表達熱休克蛋白的溶瘤微生物及其應用的製作方法

2024-02-29 06:37:15 3

專利名稱：表達熱休克蛋白的溶瘤微生物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地講，本發明涉及腫瘤疫苗領域。本發明具體涉及可選擇性地在腫瘤細胞中生長的微生物、含有所述該微生物的藥物或藥物組合物，以及使用該微生物殺死局部的及轉移的腫瘤的方法。
背景技術：
目前，治療腫瘤最常用的還是傳統的腫瘤手術切除和放化療療法，它給患者帶來很大的痛苦和負擔。而且，對轉移性腫瘤患者而言，一方面很難將腫瘤徹底手術切除或通過放化療療法徹底殺滅；另一方面，切除原位腫塊，往往有引發腫瘤在身體其它部位生長的風險，結果反而加速了腫瘤的擴散。
通過改變遺傳特性，人們創建了一些能夠選擇性地感染腫瘤細胞的病毒，例如單純皰疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)1-3。雖然這其中的某些病毒具備很強的抗腫瘤活性，在臨床試驗中能夠使腫瘤體積變小甚至完全消除3，但存在的問題是對於轉移性腫瘤的抑制作用不強。原因在於雖然這種病毒通過裂解腫瘤細胞來使腫瘤消退，但實體瘤的病人體內缺乏腫瘤特異性的細胞毒性T淋巴細胞介導的免疫反應4。缺乏免疫反應的原因可能是大部分腫瘤抗原是在腫瘤細胞內，而並不是釋放出來，發生壞死而釋放腫瘤抗原的腫瘤細胞數量也很有限，抗原提呈細胞吸納腫瘤抗原的機率極小。即使在病毒介導的腫瘤細胞裂解後通過增強腫瘤抗原的釋放，呈遞「危險信號」，來激發機體腫瘤特異性免疫反應，但由於只有很少的一部分腫瘤抗原能夠被提呈，激發的免疫反應也非常有限，仍然需要特殊的機制來進一步增強抗腫瘤的免疫反應。
用癌症疫苗進行腫瘤免疫治療的策略主要是將被殺死的腫瘤細胞或其裂解產物同時與佐劑或細胞因子共同使用。癌症疫苗免疫能通過在腫瘤原位進行接種從而激發機體的抗腫瘤免疫反應，這在腫瘤治療研究中將是一個重大的進展。但是，在很多情況下，腫瘤抗原是弱免疫原，也即不能夠引起機體足夠的針對腫瘤抗原的免疫應答反應。現階段利用癌症疫苗治療腫瘤的方式主要為用分離的腫瘤特異性抗原進行免疫；或通過體外將腫瘤細胞與樹突狀細胞融合後對病人進行細胞治療。但是，因為不同病人存在著腫瘤抗原的個體差異性；而且同一病人在腫瘤發展的不同階段，腫瘤細胞所表達的特異性抗原也不相同；即使在同一病人的腫瘤的某一發展時期，其腫瘤細胞內也存在著多種腫瘤抗原。由於這種種限制，導致現階段用癌症疫苗治療腫瘤存在著許多缺點必須針對每個病人設計相應的腫瘤抗原，技術操作細節各不相同，操作環節多，每個環節的技術要求高，操作中容易造成汙染；而且由於病人體內多種抗原的動態發展，使得這種體外操作技術不一定有效。在臨床治療實踐中，必須針對每個病人製備獨特的癌症疫苗，難度大，費用高，可行性差。
綜上所述，傳統的手術治療和放化療對機體本身造成傷害而且難以消除轉移性腫瘤。現階段用病毒等作為載體對腫瘤進行基因治療也只能針對局部腫瘤，對轉移性腫瘤也無能為力。用白介素，幹擾素等細胞因子對腫瘤進行免疫治療只能激發免疫調節反應和很少的CTL細胞介導的對腫瘤細胞的特異性殺傷效應。最近發展的「癌症疫苗」療法非常昂貴且沒有普遍適用性。因此，到目前為止，還缺乏一種高效低毒、給藥方便的腫瘤治療物質，該物質在被施用給腫瘤患者後能在體內誘導出有效的抗腫瘤免疫反應，從而將腫瘤，包括轉移性腫瘤有效的殺滅。
發明概述本發明總的目的在於找到一種能在腫瘤患者體內誘導特異性抗腫瘤免疫反應的物質，並將該物質對腫瘤患者施用，從而不但將局部的腫瘤殺滅而且還可以將轉移的腫瘤殺滅。具體來講，本發明包括如下幾個方面本發明的一個目的在於提供一種溶瘤微生物，其中該微生物表達能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白，並且該微生物能選擇性地在腫瘤細胞中生長以裂解腫瘤細胞。
本發明的再一目的在於提供一種治療腫瘤的藥物，其含有本發明的溶瘤微生物，其中該微生物表達能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白，並且該微生物能選擇性地在腫瘤細胞中生長以裂解腫瘤細胞。
本發明的又一目的在於提供一種藥物組合物，其含有a)能選擇性地在腫瘤細胞中生長的微生物；和b)能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白。
本發明的另一個目的在於提供一種治療腫瘤、特別是惡性腫瘤的方法，該方法包括給腫瘤患者施用免疫有效量的本發明的藥物或藥物組合物。
在一個具體實施方案中，本發明提供了提供一種溶瘤微生物，其中該微生物表達能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白，而且該微生物能選擇性地在腫瘤細胞中生長以裂解腫瘤細胞。所述的能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白優選是熱休克蛋白。該微生物能選擇性地在腫瘤細胞中生長，從而將腫瘤細胞殺死。所述的熱休克蛋白能粘附腫瘤細胞溶解所釋放的腫瘤抗原並與抗原提呈細胞結合，從而誘導患者的抗腫瘤免疫反應。所述微生物優選為選擇性地在腫瘤細胞中複製的病毒或細菌。所述病毒實例是腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質炎病毒或其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的病毒。所述細菌的實例包括傷寒沙門氏菌、雙岐桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的細菌。所述的熱休克蛋白來源於哺乳動物(包括但不限於人、非人靈長類動物和齧齒動物)和病原微生物，所述的病原微生物包括但不限於結核分支桿菌、麻風分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。
在另一個具體實施方案中，本發明提供一種治療腫瘤的藥物，其含有本發明的溶瘤微生物，該微生物表達能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白。該微生物可進一步含有編碼免疫增強分子的DNA序列。所述的藥物可進一步含有可藥用載體。該發明的藥物可以單獨使用，也可以和其它形式的免疫治療劑聯合使用，包括細胞因子和傳統中藥。
在另一個具體實施方案中，本發明提供一種藥物組合物，其含有a)能選擇性地在腫瘤細胞中生長的微生物；和b)能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白。所述微生物優選為選擇性地在腫瘤細胞中複製的病毒或細菌。該病毒或細菌還優選進一步含有編碼免疫增強分子的DNA序列。所述病毒的實例是腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質炎病毒或其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的病毒。所述細菌的實例包括傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的細菌。所述的能粘附腫瘤細胞抗原並被抗原提呈細胞所識別的蛋白例如是來源於哺乳動物(包括但不限於人、非人靈長類動物和齧齒動物)和病原微生物的熱休克蛋白。所述的病原微生物包括但不限於結核分支桿菌、麻風分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。該熱休克蛋白能粘附腫瘤細胞溶解所釋放的腫瘤抗原並與抗原提呈細胞結合，從而誘導患者的抗腫瘤免疫反應。本發明的藥物組合物還可進一步含有可藥用的載體。
