檢測水稻抗穗瘟病基因Pi25(t)的分子標記SK17的製作方法
2024-03-26 07:05:05 2
專利名稱：檢測水稻抗穗瘟病基因Pi25(t)的分子標記SK17的製作方法
技術領域：
本發明涉及水稻育種中的檢測技術領域，特別涉及檢測水稻抗穗瘟病基因的分子標記。
背景技術：
稻瘟病是廣泛發生於世界各稻區的最重要的水稻病害之一。其中穗瘟對水稻產量的影響尤為嚴重。種植抗稻瘟病水稻品種是解決該問題的最經濟有效的手段。在轉育抗病基因的回交育種中，必須在抽穗之前完成穗瘟抗性的鑑定，常規的穗瘟鑑定必須在抽穗之後才能進行，無法滿足該條件。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供檢測水稻抗穗瘟病基因Pi25(t)的分子標記SK17，提高效率。為此，本發明採用以下技術方案它的特異性PCR引物，上遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為CAGCTGTGGACTCAGACCTCTC，下遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為GCGAACAAGCGATGAATCTATC。
一般，常將抗稻瘟品種和高產品種進行雜交而獲得高產抗瘟品種。谷梅2號為我國水稻病理學家從38000份稻種資源中篩選到的唯一具有持久抗瘟性的半矮稈材料(彭紹裘，中國農業科學，1996，2952-58)。發明人在研究中經三年重複接種中156和谷梅2號重組自交系群體，分析了各個株系的DNA標記基因型，將一個兼具抗葉瘟和穗瘟的基因Pi25(t)定位於水稻的第6染色體，其抗性等位基因來源於谷梅2號。
在本發明過程中，發明人設計出了特異性的PCR引物，它能對水稻苗期所提取的DNA，進行標記鑑定，檢測是否具有抗葉瘟和穗瘟的基因Pi25(t)，即是否具有抗葉瘟和穗瘟能力，其檢測的準確性高，操作簡單。由於谷梅2號是普遍應用的抗稻瘟雜交品種的親本，因此，該分子標記還具有檢測是否具有抗葉瘟和穗瘟的普遍意義，可以作為其他以谷梅2號作為親本的育種材料的檢測工具。
圖1為本發明的分子標記SK17對中156/谷梅2號重組自交系檢測的結果。圖中，P1代表中156；P2代表谷梅2號；其他材料為重組自交系；R為抗穗瘟；S為感穗瘟。
具體實施例方式
在福建稻瘟病區種植上述中156和谷梅2號重組自交群體。在苗期採用本發明所提供分子標記進行抗葉瘟和穗瘟檢測。該分子標記的特異性PCR引物，上遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為CAGCTGTGGACTCAGACCTCTC，下遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為GCGAACAAGCGATGAATCTATC。
一DNA提取1把2cm長的葉尖剪到1.5-ml離心管中，蓋緊蓋子，標上號碼，置於冰上。
2把葉尖剪成0.5cm長的小段，放入研缽中。
3加入400μl提取液(Tris-Hcl 50mM，pH8.0；EDTA 25mM，pH8.0；NaCl 300mM；SDS 1％)，研磨。
4再加入400μl提取液，混勻，吸取400μl到原來的1.5-ml離心管中。
5加入400μl氯仿，混勻，12000rpm離心30秒。
6小心吸取上清夜至一新的1.5-ml離心管中，標上號碼。
7加入800μl無水乙醇，混勻，12000rpm離心3分鐘，棄上清.
8沉澱用75％乙醇洗滌後，自然風乾。
9用50μlTE(Tris-Hcl 10mM，pH8.0；EDTA 1mM，pH8.0)溶解沉澱。保存於-20℃.
10取1μl用於PCR擴增反應。
二PCR擴增PCR擴增反應在PCR擴增儀上進行。
1反應體系如下67mM Tris-Hcl，pH8.8；16mM(NH4)2SO4；1.5mM MgCl；0.01％TWEEN-20；200μM dNTPs；0.5μM上遊引物；0.5μM下遊引物；1單位Taq DNA聚合酶/10μl；1μl DNA/10μl2溫度循環條件如下94℃ 1分鐘；94℃ 45秒，42℃ 45秒，72℃ 1分鐘，35循環；72℃8分鐘三PCR產物檢測將擴增產物，上樣於2.5％瓊脂糖凝膠上，電泳至溴酚藍跑出底線，經溴化乙錠染色後應用凝膠圖象分析系統GDS-7600(UVP)記錄結果。
共在236個株系提取DNA，進行上述檢測過程，結果顯示其中126個具有谷梅2號抗性等位基因(圖1)。
對上述236個株系進行抗稻瘟病鑑定後，發現在上述126個株系中有110個表現為抗性，16個表現為感病。標記和表型的吻合度為87.3％。
如果結合另一個分子標記SA7，它的特異性PCR引物，上遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為CGGGTGAGTAAAACTTATCTGG，下遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為TAGTGATTGAAACGGGTGCACT，則標記和表型的吻合度可高達98.1％。
權利要求
1.檢測水稻抗穗瘟病基因Pi25(t)的分子標記SK17，其特徵在於它的特異性PCR引物，上遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為CAGCTGTGGACTCAGACCTCTC，下遊端自5』端至3』端的核苷酸序列為GCGAACAAGCGATGAATCTATC。
全文摘要
本發明提供了檢測水稻抗穗瘟病基因Pi25(t)的分子標記SK17，它的特異性PCR引物，上遊端自5′端至3′端的核苷酸序列為CAGCTGTGGACTCAGACCTCTC，下遊端自5′端至3′端的核苷酸序列為GCGAACAAGCGATG AATCTATC。它能對水稻苗期所提取的DNA，進行標記鑑定，檢測是否具有抗葉瘟和穗瘟的基因Pi25(t)，即是否具有抗葉瘟和穗瘟能力，其檢測的準確性高，操作簡單。由於谷梅2號是普遍應用的抗稻瘟雜交品種的親本，因此，該分子標記還具有檢測是否具有抗葉瘟和穗瘟的普遍意義，可以作為其他以谷梅2號作為親本的育種材料的檢測工具。
文檔編號C12Q1/68GK1607255SQ200310100888
公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月15日 優先權日2003年10月15日
發明者莊傑雲, 鄭康樂, 吳建利, 樊葉揚 申請人:中國水稻研究所