細胞和病毒的快速靈敏檢測的製作方法

2024-02-29 03:18:15 1

專利名稱：細胞和病毒的快速靈敏檢測的製作方法
背景技術：
本發明涉及醫學、工業、或環境樣品中細胞和病毒的鑑定。
概述檢測、計算、和鑑定低水平的特定細胞及病毒是常規醫學、工業、和環境診斷的基礎。例如，對樣品進行分析從而檢測感染劑，癌細胞，食物病原體，藥物和化妝品的微生物汙染物，以及水和環境中的微生物。
簡言之，下面的討論集中在常規的醫學診斷上；類似的方法可用於工業和環境應用。
微生物學方法微生物培養通過利用它們迅速大量繁殖的趨勢而進行微生物(例如，細菌，病毒，和真菌)的簡單目測。例如，單一細菌細胞因為太小(約百萬分之一米)而不能用內眼看到，當放在營養肉湯中時，肉湯在24小時內明顯變渾濁。
相關的微生物培養技術，也被稱作微生物計數或集落計數，可量化樣品中的微生物細胞數。以原位微生物複製為基礎的微生物計數方法，通常相對於樣品中的每種微生物細胞產生一個可目測的「集落」。因此，計算可見集落數可使微生物學家準確測定樣品中的微生物細胞數。為了進行微生物計數，可將細菌細胞分散在陪替氏培養皿中營養瓊脂(「瓊脂平板」)的表面上，並在可以進行原位細菌複製的條件下培養。單一的，不可目測的微生物反覆複製，在祖代微生物細胞沉積的位置產生大量相同的子代微生物。子代細胞持續與原始細胞共同-定位(基本相連)，這樣子代細胞群(它們可生長至幾千萬或幾億個細胞)最終在平板上形成肉眼可見的集落。
微生物培養是一種非常成功的方法，這是因為即使在一個多世紀後，該方法仍然支配著醫學微生物學和工業微生物學中的質量控制試驗(例如，藥物，食品，和飲料的製造)。該方法便宜，相對簡單，而且超-靈敏。微生物培養的靈敏度可在絞細牛肉中的食源性病原體的普通試驗中觀察到。單一顯微細菌病原體細胞可利用微生物培養，在25g絞細牛肉中檢測。微生物培養的其它優點是其檢測各種具有醫學和工業重要性的微生物的能力。
某些病毒可在培養物中生長。病毒培養已經特別用於研究中的速生噬菌體(感染細菌的病毒)。病毒培養有時用於診斷臨床感染，儘管現在正越來越多地使用核酸擴增替代該方法。
傳統的微生物培養較慢—它要花費較長時間來產生病毒檢測所需數量的細胞或病毒。微生物培養所需的較長生長周期是保健和工業中的重要問題。例如，因為它需要幾天時間來培養並鑑定導致患者血液感染的微生物，因此真菌血液感染的患者甚至可能在開始抗-真菌治療之前就已經死亡。某些感染劑，如引起肺結核的細菌，通常需要在培養物中生長几周。檢測結核分枝桿菌所需的較長時間可導致肺結核患者感染很多其它高度傳染性的疾病，或導致沒有肺結核的患者在檢疫期的花費較高。在食物的製造中，較長的試驗周期可能增加食物變質。緩慢的微生物培養還會不利地影響生物藥和疫苗的生產。
現在已經發展了很多更快速進行微生物計數的微生物培養方法。其中一種較為快速的方法可使細菌細胞沉積在塗覆了營養培養基的顯微鏡載玻片上。利用顯微鏡檢查，可比用肉眼更早地檢測微生物生長，這是因為顯微鏡可檢測由於少數細胞分裂產生的小菌落。商業化系統Colifast Rapid Microcolony Counter(Colifast)可在肉眼看到之前幾小時檢測少量螢光標記的大腸埃希氏菌集落。Colifast系統利用包含在營養瓊脂培養基中的螢光化合物(非螢光的，直到被大腸埃希氏菌代謝的物質)提高檢測。利用生物發光標記快速計算微生物集落數的系統近來已經商業化。MicroStar系統(Millipore)利用小菌落中的細胞ATP，經由所用螢光素酶和底物的作用產生光。該方法可大大減少檢測時間。MicroStar成像系統已經與標記探針聯合用於鑑定特定的細菌(Stender，H.等，(2001)J.Microbiol Methods 4669-75)。
免疫學方法免疫學試驗，或免疫測定法，在醫學診斷中常常用於鑑定特定的細胞和病毒。免疫測定法可檢測抗體與靶和病毒分子成分上的位點的特異性結合。血清學試驗屬於免疫測定法，它不是直接測試抗原，而是測試宿主對先前與抗原接觸的免疫應答—例如，它們可測試宿主對特定細胞和病毒的抗體的存在。有很多免疫測定系統都可使用，例如從大型自動化中心實驗室系統，到可直接進行的合法妊娠試驗。該試驗包括多種形式，如凝集測定法，沉澱素測定法，酶聯免疫測定法，直接發螢光測定法，免疫-組織學試驗，補體結合測定法，血清學試驗，免疫-電泳測定法，和快速「帶狀」試驗(例如，側流和流通試驗)。免疫學試驗可以非常簡單而且快速。因此，絕大多數理想試驗，例如可在醫生辦公室或由患者在家進行的那些，是免疫學試驗。
基因方法基因方法是用於檢測並鑑定細胞和病毒中核酸分子的普通且有效的工具。近來已經發展了以核酸擴增為基礎、超靈敏檢測並區別細胞和病毒的核酸含量的革命性新方法。例如，商業試驗可檢測少數亞顯微HIV病毒粒子的核酸(例如，50個粒子/ml)。擴增技術包括聚合酶鏈反應(PCR)，連接酶鏈反應(LCR)，基於核酸序列的擴增(NASBA)，轉錄介導的擴增(TMA)，和滾環擴增(RCA)。擴增法可提供令人印象深刻的分析靈敏度，而且中等快速，例如，Smart Cycler(Cepheid)可在一小時內產生結果(Belanger，S.D.等，(2002)Journal of ClinicalMicrobiology 401436-40)。
顯微成像方法顯微成像是檢測細胞和病毒的一種最普遍的方法。例如，通過用染料，抗體，或核酸探針標記，可在顯微鏡下觀察靶。顯微分析的靈敏度可利用如催化報導基因沉積(CARD)的方法來提高，其已經用於檢測人細胞中單一拷貝水平的病毒基因組(Huang，C.C.等，ModernPathology 11971-7，1998)。用於增加原位雜交靈敏度的其它方法依賴於原位擴增或複製，或利用，例如，支鏈DNA的信號擴增或dendrimer技術(例如，Orentas，R.J.等，Journal of Virological Methods 77153-63，1999)。
多重螢光標記可用於使用原位分析立刻檢測多種病原體。例如，不同類目(category)特異性抗原的抗體可用不同的螢光標記來標記。組合標記策略也已經與顯微鏡檢查聯合用於同時鑑定多種細菌病原體(Amann，R.等，Journal Of Bacteriology 1783496-500，1996；美國專利號第6,007,994)。
人們已經研究出了很多商業系統，它們可獲得高流通量的顯微靶的原位顯微鏡分析(例如，WO 98/22618和WO 93/21511)。通常，微生物或細胞沉積於載玻片上或多孔平板的孔底。然後使孔中的標記靶在顯微鏡下成像。
非-顯微成像方法非-顯微成像可測量較大面積中細胞的存在。例如，HamamatsuCorporation(Masuko，M.等，FEMS Microbiol Lett 67231-8，1991；Masuko，M.等，FEMS Microbiol Lett 65287-90，1991；Yasui，T.等，Appl Environ Microbiol 634528-33，1997)的研究人員研製了一種不用放大即可使單一細菌細胞成像的系統。該系統使用了與光學纖維系統連接的超靈敏光子-計數CCD照相機，像增強器，和像-處理器。Elisa斑點試驗方法是一種專門用於計算產生特定抗體(或其它大量分泌的產物；Logtenberg，T.等，Immunol Lett 9343-7，1985)的單一細胞數的技術。該方法的靈敏度是由於大量靶(分泌的蛋白分子)在分泌細胞周圍定位。
流式細胞術方法流式細胞術是一種用於在臨床診斷實驗室中描繪細胞的重要工具。流式細胞術方法根據它們的物理性質以及它們結合標記探針(例如，染料，抗體，或核酸)的能力，可用於定量檢測特定的細胞類型。單一細胞或粒子被強迫流過狹窄的通道，每次流過一個，通過雷射束。螢光發射和大小/形狀的信息是通過分析光譜和由生物體/粒子引起的光散射而搜集的。每分鐘可分析上千單一的細胞或粒子。例如，流式細胞術可用於量化AIDS患者中淋巴細胞類的群體大小。可檢測並鑑定非-細胞分子，如蛋白或核酸的多路流式細胞術方法已經由Luminex商業化(美國專利號第5,981,180)。