在另一個具體實施方案中，本發明提供一種治療腫瘤、特別是惡性腫瘤的方法，該方法包括給腫瘤患者施用免疫有效量的本發明的藥物或藥物組合物。可替代地，也可對腫瘤患者施用抗原提呈細胞，其中所述的細胞已與粘附有腫瘤抗原的並對抗原提呈細胞具有親和性的蛋白接觸。所述的粘附有腫瘤抗原的並對抗原提呈細胞具有親和性的蛋白優選為熱休克蛋白。該接觸可通過兩種途徑實現其一是使本發明的表達熱休克蛋白的能選擇性地在腫瘤細胞中生長的微生物感染腫瘤細胞，然後將細胞裂解液與抗原提呈細胞接觸；其二是將熱休克蛋白和能選擇性地在腫瘤細胞中生長的微生物同時注射到腫瘤中，然後分離、提取結合有熱休克蛋白的抗原提呈細胞。
本發明通過溶瘤微生物將腫瘤細胞裂解，同時溶瘤病毒所表達的熱休克蛋白對釋放的腫瘤抗原進行吸附，並隨後由樹突狀細胞將腫瘤抗原加工提呈，來激發機體本身的腫瘤特異性免疫反應；不但能夠溶解局部腫瘤，還可以進一步抑制並殺滅轉移腫瘤。與單獨用溶瘤病毒進行腫瘤治療相比，本發明突破原有技術只能治療局部腫瘤的局限性，不但能夠治療局部腫瘤，對轉移腫瘤同樣有效。
本發明中溶瘤微生物所表達的能粘附腫瘤細胞抗原的蛋白，能夠將患者自身腫瘤細胞裂解後釋放的腫瘤特異性抗原實時提呈，並且不論腫瘤細胞所處的發展階段以及腫瘤抗原的種類是否相同，都能激發機體針對自身特定的腫瘤抗原有效的免疫反應。本發明實現了在不同個體內利用個體自身的抗原提呈細胞在體內實時動態的將其自身特異性的腫瘤抗原進行加工和提呈，從而激發針對各自不同腫瘤抗原的特異性免疫反應，達到了既簡單又有效的治療效果。本發明克服了現有技術中的由於腫瘤抗原的個體差異性，用「癌症疫苗」進行治療的主要缺陷例如，必須在得到病人自體的腫瘤細胞，並在體外進行培養及一系列的實驗操作，以及隨後的疫苗接種等種種缺陷。舉例來說，本發明通過溶瘤微生物將腫瘤細胞裂解，同時由溶瘤微生物所表達的對抗原提呈細胞具有親和性的蛋白或獨立地加入的對抗原提呈細胞具有親和性的蛋白對釋放的腫瘤抗原進行吸附，並隨後由抗原提呈細胞如樹突狀細胞將腫瘤抗原加工提呈，來激發機體本身的腫瘤特異性免疫反應；不但能夠溶解局部腫瘤，還可以進一步抑制並殺滅轉移腫瘤。
附圖簡述

圖1是本發明所構建的表達熱休克蛋白的重組HSV-1病毒質粒pHSV-HSP的圖。質粒pHSV-HSP含有CMV啟動子控制下的HSP70基因和SV40多聚腺苷酸序列(SV40poly(A))。該質粒還包括選擇標記、E.coli的複製起點(ColEl ori)、HSV順式調控序列，HSVψ(HSV切割和包裝信號)和HSV ori(HSV的DNA複製起點)。
圖2是顯示重組病毒HSV-HSP的體外細胞毒性效果的圖。其中將鼠腫瘤細胞CT26培養於24孔板(每孔1×105)並由HSV-HSP或HSV以不同的感染複數(0.01-10)感染。感染4天後用Promega試劑盒測定細胞毒性(％)。圖2中當感染複數為1時，細胞毒性已達99％以上。
圖3表示重組的HSV-HSP在原位腫瘤內注射後能抑制遠端腫瘤的良好能力。在小鼠的肋部雙側對稱接種CT26細胞。當腫瘤分別長到最大直徑為0.5cm時，僅在鼠的右側腫瘤瘤內注射接種HSV-HSP(1×106)(以實心方塊表示)、HSV載體(1×106)(以實心菱形表示)或HSP70(以實心三角表示)作為對照(該日設為第0日)，過7天再進行第二次接種(每組6隻)。與對照組相比，經瘤內注射接種HSV-HSP的腫瘤和其對側未被接種的腫瘤在注入HSV-HSP後都會有顯著的癌症生長減慢(p＜0.001，感染後25天，非配對的t檢驗)。HSV-HSP在抑制兩側的腫瘤生長顯著優於HSV單獨使用(p＜0.001，感染後25天，非配對t檢驗)圖4是本發明所構建的表達熱休克蛋白的重組pcDNA-HSP質粒圖。將PCR擴增得到的HSP基因通過平端連接連到真核表達質粒pcDNA3.1上，重組質粒pcDNA-HSP含有CMV啟動子控制下的HSP70基因和BGH多聚腺苷酸序列(BGHpolyA)，該質粒還包括選擇標記以及複製起點SV40ori.。
圖5表示表達熱休克蛋白的沙門氏菌SL3261(pcDNA-HSP)在原位腫瘤內注射後能抑制遠端腫瘤的良好能力。在小鼠的肋部雙側對稱接種SMMC7721細胞。當腫瘤分別長到最大直徑為0.5cm時，僅在鼠的右側腫瘤瘤內注射接種含有質粒pcDNA-HSP的沙門氏菌(aroA-)(1×107)(以實心方塊表示)、不含質粒的沙門氏菌(aroA-)(1×107)(以實心菱形表示)或HSP70(以實心三角表示)作為對照(該日設為第0日)，過7天再進行第二次接種(每組6隻)。與對照組相比，在注入pcDNA-HSP的沙門氏菌(aroA-)後經瘤內注射接種含有質粒pcDNA-HSP的沙門氏菌(aroA-)的腫瘤和其對側未被接種的腫瘤都會有顯著的癌症生長減慢(p＜0.001，感染後25天，非配對的t檢驗)。HSV-HSP在抑制兩側的腫瘤生長顯著優於HSV單獨使用(p＜0.001，感染後25天，非配對t檢驗)。
發明詳述在本專利申請的上下文中，採用的術語具有本領域中所熟知的一般含義。為清楚起見，本專利申請中的下列術語具有如下所說明的含義「溶瘤微生物」這一術語在此定義為經過遺傳改造的一類能夠進入腫瘤細胞，並通過選擇性地在腫瘤細胞內大量複製而導致腫瘤細胞裂解死亡的微生物。溶瘤微生物的實例包括如下定義的溶瘤病毒和溶瘤細菌。
「溶瘤病毒」這一術語在此定義為一種經過遺傳改造的病毒，該病毒能夠選擇性地在腫瘤細胞內複製並殺死腫瘤細胞而不論腫瘤細胞的p53或其它蛋白是否突變。溶瘤病毒的實例包括單純皰疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)等。
「溶瘤細菌」這一術語在此定義為一種經過遺傳改造的細菌，該細菌能夠在腫瘤細胞內複製並殺死腫瘤細胞。已知一些細菌的突變株可以作為腫瘤的基因治療載體20。例如，沙門氏菌中編碼嘌呤(pur)或芳香族胺基酸(aroA)的基因突變後，不能自己合成這些對其必不可少的營養物質。這些物質在正常細胞中並不存在，而腫瘤細胞由於遺傳特性的改變可以提供這些營養物質。所以這些營養缺陷型細菌能夠選擇性地在腫瘤細胞內擴增而使其裂解，如Salmonellatyphimurium YS72(pur-)在荷瘤鼠腹膜接種2天後，可檢測到在腫瘤細胞中與在正常肝細胞中的比例為9000∶120。將表達熱休克蛋白的基因引入這些細菌突變株，再利用突變型細菌能夠在腫瘤細胞中富集並使其裂解的這種特性，這些細菌完全可以作為本發明的溶瘤微生物使用。
「粘附腫瘤抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白」這一術語在此定義為一類蛋白，該蛋白能夠通過吸附、粘附或結合等作用與腫瘤特異抗原多肽連接而形成蛋白-多肽複合物，並通過抗原肽伴侶轉移作用將抗原提交給樹突狀細胞等抗原提呈細胞，抗原被加工提呈，激發機體免疫反應。這類蛋白的實例包括以熱休克蛋白為主的分子伴侶蛋白。
