
[0012](4)根據(3)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜製備方法的另一實施方案，通過對條件進行調節，可以將聚氨酯多孔膜的厚度控制到0.1?100微米，所述條件選自:第一步驟中形成為層的聚氨酯材料的組成，第二步驟中的反應溫度，以及第二步驟中的反應時間。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法能夠容易地製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。
[0013](5)根據(2)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法的另一實施方案，聚氨酯多孔膜在暴露表面上可以具有0.1?100微米的平均孔徑。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法能夠製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。
[0014](6)根據(5)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法的另一實施方案，通過對條件進行調節，可以將聚氨酯多孔膜的暴露表面上的平均孔徑控制到0.1?100微米，所述條件選自:第二步驟中的反應溫度、第二步驟中的反應時間、以及第二步驟中供給至暴露表面的水蒸汽的量。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法能夠容易地製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。
[0015](7)根據(I)?(6)中任意一項所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法的另一實施方案，第二步驟中提供的多孔結構可以包括朝向暴露表面開口的多個孔，以及，所述多個孔中的至少一部分形成為貫通至聚氨酯材料層與基材相鄰的表面的孔。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法能夠製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。這也提供了一種兩個表面都能用作細胞培養支架的聚氨酯多孔膜。使用這樣的聚氨酯多孔膜能夠進行這樣的細胞培養，提供在各自表面上所培養細胞之間的相互作用。
[0016](8)根據(7)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法的另一實施方案，通過對條件進行調節，可以使多個孔中的至少一部分成為貫通至聚氨酯材料層與基材相鄰的表面的孔，所述條件選自:第一步驟中形成為層的聚氨酯材料的組成、第二步驟中的反應溫度、以及第二步驟中的反應時間。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法能夠製備適合於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。這也提供了兩個表面都能用作細胞培養支架的聚氨酯多孔膜。使用這樣的聚氨酯多孔膜能夠進行這樣的細胞培養，提供在各自表面所培養細胞之間的相互作用。
[0017](9)根據(7)所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法的另一實施方案，第一步驟可以包括:混合步驟，將至少包括多元醇和異氰酸酯的聚氨酯材料混合；以及層形成步驟，將在混合步驟中所混合的聚氨酯材料形成為層。通過對條件進行調節，可以使多個孔中的至少一部分成為貫通至聚氨酯材料層與基材相鄰的表面的孔，所述條件選自:混合步驟與層形成步驟之間的時間，以及，混合步驟與層形成步驟之間時聚氨酯材料的環境溫度。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法能夠製備適合於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜。
[0018](10)根據⑴?(9)中任意一項所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法的另一實施方案。所述聚氨酯多孔膜的製備方法可以進一步包括第三步驟，在第二步驟之後進行，停止水蒸汽的供給，進一步固化聚氨酯材料。根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法提供了這樣的聚氨酯多孔膜:其在暴露表面上具有較小的平均孔徑，並且朝向暴露表面開口的孔的孔徑的變化較小。
[0019](11)根據另一方面，提供了一種通過⑴?(10)中任意一項所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法而製備的聚氨酯多孔膜。所述聚氨酯多孔膜具有第一表面以及與該第一表面相對的第二表面，並且具有包括多個孔的多孔結構。各孔朝向第一表面開口，並且具有朝向所述第二表面凸起的彎曲內壁面。所述多個孔中的至少一部分可以是貫通至第二表面的孔。
[0020]還可以通過除上述製備方法之外的其他方面實現本發明:例如，通過用於製備適於培養細胞和癌細胞生長中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的方法而製備的聚氨酯多孔膜，以及，用於製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的聚氨酯材料組成的確定方法。
[0021]本發明的用於製備適於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的方法，通過向聚氨酯材料層供給水蒸汽這樣簡單的工藝，生產聚氨酯多孔膜。這有利地降低了聚氨酯多孔膜的製造成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是示意性示出示例性聚氨酯多孔膜的結構的截面圖；
[0023]圖2是示意性示出另一示例性聚氨酯多孔膜的結構的截面圖；
[0024]圖3是示意性示出另一示例性聚氨酯多孔膜的結構的截面圖；
[0025]圖4是示出聚氨酯多孔膜的製備方法的流程圖；
[0026]圖5是圖示在基材上形成聚氨酯材料層的工藝的圖；
[0027]圖6是圖示隨著供給水蒸汽使聚氨酯固化的工藝的圖；
[0028]圖7是示出聚氨酯多孔膜另一製備方法的流程圖；
[0029]圖8是示出聚氨酯膜的材料組成以及固化條件的圖表；
[0030]圖9是示出聚氨酯膜的觀察結果的圖表；
[0031]圖10是示出聚氨酯膜的材料組成以及固化條件的圖表；
[0032]圖11是示出聚氨酯膜的觀察結果的圖表；
[0033]圖12是示出聚氨酯膜的材料組成以及固化條件的圖表；
[0034]圖13A和圖13B是示出聚氨酯膜的觀察結果的圖表；
[0035]圖14是示出聚氨酯膜的材料組成以及固化條件的圖表；
[0036]圖15A和圖15B是示出聚氨酯膜的觀察結果的圖表；
[0037]圖16A和圖16B是示出聚氨酯膜的材料組成和固化條件以及測量結果的圖表；
[0038]圖17是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0039]圖18是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0040]圖19是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0041]圖20是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0042]圖21是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0043]圖22是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0044]圖23是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0045]圖24是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0046]圖25是示出聚氨酯膜的觀察結果的照片；
[0047]圖26是示出聚氨酯膜的材料組成和固化條件以及測量結果的圖表；
[0048]圖27是示意性圖示細胞培養裝置的透視圖；
[0049]圖28是示出在聚氨酯多孔膜的兩個表面上進行細胞培養過程的圖；
[0050]圖29是示出將HUVEC接種於上表面的單側培養結果的照片；
[0051]圖30是示出將HUVEC接種於上表面的單側培養結果的照片；
[0052]圖31A和圖31B是示出雙側(上側和下側)培養結果的照片，將AoSMC接種於上表面，以及，將HUVEC接種於下表面；
[0053]圖32A和圖32B是示出雙側(上側和下側)培養結果的照片，將AoSMC接種於上表面，以及，將HUVEC接種於下表面；
[0054]圖33是示出聚氨酯膜的材料組成和固化條件以及測量結果的圖表；