雷射掃描方法雷射掃描是用於檢測沉積在表面上的細胞和病毒的有效且靈敏的方法。通常，顯微雷射束(例如，直徑20μm)可追蹤二維樣品，所述二維樣品在大量連續線性通道中的固體表面上含有螢光標記靶，其中每個線性通道都稍稍偏離於前一個，如此最終可掃描整個樣品區域。當螢光標記靶落在光束下時，所發射螢光的閃爍可用檢測裝置，如光電倍增管檢測。顯微靶的數目和位置可通過雷射微束掃描獲得。
人們已經研製了很多雷射掃描系統。ScanRDI系統(Chemunex)使用非-特異性螢光染料標記濾器上的微生物細胞(美國專利號第5,663,057；Mignon-Goderfroy，K.等，Cytometry 27336-44，1997)。螢光微體積測定技術(FMAT；PE Biosystems and Biometric Imaging；Miraglia，S.等，J Biomol Screen 4193-204，1999)也已經用於檢測微量滴定孔中的細胞。尖端的雷射掃描系統已經由CompuCyteCorporation(Kamentsky，L.，2001，雷射掃描細胞術，Cytometry，Z.Darzynkiewicz，H.Crissman和J.Robinsnon編輯，Methods in CellBiology Vol.63，Part A，3rd版，Series Eds.L.Wilson和P.Matsudaira.(SanDiegoAcademic Press))研製並商業化。可檢測液體樣品(例如，全血)中單一顯微靶的微束雷射掃描系統已經由Immunicon Corporation及Twente University的合作者(Tibbe，A.G.等，Nat Biotechnol171210-3，1999)研製出來。
生物化學、化學、及物理方法靈敏檢測細胞和病毒，或它們的分子成分，細胞和病毒的分子成分的其它技術包括流式細胞術，質譜，生物傳感器，吸光光譜，螢光偏振，螢光波動光譜，電泳，色譜等。
生物傳感器技術可持續靈敏檢測細胞和病毒。生物傳感器使用物理方法將生物事件，例如，抗體與抗原的結合，轉換成可檢測的信號。其中一種用於分子檢測的普及生物傳感器使用表面等離子共振(Mullett，W.M.等，(2000)Methods 2277-91)。熱BioStar’s光學免疫測定法(Schultze，D.等(2001)Eur J Clin Microbiol Infect Dis20280-3)利用光幹涉原理檢測抗原與抗體的結合。BARC生物傳感器技術是磁阻檢測(硬碟存儲)單一磁性微粒標記的分析物(Edelstein，R.L.等，Biosens Bioelectron 14805-13，2000)。
細胞和病毒檢測的未滿足的需要雖然很多用於常規檢測低水平細胞和病毒的不同且有效的方法已經商業化，但是在測試系統中仍然存在缺陷。特別是，需要一種試驗能夠快速檢測非常低水平的細胞和病毒，而且該試驗無需實驗室生長，用戶容易掌握使用，而且成本低。
背景技術：
本發明提供快速並靈敏地鑑定醫學、工業、和環境樣品中的細胞和病毒靶的有效方法。本發明標記靶，然後利用大面積成像檢測它們。基於本發明的診斷試驗是快速、超靈敏、定量、多路、且自動化的。該試驗可使樣品製備減到最少，而且無需核酸擴增或細胞培養。本試驗可檢測多種細胞和病毒。基於本發明的試驗可提供核酸擴增試驗的高水平靈敏度，用戶容易掌握使用，而且可提供免疫測定法的速度，以及由微生物試驗提供的低成本及量化。本發明實現現有診斷技術的最佳特徵，同時解決了診斷系統中的缺陷。
本發明能夠快速並低成本檢測低水平靶和病毒的能力源於聯合使用高強度標記，促進快速反應動力學的形式，和大面積成像的優點，該大面積成像使用由現有商業元件製造的儀器，或根本不用儀器。表1列出本發明某些優點。
表1
本發明通過特異性標記低水平的細胞和病毒，產生高強度信號而檢測它們。可使用各種產生信號的複合物，包括螢光染色的，光-散射，量子點，磷光體，和酶-塗覆的粒子。這些粒子可產生各類型的信號，包括螢光，化學發光，和比色。同樣，可使用各種分子獲得產生信號的標記，包括抗體，核酸，配體，和適體的特異性結合。
當檢測某些臨床，環境，和製造樣品時，需要檢測較大體積中的少數靶和病毒。本發明檢測大量樣品中低水平靶的能力部分取決於其在不放大的情況下，檢測單一細胞和病毒的能力。不放大的檢測可檢測大面積中少數粒子的單一像。大面積成像對於本發明有效分析較大樣品體積的能力至關重要。使用高倍顯微鏡或微流檢測較大體積中的標記粒子時，需要濃縮步驟或對上千個像進行分析。使用微束掃描少數粒子的方法非常浪費時間，且大面積使用時較為昂貴。
計算單一顯微標記可增加基於本發明的試驗結果的穩定性。與很多用於分析細胞和病毒靶的大面積成像方法形成對照，本發明通常直接將單一信號與較小的鄰接區進行比較。與求大面積中總信號和背景積分的方法相比，這種比較可提高含有少數標記靶的樣品的信號背景比。
檢測單一細胞或病毒的其它優點是在不犧牲速度的前提下，通過適當增加檢測區大小來增加樣品體積，從而增加試驗的靈敏度。
計算大面積像中的單一信號數還可減少產生假陽性結果的機會。(假陽性結果是不存在實際靶時產生的陽性試驗結果)。與檢測單一積分信號的方法，如測量樣品中分子(例如，ATP，抗原，或核酸)總量的方法相比，這種計數方法是有利的。當使用依賴於信號積分的方法時，引起信號的任何人工製品都可產生假陽性結果。含有482個正信號的樣品，每個都可產生100個螢光單位。積分方法的結果是單一的數字(48,200個螢光單位)。產生相似螢光單位數的人工製品，例如，較大的螢光塵粒是不能區別的。相反，本發明可很容易地區分單一較大的螢光塵粒和482個正信號。
使用本發明構造的試驗可檢測各種濃度，從非常低的水平到高水平的靶和病毒。本發明的這種性質，其較大的動態範圍，可讓用戶取消樣品的製備步驟(例如，多次稀釋)，而這一步驟常常是具有較小動態範圍的技術所需的。
基於本發明的試驗可利用各種有效的形式，包括簡單、非-儀器、且低成本的一次性帶狀試驗，和尖端的自動化臺式系統。
本發明可使用的各種檢測方法包括目測，基於膠片的檢測，和電子檢測。檢測方法的範圍對於提出廣泛的診斷問題和試驗地點是有利的。
本發明的其它特徵和優點可從下列說明書和權利要求書很明顯地看出。
靶是指可能存在於樣品中的細胞或病毒，它的存在是通過本發明測試的。
靶的類目是指共有一個或多個特徵，且為了使用本發明構造試驗的目的，被認為相同的多個靶。例如，對於被設計檢測所有HIV病毒的試驗而言，類目只是HIV。這種試驗可檢測所有HIV病毒，而不區分HIV-1和HIV-2變體。在這種情況下，靶的類目包括HIV-1和HIV-2。其它試驗的目的可能是區分HIV-1和HIV-2。在這種情況下，每種類型的HIV被看作是不同的類目。
靶的非重疊類目是指其併集為空集的靶的類目。所有大腸埃希氏菌類目，所有假單胞菌類目，所有真菌類目，以及所有HIV病毒類目屬於非重疊類目。也就是說，任一類目都沒有哪個成員是其它任一組的成員。相反，HIV-1病毒的類目和HIV病毒的類目是靶的重疊類目，這是因為HIV-1類目的每個成員也是所有HIV病毒類目的成員。
檢測並鑑定多個類目的試驗通常可檢測靶的多個非重疊類目。例如，設計試驗來鑑定血液中的HIV，HCV，和HBV病毒。這種試驗可區分靶的三個非重疊類目，即三種類型的病毒。值得注意的是，每種類型的病毒僅僅屬於三個類目中的一個(例如，在HCV類目中沒有HIV病毒)。
試驗的類目複雜度是指在試驗中檢測的靶的非重疊類目數。
類目特異性結合位點是指靶上的位點，它可在特異性-結合條件下(見斜體字的術語定義)特異性結合類目結合分子，而且可把在試驗中鑑定的特定類目成員與不是該類目成員，但可能也存在於試驗樣品中的靶區分開來。也就是說，該位點通常存在於一個類目的所有成員上，而且通常不存在於非重疊類目的任何成員上。類目特異性結合位點特異性結合類目特異性結合分子。
類目特異性結合位點常常與靶相關。在ELISA斑點測定法中，分泌單一抗體的雜交瘤細胞是通過檢測大量抗體蛋白鑑定的，所述抗體蛋白可結合螢光抗原，並靠近分泌細胞源固定。在這種情況下，含有抗原結合位點的分泌抗體分子與雜交瘤細胞不相關。因此，游離抗體上的抗原結合位點不是類目特異性結合位點。
如果試驗掃描含有構成分類群的靶類目樣品，那麼類目特異性結合位點基本存在與該分類群的所有成員中，但基本不存在於試驗樣品中其它分類群的所有成員中。其中一個例子是結合特定單克隆抗體的HIV膜蛋白上的位點。