「熱休克蛋白」這一術語在此定義為一族高度保守具有ATP酶活性的分子，包括只是保守替換和/或修飾的熱休克蛋白變體。熱休克蛋白在所有的原核生物以及大多數真核細胞中都存在；無論是否存在外界壓力，其在蛋白質代謝中都起著重要作用，包括在蛋白質從頭合成途徑中蛋白質的摺疊和跨膜轉運以及錯誤摺疊後的蛋白的降解。所述熱休克蛋白，包括從腫瘤細胞和細菌感染的細胞中得到的hsp70和grp94/gp96，他們都能夠激發細胞性的免疫反應。「佐劑」是一類和抗原共同使用或其本身就能夠充當抗原來能夠增強免疫反應的物質。
「抗原」這一術語在此定義為能激發免疫應答的一種分子。免疫反應包括產生抗體，具備特異的免疫活性細胞的活化，或兩者的組合。抗原可以產生於生物體、蛋白或抗原的亞單位、被殺死或被去活化的全細胞或裂解物。「癌症」這一術語在此定義為一種惡性的細胞性腫瘤並能夠侵襲其它細胞。其實例包括但並不限於乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宮癌，皮膚癌，胰腺癌，結腸癌和肺癌。
「癌症疫苗」這一術語在此定義腫瘤特異性抗原分子或接觸過腫瘤細胞的免疫細胞。腫瘤細胞所表達的，使腫瘤細胞具有免疫原性從而能被免疫系統識別的蛋白質為腫瘤特異性抗原，通過體外製備該抗原蛋白質或其具有免疫效應的抗原表位多肽；或通過體外免疫細胞與腫瘤細胞接觸使免疫細胞能夠識別該種抗原，上述蛋白或多肽或免疫細胞即可作為治療性的癌症疫苗。「殺滅腫瘤」這一術語在此定義為能夠有效地抑制腫瘤的擴增和浸潤與轉移以及使腫瘤消退或轉化成良性。
「表達」這一術語在此定義為由其啟動子啟動的一段特定序列的轉錄和/或翻譯。
「主要組織相容性複合物」或「MHC」這一術語在此定義為一簇特殊的基因，其中大部分編碼在細胞表面進行抗原提呈的蛋白，其中對決定組織相容性最重要的包括I類組織相容性複合物，或MHCI，其功能主要是將抗原提呈給CD8T淋巴細胞；II類組織相容性複合物，或MHCII，其功能主要是將抗原提呈給CD4T淋巴細胞。
「啟動子」這一術語在此定義為一段核酸序列，能夠調控一段特殊的核酸序列的轉錄。啟動子這一術語包括增強子、沉默子和其它順式調控原件。「T淋巴細胞」在此定義為胸腺來源的能夠參與一系列的細胞介導的免疫反應的一類細胞。
「抗原提呈細胞」在此定義為功能為加工提呈抗原給T細胞和B細胞的一類細胞，該類細胞包括樹突狀細胞，巨噬細胞和B細胞。
「免疫增強分子」在此定義能增強免疫作用的分子，包括IL-2、IL-12、TNF、IFN、GM-CSF、趨化因子等在內的細胞因子和免疫共刺激分子如免疫共刺激分子B7等。
「免疫有效量」這一術語在此定義為能夠有效地激發機體產生抑制或殺死腫瘤細胞的免疫反應的劑量。
在本發明中，我們採用的策略是用表達能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白的溶瘤微生物感染局部腫瘤，該溶瘤微生物在腫瘤細胞中生長而在正常細胞中基本上不生長。溶瘤微生物在腫瘤細胞中生長的同時，表達能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白，而且由於溶瘤微生物在腫瘤細胞中的生長，腫瘤細胞裂解，釋放出各種腫瘤細胞的抗原。這些抗原與溶瘤微生物所表達的能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白結合，形成抗原一蛋白複合物。該複合物進一步被抗原提呈細胞識別，經抗原提呈細胞加工後提呈給細胞毒性T淋巴細胞，從而對腫瘤細胞產生特異性的細胞免疫反應。在一個具體的實施方案中我們採用表達熱休克蛋白的溶瘤微生物感染局部腫瘤。表達的熱休克蛋白能夠結合腫瘤抗原通過癌症疫苗免疫的方式起到免疫調節的作用。在本發明中，熱休克蛋白在原位腫瘤的表達能夠顯著增強具備複製能力的溶瘤微生物對轉移腫瘤的抗瘤活性。在本發明中，將表達熱休克蛋白的溶瘤微生物給予患者後使原位腫瘤細胞裂解，從而使腫瘤相關抗原釋放，我們在不需要體外製備腫瘤抗原以及預先知道患者的特異性腫瘤抗原的情況下，利用表達的熱休克蛋白能夠和釋放的腫瘤抗原結合的特性，進一步引發或增強對腫瘤抗原的免疫反應。在存在或缺乏佐劑或抗原提呈細胞的情況下，都能通過給予患者表達熱休克蛋白的溶瘤微生物來治療腫瘤。所述溶瘤微生物優選為選擇性地在腫瘤細胞中複製的病毒或細菌。所述病毒的實例是腺病毒如ONYX-015、單純皰疹病毒如HSV-1、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質炎病毒或其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的病毒。所述細菌的實例包括傷寒沙門氏菌、雙岐桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他天然存在和經誘變篩選後能選擇性地在腫瘤細胞中生長的細菌。
本發明中溶瘤微生物所表達的一類蛋白為能夠粘附腫瘤抗原並對抗原提呈細胞有親和性的蛋白，這類蛋白能夠結合腫瘤特異抗原多肽形成蛋白-多肽複合物，並通過抗原肽伴侶轉移作用將抗原提交給樹突狀細胞等抗原提呈細胞，抗原被加工提呈，激發機體特異性CTL免疫反應。這類蛋白的實例包括以熱休克蛋白為主的分子伴侶蛋白。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)是一類高度保守並具有ATP酶活性的蛋白家族，在所有的原核生物以及大多數真核細胞中都存在。無論是否存在外界壓力，熱休克蛋白在蛋白質代謝中都起著重要作用，包括在蛋白質從頭合成途徑中蛋白質的摺疊和跨膜轉運以及錯誤摺疊後的降解5。熱休克蛋白，包括從腫瘤細胞和細菌感染的細胞中得到的hsp70和grp94/gp96，都能夠激發細胞性的免疫反應6-7。熱休克蛋白的免疫原性主要是由結合到其分子上的多肽所產生8。產生的熱休克蛋白-抗原多肽通過一種不表達內生性抗原的特異性細胞將抗原呈遞給T淋巴細胞後，從而激活免疫系統。這些結果表明熱休克蛋白作為分子伴侶能夠將抗原性的多肽呈遞給抗原提呈細胞，可能是通過使這些多肽與MHCI和MHCII分子結合而進入MHCI和MHCII呈遞抗原途徑；這些抗原多肽會進一步被提呈給CD8+細胞毒性T細胞和CD4+輔助性T細胞。
各種熱休克蛋白、其片斷或各種修飾(包括但不限於一個或多個胺基酸地添加、缺失和/或替換等)變體均可用於本發明，只要該熱休克蛋白、片段或變體保持與腫瘤細胞抗原多肽結合的能力即可。同理，本發明的溶瘤微生物也包括各種變體，只要該微生物具有選擇性地在腫瘤細胞中複製和生長從而將腫瘤細胞裂解的能力即可。因此，本領域的普通技術人員可以認識到，將編碼能粘附腫瘤抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白如熱休克蛋白的基因引入溶瘤微生物的基因組或表達質粒中，只要保證所述的基因與調控序列如啟動子和終止子有效地連接，所述的溶瘤微生物如HSV-1或ONYX-015就可以表達能粘附腫瘤抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白如熱休克蛋白。在不背離本發明的範圍和精神情況下，可對本發明申請中各種實例進行不同改變或修改，這一點對於本領域的技術人員是很顯而易見的。