[0055]圖34是示出培養T0V21G的細胞生長率的柱狀圖；以及
[0056]圖35是示出培養Caov3的細胞生長率的柱狀圖。

【具體實施方式】
[0057]A.聚氨酯多孔膜的結構
[0058]圖1是示意性圖示聚氨酯多孔膜10結構的截面圖，其作為通過本發明一個實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法製備的示例性膜。聚氨酯多孔膜10由聚氨酯製成，並且具有多個孔30。聚氨酯多孔膜具有作為第一表面的上表面22、以及作為第二表面的下表面24，其中，多個孔30全部朝向上表面22開口。孔30在上表面20上的平均孔徑是例如0.1?100微米。
[0059]如圖1中所示，僅有單一的孔30沿聚氨酯膜10的膜厚度方向設置。孔30的內壁通常形成為大致曲面。但是，孔30的內壁面並不必須是光滑表面，而是可以具有多個微小凹凸體。形成於孔30內壁面上的微小凹凸體是(例如)寬度不大於膜厚度的20%的凹凸體，或者，優選的是，寬度不大於膜厚度的10%的凹凸體。孔30朝向上表面22開口，並且具有朝向下表面24凸起的彎曲內壁面。更具體而言，隨著更靠近孔30中心軸，從下表面24至孔30的內壁面底部之間的距離逐漸減小，其中內壁面底部位於比上表面22更接近於下表面24 —側，所述孔30的中心軸是平行於聚氨酯多孔膜10的膜厚度方向的橫截面中的中心軸。圖1中，平行於聚氨酯多孔膜10膜厚度方向的橫截面中的孔30的中心軸表示為中心軸O。孔30的底部與下表面24之間的距離隨著越靠近此中心軸O而減小，這一情形由箭頭不出。
[0060]圖2是示意性圖示聚氨酯多孔膜110結構的截面圖，其作為通過本發明實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法而製備的另一示例性膜。在聚氨酯多孔膜110中，類似於聚氨酯多孔膜10的構成部分用相同的附圖標記表示，這裡不再具體描述。聚氨酯多孔膜110具有多個孔130，而不是多個孔30。孔130具有與孔30類似的形狀，但結構與孔30不同，不同之處在於多個孔130中的至少一部分貫通至下表面24。從下表面24至孔130底部之間的距離隨著與孔130中心軸的距離的減小而逐漸減小，並在孔130貫通到下表面24的位置處達到零，其中所述孔130的中心軸是平行於聚氨酯多孔膜110的膜厚度方向的橫截面中的中心軸。聚氨酯多孔膜110的上表面22上的孔130的平均孔徑為例如0.1?100微米。
[0061]圖3是示意性圖示聚氨酯多孔膜210結構的截面圖，其作為通過本發明實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法製備的又一示例性膜。在聚氨酯多孔膜210中，類似於聚氨酯多孔膜10的那些構成部分用相同的附圖標記表示，這裡不再具體描述。聚氨酯多孔膜210具有多個孔230，而不是多個孔30。孔230沒有確定的形狀。
[0062]如上所述，至少在上表面22上，通過本發明實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法製備的聚氨酯多孔膜可以具有與上述聚氨酯多孔膜10、110的凹凸體不同的凹凸體。在任意情況下，聚氨酯多孔膜的膜厚度為例如0.1?100微米。聚氨酯多孔膜的膜厚度表示:聚氨酯多孔膜上表面22所形成凹凸體中的凸起部最高位置與下表面24之間的距離(即:凸起部最高位置與基材之間的距離，這是因為，根據下文所述的實施方案，聚氨酯多孔膜是在基材上形成的)。在下文說明中，將這種膜厚度稱為「峰處膜厚度」。在下文說明中，將聚氨酯多孔膜上表面22之上所形成的凹凸體的凸起部最深位置與下表面24之間的距離(即凸起部的最深位置與基材之間的距離)稱為「谷處膜厚度」。就根據本發明實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法製備的膜而言，相比於峰處膜厚度，谷處膜厚度優選為不大於95%、更優選為不大於85%、還優選為不大於50%。谷處膜厚度可以等於0% (這意味著孔貫通了膜)。
[0063]通過用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察聚氨酯多孔膜的橫截面，確定聚氨酯多孔膜的峰處膜厚度和谷處膜厚度。例如，具體過程可以在聚氨酯多孔膜橫截面的SEM圖像中選擇三個可見區域，測量各可見區域中隨機選擇的五個不同部位處的膜厚度，計算各可見區域中測量值的平均值，以及確定各個可見區域平均值的中值(mean value) 0
[0064]通過用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察聚氨酯多孔膜的表面，確定聚氨酯多孔膜的平均孔徑。例如，具體的過程是:測量聚氨酯多孔膜表面的SEM圖像上在指定可見區域中觀察到的所有孔中的最大長度，並且確定測量值的平均值。最大長度表示外切於孔的矩形的側邊長度的最大值。
[0065]根據上述實施方案的聚氨酯多孔膜可以用作細胞培養基材，利用具有凹凸體的表面(例如，孔開口所在的上表面)來提供細胞培養支架。將本實施方案的聚氨酯多孔膜用作細胞培養支架這種應用的一個例子是細胞晶片(cell chip)應用，其中通過布置細胞或使細胞形成圖案以使細胞分布均衡從而使細胞響應穩定化。另一例子是在再生醫療領域中的應用，其中使用聚氨酯多孔膜作為細胞支架來製造假體組織，例如假體血管，用構成血管的細胞對其進行塗覆。
[0066]具有貫通至下表面的孔的聚氨酯多孔膜可以通過利用該膜的兩個表面來進行細胞培養。在這種情況下，在上表面和下表面上可以培養不同類型的細胞，並且可以評估不同類型細胞之間的相互作用。特別是，當貫通至下表面的孔的孔徑(平均孔徑)小於10微米(其為標準細胞尺寸)時，通過在允許物質(例如，來自各自細胞的分泌物)轉移的同時阻礙細胞在上表面和下表面之間進行遷移，能夠以更高的精確度具體地分析不同類型細胞之間的相互作用。
[0067]除了細胞培養應用之外或者作為替代方式，本實施方案的聚氨酯多孔膜可以用於癌細胞生長抑制的應用。例如，聚氨酯多孔膜可用於癌症治療，用於抑制癌症復發或癌症轉移，或用於癌症研究。在將聚氨酯多孔膜用於癌症治療或用於抑制癌症復發或癌症轉移的應用時，聚氨酯多孔膜優選具有孔30，這些孔30的底部遠離聚氨酯多孔膜的下表面24，如圖1中所示的聚氨酯多孔膜10。可以將聚氨酯多孔膜置於體內，使得具有凹凸體的上表面22與癌細胞相接觸，或者與所關注組織相接觸，以抑制癌細胞生長的目的。這抑制了癌細胞通過聚氨酯多孔膜中的通孔從上表面22向下表面24遷移。當將聚氨酯多孔膜用於如上所述癌細胞生長抑制的目的時，可以將抗癌藥附加地設置在聚氨酯多孔膜的上表面22和下表面24中的至少之一上。
[0068]B.聚氨酯多孔膜的製備方法
[0069]圖4是示出根據本發明實施方案的用於製備聚氨酯多孔膜方法的流程圖。所述聚氨酯多孔膜的製備方法首先提供未固化的聚氨酯材料(步驟S100)。聚氨酯材料包括多元醇或多羥基醇、異氰酸酯、以及稀釋溶劑。將構成聚氨酯材料的各成分混合的步驟對應於上述解決問題的方案中所述的「混合步驟」。
[0070]所使用的多元醇可以是已知的多元醇，並且是例如具有20?570羥基值的多元醇。多元醇的官能團數優選為兩個或更多，從而能夠繼續與異氰酸酯進行良好的反應。多元醇的官能團數優選為八個或更少，從而能夠使孔的形成反應順利進行。多元醇的數均分子量優選為不小於100，且優選為不小於1000，從而能夠保證聚氨酯多孔膜的柔韌性。多元醇的數均分子量還優選為不大於20000、更優選為不大於10000，從而能夠降低聚氨酯材料的粘度。多元醇的可用示例包括聚醚多元醇、聚合物多元醇、聚酯多元醇、丙烯酸系多元醇、以及聚碳酸酯多元醇。這些多元醇的任意一種可以單獨使用，或者可以將這些多元醇的兩種或兩種以上組合使用。其中，聚醚多元醇和聚合物多元優選適宜的；以及聚醚多元醇是尤其優選的。
[0071]所使用的聚醚多元醇可以是例如聚丙烯乙烯多元醇(polypropylene ethylenepolyol)和/或聚四亞甲基醚二醇。特別優選的是聚丙烯乙烯多元醇。優選使用的聚合物多元醇是通過在聚醚多元醇中聚合不飽和乙烯單體(如苯乙烯或丙烯腈)所產生的聚合物。
[0072]所使用的異氰酸酯可以是已知的異氰酸酯，並且是例如在分子末端含有15質量％?50質量％的異氰酸酯基(NCO)的異氰酸酯。更具體地，所使用的異氰酸酯可以選自例如芳族異氰酸酯以及脂肪族異氰酸酯。特別優選的是芳族異氰酸酯。芳族異氰酸酯的可用示例包括二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)、甲苯二異氰酸酯(TDI)以及它們的混合物。其中，二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)是優選的。
[0073]所使用的MDI可以是例如在一個分子中具有兩個異氰酸酯基團和兩個苯環的單體MD1、在一個分子中具有三個或更多異氰酸酯基團和三個或更多苯環的聚合MD1、或者其混合物。所使用的MDI並不局限於單體MDI和/或聚合MDI，但也可以是通過MDI與多元醇反應而得到的MDI預聚物。
[0074]使用稀釋溶劑來調節包括多元醇和異氰酸酯在內的材料的粘度，並且稀釋溶劑優選是基本上不與聚氨酯材料的其它組分發生反應的溶劑。稀釋溶劑還優選是能夠溶解多元醇和異氰酸酯以製備均質聚氨酯材料的溶劑。所使用的稀釋溶劑可以選自例如四氫呋喃、丙酮以及甲基乙基酮。四氫呋喃是尤其優選的。