可選擇性地，試驗可掃描包括了由不同分類群成員共有的類目特異性結合位點的樣品。這種類型的類目特異性結合位點的例子包括各種大分子(例如，DNA)和基因，mRNA，和蛋白，它們可產生抗生素抗性，毒性，或顯示活力。類目特異性結合位點常常是較大分子或複合物的一部分。例如，在試驗中，可將類目特異性基因組序列用作類目特異性結合位點。這種類目特異性結合位點是更大基因組的一部分，它可含有(1)不是類目特異性的部分；(2)是類目特異性結合位點，但試驗不能掃描的部分；和(3)試驗可掃描的、不同類目特異性序列的其它部分。
類目特異性結合位點是指在屬於類目成員的靶中以80％，90％，95％，或超過99％存在，但在屬於相同種類所有其它類目成員的靶中，以80％，90％，95％，或超過99％缺少的結合位點。值得注意的是，屬於類目成員的靶可能一般或異常缺少類目特異性結合位點。
同樣，類目特異性結合位點可一般或異常存在於不屬於類目成員的靶中。例如，認為蛋白位點基本存在於所有大腸埃希氏菌中，而不存在於其它細菌種類中。如果，在上百萬個細菌中少於一個細胞，導致不產生蛋白的突變，那麼標記將不存在於大腸埃希氏菌中。然而，這種蛋白位點仍然被認為是類目特異性結合位點。可選擇性地，利用重組DNA技術或自然方式(例如，利用病毒轉導)可將相同蛋白的基因轉移到不同種類細菌的菌株中。在這種情況下，不屬於大腸埃希氏菌類目成員的細菌菌株將表達什麼仍然被認為是大腸埃希氏菌-特異性結合位點。
類目結合分子是指特異性結合類目特異性結合位點的分子或分子複合物。類目結合分子的例子是與基因組DNA雜交的核酸探針；已經被選擇或「推斷」體外特異性結合蛋白上位點的核酸適體；結合細胞抗原或血清蛋白的抗體；以及特異性結合激素受體或結合分子，如抗生物素蛋白的配體，如表皮生長因子或生物素。如果它們結合不同且非重疊的類目特異性結合位點，那麼這兩個類目結合分子被認為是不同的。根據它們的分子組成，類目結合分子可被稱作，例如，類目結合寡核苷酸，探針，抗體，配體等。
捕獲分子是指與表面，薄膜，或不是顆粒的其它基質穩定結合的類目結合分子。
特異性結合靶類目的類目結合分子是指在規定的結合條件下，基本結合可由試驗掃描的類目成員的所有靶，但基本不結合不屬於該類目成員，但可能存在於樣品中的其它種類靶的類目結合分子。與不是通過這種類目中的靶結合的數目相比，通過所掃描類目中的靶結合的類目結合分子數要高2倍，5倍，10倍，或50倍。
結合條件是指在試驗中使用的、獲得類目結合分子與類目特異性結合位點的特異性結合的條件。例如，當類目結合分子是類目特異性DNA探針時，特定試驗的結合條件是嚴格的DNA雜交條件。適宜的嚴格DNA雜交條件取決於探針的性質，這是本領域那些技術人員熟知的。例如，對於長度大於500個鹼基的典型DNA探針而言，適宜的結合條件(在雜交中被稱作「清洗條件」)是65℃，0.2X SSC。對於抗體與抗原的結合而言，典型的結合條件是室溫，PBS-TB。
類目結合分子的家族是指一組特異性結合靶特定類目的類目結合分子。
針對C型肝炎病毒培養的多克隆抗體製品構成類目特異性分子的家族，這是因為它含有特異性結合靶-HCV相同類目的多個不同抗體。多克隆抗體通常構成類目結合分子的家族，這是因為它們通常包括結合靶相同類目的多個不同類目結合分子。值得注意的是，除非使用親和純化，多克隆抗體製品通常還含有不與靶的選定類目結合的抗體，而且可含有結合其它類目的抗體，這是因為動物的抗體系統是通過動物的感染史確定的。因此，優選利用親和法純化多克隆抗體。
家族中的類目結合分子可能與類目中的某些靶結合，但不與其它靶結合。例如，HIV-1特異性抗體不與HIV-2交叉反應，HIV-2-特異性抗體不與HIV-1交叉反應。在不區分HIV-1或HIV-2的條件下，如果HIV作為試驗中的類目被檢測，那麼可用具有相同信號標誌的信號傳遞部分標記兩種類型抗體的混合物。當在試驗中使用該家族的類目結合分子，即兩種抗體製品的混合物時，不論存在HIV-1還是HIV-2，都可獲得相同的信號。(值得注意的是，如果使用抗體捕獲本實施例中檢測區位點的HIV靶，那麼在該位點使用抗-HIV-1和抗-HIV-2捕獲抗體的混合物)。
類目結合分子家族的其它例子是一組80個類目特異性基因組DNA序列，它們存在於所有大腸埃希氏菌O157:H7菌株中，但不存在於其它種類細菌的成員中。該家族的類目結合分子可與適當製備的大腸埃希氏菌O157:H7細胞雜交，但是不與細胞的其它類目雜交。家族可包括不同類型的類目結合分子。例如，上述類目結合分子家族還可包括特異性結合O157抗原的單克隆抗體，以及結合intimin蛋白(毒性因子)的一類。類目結合分子的家族可包括任何數量的類目結合分子(即，一個或多個)。
類目結合分子的非重疊家族是指這樣的類目結合分子家族，其中每個家族特異性結合一組非重疊類目中的一個，而且僅僅一個類目。也就是說，一組類目結合分子的非重疊家族對應於一組非重疊類目。例如，在掃描4USP有害生物大腸埃希氏菌，沙門氏菌，假單胞菌，和金黃色葡萄球菌的試驗中，有4個非重疊類目。這種試驗可摻入4種不同的非-交叉反應多克隆抗體，每種抗體對其中一個試驗類目特異。因此，該試驗包括類目結合分子的4個非重疊家族。試驗中的類目結合分子的非重疊家族被稱作類目結合分子的整體(ensemble)(見下面的定義)。
類目結合分子的整體是指類目結合分子的一個或多個非重疊家族組，對於特定的試驗而言，將它們在混合物中混合。掃描靶的多個非重疊類目的試驗包括每個類目的一個類目結合分子家族。包含這些家族的類目結合分子的整個組被稱作整體。例如，可使用5種病毒-特異性單克隆抗體掃描5種類型上呼吸道病毒(RSV，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感和腺病毒)的存在。這5個單克隆抗體構成類目結合分子的5個非重疊家族。抗體的聯合組是類目結合分子的整體。
整體的類目結合分子複雜度是指一個整體中的不同類目結合分子或部分的數目。例如，如果一個類目結合分子的整體包括234個寡核苷酸探針，那麼該整體的類目結合分子複雜度為234。
整體的家族複雜度是指一個整體中的類目結合分子的非重疊家族數。家族複雜度與結合整體中每個家族的類目結合分子所需的最小靶數相等。試驗的家族複雜度與試驗的分類學複雜度—即，所掃描樣品的不同類目數相對應。DNA探針的整體包括3個探針家族。其中一個家族包括一組12個大腸埃希氏菌類目結合DNA序列，另外一個家族包括一組10個輪狀病毒類目結合DNA序列，另外一個家族包括一組15個賈第蟲類目結合DNA序列。該探針整體的家族複雜度為3，這是因為結合整體中的所有探針時，需要不少於3種類型靶的基因組(大腸埃希氏菌，輪狀病毒，和賈第蟲)。
信號元件是指直接產生可檢測信號的分子或粒子。術語「直接產生」是指信號元件是可檢測信號的直接來源或決定性調節子。因此，如果信號是由螢光團產生的光子，那麼螢光團是光子的直接來源，並因此是信號元件。如果信號是由RLS散射的光子，那麼RLS粒子是信號元件。可選擇性地，如果信號是從辣根過氧化物酶的產色沉澱產物發射或散射的光，那麼產色產物是信號元件。
信號元件的特徵在於這種元件不能被分成若干部分，以致每個部分產生可與整體(特徵，而不必是強度方面)比較的信號。因此，2nM直徑的量子點也是一種信號元件，隨著分開，它可改變所得納米晶體的特徵(發射譜)。用螢光染料，如螢光素浸滲的5μm粒子不是信號元件，這是因為它可被分成若干部分，以致每個部分具有可與完整粒子相比較的信號特徵。相反，分子螢光素是信號元件。產生信號的酶(例如，螢光素酶，鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶)的可檢測產物也被認為是信號元件。這種信號元件(或它們的前體，當存在前體向信號元件化學轉化時)可以是擴散性物質，不溶性產物，和/或不穩定的中間體。例如，鹼性磷酸酶可將化學發光底物CDP-Star(NEN；目錄號NEL-601)轉化成活化產物，它是發射光子的信號元件。