在本發明的一個更為具體的實施方案中，本發明公開了能夠表達熱休克蛋白的溶瘤病毒，其能夠殺死局部腫瘤並通過釋放腫瘤抗原來激發機體的抗腫瘤免疫反應。編碼熱休克蛋白HSP70的基因被置於啟動子CMV啟動子的控制之下。在所有的應用中，「溶瘤病毒」這一術語是指能夠在腫瘤細胞內複製並將其殺死的任何病毒，例如單純皰疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)1-3。其中的一個例子ONYX-015為一種能夠選擇性的在p53功能缺陷的腫瘤細胞內複製的減毒腺病毒9-14。在臨床試驗中，這種病毒表現非常強的抗腫瘤活性，能夠有效的使腫瘤體積減小甚至消除。
在一個具體的實施例中，採用的溶瘤病毒是單純皰疹病毒。一種具備複製能力的單純皰疹病毒的突變株經過大量的不同種的動物模型試驗發現為非病原性的16並被用於人的原發性腦部腫瘤治療的臨床試驗。這種單純皰疹病毒突變株在分裂細胞內的複製能夠導致細胞死亡，其在非分裂細胞內的複製能力則非常弱16。這種單純皰疹病毒突變株在接種到荷瘤鼠後能夠選擇性的在腫瘤內複製，從而抑制原位腫瘤的生長並延長荷瘤鼠的生存期15-17。這種病毒突變株能夠攜帶編碼熱休克蛋白HSP70的擴增質粒。
應用於單純皰疹病毒表達熱休克蛋白增強免疫反應的熱休克蛋白是來源於人的，包括人的HSP70和HSP96。可以替代的熱休克蛋白也可以來源於病原微生物，包括結核分支桿菌(M.tuberculosis)，麻風分支桿菌(M.leprae)，克氏錐蟲(Trypanoma cruzi)，惡性瘧原蟲(Plasmodium falcipaum)；以及其它物種如靈長類，鼠等哺乳動物。在本發明的一個具體實施例中，使用HSP70。HSP70的cDNA是從人的cDNA文庫中通過PCR擴增得到並進行了DNA序列測定。用Klenow酶補平上述PCR產物的DNA片段兩端，然後平末端插入連接於質粒pHSV中的SpeI位點，得到質粒pHSV-HSP。
在另一個具體的實施例中，採用的溶瘤病毒是腺病毒。所採用的腺病毒突變株能夠選擇性的在腫瘤細胞中複製而使細胞裂解死亡，其在正常細胞內的複製能力則非常弱10。這種腺病毒突變株在接種到荷瘤鼠後能夠選擇性的在腫瘤內複製，從而抑制原位腫瘤的生長並延長荷瘤鼠的生存期9-11。這種病毒突變株能夠攜帶編碼熱休克蛋白HSP70的擴增質粒。應用於腺病毒表達熱休克蛋白增強免疫反應的熱休克蛋白是來源於人的，包括人的HSP70和HSP96。可以替代的熱休克蛋白也可以來源於病原微生物，包括結核分支桿菌(M.tuberculosis)，麻風分支桿菌(M.leprae)，克氏錐蟲(Trypanomacruzi)，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)；以及其它物種如靈長類，鼠等哺乳動物。在本發明的具體實施例中，使用HSP70。HSP70的cDNA是從人的cDNA文庫中通過PCR擴增得到。用XhoI，SalI和EcoRV限制性內切酶切割質粒pAdIR-BG，瓊脂糖電泳分離酶切片段，回收5.3kb大片段，用Klenow酶補平片段兩端，此為片段pAd-RSV。用Klenow酶補平PCR產物的DNA片段兩端，與片段pAd-RSV正向平端連接，得到質粒pAd-RSV-HSP70。
在本發明中，編碼熱休克蛋白70的序列受溶瘤病毒HSV的啟動子的轉錄調控。「啟動子」是指能被細胞自體的或引入的轉錄複合物所識別的DNA序列，其對於一個基因地轉錄起始是必須的。對於啟動子是如何組織的，人們通過分析多種不同病毒如CMV(巨細胞病毒)，HSV胸苷激酶(tk)和SV40的啟動子來進行研究。近來的研究表明，啟動子由不連續的功能調控元件組成，每個約7-20bpDNA，並且包括一個或更多的由轉錄活化或抑制蛋白的識別位點。其它類型的啟動子例如增強子能夠調控轉錄起始的頻率。典型的啟動子序列都是位於起始位點上遊30-110bp處，儘管現在表明有包含在起始位點下遊的調控元件的啟動子。啟動子各元件之間的距離通常是可改變的，所以當某些元件被插入或移去時仍能保持啟動子的正常功能。在tk啟動子中，在保持活性的前提下，啟動子各元件之間的距離最多可以增加到50bp。根據各啟動子類型不同，各元件可互相協同或獨立的活化轉錄反應。
一個啟動子可以是一個基因或一段序列自身的，即從編碼區和/或外顯子的上遊5』端非編碼序列得到。這樣的啟動子為「內源性」啟動子。我們同樣可以得到這個基因或這段序列上遊或下遊的增強子。可替代的，將並非基因或序列自身的啟動子也即重組或異源啟動子置於編碼序列的上遊進行轉錄調控會有特殊優勢。重組或異源的啟動子包括並非在自然環境中與基因或序列相關的增強子。這種啟動子和增強子可包括其它基因的啟動子和增強子，以及從原核生物，病毒或真核細胞中分離的啟動子和增強子，或者並非「天然存在」的啟動子和增強子，例如不同轉錄調控區的不同調控元件的組合，和/或引入能夠影響功能的突變。而且在合成啟動子或增強子序列時，還可以使用重組克隆和/或包括PCR在內的核酸擴增技術。而且，也可以使用其它細胞器如線粒體，葉綠體的能夠調控轉錄和/或表達的序列。
在實施例中所採用的為巨細胞病毒(CMV)的前早期啟動子序列。這個啟動子屬於組成型的強啟動子能夠啟動其下遊序列的高水平表達。同時，也可使用其它組成型的啟動子猴病毒SV40前早期啟動子，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子，人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子，鼠病毒啟動子，鳥白血病病毒啟動子，EB病毒前早期啟動子，勞氏肉瘤病毒啟動子，以及人類基因啟動子，例如(但不限於)肌動蛋白啟動子，肌球蛋白啟動子，血紅蛋白啟動子，肌酸啟動子。而且本發明並不僅限於用組成型啟動子，也可以選用誘導型啟動子。本發明中誘導型啟動子的使用提供了在需要時能打開其相連的下遊核酸序列表達的分子開關，並在不需要其表達時將其關閉。誘導型啟動子包括但並不局限於金屬硫蛋白啟動子，糖皮質激素啟動子，孕酮啟動子，四環素啟動子。而且，本發明還包括使用組織特異性啟動子，其轉錄活化只能在特定組織內進行。組織特異性啟動子包括但不限於現在已知的如HER-2啟動子，PSA相關啟動子序列。
對於熱休克蛋白的表達，需要一個典型的多聚腺苷酸信號來完成轉錄的正確多聚腺苷酸加尾反應。多聚腺苷酸的性質對於成功的實施本發明並不是至關重要的，任何類型的中止序列都可以使用。優選的實施例包括SV40多聚腺苷酸信號，LTR多聚腺苷酸信號和/或牛生長激素多聚腺苷酸信號，對於不同的靶向細胞應以方便原則和/或已知能在其中正確行施功能的原則選擇多聚腺苷酸信號。也可以選用轉錄中止位點來中止轉錄。這些元件應能夠增強轉錄的翻譯中止水平和/或避免通讀到其它序列。重要的一點是，本發明中溶瘤病毒正確進行蛋白表達並不需要病毒整合到受體細胞的基因組中。病毒載體可以以游離體狀態存在於靶細胞中。例如，在某些類型的細胞中病毒載體表達目標蛋白並不需要病毒的複製。這些細胞例如肌肉細胞通常是不能正常複製的，被導入非分裂細胞的表達載體在載體本身不複製的情況下能夠表達目的蛋白。