[0075]在根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法中，步驟SlOO中所提供的聚氨酯材料可以另外包括水作為改性劑。作為改性劑添加至聚氨酯材料的水起到此作用，改善聚氨酯材料對用於形成聚氨酯多孔膜的基材的溼潤性。更具體地，作為改性劑的水的作用是，在下述步驟SllO在基材上滴加或施加聚氨酯材料的過程中避免聚氨酯材料凝結成塊，並且便於在基材上形成均質聚氨酯材料層。就保證聚氨酯材料對基材的潤溼性而言，相對於100質量份多元醇，添加至聚氨酯材料的水的量優選為不少於3質量份，更優選為不少於5質量份。還優選的是，在進行下述固化步驟之前，使作為改性劑添加至聚氨酯材料的水大部分去掉或揮發。因此，相對於100質量份多元醇，添加至聚氨酯材料的水的量優選為不超過15質量份，更優選不超過10質量份。只要在下述步驟S120中能夠沒有困難地形成聚氨酯材料層，也可以不向聚氨酯材料加水。
[0076]另外，在根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法中，可以向在步驟SlOO所提供的聚氨酯材料中加入分子量低於上述多元醇(例如，分子量為60?500，或優選分子量為60?300)的含羥基化合物，作為交聯劑。交聯劑的可用示例包括:二醇類，如乙二醇、二甘醇、I，2-丙二醇、I，3-丙二醇、I，2- 丁二醇、I，3- 丁二醇和I，4- 丁二醇；二醇化合物如二乙醇胺；三醇，如甘油；以及三醇化合物，如三乙醇胺和三羥甲基丙烷。
[0077]在根據本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法中，可以將用於加速固化和發泡的催化劑添加至在步驟S10所提供的聚氨酯材料。所使用的催化劑可以是已知的催化劑，並且可以是例如選自胺催化劑(如三乙胺、三丙胺和三丁胺)以及有機金屬催化劑(如有機錫化合物)的催化劑。另外，適當時，可以添加任意已知的各種添加劑和輔助劑，包括:泡沫穩定劑，如表面活性劑；著色劑；抗氧化劑，如氧化抑制劑和紫外線吸收劑；填料如碳酸鈣和硫酸鋇；阻燃劑；增塑劑；以及脫模劑。然而，聚氨酯材料的組成越簡單(即，包括在聚氨酯材料中的組分的數量越少)，越宜於減輕後述對細胞的潛在影響。另外，適宜的是不添加用於加速固化的催化劑，因為這會導致發泡反應進展緩慢，並且便於控制孔徑。
[0078]在步驟SlOO提供聚氨酯材料之後，所述製備方法在基材上形成聚氨酯材料層(步驟SI 10)。這個步驟SllO對應於解決問題的方案中所描述的「層形成步驟」，並且步驟SlOO和步驟SllO對應於解決問題的方案中所描述的「第一步」。步驟SllO中所使用的基材可以是任意基材，只要其基本上不與聚氨酯材料發生反應、在製備聚氨酯多孔膜的過程中所用的溫度條件下保持穩定、並且用於形成聚氨酯材料層表面足夠光滑。所使用的基材可以是由選自下述材料製成的膜:聚丙烯(PP)、氟樹脂如聚四氟乙烯(PTFE)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯、聚偏二氯乙烯、聚醯胺以及聚醯亞胺。
[0079]圖5是圖示在基材44上形成聚氨酯材料層40的一個示例性過程的圖。步驟SllO所採用的在基材上形成聚氨酯材料層的方法是例如這樣的方法:在基材上滴加聚氨酯材料，並且使用旋轉塗布機、刮條塗布機、或唇式塗布機、噴塗法、或者輥塗法來形成聚氨酯材料的膜。圖5圖示使用旋轉塗布機通過旋轉塗布法形成聚氨酯材料層的過程。更具體地，圖5圖示在基材44 (其被緊固在置於旋轉塗布機迴轉臺的玻璃板42上)上形成聚氨酯材料層40的過程。在此處說明中，在基材上形成聚氨酯材料層以製備聚氨酯膜的情況下，得到的聚氨酯膜中，遠離基材的暴露表面稱為「上表面」，而與基材相鄰的相對表面稱為「下表面」。
[0080]步驟SllO所形成聚氨酯材料層的厚度為例如0.1?20微米。為了保證聚氨酯多孔膜的強度並且改進處理能力，聚氨酯材料層的厚度優選為不小於I微米，且更優選為不小於3微米。為了在下述步驟120得到具有貫通至與基材相鄰的相對表面的孔的聚氨酯多孔膜，聚氨酯材料層的厚度優選為不大於15微米，且優選為不大於10微米。
[0081]聚氨酯材料中所包括的稀釋溶劑一般是高揮發性的，因而，當在步驟SllO形成聚氨酯材料層時，稀釋溶劑會迅速從所形成聚氨酯材料層中揮發出來。隨著在步驟SllO中用於形成聚氨酯材料層的聚氨酯材料中所包括的稀釋溶劑的比例增加，在步驟SllO中形成的聚氨酯材料層的厚度相應減小。還優選的是，在後述固化聚氨酯的步驟S120之前，在步驟SllO使聚氨酯材料層中所包括的水充分揮發。更具體地，優選的是使聚氨酯材料層中所包括的水的量降低至這樣的水平:即聚氨酯材料中的水基本上不會在後述固化聚氨酯的步驟S120中起到發泡劑的作用。當在步驟SllO採用旋轉塗布法來形成聚氨酯材料層時，隨著聚氨酯材料層的形成，能同時使稀釋劑和水揮發。
[0082]在步驟SllO形成聚氨酯材料層之後，所述製備方法隨著向聚氨酯材料層供給水蒸汽以使聚氨酯材料層固化(步驟S120)，從而完成聚氨酯多孔膜。這製備了例如圖1至圖3中所示的聚氨酯多孔膜10、110、210。步驟S120對應於解決問題的方案中所述的「第二步驟」。
[0083]更具體地，所述製備方法隨著向遠離基材44的聚氨酯材料層40的暴露表面供給水蒸汽，使聚氨酯材料固化。所採用的向聚氨酯材料層40暴露表面供給水蒸汽的方法是例如這樣的方法:將形成於基材44上的聚氨酯材料層40置於飽和蒸汽壓環境下。另一可用方法是使用例如水蒸汽噴嘴向聚氨酯材料層的暴露表面噴灑水蒸汽。
[0084]圖6示意性圖示將聚氨酯材料層40置於飽和蒸汽壓環境下以製備聚氨酯多孔膜的工藝的圖。此工藝使用了帶有蓋件52的氣密容器54，並且在氣密容器54中加入水56的情況下，將基材44施加至蓋件52的裡側，以使聚氨酯材料層40的暴露表面與水56相對。例如，將氣密容器54放置在設定為預定溫度的恆溫浴中，以維持氣密容器54的內部溫度處於預定溫度，並且控制氣密容器54中的蒸汽壓為處於預定溫度的飽和蒸汽壓。以水蒸氣的形式向聚氨酯材料層40供給水56的過程，在圖6中用箭頭示出。步驟S120中的反應的溫度(稱為「反應溫度」)表示發生反應的聚氨酯材料層的溫度，並且等於放置有氣密容器54的恆溫浴的設定溫度(在圖6所示的方法中)。在如上所述使用水蒸汽噴嘴的應用中，反應溫度是例如待噴灑水蒸汽的溫度。
[0085]固化反應在聚氨酯材料層中進行，在聚氨酯材料層中混合多元醇和異氰酸酯。在聚氨酯材料層中，涉及發泡的反應在供有水蒸汽的暴露表面上進行。更具體地，在聚氨酯材料層中，當向暴露表面供給水蒸汽時，聚氨酯材料中的異氰酸酯與水蒸汽反應生成二氧化碳，這在固化的過程中使聚氨酯發泡(以形成孔)，以構成多孔。根據本實施方案，水蒸氣相應地起到聚氨酯發泡劑的作用。孔的形成是在供有作為發泡劑的水蒸汽的暴露表面上進行的，因而，在如圖1至圖3中所示的所得到的聚氨酯多孔膜中，孔通常形成為朝向暴露表面(上表面22)開口。
[0086]在本實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法中，通過調節條件，可以對聚氨酯多孔膜的結構進行控制，所述條件選自步驟S120的反應時間(稱為「反應時間」)、步驟S120供給至聚氨酯材料層的水蒸汽的量(稱為「水蒸汽供給量」)、以及聚氨酯材料的組成。這裡聚氨酯多孔膜的結構包括:形成於聚氨酯多孔膜中的孔形狀、孔直徑、孔直徑的變化、以及聚氨酯多孔膜的膜厚度。
[0087]使聚氨酯固化的反應(稱為「固化反應」)以及使聚氨酯發泡的反應(稱為「發泡反應」)二者均為化學反應。步驟S120中反應溫度升高，繼而增強了各反應的活化程度，而步驟S120中反應時間的增加使各反應更多地進行。因此，調節步驟S120的反應溫度和/或反應時間能夠改變固化反應與發泡反應之間的平衡，從而控制所得到的聚氨酯多孔膜的結構。就保證聚氨酯多孔膜的生產率以及保證聚氨酯膜的足夠孔隙率而言，反應溫度優選為不低於20°C，更優選為不低於30°C，進一步優選為不低於40°C。為了控制在聚氨酯多孔膜中所形成孔的尺寸，反應溫度優選為不高於120°C，更優選為不高於80°C，進一步優選為不高於60°C。可以根據反應溫度來適當地設定反應時間。就保證聚氨酯多孔膜的生產率而言，反應時間優選為不長於24小時，更優選為不長於17小時，進一步優選為不長於60分鐘。就保證聚氨酯膜的足夠孔隙率而言，反應時間優選為不短於I分鐘，更優選為不短於10分鐘。
[0088]對於改變所得到聚氨酯多孔膜中形成的孔形狀而言，步驟S120中的反應溫度和反應時間是重要參數。更具體地，對反應溫度和反應時間進行適當地設定能夠控制孔的形狀，使得孔的內壁通常形成為大致彎曲的表面，並且孔朝向聚氨酯多孔膜的暴露表面開口。另外，這樣的設定能夠控制孔的形狀，使得僅有單一的孔是沿膜的厚度方向設置(在膜的厚度方向上不會連續形成多個孔)(參見圖1和圖2)。
[0089]對於改變聚氨酯多孔膜的暴露表面(上表面22)上的平均孔徑以及孔徑變化，步驟S120中的反應溫度和反應時間也是重要參數。通過調節反應溫度和/或反應時間，可以將聚氨酯多孔膜的平均孔徑控制在0.1?100微米範圍內。為了將平均孔徑控制在上述範圍內，反應溫度優選為不低於20°C，更優選為不低於30°C，進一步優選為不低於40°C。為了將平均孔徑控制在上述範圍內，反應溫度還優選不高於120°C，更優選為不高於80°C，進一步優選為不高於60°C。可以根據反應溫度適當地設定反應時間。為了將平均孔徑控制在上述範圍內，反應時間優選為不長於24小時，更優選為不長於17小時，進一步優選為不長於60分鐘。為了將平均孔徑控制在上述範圍內，反應時間還優選為不短於I分鐘，更優選為不短於10分鐘。