信號傳遞部分是指含有或產生(在酶情況下)一種或多種信號元件的分子，粒子，或物質，而且它與類目結合分子偶聯。信號傳遞部分可與類目結合分子共價或非-共價和直接或間接(例如，經由一個或多個連接物或「化學鍵」或通過與同一粒子偶聯的兩個部分)偶聯。信號傳遞部分的例子包括羧化量子點；被修飾用於結合核酸探針或抗體探針的螢光團如Texas Red；塗覆鏈黴抗生物素的螢光聚苯乙烯粒子(其可與生物素化的類目特異性結合蛋白偶聯)；含有重複核酸序列的滾環複製產物，其中每個核酸序列都可與用螢光修飾的核苷酸追蹤的若干寡核苷酸雜交，並在5』末端含有類目特異性結合寡核苷酸。信號傳遞部分可含有完全不同的元件。例如，在某些情況下，信號傳遞部分是與類目結合分子(例如，抗體)偶聯的酶(例如，鹼性磷酸酶)。當鹼性磷酸酶的底物(例如，分別來源於NEN和Roche的CDP-Star，或BM紫)轉化成信號元件產物(例如，發射光子的不穩定中間體，或可沉澱的產色產物)時，產生信號。對於類目結合分子，酶信號傳遞部分，和在不同反應時間所用的底物而言，它是不尋常的。
信號傳遞部分複合物是指含有一個以上信號傳遞部分和一個以上類目結合分子的物質實體。信號傳遞部分與類目結合分子在信號傳遞部分複合物中的締合必須是穩定的(例如，信號傳遞部分和類目結合分子的複合物應在4℃的PBS中具有至少1天的平均半衰期)。信號傳遞部分複合物的其中一個例子是塗覆兩種類型的上千個分子的聚苯乙烯微粒靶特異性抗體和鹼性磷酸酶。這種信號傳遞部分複合物經由偶聯的抗體類目結合分子與靶結合。當與產色鹼性磷酸酶底物(信號元件；例如，BM紫，Roche)培養時，產生肉眼可檢測的有色斑點。可選擇性地，相同的信號傳遞部分複合物，當與化學發光或螢光鹼性磷酸酶底物培養時，可產生化學發光或螢光信號。信號傳遞部分複合物的其它例子包括與螢光素標記抗體偶聯的納米金粒子，與寡核苷酸類目結合分子及acridinium酯偶聯的膠乳粒子，它可在加入過氧化氫後化學發光。
粒子是指小於50微米的物體或基質。一群或一批粒子的大小被定義為粒子樣品最長一對正交維數的平均測量值。正交維數最長那對是指正交維數如下的這樣一對粒子其長度總和是粒子所有這種總和的最大值。如果2個粒子的樣品分別具有1微米×2微米和2微米×3微米的最長一對正交維數，那麼最長那對正交維數的平均測量值是2微米[(1+2+2+3)/4＝2微米]。粒子樣品最長那對正交維數的平均測量值是，例如，小於50微米，小於20微米，或小於5微米。
很多粒子都具有某些固體的性質。然而，分子骨架或複合物，雖然不是剛性的，但也可被定義為粒子。例如，dendrimer或其它支鏈分子結構也被認為是粒子。同樣，脂質體是另外一種類型的粒子。粒子可用信號元件染色或與信號元件偶聯。常常可用術語反映粒子的大小或幾何形狀。例如，術語納米球，納米粒，或納米珠用於指代沿著任何規定軸測量時，小於1微米的粒子。同樣，術語微球，微粒或微珠用於指代沿著任何規定軸測量時，小於1毫米的粒子。粒子的例子包括膠乳粒，聚丙烯醯胺粒，磁鐵礦微粒，鐵流(磁性納米粒)，量子點等。
標記粒子是指可特異性結合靶並產生信號的粒子。標記粒子與信號傳遞部分和類目結合分子偶聯或穩定締合。
靶標記粒子複合物是指特異性結合一個或多個靶的標記粒子。
靶標記複合物是指特異性結合一個或多個類目結合分子並與一個或多個信號傳遞部分締合的靶。
標記比是指在接觸步驟過程中，靶與標記粒子的比例。例如，如果1×107個標記粒子與含有1×108個靶的樣品接觸，那麼標記比為10。
信號元件或信號傳遞部分的信號特徵是指由信號元件信號傳遞部分產生的信號情況，可用於區別它與其它信號元件或信號傳遞部分。例如，用螢光素和若丹明標記的信號傳遞部分的信號特徵是螢光。無線電詢答器的特徵是無線電頻率。光子信號傳遞特徵的例子是螢光，光散射，磷光，反射比，吸光度，化學發光，和生物發光。除後兩者外，所有光子信號傳遞的特徵取決於外部照射(例如，白光源，雷射源，或日光)。相反，化學發光和生物發光是不依賴外部光源的信號特徵。
信號元件或信號傳遞部分的種類是指信號的不同性質，可用於區別它與其它信號元件或信號傳遞部分。例如，用紅色染料標記的脂質體就可與帶有不同顏色的脂質體區別開來。紅色是它的種類。對於傳播特定無線電頻率信號的微型發送器而言，將微型傳送器與其它微型傳送器區別開來的無線電頻率信號的性質構成信號元件的種類。
信號標誌是指試驗中，結合靶類目的信號傳遞部分組合的區別信號性質。與4種類型抗體結合的靶，即其中一個與螢光素分子偶聯，另外3個與若丹明分子偶聯，它們的信號標誌由螢光素和若丹明的組合加權的吸光度和發射譜描述。
試驗或標記類目結合分子整體的信號複雜度是指可在試驗中或通過與整體結合而區別標記的靶類目數。可選擇性地，如果靶的每個類目成員都存在，信號複雜度被定義為預期出現的不同信號標誌數。對於某些試驗而言，類目結合分子整體的信號複雜度與試驗掃描的類目數相等。掃描多種類目的其它試驗所具有的信號複雜度只為1。
選擇力是指用於捕獲，分離，移動，或匯集靶的力。選擇力的例子包括重力，磁力，電力，離心力，向心力，浮力密度，和壓力。通過將選擇力單獨作用於靶上可使靶移動。可選擇性地，選擇力可特定作用在與選擇部分締合的靶上(見下面的定義)。
應用選擇力使靶移動的例子包括靶的離心；與磁性粒子結合的靶的磁性選擇；用金屬粒子標記的靶的重力沉降；和利用真空過濾使靶在多孔膜上沉積。選擇力使用的其它例子包括在下面的實施例中。
選擇部分是指可與類目結合分子偶聯並賦予類目結合分子利用選擇力而被選擇性捕獲，分離，移動，或匯集能力的原子，分子，粒子，或其它實體。當類目結合分子選擇性部分的複合物與靶特異性結合時，通常可利用選擇力選擇性捕獲，分離，移動，或匯集靶。這裡所用的選擇性是指和與選擇部分無關的實體相比，利用選擇力優先賦予選擇部分和相關實體的移動靈敏度。
順磁粒子和鐵蛋白是選擇部分的例子。在溶液中滲透的密集二氧化矽粒子是另外一種類型的選擇部分。這種粒子，當塗覆類目結合分子或與靶結合時，可使靶在水溶液中滲透，從而將結合靶與其它樣品的未結合成分分離。
選擇性特徵是指用於捕獲，選擇或移動選擇部分的選擇部分的情況。例如，順磁粒子的選擇特徵是磁力。迅速滲透在水溶液中的二氧化矽粒子的選擇特徵是聚集。
基本處於同一平面上的表面或底物是指可與虛平面平行排列的表面，這樣當測量從表面上任何一個1mm×1mm正方形中的點到虛平面上最近點的距離時，平均距離的絕對值小於50微米。
檢測表面是指靶在上面沉積的、基本處於同一平面上的底物表面。在利用光子信號傳遞特徵的實施方案中，如果檢測表面是光學透明的，那麼檢測可經由檢測表面的任何一面進行。如果檢測表面是不透明的，那麼檢測可經由沉積了靶的檢測表面進行。
檢測面積是指由本發明同時分析的檢測表面或檢測區的面積。檢測面積的最長線性尺寸通常大於1mm，例如，大於5mm，大於10mm，或大於15mm。例如，由光學裝置同時成像的載玻片的一部分可測量0.8cm×0.5cm，其中的光學裝置包括一個聚光透鏡和一個CCD晶片。檢測面積為0.4cm2。
檢測區是指靶在其中檢測的體積。檢測區具有與檢測面積相同的尺寸，深度與信號傳遞部分在其中檢測並鑑定的深度相應。因此，檢測區的深度取決於評價正信號的臨界標準。當利用光學檢測時，檢測區深度取決於視野的光學深度。
檢測面積的最長尺寸是指檢測面積周長上兩個點之間的最大直線長度。例如，如果檢測面積是0.3cm×0.4cm的長方形，那麼檢測面積的最長尺寸是0.5cm的對角線。如果檢測面積是一個半-主軸長度為7mm，半-副軸長度為2.5mm的橢圓形，那麼檢測面積的最長尺寸是14mm。
大面積檢測或大面積成像是指一種用於檢測顯微靶的方法，其中檢測面積(由檢測裝置同時分析的面積)大於靶。大面積檢測的檢測面積具有至少1個≥1mm的線性尺寸。相反，顯微靶基本較小，通常在至少2個正交維數中具有小於50μm的測量值。大面積檢測的例子包括用CCD照相機使一個9mm直徑的檢測面積成像；通過用CCD線掃描儀掃描而使一個2cm×1m的長方形成像，其中該掃描儀的長尺寸為1cm；利用在照相膠片上直接曝光而使一個含有微生物靶的4cm×4cm濾器成像；和在快速側流帶狀試驗中，目測與1cm×3cm試驗區域上的顯微靶相對應的有色斑點。
很多技術都可掃描含有顯微靶的樣品，但不能利用大面積檢測。例子包括流式細胞術；固相雷射微束掃描細胞術；液相掃描(Tibbe等，Nat Biotechnol 171210-3，1999)；以及利用高倍顯微鏡，使載玻片上的多個視野成像並檢測。