本發明的一個應用是將表達人熱休克蛋白的皰疹病毒或腺病毒直接加入到瘤內，從而引發機體針對腫瘤抗原的特異性免疫反應，殺死局部腫瘤和轉移的腫瘤。給予表達熱休克蛋白的皰疹病毒或腺病毒進行治療可以單獨使用，也可以和其它形式的免疫治療劑聯合使用，包括細胞因子和傳統中藥。在許多實際應用中，免疫調節劑如佐劑或稱為免疫刺激劑被用來增強免疫反應。殺死局部腫瘤並誘發免疫反應包括將表達HSP的溶瘤病毒直接或間接的給予到機體的腫瘤內。大量研究表明，同時給予細胞因子或表達細胞因子的質粒能夠增強抗腫瘤的免疫活性。一個本領域的技術人員很容易認識到可以將細胞因子的核酸序列和HSP的核酸序列放入同一載體來共同應用，這樣就避免使用兩個表達載體。本研究領域的技術人員從本發明中可以認識到溶瘤病毒可以應用於腫瘤的治療。對於腫瘤治療來說，一個技術人員能認識到溶瘤病毒必須攜帶熱休克蛋白的基因並且基因與啟動子是有效的連接的。另外，一個本領域的技術人員很容易認識到，為了提高熱休克蛋白在腫瘤細胞中的表達量可以將多個拷貝的HSP基因引入同一載體中。
在另一個具體實施例中，採用能夠特異性的在腫瘤細胞內複製的細菌作為表達熱休克蛋白的載體，因為所用的沙門氏菌為aroA缺陷型19，其所需要的營養只能由腫瘤細胞提供，在正常細胞中不能夠複製生長。所以該突變株能夠選擇性的在腫瘤細胞內複製並通過其增殖使腫瘤細胞裂解死亡。沙門氏菌表達的熱休克蛋白能夠結合腫瘤細胞裂解所釋放的抗原並將其傳送給抗原提呈細胞，從而激發了CTL介導的能夠特異性殺死腫瘤細胞的免疫反應，從而抑制了腫瘤的生長，延長了荷瘤鼠的生存期。
在適當的情況下，重組病毒或細菌可根據其給予的途徑不同被加工成固體，半固體，液體或氣霧劑形式。可以利用已知的方法來阻止組合物在到達靶器官前被釋放和吸收。本發明中可採用任何一個可以接受的藥劑形式保證本發明組分的有效性。在製劑時，本發明中的微生物可以單獨使用，也可和其它的藥學上活性組分以適當的比例結合/配合使用。應保證在給藥時有足夠多量的含有表達能粘附腫瘤抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白如熱休克蛋白的核酸序列的溶瘤微生物如溶瘤病毒或溶瘤細菌，從而其基因產物能提供藥學上有效的劑量。表達熱休克蛋白的溶瘤病毒或溶瘤細菌可以單獨使用也可以和不同的佐劑共同配製。
通常，可將本發明的溶瘤微生物以免疫有效量通過本領域已知的各種常規的和可接受的方式單獨或與其它治療劑一起聯合給藥。免疫有效量將根據疾病的嚴重程度、個體的年齡和相對健康狀況、所用微生物的效力以及其它因素有很大變化。通常，本領域普通技術人員可以根據個人知識以及本申請所公開的內容確定出用於治療給定腫瘤時的本發明的微生物的免疫有效量。可以和本發明的微生物共同使用的佐劑包括(但不限於)弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁、卡介苗(BCG)、脂多糖(LPS)、脂質A類似物、胞壁醯二肽(MDP)及其類似物、內毒素(LT)和霍亂毒素(CT)。
本發明的微生物可以以藥物組合物的形式通過下列途徑之一給藥瘤內注射、口服、全身性給藥(例如，經皮、鼻內或通過栓劑給藥)或胃腸外給藥(例如，肌肉內、靜脈內或皮下)。組合物可以是片劑、丸劑、膠囊、半固體、散劑、緩釋製劑、溶液劑、混懸劑、氣霧劑的形式或是任何其它適宜的組合物，並且通常由本發明溶瘤微生物以及至少一種可藥用賦形劑組成。可藥用賦形劑是無毒的、對所述微生物的活性沒有實質性損害的、有助於給藥的並且不會對其他活性成分的免疫或治療效果產生不利影響物質。所述賦形劑可以是任何固體、液體、半固體，或者在氣霧劑組合物的情況下，可以是氣體賦形劑。這些賦形劑是本領域技術人員易於得到的。
固體藥物賦形劑包括澱粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、脫脂奶粉等。液體和半固體賦形劑可以選自水、乙醇、甘油、丙二醇和各種油，包括來源於石油、動物、植物或合成的油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。優選的液體載體，特別是用於可注射溶液的液體載體包括水、鹽水、葡萄糖水溶液和二甘醇。
組合物中本發明微生物的量可以根據製劑的種類、單位劑量的大小、賦形劑的種類以及藥學領域技術人員已知的其它因素有很大變化。而且，實際的劑量和治療方案會根據其它因素如該發明的組分是否和其它治療組分結合，個體的藥物動力學，藥物分布和代謝等各不相同而有所變化。而且，加入細胞的病毒量也隨著插入載體的治療基因的長度、穩定性，和序列的性質而不同，是一個由經驗決定的變量，很可能被非本發明中方法之外的其它因素所改變。一個本領域的技術人員可以根據具體情況的出現很容易的進行調整。
雖然以上說明書是以表達能粘附腫瘤抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白的重組溶瘤微生物來進行說明的。本領域的技術人員完全可以認識到，也可以將溶瘤微生物與粘附腫瘤抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白如熱休克蛋白組合在一起使用，而不需對溶瘤微生物進行進一步的遺傳改造。下面以實施例的方式具體描述本發明。以下的實施例是舉例性的，因此不能將這些實施例看成是對本發明的限制。
實驗實施例實施例1人熱休克蛋白(HSP70)基因的擴增及克隆利用PCR方法從人腫瘤細胞系SKOV3細胞的cDNA中擴增HSP70基因。上遊引物序列為GGT ATG GAA GAT CCC TCG AGA TC，下遊引物序列為TACTA ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG.使用PE公司的PCR儀，反應條件是每個反應的引物終濃度是30pM，dNTP為100mM，模板DNA為100ng，Taq DNA聚合酶為2.5個單位。其他反應條件依照GeneAmp DNA擴增試劑盒中的使用說明進行，每個反應總體積為100微升。每份反應混合物上覆蓋以75微升礦物油。擴增共進行30個循環，每一循環包括變性步驟92℃1分鐘，退火步驟50℃1分鐘，延長步驟72℃2分鐘。反應結束後，使用Qiagen公司的PCR產物純化試劑盒純化所得產物。
溶瘤病毒-單純皰疹病毒的構建我們採用的是具備複製能力的、突變型I型單純皰疹病毒(HSV-1)15-18。其中γ34.5基因被缺失。HSV突變株在分裂型細胞中的複製會導致細胞死亡；其在非分裂型細胞中的生長能力顯著減弱16。這種單純皰疹病毒突變株在接種到荷瘤鼠後能夠選擇性的在腫瘤內複製，從而抑制原位腫瘤的生長並延長荷瘤鼠的生存期16。HSV被用來在腫瘤內投遞熱休克蛋白。HSV病毒包含編碼HSP70的質粒和HSV輔助病毒17。因為病毒基因組DNA(～153KB)被包裝的，每個病毒顆粒包含15個HSP70基因的拷貝，並且能夠高效的轉染分裂和非分裂的細胞。病毒DNA並不整合到被感染的細胞的基因組中，有CMV啟動子調控HSP70蛋白的表達，屬於瞬時高表達。鼠HSP70的cDNA是從人的cDNA文庫中通過PCR擴增得到並進行了DNA序列測定。用Klenow酶補平上述PCR產物的DNA片段兩端，然後平末端插入連接於質粒pHSV中的SpeI位點。使用這個質粒DNA和單純皰疹病毒輔助病毒DNA共轉染皰疹病毒宿主細胞，在HSV輔助病毒存在的條件下，通過同源重組，HSP70基因插入到單純皰疹病毒的基因組中，並被包裝於單純皰疹病毒的外殼中，這樣就產生了帶有HSP70基因的重組單純皰疹病毒(如圖1所示)。γ34.5基因被缺失的HSV-1突變株，作為輔助病毒來生產重組病毒HSV-HSP。對HSV-HSP進行了序列測定，其序列列於序列表中。