[0090]發泡反應的活化程度隨著反應溫度的升高而增大。將反應溫度設定為較低，相應地減小所得到聚氨酯多孔膜中形成的孔的孔徑(平均孔徑)，並且減小孔徑的變化。為了充分減小孔的直徑並且降低孔徑的變化，反應溫度優選為不高於55°C，更優選為不高於45°C。另一方面，就生產效率而言，反應溫度優選為不低於35°C，更優選為不低於38°C。除了調節上述的反應溫度和/或反應時間之外或者作為替代方式，通過調節供給至聚氨酯材料層暴露表面的水蒸汽的量，也可控制聚氨酯多孔膜暴露表面(上表面22)上的平均孔徑。這是因為隨著作為發泡劑的水蒸汽的供給量的增加，發泡反應的活化程度會提高。當如圖6所示在添加水的同時在氣密容器中進行固化反應時，設定的溫度越高，使反應溫度升高，並且飽和蒸汽壓也增大，從而增加了水蒸汽供給量。這導致發泡反應的活化程度會升高，從而增大了平均孔徑。聚氨酯多孔膜中孔的增大尺寸隨著孔中谷處膜厚度而增大。
[0091]另外，對於改變聚氨酯多孔膜的膜厚度(峰處膜厚度)，步驟S120的反應溫度和反應時間是重要參數。通過調節反應溫度和/或反應時間，聚氨酯多孔膜的厚度可控制在I?100微米範圍內。發泡反應活化程度的提高會增大得到的聚氨酯多孔膜的膜厚度。將反應溫度設定為較低，相應地減小聚氨酯多孔膜的膜厚度。為了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述範圍內，反應溫度優選為不低於20°c，更優選為不低於30°C，進一步優選為不低於40°C。為了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述範圍內，反應溫度優選為不高於120°C，更優選為不高於80°C，優選為不高於60°C。可以根據反應溫度來適當地設定反應時間。為了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述範圍內，反應時間優選為不長於24小時，更優選為不長於17小時，進一步優選為不長於60分鐘。為了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述範圍內，反應時間還優選為不短於I分鐘，更優選為不短於10分鐘。
[0092]除了上述調節反應溫度和/或反應時間之外或作為替代方式，通過調節聚氨酯材料的組成，也可控制聚氨酯多孔膜的膜厚度。更具體地，由於稀釋溶劑的揮發，材料中所包括稀釋溶劑的比例升高會導致經過步驟S120反應後的聚氨酯材料層的厚度減小。這導致所得到的聚氨酯多孔膜的膜厚度減小。為了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述範圍內，相對於材料中所包括的100質量份多元醇,材料中所包括稀釋溶劑的比例優選為不少於40質量份，更優選為不少於80質量份。為了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述範圍內，相對於材料中所包括的100質量份多元醇,材料中所包括的稀釋溶劑的比例還優選為不大於500質量份，更優選為不大於350質量份。
[0093]在步驟S120的固化反應和發泡反應進行期間，聚氨酯材料層越薄越容易形成貫通至基材側(下表面)的孔。因此，通過如上所述提高稀釋溶劑的比例來形成較薄的聚氨酯材料層，使得更容易得到具有更多數目的貫通至下表面的孔的聚氨酯多孔膜。為了得到具有這種通孔的聚氨酯多孔膜，相對於材料中所包括的100質量份多元醇，材料中所包括的稀釋溶劑的比例優選為不少於90質量份，更優選不少於150質量份。為了得到具有這種通孔的聚氨酯多孔膜，相對於材料中所包括的100質量份多元醇，材料中所包括的稀釋溶劑的比例還優選為不大於500質量份，更優選為不大於350質量份。
[0094]通過調節下列條件中的至少之一，可以控制聚氨酯多孔膜中所形成的孔深度(或者下文所述的谷處膜厚度)和/或平均孔徑，所述條件即，步驟S10準備聚氨酯材料的「混合步驟」與步驟SllO形成聚氨酯材料層的「層形成步驟」之間的時間、以及上述「混合步驟」與上述「層形成步驟」之間聚氨酯材料的環境溫度。例如，對上述條件的調節能夠控制將在所得聚氨酯多孔膜中形成的孔的至少一部分，使之成為貫通至與基材44相鄰的下表面24的通孔。
[0095]更具體地，「混合步驟」與「層形成步驟」之間時間的增加、或者「混合步驟」與「層形成步驟」之間溫度的升高，使混合聚氨酯材料的固化反應更多地進展。在步驟S120，聚氨酯材料層中固化反應的進展越多，越難以通過供給水蒸汽形成孔。因此，「混合步驟」與「層形成步驟」之間時間的增加、或者「混合步驟」與「層形成步驟」之間溫度的升高，易於使孔的深度減小，並且易於使平均孔徑減小。換而言之，「混合步驟」與「層形成步驟」之間時間的減少、或者「混合步驟」與「層形成步驟」之間溫度的降低，使得更容易形成通孔(作為聚氨酯多孔膜中所要形成的孔的至少一部分)，並且易於增大平均孔徑。
[0096]根據上述本發明實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法，能夠通過向聚氨酯材料層供給水蒸汽這樣簡單的技術，製備用於細胞培養和癌細胞生長抑制中的至少一種應用的聚氨酯多孔膜。這使得聚氨酯多孔膜的製造成本降低。
[0097]根據本發明實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法，能夠通過調節條件來容易地形成貫通至下表面的多個孔，所述條件選自:在供給水蒸汽的同時進行固化反應期間的反應溫度、反應時間、水蒸汽供給量、以及聚氨酯材料的組成。這樣能夠使膜的兩個表面都能夠用作細胞培養支架。另外，使用這樣一種聚氨酯多孔膜能夠以提供細胞之間相互作用的特定模式在各自的表面上進行細胞培養。
[0098]根據本發明實施方案的聚氨酯多孔膜的製備方法，能夠將貫通至下表面的孔的孔徑(平均孔徑)減小至小於10微米(這是標準細胞尺寸)。使用這樣的膜能夠允許物質(例如，來自各自細胞的分泌物)發生轉移的同時阻礙細胞在各自表面之間進行遷移，由此能夠更詳細地分析各自表面上的細胞之間的相互作用。
[0099]使用水(液態水)作為發泡劑來製備多孔聚氨酯的方法在本領域是已知的。將液態水與聚氨酯材料混合使水與異氰酸酯反應，從而生成二氧化碳和泡沫聚氨酯。然而，本實施方案與現有技術的不同之處在於並不是使用處於液態水狀態的水作為發泡劑，而是使用處於水蒸汽的汽化狀態的水作為發泡劑。
[0100]除了液態水之外，還已知的是使用氟碳化合物和環戊烷作為發泡劑來製備多孔聚氨酯。通過使用液態水或氟碳化合物所形成的孔的尺寸通常為約數百微米。因此，使用液態水或氟碳化合物難以滿足作為用於細胞培養的多孔膜的要求。使用液態水或氟碳化合物作為發泡劑在膜內形成孔，相應地難以形成朝向膜上表面開口的孔以提供具有足夠凹凸體的膜表面，或者難以形成貫通至膜下表面的孔。另一方面，本實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法將水蒸汽作為發泡劑供給到暴露表面上，由此製備在上表面上具有凹凸體的膜，其適合作為用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的多孔膜。
[0101]用於製備聚氨酯多孔體的另一已知技術是用在普通狀態下或者在超臨界狀態下將二氧化碳氣體、氮氣或空氣充入樣品並且調節溫度，從而獲得氣體和聚合物的熔融狀態，由此形成細孔。然而，這種已知方法將孔形成為閉孔結構，因此難以形成朝向膜上表面開口的孔以提供具有足夠凹凸體的膜表面、或者難以形成貫通至膜下表面的孔。該方法還難以在發泡過程中將膜厚度控制在一定範圍內。另一方面，本實施方案的聚氨酯多孔膜製備方法能夠製備在上表面上具有凹凸體、具有期望膜厚度的多孔膜，其適合作為用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的多孔膜。
[0102]C.變化
[0103]圖7是示出根據本發明實施方案的聚氨酯多孔膜的變化例製備方法的流程圖。圖7中與圖4相同的步驟用相同的步驟編號示出，並且在此不再具體說明。在圖7的變化流程中，步驟SlOO?步驟S120與圖4流程中的是相同的。與圖4流程的不同之處在於這樣的附加步驟:在步驟S120之後，停止水蒸汽的主動供給，在乾燥條件下，使聚氨酯加速固化(步驟S130)。更具體地，當如先前所述在步驟S120中使用氣密容器54時，本過程除去了氣密容器54中的液態水，並且進一步繼續進行固化反應。在另一示例中，當在步驟S120中使用水蒸汽噴嘴時，本過程停止使用噴嘴噴灑水蒸汽，並且進一步繼續進行固化反應。
[0104]這種變化例流程在製備聚氨酯多孔體的步驟之後具有附加的步驟，以使聚氨酯進一步繼續固化，因而，可以通過主要考慮期望的孔隙率程度來設定步驟S120的條件。這能夠以更高的精確度來控制孔隙率程度(更具體地，例如，平均孔徑、貫通至下表面的通孔的比例、以及由於發泡導致的膜厚度變化程度)。與圖4的製備方法相比，圖7的製備方法通過在步驟S120中設定較低的反應溫度和較短的反應時間，進一步減小位於膜上表面的平均孔徑，並進一步降低孔尺寸的變化