偶聯或穩定締合是指兩個實體之間的締合，其中在4℃的PBS中，締合的平均半衰期最少為1天。例如，被動蛋白吸附聚苯乙烯粒子。有很多不同種類的吸附蛋白。某些蛋白與表面穩定締合，具有幾個月的半衰期。其它蛋白，如鬆散結合在吸附蛋白外層上的那些，可能並不與粒子穩定締合，而且可在幾小時內浸出。
像增強器或映像管是指放大光子信號傳遞的裝置，見Inoué的專業詞典，Shinya等，Video microscopythe fundamentals(Plenum Press，New York，1997；p.665)「一種(通過纖維光學或透鏡)與攝像管連接從而增加靈敏度的裝置」。增強器是一個在前端具有光電陰極的真空管，它可根據聚焦在它上面的像發射電子，它還具有一個將電子聚焦在後端磷光體上的電子透鏡和/或微通道板，以及一個增加電子能量的高壓加速器。可以是單級或多級的。各種像增強器在同一篇參考文獻的第8章中詳細描述。
對檢測面積一部分中的靶同時檢測是指一步檢測來源於基本處於同一平面的檢測表面部分的信號。同時檢測的例子是用CCD晶片、目測、或基於光電二極體的信號積分來檢測在檢測面積中大面積成像的靶。
靜止期的靶是指不移動的靶。例如，固定於載玻片上的靶就處於靜止期。被微量滴定皿孔底上的固定位置中的類目結合分子捕獲的靶也處於靜止期。甚至是沒被固定在表面上，而且可通過流體動力或其它力移動的靶也被認為處於靜止期，在檢測/成像過程中，以大於10秒的間隔拍攝的連續像基本可檢測基本處於同一相對位置的相同靶。流式細胞術中的靶不處於靜止期。然而，由與側流試驗的固相試驗區結合的抗體所捕獲的靶處於靜止期。
均相測定法或均相免疫測定法是指反應物沒有從已完成測定法的產物中完全除去的測定法或免疫測定法。
鑑定是指確定屬於其中成員的靶的類目。例如，掃描靶多個類目的側流試驗中，每個都可能存在於樣品中。屬於特定類目的靶在結合了相應類目特異性抗體的薄膜區被捕獲。已知薄膜區含有捕獲抗體，靶可由發生捕獲的區鑑定。
樣品是指可利用本發明掃描其中是否存在靶的物質。
直接目測是指除了佩戴矯正透鏡外，在不藉助儀器的情況下目測。例如，直接目測可用於檢測某些快速側流試驗中，納米金粒子的微紅反射信號。
光電檢測器是指將光子信號傳遞轉換成電信號的人造裝置或儀器。光電檢測器的例子包括CCD檢測器，光電倍增管檢測器，和光電二極體檢測器，例如，雪崩光電二極體。
環繞能或ensquared能是指來源於無限小光源的光子百分比，它們可被捕獲在光檢測器陣列的像素上。
熱輻射是指黑體輻射。
細胞自發螢光或自發螢光是指由於天然固有細胞成分，如NADH和氧化黃素蛋白的螢光，而由細胞發出的螢光。由於重組螢光蛋白，如綠色螢光蛋白而發出螢光的細胞不被認為是自發螢光。
照射是指用電磁輻射照射。可使用各種波長的電磁輻射照射。它包括，例如，用光譜的X-射線，UV，可見，或紅外區照射，值得注意的是，在可見範圍中，照射不是必需的。
具有光子信號傳遞特徵的信號元件或信號傳遞部分是指可通過光子的發射，反射，散射，折射，吸收，捕獲，或重定向，或光子行為的任何其它調製或組合而檢測的信號元件或信號傳遞部分。具有光子信號傳遞特徵的信號元件或信號傳遞部分的一些例子包括螢光團Texas Red(螢光信號特徵)；CDP-Star(化學發光信號傳遞特徵)；螢光素酶(生物發光信號特徵)；共振光散射粒子(光散射信號特徵)；BM紫(光吸收或產色信號傳遞特徵)；和正向-轉換的磷光體(兩個較長波長光子的吸收和一個較短波長光子的發射)。
『數目』×『溶液名稱』是指這樣一種水溶液，它的溶液濃度為這個數目的倍數(水除外)。例如，10×EE含有10mM EDTA/100mMEPSS(EE，或1×EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE是1mM EDTA/10mM EPPS溶液。在將它們混合之前，用NaOH將兩個成分的共軛酸調節至pH8.0。
HYB是用於雜交的溶液，含有1M NaCl，50mM EPSS pH8.0，2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母tRNA(Sigma)。
UBB(通用結合緩衝液)是用於結合各種類型類目結合分子(如抗體及核酸)的混合物的溶液，含有250mM NaCl，50mM EPPS pH8.0，2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母tNRA(Sigma)。
BB(封閉緩衝液)含有100mM EPPS pH8.0/150mM NaCl/2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)。
PB是0.1M磷酸鈉緩衝液，pH7.4。
PBS是磷酸鹽-緩衝生理鹽水溶液，含有120mM NaCl，2.7mM KCl和10mM磷酸鹽緩衝液(鈉鹽)pH7.4。
PBS-B是BSA的0.1％PBS溶液(沒有IgG；Sigma目錄號A-7638)。
PBS-T是Triton X-100的0.05％PBS溶液(Sigma目錄號X-100)PBS-TB是PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100。
PBT是PBS/0.1％BSA(沒有IgG；Sigma目錄號A-7638)/0.05％Tween-20(Sigma目錄號X-100)LB是用於生長細菌並按照先前所述(Ausubel 1987，supra)製備的Luria肉湯SSC是用HCl調節至pH7.0的150mM NaCl/15mM檸檬酸鈉MES是(2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸)MESB是0.05M MES(2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸)，pH6.1EDAC是(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基))碳二亞胺連接緩衝液是10mM MgCl2/50mM Tris-HCl/10mM二硫蘇糖醇/1mM ATP/25μg/μl牛血清白蛋白。
預溶解溶液該溶液是按照Graves，L等(1993)通用細菌DNA分離過程診斷分子微生物學原理和應用，D.Persing，T.Smith，F.Tenover和T.White，編輯(Washington，D.C.American Society forMicrobiology)。新鮮製備並在冰上保存的該溶液含有0.25ml 2M Tris(pH7.0)，3.1ml的胰脂肪酶(將6.1mg胰脂肪酶(Sigma)溶解在59.8ml水中，然後加入1.2ml 0.1M CaCl2；以3.1ml的等分試樣在-20℃貯存)，0.3ml 1％牛磺膽酸鈉(Difco)，0.5ml 0.1M CaCl2，5.25ml蔗糖，和0.05g溶菌酶。
標準PCR方案(除非另有說明)所有PCR反應是在Perkin-ElmerGeneamp 9700熱循環器中的50mM KCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris HClpH8.3，250μM(各種)dNTP，和10μM(各種)引物中循環30次，然後在72℃培養10分鐘。循環是由3個步驟組成的94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，90秒。
AP鹼性磷酸酶BAL支氣管肺泡的灌洗BSA牛血清白蛋白CCD荷電耦聯裝置
CFTR囊性纖維化跨膜電導調節器cfu集落形成單位(與活細菌細胞數對應的細菌濃度測量值)CMV巨細胞病毒FITC異硫氰酸螢光素HBVB型肝炎病毒HCVC型肝炎病毒HIV人免疫缺損病毒pfu噬斑形成單位(與感染病毒粒子數對應的病毒濃度測量值)PNA肽核酸RSV呼吸道合胞病毒TCID50燒瓶50％感染的組織培養感染劑量除非另有說明，寡核苷酸序列是按照5』-3』方向表示的。