單純皰疹病毒的滴度測定用脂質體lipofectAMINE(Life Technologies產品)將純化的擴增質粒DNA(pHSP70)和HSV病毒共轉染Vero細胞，然後在34.5℃溫育培養，直到細胞表現出完全的細胞病變效應。從Vero細胞中收穫重組病毒並按1∶5比例稀釋培養，直到觀察到輔助病毒的複製被抑制。含有pHSP70質粒的HSV被命名為HSV-HSP。經過凍融和超聲以及低速離心(2000×g，4℃10分鐘)去除細胞碎片，測定重組病毒的滴度。病毒滴度以病毒在34.5℃培養的Vero細胞中形成的溶斑形成單位(PFUs)來表示。對於HSV-HSP來說，其滴度決定著HSP70的表達量，以及最高的培養水平。HSV-HSP的病毒滴度為5×107PFU/ml。同樣，測定HSV-1的滴度，其制值為6×107PFU/ml。
HSV-HSP的體外溶瘤活性HSV-1能夠在很多類型的腫瘤細胞中都能夠複製。人們發現鼠的結腸癌細胞系CT26易受HSV感染的影響。這種細胞系免疫原性很弱並且不能激發可檢測到的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。CT26型腫瘤經細胞因子治療後仍然容易復發。現已證明CT26的MHC-I限制性優勢免疫抗原是一個九肽，來源於內生性親嗜性鼠白血病前病毒的膜蛋白(gp70)。研究已證實了誘導產生的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對皮下接種的CT26腫瘤的抗瘤效果。其中將鼠腫瘤細胞CT26培養於24孔板(每孔1×105)並由HSV-HSP或HSV以不同的感染複數(0.01-10)感染。在感染複數(MOI)0.1時，用HSV-HSP或HSV對CT26細胞感染，感染4天後導致70％的腫瘤細胞的死亡。在感染複數(MOI)為1時，用HSV-HSP或HSV對CT26細胞感染，感染4天後導致99％的腫瘤細胞的死亡(如圖2所示)。感染的腫瘤細胞經培養後，用放射性標記及免疫沉澱/SDS-PAGE可以檢測到HSP70的表達。這些數據表明插入的HSP70並沒有降低HSV的複製能力和細胞毒性。
HSV-HSP抑制遠端腫瘤的生長同系的BALB/c小鼠上進一步評價HSV-HSP對CT26腫瘤的治療效果。BALB/c來自於Charles River(Wilmington，MA，USA)。所有動物實驗都經動物關心和使用委員會(Animal Care and Use Committee)批准。將動物分成3組，第一和第二組作為實驗組，第三組作為對照組。將小鼠用CT26腫瘤細胞(1×105)在小鼠肋部對稱部位分別進行皮下注射。將這些小鼠作為患有轉移性腫瘤的動物的模型。當皮下注射的腫瘤迅速生長(最大直徑達到5毫米)時，將第一組每隻動物非對稱(右面)的瘤內接種HSV-HSP(1×106PFU)，並於第一次接種7天後進行第二次接種。將第二組每隻動物非對稱(右面)的瘤內接種HSV-1(1×106PFU，並於第一次接種7天後進行第二次接種。HSV-1作為接種HSV-HSP的對照以評價病毒因素的影響。將第三組小鼠每隻動物非對稱(右面)的瘤內接種熱休克蛋白HSP70，並於第一次接種7天後進行第二次接種，來評價熱休克蛋白本身的作用。腫瘤體積用卡尺測量，體積的計算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其腫瘤直徑超過18毫米，將被處死，並記錄下日期來研究其存活率。用非配對法t檢驗進行方差統計，軟體為StaView4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。用HSV-HSP接種能引起非常顯著的抗腫瘤效果，無論是被注射一側的腫瘤，還是同只動物身體上未經注射的對稱端的腫瘤的生長都明顯受到抑制(如圖3所示)。經注射HSV-HSP的小鼠身上的腫瘤無論在注射側還是在非注射側都已經消退得無法檢測到。而注射HSV-1隻能引起經過注射的腫瘤生長的抑制，對於未被注射的對側腫瘤僅有一定的影響(如圖3所示)。僅注射HSP70的對照組顯示出在對注射側和非注射側的腫瘤都沒有影響。這些結果表明重組的HSV通過表達HSP70能夠激發強的免疫應答從而抑制了遠端腫瘤的生長。
實施例2帶有HSP70基因的重組腺病毒9-14的構建用XhoI，SalI，和EcoRV限制性內切酶切割質粒pAdIR-BG，瓊脂糖電泳分離酶切片段，回收5.3kb大片段，用Klenow酶補平片段兩端，此為片段pAd-RSV。採用實施例1中所述的用Klenow酶補平的PCR產物的DNA片段兩端，與片段pAd-RSV正向平端連接。得到質粒pAd-RSV-HSP70。用10微克質粒pAd-RSV-HSP70和14微克質粒pBHG10共轉染單層培養於直徑10釐米培養皿中的293細胞，並覆蓋瓊脂糖培養基，靜置培養於37℃，5％二氧化碳培養箱中。9天後出現噬斑，挑取單個噬斑，感染293細胞擴增重組腺病毒，HindIII內切酶分析重組腺病毒DNA，得到正確的重組腺病毒Ad-HSP70。
體外溶瘤活性和腫瘤抑制能力採用與實施例1相似的步驟，進行體外溶瘤試驗和在動物模型上的抑瘤試驗，取得了相似的試驗結果。重組腺病毒通過表達HSP70能夠激發潛在的免疫應答從而抑制了遠端腫瘤的生長。
實施例3表達熱休克蛋白的沙門氏菌的構建我們採用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)SL3261，其中芳香族胺基酸aroA突變，其所需要的營養物質只有腫瘤細胞才能夠提供，所以突變株能夠選擇性的侵襲腫瘤細胞，在腫瘤細胞中複製並導致腫瘤細胞裂解死亡；而在正常細胞中SL3261則不能夠生存。通過將HSP70序列插入到pcDNA3.1質粒中構建得到重組質粒pcDNA-HSP質粒，如圖4所示。由CMV啟動子調控HSP70蛋白的表達，屬於瞬時高表達。
抑瘤活性在同系的BALB/c小鼠上評價表達熱休克蛋白的鼠傷寒沙門氏菌SL3261對腫瘤的治療效果。將動物分成3組，第一和第二組作為實驗組，第三組作為對照組。用SMMC7721腫瘤細胞(1×105)在小鼠肩部對稱部位分別進行皮下注射。將這些小鼠作為患有轉移性腫瘤的動物的模型。當皮下注射的腫瘤迅速生長(最大直徑達到5毫米)時，將第一組每隻動物非對稱(右面)的瘤內接種攜帶表達質粒pcDNA-HSP的SL3261(1×107PFU)，並於第一次接種7天後進行第二次接種。將第二組每隻動物非對稱(右面)的瘤內接種SL3261(1×106PFU)，並於第一次接種7天後進行第二次接種，作為對照以評價細菌本身因素的影響。將第三組小鼠每隻動物非對稱(右面)的瘤內接種熱休克蛋白HSP70，並於第一次接種7天後進行第二次接種，來評價熱休克蛋白本身的作用。腫瘤體積用卡尺測量，體積的計算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其腫瘤直徑超過18毫米，將被處死，並記錄下日期來研究其存活率。用非配對法t檢驗進行方差統計，軟體為StaView4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。用表達熱休克蛋白的鼠傷寒沙門氏菌SL3261接種能引起非常顯著的抗腫瘤效果，無論是被注射的一側腫瘤，還是同只動物身體上未經注射的對稱端的腫瘤的生長都明顯收到抑制(如圖5所示)。而注射鼠傷寒沙門氏菌SL3261隻能引起經過注射的腫瘤生長的抑制，對於未被注射的對側腫瘤的影響甚微(如圖5所示)。這些結果表明傷寒沙門氏菌SL3261也能夠通過表達HSP70能夠激發潛在的免疫應答從而抑制了遠端腫瘤的生長。