[0105]實施例
[0106]〈製備聚氨酯多孔膜〉
[0107][樣品I和樣品2]
[0108]圖8是示出樣品I和樣品2的聚氨酯膜的材料組成和固化條件的圖表。樣品I的聚氨酯膜根據圖4中所示的製備方法製備。如後所述，樣品2的聚氨酯膜的製備方法的不同之處僅在於，在與圖4的步驟S120相對應的步驟中，在沒有供給水蒸汽的情況下進行固化。製備樣品I和樣品2的聚氨酯膜的過程在步驟SlOO中提供了具有圖8中所示組成的材料。如圖8中所示，使用聚醚多元醇作為樣品I和樣品2的聚氨酯膜生產中的多元醇。更具體地，所使用的多元醇是具有約4000數均分子量和37羥值的聚丙烯乙烯多元醇。所使用的異氰酸酯是多元醇改性的二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)，在其分子末端含有28.0質量％的異氰酸酯基(NCO)。所使用的交聯劑是二甘醇(DEG)。所使用的稀釋溶劑是四氫呋喃(THF)。所使用的改性劑是水或者更具體的是超純水(Mill1-Q(商標名)水)。圖8示出了各自成分相對於100質量份多元醇的質量比、以及作為材料中各成分組成的各組分混合重量。關於四氫呋喃，所加入的溶劑的量示於圖8中。基於溶劑中四氫呋喃的濃度為0.89克/毫升的假設來計算四氫呋喃的質量比。
[0109]在步驟S110，本過程通過圖5中所示的旋轉塗布法在基材44上形成聚氨酯材料層40。更具體地，在步驟S110，本過程將圖8中所示組成中除異氰酸酯之外的其他各組分加入氣密樣品容器中，並且使用Vortex攪拌器(由IKA Works Inc.製造的GENIUS3)攪拌混合物30秒。本過程接著在冰浴上冷卻容納有上述混合物的樣品容器。然後，本過程加入圖8中所示的特定量的異氰酸酯，使用Vortex攪拌器攪拌混合物30秒，並且在冰浴上冷卻容納有上述樣品的混合物的樣品容器，以抑制進一步反應。在臨進行旋轉塗布之前，本過程用Vortex攪拌器再次攪拌上述樣品I分鐘，並且在置旋轉塗布機中的基材44上，施加並旋塗I毫升樣品。所使用的旋轉塗布機是由Mikasa Col., Ltd.製造的MS-A100。所使用的基材44是聚丙烯(PP)薄膜，並且用膠帶將該薄膜緊固在放置於旋轉塗布機轉臺的玻璃板上。在室溫下以5000轉每分鐘(rpm)的旋轉速度進行旋塗60秒鐘。
[0110]在步驟S120，使用由Iwasaki Industry Inc.製造的 AIR KEEPER A-032 (1.35 升容量)作為圖6中所示的氣密容器。在製備樣品I的過程中，向上述氣密容器54中加入100毫升水，並且將氣密容器54置於設定至40°C (其為固化溫度)的恆溫浴中，以加熱氣密容器54，直至氣密容器54中的水溫達到固化溫度。在臨開始固化反應之前，本過程從恆溫浴中取出氣密容器54,並且用Kimtowel (註冊商標)(由Nippon Paper Crecia C0.，Ltd.製造)擦掉氣密容器54的蓋件52背面上的水，以抑制水滴在固化反應期間的影響。使用雙面膠帶，將帶有用旋轉塗布機所形成聚氨酯材料層40的基材44緊固至蓋件52。本過程將固定有聚氨酯材料層40的蓋件52封閉，並且將氣密容器54放置在恆溫浴中，以加熱氣密容器54過夜。相應地，使樣品I暴露於40°C下的飽和蒸汽壓，並且使其在40°C下進行固化反應。在下文說明中，將聚氨酯固化期間在固化溫度下具有飽和水蒸汽的氣氛稱為水蒸汽氣氛。
[0111]取代步驟S120，使樣品2在沒有供給水蒸汽的情況下經歷固化步驟。更具體地，除了在氣密容器中沒有加水並且恆溫浴的溫度被設定為60°C之外，按照與上述樣品I製備過程相同的過程來製備樣品2。因此，在樣品2固化反應期間，氣密容器中的水蒸汽壓等於封閉氣密容器之前空氣中的水蒸汽壓。在下文說明中，將聚氨酯固化期間在未主動供給水蒸汽的情況下的水蒸汽壓力稱為乾燥氣氛。
[0112]圖9的圖表示出對樣品I和樣品2的聚氨酯膜進行觀察的結果。在15千伏加速電壓下，使用掃描電子顯微鏡(SEM，S-800，由Hitachi，Ltd.製造)以200?10000倍放大倍率觀察聚氨酯膜。作為示例，圖9示出了 3000倍放大倍率下對聚氨酯膜的上表面(遠離基材的暴露表面)和下表面(通過去除基材可觀察到的表面)的觀察、以及在1000倍放大倍率下對橫截面的觀察。通過用刀片沿膜厚度方向切割帶有聚氨酯膜的基材44，由此準備用於觀察橫截面的樣品。如下所述，關於樣品2沒有觀察到孔的形成，因而，對於樣品2也就沒有去除基材44對下表面進行觀察。
[0113]在圖9中，在各樣品中，峰處膜厚度(膜上表面上所形成凹凸體的凸起部最高位置之間的距離)示為「峰處膜厚度」。在形成有孔的樣品中，谷處膜厚度(膜下表面所形成凹凸體的凹部最深位置之間的距離)示為「谷處膜厚度」。在形成有孔的樣品中，位於膜的上表面22上的孔的開口直徑(參見圖1至圖3)示為「上表面孔尺寸」，以及，位於下表面24上的孔的開口直徑的最大值(參見圖1至圖3)示為「最大下表面孔尺寸」。圖9還示出了「峰處膜厚度」、「谷處膜厚度」、以及「上表面孔尺寸」的標準偏差。
[0114]通過以下方式確定上述「峰處膜厚度」、「谷處膜厚度」以及其標準偏差:在樣品橫截面圖像中選擇三個可見區域，計算各可見區域中的平均值，並且計算各自可見區域平均值的中值。關於後述的其它樣品，按照相同的方式來確定「峰處膜厚度」、「谷處膜厚度」以及其標準偏差。
[0115]利用圖像分析軟體Mac-View (由Mountech C0., Ltd.出品)，通過圖像分析來確定上述「上表面孔尺寸」和「最大下表面孔尺寸」、以及「上表面孔尺寸的標準偏差」。更具體地，對於各樣品上表面或下表面的特定可見區域(1000倍放大倍率下的視場)中的所有孔而言，圖像分析的過程測得最大長度(外切於各孔的矩形的側邊長度最大值)，並且根據最大長度的測量值來計算「上表面孔尺寸」及其標準偏差和最大值的平均值。在圖9中，「上表面孔尺寸」的標準偏差示於「上表面孔尺寸」平均值的下方。對於後述其它樣品，「上表面孔尺寸」、「下表面孔尺寸」及其標準偏差，以及上表面和下表面的各自孔尺寸的最大值和最小值，也通過上述圖像分析軟體確定。
[0116]如圖9中所示，通過在水蒸汽氣氛下進行固化反應，樣品I給出的聚氨酯多孔膜具有大量貫通至下表面的孔。另一方面，在採用乾燥氣氛下進行固化反應的樣品2中，觀察到沒有孔形成。樣品I和樣品2具有與圖8中所示相同的材料組成，因此二者在固化反應之前具有幾乎相同的材料層厚度。然而，在固化之後，發泡的樣品I具有更大膜厚度(圖9中「峰處膜厚度」)。在樣品I中，位於上表面22的開口的孔徑大於位於下表面24的開口的孔徑。這表明了孔從上表面22側發展至下表面24側的孔形成過程。
[0117]如圖8中所示，相對於材料中100質量份多元醇，樣品I和樣品2各含有7質量份水。與在聚氨酯泡沫生產期間使用水作為發泡劑的情況下材料中所混合水的通常比例相t匕，此含量比更高。然而，在樣品2中觀察到沒有孔形成。這歸因於在旋塗過程中材料中的水分喪失，導致混合在材料中的水幾乎不能起到發泡劑的作用。因此，認為是，在形成有孔的樣品I中，只有供給至暴露表面的水蒸汽實質上起到了發泡劑的作用。
[0118][樣品3?樣品8]
[0119]圖10的圖表示出樣品3?樣品8的聚氨酯膜的材料組成以及固化條件。樣品3?樣品8的聚氨酯膜根據圖4中所示的製備方法製備。更具體地，製備樣品3?樣品8的聚氨酯膜的過程是在步驟SlOO中提供具有圖10所示組成的材料。如圖10中所示，用來生產樣品3?樣品5的聚氨酯膜的多元醇是聚醚多元醇(37的羥基值，以及大約4000的分子量)，其與樣品I的相同。另一方面，用來生產樣品6?樣品8的聚氨酯膜的多元醇是聚合物多元醇(27的羥基值，以及大約5000的分子量，是通過苯乙烯和丙烯腈在聚醚多元醇中進行接枝共聚而得到的聚合物)。材料中所包括其它組分的種類以及膜形成條件都與樣品I中的相同。圖10按與圖8相同的方式示出了各自組分的組成。
[0120]按與樣品I中相同的方式來進行步驟SllO的後繼材料層形成步驟、以及步驟S120的固化步驟。與樣品I的不同在於:對於樣品3和樣品6，固化溫度設定為室溫；對於樣品4和樣品7，固化溫度設定為60°C ；以及，對於樣品5和樣品8，固化溫度設定為80°C。
[0121]圖11的圖表示出按與樣品I相同的方式用SEM觀察樣品3?樣品8聚氨酯膜的結果。作為示例，圖11示出了 1000倍放大倍率和5000倍放大倍率下對聚氨酯膜的上表面(遠離基材的暴露表面)進行的觀察。圖11還示出各自樣品的總膜厚度(峰處膜厚度)。
[0122]如圖11中所示，在樣品3?樣品8中，通過在水蒸汽氣氛下進行固化反應，在上表面形成凹凸體。比室溫高的溫度條件導致所形成凹凸體的數量增加，並因此導致所形成孔的數量增加。這歸因於，利用水蒸汽在膜的上表面上形成凹凸體(孔)的反應是與固化反應類似的化學反應，並且將溫度升高到一定水平，保證了活化程度更充分。
[0123]在將聚醚用於多元醇的情況下，在將固化溫度設定為室溫時，在上表面上形成了凹凸體，但沒有觀察到可識別為孔的孔洞(樣品3)。在將固化溫度設定為60°C以及80°C時，在上表面觀察到大量的孔(樣品4和樣品5)。然而，採用相對較低固化溫度60°C的樣品4具有孔徑更精細且更均勻的孔(參見1000倍放大倍率下的上表面圖像)，並且具有更大的膜厚度。另一方面，在將聚合物多元醇用於多元醇的情況下，將固化溫度設定為室溫以及60°C下時，在上表面上形成了凹凸體，但沒有觀察到可識別認為孔的孔洞(樣品6和樣品7)。在將固化溫度設定為80°C時，在上表面上觀察到了大量的孔(樣品8)。考慮到這些結果，可以預期的是，可以根據所使用聚氨酯材料的類型，通過適當地設定包括固化溫度在內的固化條件，能夠適當地控制在膜上表面所形成的凹凸體或孔。