除非另有說明，說明書中描述的微生物株是從美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA獲得的。
附圖簡述

圖1.用CCD陣列對產生信號的各個粒子進行不放大的大面積成像的原理該圖表示使用CCD陣列檢測器使各個靶成像的原理。
圖2.利用不放大的大面積成像檢測結核分枝桿菌該圖表示以本發明為基礎的試驗，它可掃描痰液樣品中是否存在結核分枝桿菌，即可引起肺結核的細菌病原體。將痰液樣品熱固定在顯微鏡載玻片上後，用特異性結合結核分枝桿菌的標記抗體(抗-MTBAb)培養樣品。除去未結合的抗體，只留下與結核分枝桿菌結合的抗體。用螢光團標記抗體，這樣當用一束有色光(激發光譜)照射時，它們可發出第二種顏色(發射光譜)。用激發光譜照射載玻片，使抗體在發射光譜中發光，所述抗體位於載玻片上固定了細菌的位置。發射的光聚焦在CCD晶片上的像素陣列上。照射位於螢光細菌下的像素，並向計算機傳輸電信號，然後使電信號在計算機中作為像保存。用軟體對像進行分析，然後由用戶界面報告在掃描時發現的細菌數。
圖3.進行大面積成像的CCD成像裝置圖中描述的CCD成像器用於收集在實施例中描述的大量數據(見詳述部分的步驟6)。激發光是通過將光從高強度白光源(1000瓦Xenon弧光燈，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，MonmouthJunction，NJ)引入到液體光導(芯直徑5mm，Model 380，PhotonTechnology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)中提供的。液體光導可將光傳送給激發濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)並將濾過的光束(通常直徑為9mm)對準含有標記靶的檢測表面。該儀器可檢測各種檢測表面(例如，多孔膜，顯微鏡載玻片，微量滴定皿，蓋玻片，和底部平坦，且光學透明的試管)上的標記靶。入射光穿透檢測表面，誘導信號傳遞部分中的螢光，該信號傳遞部分經由類目結合分子與靶結合，並沉積在光學透明的表面上。發射螢光的一部分是通過高-收集效率的透鏡系統收集的，並通過發射濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics)傳輸給CCD照相機(OrcaII，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
圖4.進行不放大的大面積成像的CCD成像系統該圖表示具有角形照射結構的CCD成像器，其中光被傳到收集透鏡側面斜角處的檢測表面(這裡表示為微量滴定平板的孔底)上。選擇適當角度從而優化收集效率，並避免收集透鏡對入射光束的阻礙。這種結構的優點在於源於樣品支持物底部表面的反射沒有被收集透鏡收集，因此不會造成螢光背景幹擾。
圖5.利用組合標記檢測不同的病原體使用多個信號傳遞部分(標記)的組合標記可用於獲得較高的信號複雜度(即，大量不同的信號標誌；還可見詳述部分第2步中的討論)。圖中給出的三個病原體是用不同的量子點組合標記的。因此，每個病原體可發射不同編碼的信號(在病原體右側，用有色條形碼表示)。所示的類目結合分子是與基因組DNA雜交的病原體-特異性寡核苷酸探針。每個探針與螢光量子點偶聯。許多類型的類目結合分子(例如，抗體，配體，PNA探針等)都可用於組合標記，其它類型的信號傳遞部分(例如，螢光團，螢光粒子，RLS光-散射粒子等)也可。
圖6.使用標記互補序列偶聯信號傳遞部分該圖描述了間接標記類目特異性寡核苷酸類目結合分子的方法。合成含有類目特異性結合部分和標記序列部分的雙寡核苷酸.信號傳遞部分與第二個寡核苷酸偶聯，被稱作標記互補序列，它與標記序列互補。使用該系統間接標記，可很容易用信號傳遞部分組合編碼而合成具有標記的類目特異性寡核苷酸家族。
圖7.用螢光DNA-結合染料標記的各個細菌的大面積成像該圖表示在多孔膜支持物上檢測各個螢光染色的細菌細胞。細胞是用核酸染料Sybr Green I染色的，並通過黑色聚碳酸酯薄膜過濾。用配有FITC濾光器裝置、基於不放大的大面積成像器的CCD使螢光信號成像。左面表示大約100個大腸埃希氏菌細胞的螢光像。點數與加入到薄膜上的細胞數相關。右面表示薄膜上沒有加細胞的陰性對照組。
圖8.利用各種類目結合分子和信號傳遞部分標記的各個細菌細胞的大面積成像該圖表示用4種類型的信號傳遞部分(Syber Green I，實施例2)；螢光團-標記的寡核苷酸探針，實施例3；螢光團標記的PNA探針，實施例4；螢光團標記的抗體，實施例5)標記蓋玻片上的大腸埃希氏菌細胞的實驗結果。各個細胞是使用圖3所示的裝置，通過不放大的大面積成像檢測的。將標記細胞的稀釋物點在塗覆聚-L-賴氨酸的蓋玻片上。用CCD成像器使標記細胞成像後，通過螢光顯微鏡檢查證實了成像的物體含有各個細胞或若干細胞的臨時群。上面的像表示通過CCD成像檢測的標記細胞。亮點與標記細胞相對應。下面表示在螢光顯微鏡(1000X放大率)中看到的相同標記的細胞。
圖9.利用不放大的大面積成像檢測各個的活細菌細胞該圖表示本發明可利用螢光染料檢測活細菌。亮的螢光點是活的大腸埃希氏菌細胞(左面)，而死亡的大腸埃希氏菌細胞(右面)沒有可檢測的螢光信號。在左面的成像區域中存在大約400個活的大腸埃希氏菌細胞，右面的成像區域中存在大約400個死亡的大腸埃希氏菌。
圖10.用高度螢光粒子標記的各個細菌的大面積不放大成像該圖表示實驗(實施例7)的結果，其中致病性大腸埃希氏菌細胞與微量滴定皿孔的光學透明表面結合，用螢光粒子標記，並進行不放大的大面積成像。將大腸埃希氏菌O157細胞(用Syber Green I染色)熱固定在96-孔平板的底部，並通過與塗覆了抗-大腸埃希氏菌O157抗體的螢光粒子結合而被標記。左面表示在CCD成像器中見到的細胞粒子複合物。中間表示利用低倍螢光顯微鏡(50X放大率)看見的相同樣品。通過高倍螢光顯微鏡(右面；1000X放大率)可以看到，染色的大腸埃希氏菌O157被很多螢光粒子圍繞。
圖11.利用螢光粒子:病毒:磁性粒子複合物的液相磁性選擇和不放大的大面積成像對病毒(HCV)進行均相免疫測定該圖表示用於掃描液相樣品中的顯微靶—C型肝炎病毒(HCV)的有效方法。將塗覆特異性結合病毒的抗體的磁性和螢光粒子混合在可能含有病毒的樣品的微量滴定皿孔中。然後使樣品中的病毒與粒子結合。從圖中的放大投影可以看出，有些病毒與磁性粒子結合，有些與螢光粒子結合。所述磁性粒子:病毒:螢光粒子複合物具有通過磁力和高度螢光選擇的性質。將微量滴定皿放在磁鐵上，這樣磁性粒子，HCV病毒和與磁性粒子締合的螢光粒子就會沉到孔光學透明底部的表面。利用CCD成像裝置(如圖3所示)，使孔的底部成像。由於高度螢光粒子與病毒結合，因此像中的亮點表現為病毒複合物。像的軟體分析可量化檢測表面上的複合物數目，並將標記複合物的信號總強度積分(均相免疫測定法的代表性結果見實施例8和圖12)。
圖12.利用不放大的大面積成像檢測各個細菌的均相免疫測定該圖表示利用實施例8所述不放大的大面積成像靈敏檢測大腸埃希氏菌的免疫測定結果。塗覆了類目特異性抗體的磁性和螢光粒子首先與細菌細胞結合，然後利用磁力使複合物沉在光學透明孔的底部表面(檢測區域)上，然後利用不放大的大面積CCD成像檢測複合物。該圖表示在血液中進行的均相免疫測定(下面)，和在血液(上面)及緩衝液(中間)中進行的非均相(洗過的)免疫測定的結果比較。最簡單的形式，均相免疫測定法可有效檢測具有極好信號背景比的細胞(見圖下面右側的均相測定法的量化)。
最左面兩個表示利用不放大的大面積CCD成像獲得的像。當大腸埃希氏菌存在(左側)時，三次測定都產生了較強的信號，但當沒有加入大腸埃希氏菌時，背景信號較低。使用CCD照相機獲得、與塗覆了粒子的大腸埃希氏菌細胞對應的信號是利用高倍螢光顯微鏡(1000X；上面兩排，最右面兩行)檢查分析獲得的。像表示含有大腸埃希氏菌細胞，磁性粒子，和螢光粒子的典型複合物。每種複合物的兩個像是使用兩個濾器裝置產生的一個觀察DNA螢光(SyberGreen I；右數第2行)，一個觀察螢光粒子(最右面那行)。該圖表示被磁性粒子和螢光粒子圍繞的大腸埃希氏菌細胞組成的複合物。