本專利申請將下列文獻以其全文引入作為參考。
參考文獻1.Barker D.D. Berk A.J.(1987)Adenovirus proteins from both E1B reading frames arerequired for transformation of rodent cells by viral infection and DNAtransfection.Virology，156，107.
2.Kim D.H. McCormick F.(1996)Replicating virus as selective cancertherapeutics.Molecular Medicine Today，2，519.
3.Kim D.，Hermiston T. McCormick F.(1998)ONYX-015climcal data are encouraging.Nature Medicine，4，1341.
4.Matzinger P.(1998)An innate sense of danger.Seminars in Immunology，10，399.
5.Hartl F.U.(1996)Molecular chaperones in cellular protein folding.Nature，381，571.
6.Udono H.Levey D.L. Srivastava P.K.(1994)Cellar requirements for tumor-specificimmumty elicited by heat shock proteinstumor rejection antigen gp96primes CD8+T cells invivo.Proceeding of the National Academy of Sciences of the United Ststes ofAmerica，91，3077.
7.Udono H. Srivastava P.K.(1993)Heat shock protein 70-associated peptides elicit specificcancer immunity.Journal of Experimental Medicine，178，1391.
8.Li Z. Srivastava P.K.(1993)Tumor rejection antigen gp96/grp94is an ATPaseimplicationsfor protein folding and antigen presentation.EMBO Journal，12，3143.
9.Heiss C.C.，Williams A.，Olesch J. Kim D.H.(1999)Efficacy of a replication-competentadenovirus(ONYX-015)following intratumoral injectionintramural spread and distributioneffects.Cancer Gene Therapy，6，499.
10.Heiss C.C.，Williams A.M.，Xue S.，Propst M. Kim D.H.(1999)Intravenousadministration of ONYX-015，a selectively replicating adenovirus，induces antitumoralefficacy.Cancer Research，59，2623.
11.Oliff A.，Gibbs J.B. McCormick F.(1996)New molecular targets for cancer therapy.Scientific American，275，144.
12.Hall A.R.，O』Carroll S.J. Braithwaite A.W.(1998)p53-dependent cell death/apoptosis isrequired for a productive adenovirus infection.Nature Medicine，4，1068.
13.Dix B.R.，O』Carroll S.J.，Myers C.J.，Edwards S.J. Braithwaite A.W.(2000)Efficientinduction of cell death by adenovirus requires binding of E1B55k and p53.CancerResearch，60，2666.
14.Rogulski K.R.，Freytag S.O.，Zhang K.，Gilbert J.D.，Palielli D.L.，Kim J.H.，Heise C.C Kim D.H.(2000)In vivo antitumor activity of ONYX-015 is influenced by p53 staus and isaugmented by radiotherapy.Cancer Research，60，1193.
15.Kwong A.D. Frenkel N.(1995)Biology of Herpes simple virus(HSV)defective virusesand development of the amplicon system.In Viral Vectors.InGene therapy andNeuroscience Applications(ed.M.G.Kaplitt A.D.loewy)，p.25.Academic Press，San Diego.
16.Mineta T.，Rabkin S.D.，Yazaki T.，Hunter W.D. Martuza R.L(1995)Attenuated multi-mutated herpes virus-1 for the treatment ofmalignant gliomas.Nature Medicine，1，938.
17.Spaete R.R. Frenkel N.(1982)The hepes simplex virus amplicona new eucaryoticdective-virus cloning-amplifving vecto r.Cell，30，295.
18.Kaplitt，M.G.，J.G.Pfaus，S.P.Kleopoulos，B.A.Hanlon，S.D.Rabkin，D.W.Pfaff 1991.Expression of a functional foreign gene in adult mammalian brain following in vivo transfervia a herpes simplex virus type 1 defective viral vector Mol.Cell.Neurosci.2320.