[0124][樣品9?樣品11]
[0125]圖12的圖表示出樣品9?樣品11的聚氨酯膜的材料組成以及固化條件。根據圖4中所示的生產方法來製備樣品9和樣品10的聚氨酯膜。樣品11的聚氨酯膜製備方法的不同之處在於:採用乾燥氣氛作為與下述步驟S120相對應的步驟中的氣氛。生產樣品9?樣品11聚氨酯膜的過程中，在步驟SlOO提供圖12中所示組成的材料。如圖12中所示，包括在用於製備樣品9?樣品11的聚氨酯膜材料中的組分類型以及膜形成條件與樣品I中的相同。圖12按與圖8相同的方式示出各自組分的組成。
[0126]按與樣品I中相同的方式來進行步驟SllO的後繼材料層形成步驟、以及步驟S120的固化步驟。然而，對於樣品9，固化溫度設定為50°C，以及，對於樣品10和樣品11，固化溫度設定為60°C。
[0127]圖13A和圖13B的圖表示出按與樣品I相同的方式用SEM觀察樣品9?樣品11的聚氨酯膜的結果。作為示例，圖13A示出了 3000倍放大倍率下對聚氨酯膜的上表面、下表面、以及橫截面的觀察。關於如下所述的樣品11，沒有觀察到形成孔，因而，對於樣品11，沒有去除基材去觀察下表面。圖13B示出關於各樣品的「峰處膜厚度」和「谷處膜厚度」及其標準偏差，連同上表面和下表面的平均孔徑及其標準偏差、以及孔徑的最大值和最小值。使用1000倍放大倍率下的上表面圖像以及200倍放大倍率下的下表面圖像進行孔徑分析。
[0128]如圖13A中所示，對於樣品9和樣品11，通過在水蒸汽氣氛下進行固化反應，形成了貫通至下表面的孔。然而，在採用乾燥氣氛進行固化反應的樣品11中，沒有觀察到孔或凹凸體形成。
[0129]根據樣品9與樣品10之間的比較，儘管樣品9和樣品10具有相同的材料組成，但採用相對較高固化溫度的樣品10具有更大的膜厚度。換而言之，步驟SllO所形成的樣品9和樣品10的材料層具有大致相同的厚度，但在固化之後，樣品10具有更大的膜厚度。這歸因於，在採用相對較高固化溫度的樣品10中，使用水蒸汽進行的發泡反應更充分。根據樣品9與樣品10之間的比較，採用相對較低固化溫度的樣品9中，孔在上表面的開口孔徑較小，並具有較小的孔徑變化。另外，根據將下表面的開口孔徑進行比較，採用相對較低固化溫度的樣品9具有更大的平均孔徑，但具有較小的孔徑變化。這些結果表明，參與孔形成的化學反應在較高固化溫度下能夠更充分地進行，以及，通過適當調節伴隨發泡反應的固化溫度，能夠製備出具有貫通至下表面的孔、孔徑較小且孔徑變化較小的聚氨酯多孔膜。
[0130]在如上所述分別採用60°C固化溫度和80°C固化溫度以在水蒸汽氣氛下進行固化的樣品4和樣品5中，沒有形成貫通至下表面的孔。另一方面，在採用40°C固化溫度的樣品1、採用50°C固化溫度的樣品9、以及採用60°C固化溫度的樣品10中，在水蒸汽氣氛下進行固化，形成了貫通至下表面的孔。這歸因於樣品1、樣品9、以及樣品10在材料中具有的稀釋溶劑含量比(相對於100質量份聚醚的稀釋溶劑量)高於樣品4和樣品5，因此，使經過固化反應的材料層厚度減小，並且易於形成通孔。
[0131][樣品12?樣品14]
[0132]圖14是示出樣品12?樣品14的聚氨酯膜的材料組成以及固化條件的圖表。根據圖7中所示的生產方法來製備樣品12和樣品13的聚氨酯膜。樣品14聚氨酯膜的製備方法的不同之處在於，取代步驟S120和步驟S130，僅僅採用了乾燥氣氛下的一步固化反應。製備樣品12?樣品14的聚氨酯膜的過程中，在步驟SlOO提供具有如圖14中所示組成的材料。如圖14所示，用於製備樣品12?樣品14聚氨酯膜的材料中所包括的組分類型以及膜形成條件與樣品I中的相同。圖14按照與圖8相同的方式示出了各自組分的組成。
[0133]對於樣品12和樣品13，按照與樣品I相同的方式進行步驟SllO的後續材料層形成步驟、以及步驟S120的固化步驟。與樣品I的不同之處在於，在步驟S120，樣品12在40°C的固化溫度下進行固化反應30分鐘，以及，樣品13在50°C的固化溫度下進行固化反應30分鐘。在樣品12和樣品13中，步驟S130之後，在乾燥氣氛下使固化加速。更具體地，本過程將氣密容器中的液態水除去，以使氣氛從水蒸汽氣氛改變為乾燥氣氛，並且在60°C下繼續固化反應過夜。另一方面，在樣品14中，在步驟S120，本過程以60°C的固化溫度在乾燥氣氛下使固化反應過夜，而沒有在水蒸汽氣氛下進行固化反應。
[0134]圖15A和圖15B的圖表不出按與樣品I相同方式在SEM下對樣品12?樣品14的聚氨酯膜進行觀察的結果。作為示例，圖15A示出500倍放大倍率下對各聚氨酯膜的上表面的觀察、以及1000倍放大倍率下對橫截面的觀察。圖15A還示出在200倍放大倍率下對樣品12的下表面進行的觀察、以及在500倍放大倍率下對樣品13的下表面進行的觀察。如下所述，關於樣品14，沒有觀察到孔形成，因而，對於樣品14，沒有去除基材去觀察下表面。圖15B示出了各樣品的「峰處膜厚度」和「谷處膜厚度」及其標準偏差、以及上表面和下表面的平均孔徑及其標準偏差、以及孔徑的最大值和最小值。使用500倍放大倍率下的上表面圖像、以及200倍放大倍率下的下表面圖像進行孔徑分析。
[0135]如圖15A中所示，在樣品12和樣品13中，在水蒸汽氣氛下進行固化反應，觀察到形成了貫通至下表面的孔。另一方面，在樣品14中，只在乾燥氣氛下進行固化反應，沒有觀察到孔或凹凸體形成。
[0136]根據樣品12與樣品13之間的比較，儘管樣品12和樣品13具有相同的材料組成(儘管樣品12和樣品13的材料層具有大致相同的厚度)，但採用相對較高固化溫度的樣品13具有更大的膜厚度。這歸因於，採用相對較高固化溫度的樣品13中使用水蒸汽進行的發泡反應更充分。根據樣品12與樣品13之間的比較，在水蒸汽氣氛下採用相對較低固化溫度的樣品12中，位於上表面和下表面的孔具有較小的孔徑(平均孔徑、最大值、以及最小值)、以及較小的孔徑變化(孔徑的標準偏差)。
[0137]在作為固化反應第一步驟的步驟S120中採用了 40°C反應溫度的樣品12中，聚氨酯多孔膜的上表面上，觀察到了幹涉圖樣。這種幹涉圖樣的存在表明，朝向膜的上表面開口的多個孔的孔徑變化是非常小的。然而，即使將伴隨發泡反應的固化溫度設定至40°C，如果如同上述樣品I那樣沒有在乾燥氣氛下進行加速固化步驟S130，那麼任何樣品中都沒有在聚氨酯多孔膜的上表面觀察到幹涉圖樣(這種幹涉圖樣的數據未示出)。這些結果顯示，可以通過將固化反應(伴隨有使用水蒸汽的發泡反應)的時間設定為較短，並且接著在乾燥氣氛下加速固化反應，可以得到較小的平均孔徑和較小的孔徑變化。這歸因於，在兩步式固化反應中，僅在第一步採用水蒸汽氣氛，這樣的固化反應使得發泡反應在過多進展之前就停止而處於孔徑較小且均勻的狀態。
[0138][樣品15?樣品23]
[0139]圖16A和圖16B的圖表不出樣品15?樣品23的聚氨酯膜的材料組成和固化條件、以及對所得到聚氨酯多孔膜的表面進行測量的結果。根據圖7中所示的生產方法來製備樣品15?樣品23的聚氨酯膜。圖16A和圖16B示出了材料中各自組分的組成，以各自組分相對於100質量份多元醇的質量比來表示。
[0140]如圖16A和16B中所不，樣品15?樣品23使用了與上述樣品I?樣品14中不同類型的多元醇和異氰酸酯來製備聚氨酯膜的材料。在各自樣品中使用了下列多元醇。樣品15中所使用的多元醇是具有397羥值的聚醚多元醇(聚氧亞丙基甘油醚)。樣品16中所使用的多元醇是具有27羥值的聚合物多元醇(其是通過苯乙烯與丙烯腈在聚醚多元醇中進行自由基聚合、環氧丙烷和環氧乙烷與丙三醇進行加成聚合而獲得的)。樣品17中所使用的多元醇是具有56羥值的聚酯多元醇(聚(己二酸乙二醇酯)二醇)。樣品18中所使用的多元醇是具有55羥基值的聚碳酸酯二醇。
[0141]樣品19中所使用的異氰酸酯是在分子末端含有33.6質量％異氰酸酯基(NCO)的單體MDI。樣品20中所使用的異氰酸酯是在分子末端含有23.1質量％異氰酸酯基(NCO)的多元醇改性的MDI。樣品21中所使用的異氰酸酯是在分子末端含有30.7質量％異氰酸酯基(NCO)的聚合MDI。樣品22中所使用的異氰酸酯是在分子末端含有28.7質量％異氰酸酯基(NCO)的碳二亞胺改性的MDI。樣品23中所使用的交聯劑是乙二醇。樣品15?樣品23中所使用的其它組分與樣品I?樣品14中所使用的那些相同。圖16A和圖16B示出了聚氨酯膜的材料組成，以相對於100質量份多元醇的量的形式表示。樣品15?樣品23生產中所採用步驟SllO?S130的條件與上述樣品12中所採用的那些相同。
[0142]圖17?圖25示出用處於15千伏加速電壓下掃描電子顯微鏡(SEM，S-800，Hitachi，Ltd.製造)以2000倍放大倍率或3000倍放大倍率從一定角度對樣品15?樣品23各自生產的聚氨酯膜進行的觀察。如圖17?圖25中所示，可以確認，使用不同類型的多元醇、異氰酸酯、或交聯劑，可生產出具有朝向至少上表面22開口的多個孔的聚氨酯多孔膜。圖16A和圖16B還示出樣品15?樣品23的各自聚氨酯多孔膜的膜厚度、以及上表面22上的平均孔徑(上表面孔尺寸)。
[0143]〈使用聚氨酯多孔膜的細胞培養〉
[0144]下文對使用如下製備的聚氨酯多孔膜(樣品24和樣品25)進行細胞培養的結果加以說明。