像的定量分析是通過軟體進行的，該軟體可計算螢光物體數(圖12，下面，左側的柱形圖)並將所有物體的強度積分(圖12，下面，右側的柱形圖)。所示數據表示6個樣品的分析3個樣品含有1000個大腸埃希氏菌細胞，3個樣品不含細胞。在兩次測量中，含有大腸埃希氏菌(1000個細胞)的樣品明顯比不含大腸埃希氏菌的樣品數值要高。柱的高度表示三個樣品的平均值。誤差柱表示三個樣品平均值左右的三個標準偏差。
圖13.「模擬痰液」中抗酸染色的分枝桿菌的大面積成像該圖表示實施例9所述試驗的結果，其中與導致肺結核的病原體緊密相關的分枝桿菌是利用抗酸桿菌(AFB)染色法聯合不放大的大面積成像檢測的。用金胺-若丹明將「模擬痰液」中含有分枝桿菌細胞(瘰癘分枝桿菌；左面1A，2A)或大腸埃希氏菌(右面1B，2B)的市售載玻片染色，並利用不放大的大面積CCD成像觀察(上面1A，1B)。與含有大腸埃希氏菌樣品中的背景斑點數較少相比，在含有分枝桿菌細胞的樣品中檢測到較多的物體。螢光顯微鏡檢查分析(400X；下面2A，2B)證實了，在不放大的情況下，CCD照相機捕獲的信號與單一的分枝桿菌細胞相對應。
圖14.利用大面積成像進行的快速抗微生物靈敏度試驗該圖表示實驗結果，該實驗利用不放大的大面積成像(實施例10)測定抗生物對大腸埃希氏菌生長的最小抑制濃度(MIC)。一式兩份將細胞的等分試樣，於各個時間點在LB瓊脂上培養，然後沉積在96孔微量滴定皿孔的光學透明表面上，用CCD成像器成像(圖3)。生長(在圖中用+/-符號定量表示)是通過LB瓊脂平板上的集落數(圖中沒有表示)和CCD照相機捕獲的像的物體和強度測量值而測量的。第18小時的培養時間點與NCCLS標準方案相對應。圖中還給出了4小時培養結果和4小時CCD成像結果。通過培養和CCD成像檢測的，取決於抗性和敏感株生長的抗生物濃度比較表明，兩個方法具有可比性。
圖15.已經過磁性選擇的、各個螢光標記的白色念珠菌的大面積檢測該圖表示實施例11所述實驗的結果。白色念珠菌細胞是用核酸染料(YOYO-1)和兔抗-念珠菌多克隆抗體預標記的。將標記的細胞加入到玻璃底微量滴定盤孔中的、塗覆了山羊抗-兔IgG抗體的磁性粒子中。利用磁場，使細胞在孔底均勻排列。該細胞是使用CCD成像器和適於YOYO-1螢光染料的激發和發射濾器(FITC裝置，480/40nm激發，535/50nm發射)，通過使孔的整個底部表面成像而檢測的。
如上所述含有用YOYO-1染色的白色念珠菌細胞的微量滴定盤孔的不放大的大面積CCD像。通過在高倍放大率(1000X)的螢光顯微鏡下檢測微量滴定孔，所示螢光信號(圖中的白點)與單一或一小簇白色念珠菌細胞相對應。
沒加白色念珠菌細胞的微量滴定盤不放大的大面積CCD像(陰性對照)。
圖16.特異性結合螢光和順磁聚苯乙烯粒子的各個白色念珠菌細胞的大面積檢測該圖表示實施例12所述實驗的結果。將細胞加入到微量滴定皿中，塗覆了抗-念珠菌抗體的磁性和紅色螢光粒子的混合物中。利用磁場和流體清洗將與磁鐵結合的細胞與未結合的粒子分離。細胞-螢光粒子複合物是通過使用CCD成像器(A和B)或螢光顯微鏡檢查(C-E)以及適於螢光粒子的激發和發射濾器，使孔的整個底部表面成像而檢測的。
A.含有用多個紅色螢光粒子標記的白色念珠菌細胞的微量滴定孔的不放大的大面積CCD像。
B.沒有加入白色念珠菌細胞時，微量滴定孔的不放大的大面積CCD像(陰性對照)。
C.在A.中成像的、相同孔面積的放大螢光顯微像(100X放大率)。多個紅色螢光粒子圍繞在單一或一小簇白色念珠菌細胞(綠色)周圍。
D.在B.中成像的、相同孔面積的放大螢光顯微像(100X放大率)(沒有加入細胞的陰性對照)。
E.和F.圖A中所示相同樣品面積的高倍放大率(1000X)螢光顯微像。多個1μm直徑的紅色螢光粒子圍繞在白色念珠菌細胞(大約5μm直徑，綠色)周圍。沒有見到磁性粒子。
圖17.特異性結合螢光抗體和磁性粒子的各個白色念珠菌的大面積檢測該圖表示實施例13所述實驗的結果。在玻璃底的微量滴定盤中，將白色念珠菌細胞與塗覆了抗-白色念珠菌或抗-大腸埃希氏菌抗體的磁性粒子混合。30分鐘後，加入螢光團標記的抗-白色念珠菌或抗-大腸埃希氏菌抗體。清洗磁性複合物，然後利用磁場使它們均勻排列在孔底。細胞是利用本發明的CCD成像器和適於螢光團的激發和發射濾器，使孔的整個底部表面成像而檢測的。
A.含有用螢光抗-白色念珠菌抗體標記的白色念珠菌細胞的反應孔的不放大的大面積CCD像。
B.沒有加入細胞的反應孔的不放大的大面積CCD像。
C.含有用螢光抗-大腸埃希氏菌抗體標記的大腸埃希氏菌細胞的反應孔的不放大的大面積CCD像。
D.沒有加入細胞的反應孔的不放大的大面積CCD像。
注意使用紅色螢光核酸-結合染料(YOYO-3)染色，並在高倍放大(1200X)螢光顯微鏡下檢測微量滴定孔可知，點螢光信號與單一細胞或一小簇細胞對應。
圖18.使用CCD照相機對各個化學發光的酵母細胞進行不放大的大面積檢測該圖表示實施例14所述實驗的結果。白色念珠菌細胞是用FITC-偶聯的抗-白色念珠菌抗體標記的，其與抗-螢光素抗體鹼性磷酸酶偶聯物結合。將標記細胞的稀釋物點在覆蓋了尼龍薄膜的載玻片上，加入化學發光底物CDP-Star。在不放大的情況下，使細胞在CCD成像器中成像。單一細胞的位置是通過螢光顯微鏡檢查證實的。
從左到右分別表示大約200，60，和20個各個白色念珠菌細胞。在中間和右面成像的各個細胞較多。較大較亮的點表示緊密在一起的兩個或多個細胞。
圖19.利用瞬時膠片直接曝光對各個化學發光酵母細胞進行不放大的大面積檢測該圖表示實施例15所述實驗的結果。白色念珠菌細胞是用FITC-偶聯的抗-白色念珠菌抗體標記的，其與抗-螢光素抗體:鹼性磷酸酶偶聯物結合。將標記細胞的稀釋物點在尼龍薄膜上，加入化學發光底物CDP-Star。將尼龍薄膜裝在Spot Light照相機(Boston Probes)中，用ASA2000 Polaroid Film成像。
從左到右分別表示圖15所示大約200，60，和20個白色念珠菌細胞。已知所點的細胞數，就可推斷出很多點代表各個細胞，特別是在最右面中。
圖20.利用不放大的大面積成像檢測涉及下呼吸道感染的生物該圖表示利用不放大的大面積成像捕獲的像結果，它可靈敏檢測從實施例16所述的螢光標記的下呼吸道生物產生的信號。該圖表示利用不放大的大面積成像(最左側兩行)，從各種下呼吸道病原體產生的信號，這些病原體從上到下依次為肺炎衣原體，肺炎支原體和侵肺軍團菌。最右側兩行表示利用螢光顯微鏡檢查獲得的像。
圖21.利用不放大的大面積成像同時掃描含有3種不同微生物的樣品的多路直接螢光免疫測定法該圖表示實施例17所述實驗的結果。將含有3種不同微生物(大腸埃希氏菌，白色念珠菌和釀膿鏈球菌)的3份樣品固定在蓋玻片上，與類目特異性(在這種情況下，是種類-特異性的)抗體的整體培養。整體中的每個抗體家族與不同的螢光團偶聯(大腸埃希氏菌＝綠色，白色念珠菌＝藍色，釀膿鏈球菌＝紅色)。洗去未結合的抗體後，使用三個不同的濾器裝置(綠色，藍色，和紅色道)捕獲樣品的像。對於所有這3種樣品而言，最強的信號都是在與結合樣品中微生物的標記抗體相對應的通道中獲得的。
圖22.腺病毒的固相捕獲測定法該圖表示使用與固相結合的抗體捕獲病毒，掃描含有腺病毒的樣品的試驗結果(實施例18)。微量滴定平板的孔用抗-腺病毒抗體塗覆。將固定的腺病毒樣品或固定的RSV樣品連同抗-腺病毒塗覆的螢光粒子一起加入到孔中。培養1小時後，洗去所有未結合的粒子，在不放大的情況下，在CCD成像器中觀察剩餘的結合粒子。
陰性對照(RSV那幅)的孔中剩餘的粒子非常少。在腺病毒那幅中，孔中已經捕獲了上千個螢光粒子，這是由於抗-腺病毒塗覆孔，腺病毒，和抗-腺病毒塗覆粒子的相互作用。
圖23.血液中病毒的固相捕獲該圖表示使用與固相結合的抗體捕獲病毒，掃描含有腺病毒的血液樣品的試驗結果(實施例19)。微量滴定平板的孔用抗-腺病毒抗體塗覆。將固定的腺病毒樣品或固定的RSV樣品加入到含50％小鼠血液的孔中。培養1小時後，洗去所有未結合的粒子，將抗-腺病毒塗覆的螢光粒子加入到孔中。清洗後，在不放大的情況下，在CCD成像器中觀察結合粒子。
陰性對照(RSV那幅圖)的孔中剩餘的粒子非常少。在腺病毒那幅圖中，孔中已經捕獲了上千個螢光粒子，這是由於抗-腺病毒塗覆孔，腺病毒，和抗-腺病毒塗覆粒子的相互作用。在腺病毒捕獲期間，血液的存在不會干擾測定。