19.Brown A，Hormaeche C E，Demarco de Hormache R，et al.(1987)An attenuated aroASalmonella typhimurium vaccine ellicts humoral and cellular immunity cloney β-galactosidase in mice.JInfect Dis，15586-92.
20.John M.Pawelek，K.Brooks Low，and David Bermudes.(1997)Tumor targeted Salmonella asa hovel anticancer vector Cancer Research 57，4537.
序列表110chen，siyi(陳思毅)hu，fang(胡放)120expressing HSP oncolytic microorganisms and usethereof(表達熱休克蛋白的溶瘤微生物及其應用)130140pct1412001-10-081603170PatentIn Ver.2.1210121123212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4001ggtatggaag atccctcgag atc 23210221126212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4002tactaatcta cctcctcaat ggtggg 26210321110494212DNAgggccgccgg gtaaaagaag tgagaacgcg aagcgttcgc acttcgtccc aatatatata 120tattattagg gcgaagtgcg agcactggcg ccgggatcca aatgagtctt cggacctcgc 180gggggccgct taagcggtgg ttagggtttg tctgacgcgg ggggaggggg aaggaacgaa 240acactctcat tcggaggcgg ctcggggttt ggtggttacc tggggctgtg cggttgggac 300ggcgcccgtg ggcccgggcg gccgggggcg gcgggggccg gcatggcggc gcggcgggcc 360atggagacag agagcgtgcc ggggtggtag agtttgacag gcaagcatgt gcgtgcagag 420gcgagtagtg cttgcctgtc taactcgctc gtctcggccg cggggggccc gggctgcgcc 480gccgcgcttt aaagggccgc gcgcgacccc cggggggtgt gtttcggggg gggcccgttt 540tcgctcctcc ccccgctcct ccccccgctc ctccccccgc tcctcccccc gctcctcccc 600ccgctcctcc ccccgctcct ccccccgctc ctccccccgc tcctcccccc gctcctcccc 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ggcatctcta cctcagtgcc gccaatctca ggtcagagat 1560ccaaaccctc cggcgctgga cgacggggga gctggtgctc gggtgcgatg ccgcgctggt 1620gcgcgcgcgc tacgggcggg aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 1680tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 1740atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 1800tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 1860aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 1920acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 1980acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 2040ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg 2100ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 2160caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 2220ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 2280aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 2340aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa 2400tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 2460aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 2520cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 2580ttgcagcact ggggccttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt cttggtggcc 2640acgggcacgc agaagagcgc cgcgatcctc ttaagcaccc ccccgccctc cgtggaggcg 2700ggggtttggt cggcgggtgg taactggcgg gccgctgact cgggcgggtc gcgcgcccca 2760gagtgtgacc ttttcggtct gctcgcagac ccccgggcgg cgccgccgcg taaagccgcc 2820gggggtccgt gtcctgtctc ggttggccgg acccgggccc gagcccgagc agtagccggc 2880gccatgtcgg tggtgggcat agacctgggc ttccagagct gctacgtcgc tgtggcccgc 2940gccggcggca tcgagactat cgctaatgag tatagcgacc gctgcacgcc ggcttgcatt 3000tcttttggtc ctaagaatcg ttcaattgga gcagcagcta aaagccaggt aatttctaat 3060gcaaagaaca cagtccaagg atttaaaaga ttccatggcc gagcattctc tgatccattt 3120gtggaggcag aaaaatctaa ccttgcatat gatattgtgc agtggcctac aggattaaca 3180ggtataaagg tgacatatat ggaggaagag cgaaatttta 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1.一種溶瘤微生物，其中該微生物表達能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白，並且該微生物能選擇性地在腫瘤細胞中生長以裂解腫瘤細胞。
2.如權利要求1所述的微生物，其中所述的能粘附腫瘤細胞抗原的蛋白是熱休克蛋白。
3.如權利要求2所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白來源於哺乳動物或病原微生物。
4.如權利要求3所述的微生物，其中所述的哺乳動物是人。
5.如權利要求4所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白為來源於人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
6.如權利要求2所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白來源於病原微生物，所述的病原微生物包括結核分支桿菌、麻風分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。
7.如權利要求1所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物是病毒。
8.如權利要求7所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質炎病毒、EB病毒以及其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的病毒。
9.如權利要求8所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒為腺病毒。
10.如權利要求9所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白為來源於人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
11.如權利要求8所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒為單純皰疹病毒。
12.如權利要求11所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白為來源於人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
13.如權利要求1所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物是細菌。
14.如權利要求13所述的溶瘤微生物，其中所述的細菌包括傷寒沙門氏菌、雙歧桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的細菌。
15.如權利要求1-14中任一項所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物進一步含有編碼免疫增強分子的DNA序列。
16.一種治療腫瘤的藥物，其含有權利要求1-14中任一項所述的微生物。
17.權利要求16所述的藥物，其中所述的微生物進一步含有編碼免疫增強分子的DNA序列。
18.權利要求16或17所述的藥物，其進一步含有可藥用載體。
19.一種藥物組合物，其含有a.能選擇性地在腫瘤細胞中生長的微生物；和b.能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白。
20.權利要求19所述的藥物組合物，其中所述的微生物是腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒或其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的病毒。
21.權利要求19所述的藥物組合物，其中所述的微生物是傷寒沙門氏菌、雙歧桿菌、志賀氏菌、李斯特菌、鼠疫桿菌或其他能選擇性地在腫瘤細胞中生長的細菌。
22.權利要求19-21中任一項所述的藥物組合物，其中所述的能粘附腫瘤細胞抗原的並被抗原提呈細胞所識別的蛋白是來源於哺乳動物或病原微生物的熱休克蛋白。
23.如權利要求22所述的藥物組合物，其中所述的哺乳動物是人。
24.如權利要求23所述的藥物組合物，其中所述的熱休克蛋白為來源於人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
25.如權利要求22所述的藥物組合物，其中所述的熱休克蛋白來源於病原微生物，所述的病原微生物包括結核分支桿菌、麻風分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。
26.一種治療腫瘤的方法，包括給腫瘤患者施用一種免疫有效量的權利要求16-18中任一項所述的藥物。
27.一種治療腫瘤的方法，包括給腫瘤患者施用一種免疫有效量的權利要求19-25中任一項所述的藥物組合物。
28.權利要求26或27所述的治療腫瘤的方法，其中所述的腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤。
29.權利要求28所述的治療腫瘤的方法，其中所述的惡性腫瘤包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、結腸癌、卵巢癌、宮頸癌和白血病。
30.權利要求26或27所述的治療腫瘤的方法，其中所述的施用是通過腫瘤內注射、肌肉內注射、口服、黏膜內給藥、腹膜內給藥、靜脈內給藥、直腸內給藥方式完成的。
全文摘要
本發明提供了表達熱休克蛋白的溶瘤微生物、含有該微生物的藥物或藥物組合物，以及使用該微生物殺死局部的及轉移的腫瘤的方法。所述的溶瘤微生物包括能選擇性地在腫瘤細胞中生長從而將腫瘤細胞溶解的病毒和細菌。給腫瘤患者施用本發明的微生物後，所述微生物在溶解腫瘤細胞的同時還表達熱休克蛋白。所表達的熱休克蛋白與腫瘤細胞溶解所釋放的腫瘤抗原粘附，並與抗原提呈細胞結合，誘發腫瘤細胞特異性的免疫反應，從而殺死轉移的腫瘤。
文檔編號A61K35/76GK1412295SQ0114169
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月9日 優先權日2001年10月9日
發明者陳思毅, 胡放 申請人:杭州康科生物技術有限公司