[0145][樣品24和樣品25]
[0146]圖26的圖表不出樣品24和樣品25的聚氨酯多孔膜的材料組成和固化條件、以及對所得到聚氨酯多孔膜的表面進行測量的結果。根據圖7中所示的生產方法來製備樣品24和樣品25的聚氨酯多孔膜。在樣品24和樣品25的聚氨酯多孔膜的生產中所使用的材料組分的類型與樣品I中所使用的相同。圖26按與圖8相同的方式示出了各組分的組成。
[0147]樣品24和樣品25的生產中所採用的步驟SllO?S130的條件與上述樣品12中所採用的那些相同。樣品24和樣品25在步驟SlOO的材料混合(混合步驟)與步驟SllO的旋塗(層形成步驟)之間採用不同時間。在混合步驟與層形成步驟之間使樣品24在室溫下靜置12分鐘，以及，在混合步驟與層形成步驟之間使樣品25在室溫下靜置30分鐘。
[0148]如上製備的樣品24是具有貫通至下表面24的孔的通孔膜。樣品25是非通孔膜。此處的「非通孔」膜是指:以2000倍放大倍率觀察膜的下表面24 (生產期間與基材相鄰的表面)的指定可見區域，其中的孔的總面積小於所述可見區域的整個面積的5%。與上述「上表面孔尺寸」類似，使用圖像分析軟體Mac-View (由Mountech C0.,Ltd.製造)，通過圖像分析來確定下表面24上的孔面積。
[0149]在樣品24的聚氨酯多孔膜中，上表面22上的平均孔徑(上表面孔尺寸)為14微米；下表面24上的平均孔徑(下表面孔尺寸)為11微米；以及，膜厚度(峰處膜厚度)為6微米。在樣品25中，上表面22上的平均孔徑為3微米，以及，膜厚度為3微米。如上所述，混合步驟與層形成步驟之間的時間較短的樣品24提供了通孔膜，而混合步驟與層形成步驟之間的時間較長的樣品25提供了在上表面22上具有較小平均孔徑的非通孔膜。
[0150][細胞培養條件]
[0151]⑴細胞系
[0152]使用以下兩種細胞系用於培養:
[0153]HUVEC(人胳靜脈內皮細胞):HUV-EC_C(Nat1nal Institute of B1medicalInnovat1n, JCRB Cell Bank, IF050271);以及
[0154]AoSMC (人主動脈平滑肌細胞):AoSMC(Lonza，CC-2571)。
[0155](ii)培養基(Culture Medium)
[0156]用於HUVEC的培養基是DMEM-12 (Gibco，11330-057)，加入了青黴素鏈黴素(Gibco, 15140-122)、肝素鈉鹽(SIGMA-ALDRICH，H3149-100KU)和 ECGS (血管內皮細胞生長補充)(SIGMA，E2759)。用於 AoSMC 的培養基是 SmGM-2(商標)Smooth Muscle Cell MediumBulletKit (商標)(Lonza, CC-3182)。
[0157](iii)細胞培養裝置
[0158]圖27是示意性圖示在使用聚氨酯多孔膜的兩個表面進行細胞培養中所使用細胞培養裝置60的透視圖。細胞培養裝置60是由玻璃製成並具有13毫米外徑的環狀件。
[0159]在細胞培養過程中，布置聚氨酯多孔膜以覆蓋上述環狀細胞培養裝置60的一個開口。更具體地，本過程在細胞培養裝置60側面的兩個不同位置處預先貼附雙面膠帶，將聚氨酯多孔膜安裝於乙醇中的細胞培養裝置60上，並且將聚氨酯多孔膜的周邊與雙面膠帶粘合。本過程隨後除去乙醇，並且乾燥聚氨酯多孔膜，以將聚氨酯多孔膜固定於細胞培養裝置60。在進行下述的雙側(上側和下側)培養的情況下、或者在將細胞接種於上表面22上而進行單側培養的情況下，布置聚氨酯多孔膜，使得聚氨酯多孔膜的上表面22暴露於環狀細胞培養裝置60內。另一方面，在將細胞接種於下表面24上以進行單側培養的情況下，布置聚氨酯多孔膜，使得聚氨酯多孔膜的下表面24暴露於環狀細胞培養裝置60內。
[0160](iv)細胞培養過程
[0161](iv)-l雙側(上側和下側)培養
[0162]圖28是圖示使用細胞培養裝置60在聚氨酯多孔膜的兩個表面上進行細胞培養的過程的圖。在紫外線(UV)滅菌之後，本細胞培養過程首先將附著至細胞培養裝置60的聚氨酯多孔膜預處理，在用於AoSMC的培養基中過夜(圖28 (A))。本過程隨後將AoSMC接種於聚氨酯多孔膜的上表面22 (圖28 (B))，並且在37°C和5% CO2的條件下培養AoSMC五天(圖28(C))。然後，本過程將細胞培養裝置60豎向倒置(圖28(D))，並且將培養基調換為用於HUVEC的培養基(圖28 (E))。本過程隨後將HUVEC接種在聚氨酯多孔膜的下表面24上(圖28 (F))，並且在37 °C和5 % CO2條件下培養HUVEC三天。
[0163](iv)-2單側(上側或下側)培養
[0164]在進行單側(上側或下側)培養的情況下，將細胞僅接種於附著於細胞培養裝置60的聚氨酯多孔膜的一個表面(暴露於環狀細胞培養裝置60內的表面)。在進行單側培養的情況下，在UV滅菌之後，本過程將附著於細胞培養裝置60的聚氨酯多孔膜預處理，在用於待接種細胞的培養基中過夜。本過程隨後在聚氨酯多孔膜的上表面22或在下表面24上接種HUVEC或AoSMC，並且在37°C和5% CO2的條件下培養HUVEC三天或AoSMC四天。
[0165][評估方法]
[0166]細胞培養之後，將附著於細胞培養裝置60的聚氨酯多孔膜用PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)洗清一次。本過程隨後在37°C環境下以用於組織固定的4%多聚甲醛/磷酸鹽緩衝溶液(163-20145,由 Wako Pure Chemical Industries,Ltd.製造)進行處理十分鐘，以固定細胞，並且用含有1% Triton-XlOO的PBS和含有0.02% Tween20的PBS進行處理，以提供具有滲透性的細胞膜。然後，如下所述觀察各細胞。
[0167]對於HUVEC，使用對在內皮細胞表面上集中表達的作為細胞表面受體的CD31的小鼠抗體(SIGMA，P8590)作為初次抗體，以及，抗小鼠IgG抗體(Invitrogen，A-11004)被用作二次抗體。用二次抗體處理過的細胞中螢光材料的激發導致HUVEC的CD31被染成紅色。
[0168]對於AoSMC，使用對a SMA (其為平滑肌細胞的細胞骨架蛋白)的兔抗體(Abcam，ab32575)作為初次抗體，以及，使用抗兔IgG抗體(Invitrogen，A-11008)作為二次抗體。用二次抗體處理過的細胞中螢光材料的激發導致AoSMC的a SMA被染成綠色(從洗清到染色，圖 28 01))。
[0169]上述處理之後，將聚氨酯多孔膜與細胞培養裝置60分離，並密封在載玻片上。用雷射共聚焦顯微鏡觀察聚氨酯多孔膜的細胞培養表面(圖28(1))。
[0170][細胞培養結果]
[0171]圖29是照片，其示出了以HUVEC接種在樣品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)上表面22上的單側培養結果。圖30是照片，其示出了以HUVEC接種在樣品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)的下表面24上的單側培養結果。在這兩種情況下，HUVEC的接種密度為5.0 X 14細胞/平方釐米。圖29和圖30 二者都是400倍放大倍率下的觀察結果。
[0172]根據圖29與圖30之間的比較，與聚氨酯多孔膜(非通孔膜)的下表面24相比，在上表面22上觀察到更好的細胞生長。此結果證明，與不具有這種凹凸體的聚氨酯膜相比，在聚氨酯固化期間通過供給水蒸汽構成多孔(以形成凹凸體)的聚氨酯多孔膜起到更好的細胞培養膜的作用。
[0173]圖31Α和圖31Β是照片，其示出雙側(上側和下側)培養結果，AoSMC接種在樣品24的聚氨酯多孔膜(通孔膜)上表面22，以及，HUVEC接種在下表面上24。圖32Α和32Β是照片，其示出雙側(上側和下側)培養結果，AoSMC接種在樣品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)上表面22，以及，HUVEC接種在下表面上24。在這兩種情況下，AoSMC的接種密度為1.0 X 14細胞/平方釐米，而HUVEC的接種密度為5.0X 14細胞/平方釐米。圖31Α和圖3IB以及圖32Α和圖32Β都是400倍放大倍率下的觀察結果。
[0174]根據圖31Α與圖31Β、以及圖32Α與圖32Β之間的比較，與樣品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)相比較，樣品24的聚氨酯多孔膜(通孔膜)提供了 AoSMC和HUVEC 二者的更好細胞生長。這可歸因於AoSMC與HUVEC之間經由聚氨酯膜孔的相互作用。據此，可以預期的是，通過在具有通孔的聚氨酯多孔膜(如樣品24)的兩個表面上進行細胞培養，能夠分析不同細胞之間的相互作用。
[0175]
[0176]下面描述使用如下製備的聚氨酯多孔膜(樣品26、樣品27、以及樣品28)對癌細胞生長抑制作用的研究結果。
[0177][樣品26?樣品28]
[0178]圖33是圖表，其示出樣品26?樣品28的聚氨酯膜的材料組成和固化條件、以及對所得到聚氨酯膜的表面進行測量的結果。根據圖7中所示的生產方法來製備樣品26和樣品27的聚氨酯多孔膜。如下所述，在生產樣品28的聚氨酯膜時，沒有在步驟S120通過供給水蒸汽進行固化。如圖33中所示，樣品26?樣品28的聚氨酯膜的生產中所使用材料的組分類型與樣品I中所使用的相同。圖33按與圖8相同方式示出了各自組分的組成。
[0179]樣品26和樣品27按與樣品I相同的方式進行步驟SllO的層形成步驟，接著，在步驟S120中，在40°C水蒸汽氣氛下進行固化反應30分鐘，並在步驟S130中，在60°C的乾燥氣氛下進行固化反應過夜。在步驟SllO的層形成步驟中，樣品28以2000rpm的轉速在室溫下進行旋塗60秒鐘，接著，在60°C的乾燥氣氛下進行固化反應過夜，而不是在水蒸汽氣氛下進行固化反應。
[0180]如上所述製備的樣品26和樣品27是具有未貫通至下表面24的非通孔膜。樣品28是大致沒有孔形成的無孔膜。此處的「無孔膜」是指:2000倍放大倍率下觀察，在膜的上表面22 (生產期間遠離基材的表面)的指定可見區域中，其中的孔的總面積小於所述可見區域的整個面積的5%。如圖33中所示，在樣品26的聚氨酯多孔膜中，上表面上的平均孔徑(上表面孔尺寸)為16.2微米，以及，膜厚度(峰處膜厚度)為9微米。在樣品27中，上表面的平均孔徑為11.1微米，以及，膜厚度為14微米。在樣品28中，膜厚度為6微米。
[0181][細胞培養條件]
[0182]⑴細胞系
[0183]以下兩種細胞系用於培養:
[0184]TOV2IG(人類卵巢癌細胞):CRL_1I73O(ATCC， American Type CultureCollect1n);以及
[0185]Caov3 (人卵巢癌細胞):HTB_75 (ATCC)
[0186](ii)培養基
[0187]通過以下方式製備用於T0V21G的培養基:M199培養基(Sigma，M4530)和M105培養基(Sigma，M6395)以1:1混合的培養基45毫升與5毫升FBS(Hyclone，SH30071.03)混合，並進一步加入500微升青黴素(Thermo Scientific, SV30010)。通過下述方式製備用於Caov3的培養基:向45毫升的DMEM培養基(Sigma，D5921)與5毫升FBS(Hyclone，SH30071.03)的混合培養基中，添加500微升青黴素(Thermo Scientific, SV30010)和I毫升L-穀氨酸溶液(Sigma, G7513)。
[0188](iii)細胞培養過程
[0189]在樣品26 (聚氨酯多孔膜)、樣品28 (聚氨酯光滑膜)、以及細胞培養板(HTB-75，Falcon)上分別接種T0V21G並進行培養。在樣品27 (聚氨酯多孔膜)、樣品28 (聚氨酯光滑膜)、以及細胞培養板(HTB-75，Falcon)上分別接種Caov3並進行培養。在樣品26?樣品28上接種細胞時，使用形成在基材上的聚氨酯膜，但不將其與基材分開。
[0190]在UV滅菌之後，本細胞培養過程首先將形成於基材上的聚氨酯膜在用於待接種細菌的培養基中預處理過夜。本過程隨後接種T0V21G或Caov3。對於兩種細胞，接種密度都是1.0X 14細胞/平方釐米。各自接種的細胞在37°C和5%二氧化碳的條件下培養48小時。
[0191][評估方法]
[0192]培養之後測量細胞的數量(細胞密度)，並且確定各聚氨酯膜的細胞生長率。更具體地，如下述方式相對於設定為100的培養之後細胞培養板上的細胞數量(細胞密度)來確定細胞生長率，作為培養之後聚氨酯膜上的細胞數量(細胞密度)。如下計算細胞密度:使用螢光顯微鏡(由OLYMPUS CORPORAT1N製造)以100倍放大倍率觀察，在細胞培養板或各聚氨酯膜的中隨機選擇五個可見區域，測量這五個可見區域中的細胞密度的平均值，作為此細胞密度。較低的細胞生長率表示較高程度的細胞生長抑制。
[0193][評估結果]
[0194]圖34是柱狀圖，其示出分別接種於樣品26、樣品28、以及培養板上的T0V21G的培養結果。圖35是這樣的柱狀圖，其示出了分別接種於樣品27、樣品28、以及培養板上的Caov3的培養結果。在圖34和圖35的柱狀圖中，還示出了標準偏差。
[0195]如圖34和圖35中所不,與培養板相比,兩種癌細胞中的任意一種在聚氨酯光滑膜(樣品28)上都有較高的細胞生長率。另一方面，與培養板相比，聚氨酯多孔膜(樣品26和樣品27)有較低的細胞生長率。這證明了癌細胞生長抑制的效果。
[0196]本發明並不局限於上述實施方案、示例或修改，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下可以做出多種的變化和修改。例如，為了解決上述的部分或全部問題，或者為了實現上述的部分或全部有益效果，與
【發明內容】
中所述各方面技術特徵相對應的實施方案、示例或修改的技術特徵可以被取代或進行適當組合。這些技術特徵中的任一者都可以適當地省略，除非該技術特徵在這裡被描述為是必要的。
【權利要求】
1.一種用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法，所述聚氨酯多孔膜的製備方法包括: 第一步驟，在基材上形成未固化的聚氨酯材料層；以及 第二步驟，向形成於所述基材上的所述聚氨酯材料層中遠離所述基材的暴露表面供給水蒸汽，以使所述聚氨酯材料固化，並且使所述聚氨酯材料層具有這樣的多孔結構:其具有位於所述暴露表面上的多個凹凸體。
2.根據權利要求1所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，在所述第二步驟中所提供的所述聚氨酯多孔膜的多孔結構包括多個朝向所述暴露表面開口的孔，以及 在所述聚氨酯多孔膜的膜厚度方向僅存在單一的孔。
3.根據權利要求2所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，所述聚氨酯多孔膜具有0.1?100微米的厚度。
4.根據權利要求3所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，通過對條件進行調整將所述聚氨酯多孔膜的厚度控制到0.1?100微米，所述條件選自:在所述第一步驟中形成為層的所述聚氨酯材料的組成、所述第二步驟中的反應溫度、以及所述第二步驟中的反應時間。
5.根據權利要求2所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，所述聚氨酯多孔膜在所述暴露表面上具有0.1?100微米的平均孔徑。
6.根據權利要求5所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，通過對條件進行調整將所述聚氨酯多孔膜的暴露表面上的平均孔徑控制到0.1?100微米，所述條件選自:所述第二步驟中的反應溫度、所述第二步驟中的反應時間、以及在所述第二步驟中供給至所述暴露表面的水蒸汽的量。
7.根據權利要求1至權利要求6中任一項所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，在所述第二步驟中提供的所述多孔結構包括多個朝向所述暴露表面開口的孔，其中，所述多個孔中的至少一部分被製成貫通至所述聚氨酯材料層與所述基材相鄰的表面的孔。
8.根據權利要求7所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，通過對條件進行調整，將所述多個孔的至少一部分製成貫通至所述聚氨酯材料層與所述基材相鄰的表面的孔，所述條件選自:在所述第一步驟中形成為層的所述聚氨酯材料的組成、所述第二步驟中的反應溫度、以及所述第二步驟中的反應時間。
9.根據權利要求7所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法， 其中，所述第一步驟包括: 混合步驟，將至少包括多元醇和異氰酸酯的聚氨酯材料混合；以及 層形成步驟，將在所述混合步驟中混合的所述聚氨酯材料形成為層，以及 其中，通過對條件進行調整，將所述多個孔中的至少一部分製成貫通至所述聚氨酯材料層與所述基材相鄰的表面的孔，所述條件選自:所述混合步驟與所述層形成步驟之間的時間，以及，所述混合步驟與所述層形成步驟之間的所述聚氨酯材料的環境溫度。
10.根據權利要求1至權利要求9中任一項所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法，所述聚氨酯多孔膜的製備方法進一步包括: 第三步驟，在所述第二步驟之後，停止水蒸汽的供給，進一步固化所述聚氨酯材料。
11.一種通過權利要求1至權利要求10中任一項所述的用於細胞培養和癌細胞生長抑制中至少一種應用的聚氨酯多孔膜的製備方法製備的聚氨酯多孔膜， 所述聚氨酯多孔膜具有第一表面、以及與所述第一表面相對的第二表面，以及，所述聚氨酯多孔膜具有包括多個孔的多孔結構，其中 所述孔各自朝向所述第一表面開口並且具有彎曲內壁面，所述彎曲內壁面朝向所述第二表面凸起。
12.根據權利要求11所述的聚氨酯多孔膜， 其中，所述多個孔的至少一部分形成為貫通至所述第二表面的孔。
【文檔編號】C08G101/00GK104277236SQ201410323478
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2013年7月9日
【發明者】高城誠太郎, 水野恆, 中川博之, 萩山敏行, 吉村篤軌, 田中賢, 佐佐木彩乃, 高橋俊文, 太田剛 申請人:豐田合成株式會社, 國立大學法人山形大學