圖24.腺病毒的液相測定法該圖表示利用「雙粒子」試驗形式檢測腺病毒的試驗結果(實施例20，還可見圖11的表)。將固定的腺病毒或固定的RSV與抗-腺病毒塗覆的磁性和螢光粒子混合。培養4小時後，將磁性粒子和任何結合粒子與其它物質分離，轉移到微量滴定平板上，在沒有放大的情況下，在CCD成像器中觀察。
腺病毒那幅圖表示由磁性粒子捕獲的上千個抗-腺病毒塗覆的螢光粒子，這是由於它們與腺病毒的相互作用。在RSV那幅圖中捕獲的螢光粒子非常少。
圖25.同時掃描細菌和病毒的多路大面積成像免疫測定法該圖表示同時掃描樣品中是否存在大腸埃希氏菌和腺病毒的實驗結果(實施例22)。在有固定的腺病毒存在，有固定的大腸埃希氏菌存在，兩者都存在或兩者都不存在的情況下，將抗-腺病毒塗覆的紅色螢光粒子和磁性粒子，和抗-大腸埃希氏菌塗覆的綠色螢光粒子和磁性粒子混合。培養1小時後，將磁性粒子和任何結合粒子與其它物質分離，轉移到微量滴定平板上，在沒有放大的情況下，在CCD成像器中觀察。
第一排粒子混合物中只加入了腺病毒。絕大多數信號可使用TexasRed濾器裝置看到，該裝置可觀察紅色螢光的抗-腺病毒粒子。
第二排粒子混合物中只加入了大腸埃希氏菌。絕大多數信號可使用FITC濾器裝置看到，該裝置可觀察綠色螢光的抗-大腸埃希氏菌粒子。
第三排混合物中加入了腺病毒和大腸埃希氏菌。信號可使用TexasRed和FITC濾器裝置看到。
圖26.利用不放大的大面積成像檢測各個細菌的濾器流通測定法該圖表示快速「流通」測定法的結果，該測定法可檢測液體樣品中的各個分散細菌(實施例23)。將兩塊硝化纖維素薄膜浸泡在抗-大腸埃希氏菌O157抗體中並乾燥。一個濾器用於收集已經用螢光大腸埃希氏菌-特異性粒子(「大腸埃希氏菌」；這些粒子已經用大腸埃希氏菌O157:H7-特異性抗體塗覆)預培養的大腸埃希氏菌細胞。使含有大腸埃希氏菌-特異性粒子，但不含大腸埃希氏菌細胞的樣品通過另一個濾器(「沒有大腸埃希氏菌」)。通過清洗濾器除去未結合的粒子。CCD成像裝置利用不放大的大面積成像檢測螢光信號(上排)。兩個濾器的證實顯微鏡像在中排(50X放大率)和下排(100X放大率)表示。
圖27.利用螢光酯酶底物染色細胞的大面積成像量化細菌目的在很多應用中，它用於以較大的動態範圍量化活細菌細胞。一個理想的系統應當能夠準確計算從0或1個細菌細胞直到幾百萬或幾億個細菌細胞，從而取消連續稀釋以及它們固有的、缺少精密度，而這種精密度是傳統微生物平板接種法所需的。在該實施例中，我們說明如何用螢光底物將活細胞染色，而基於CCD的不放大的大面積成像可用於量化至少5個數量級以上的細胞。
實驗方法大腸埃希氏菌ATCC 8739細胞是按照實施例Y(Cell Direct實施例)所述生長並處理的。在PBS中製備細胞的連續10-倍稀釋物，樣品一式兩份通過黑色聚酯薄膜(Chemunex目錄號200-C2010-01)上過濾，所述黑色聚酯薄膜安裝在Millipore 1225多功能過濾裝置中的吸收墊(Chemunex目錄號200-C3012-02)上，然後按照實施例Y(Cell Direct實施例)所述染色。此外，一式三份將10μλ的10-5倍稀釋物平板接種在TSA(BD目錄號236950)上，37℃生長過夜，達到細胞滴定度。聚酯薄膜上的螢光信號是用裝有FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40)的CCD成像器(上面步驟6所述；圖3)捕獲的。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理來源於CCD成像器的像。從每個濾器產生的信號被定義為所有物體像素強度的總和(在該特定實施例中定義的物體的像素強度為350-65301)。限定信號的這種方法可消除不含任何染色細胞的濾器區背景，但不能掩飾或不完全統計重疊物體強度。(這是因為細胞很小而且幾乎透明，只要細胞層很薄，信號就會累積)。
結果如圖28所示，該方法產生的信號在至少5個數量級以上是線性的，因而認為本試驗具有較大的動態範圍。
變化物體數較少時，除了使用它們像素強度的總和外，準確的量化可通過計算各個物體而獲得，這是因為物體不太可能重疊。該方法可擴展到準確計算低至1或0個細胞，特別是如果使用多種染料和多種激發和/或發射波長測定代表活細胞的物體。此外，可使用更高級的物體查找算法考慮局部背景強度和照射的變化。
利用不放大的大面積成像檢測濾器上的各個染色細菌該圖表示利用CCD照相機進行不放大的大面積成像來檢測已經沉積在薄膜上的各個細菌細胞(實施例24)。使Syber Green I染色的大腸埃希氏菌細胞通過黑色聚碳酸酯濾器過濾。然後用CCD成像器(上面那排)使濾器成像。下面那排表示螢光顯微鏡檢查，它可證實CCD像中的發光物體的確是Syber Green染色的大腸埃希氏菌(1000X)。
圖28.基於本發明的試驗的動態範圍該圖表示使用本發明時可能出現的較大動態範圍。將大腸埃希氏菌細胞從幾百萬個細胞稀釋成幾百個細胞，過濾，並用螢光酯酶底物染色。分析通過基於CCD的不放大的大面積成像產生的螢光像，然後以它們的信號對細胞數繪圖。在至少5個數量級以上，信號是線性的。
圖29.在不放大的情況下非-儀器檢測少數細菌細胞該圖證實雙層塗覆(鹼性磷酸酶/抗-大腸埃希氏菌抗體)粒子在液體捕獲測定法中的應用，該測定法可檢測各個大腸埃希氏菌細胞(如實施例26所述)。每排3欄中的像是利用不同的檢測方法獲得的。上面那排表示含有100個細胞的樣品所用的方法。下面那排表示不含細胞的樣品的結果。與相應「沒有細胞」的對照組相比，每排標記的「100個細胞」具有明顯更多的點。對於化學發光信號傳遞而言，該點在黑色背景上是白色的，而對於產色信號而言，該點在白色背景上顯黑色。值得注意的是，後者的點即使在用肉眼檢查薄膜時，也很明顯，無需放大。因此，該實施例的結果可證實使用雙功能珠進行不放大的大面積成像可能是靈敏檢測的有效工具，而且無需複雜的儀器。
圖30.砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌的快速均相免疫測定法；部分1檢測砂眼衣原體的存在該圖表示實施例31所述的均相免疫測定法，它可掃描共有的性傳播疾病的病原體砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌。該圖表示免疫測定法如何檢測樣品中是否存在砂眼衣原體。為了理解本試驗如何區別兩個病原體，可參考圖31。測定的形式與圖11之一相對應。實驗詳情與實施例22中用於檢測細菌和病毒的多路測定法相似(圖25)。
圖31.砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌的快速均相免疫測定法；部分2多路檢測的原理該圖是圖31的接續，可表示實施例31所述的均相免疫測定法，它可掃描共有的性傳播疾病的病原體砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌。紅色粒子的檢測表示砂眼衣原體感染，而綠色粒子的檢測表示淋病奈瑟氏球菌感染。
測定的形式與圖11之一相對應。實驗詳情與實施例22中用於檢測細菌和病毒的多路測定法相似(圖25)。
圖32.利用不放大的大面積成像進行、具有高信號複雜度的多路均相免疫測定法該圖表示高度多路的均相免疫測定的流程。測定的原理與圖30相同，區別在於除了兩對分析物-特異性螢光粒子外，該測定法還摻入了很多分析物-特異的粒子對，從而同時掃描很多分析物。獲得高信號複雜度(即，大量不同的信號)的方法需要鑑定靶的若干類目，這些在詳述部分的步驟6中討論。
圖33.同時掃描若干下呼吸道病原體的免疫測定法該圖表示實施例33所述的免疫測定法。將下呼吸道樣品(例如，痰液或BAL)固定在顯微鏡載玻片上。將多孔模板固定於載玻片上後，向各個孔中加入不同家族的病原體-特異性生物素化抗體(例如，將抗-肺炎鏈球菌或抗-軍團菌抗體加入到各個孔中)。洗去未結合的抗體，使塗覆了鏈黴抗生物素的螢光粒子和已經結合了生物素化抗體的病原體結合。結合螢光粒子那部分的位置表示病原體的同一性，這是因為該部分與含有已知病原體的抗體的孔相對應。
圖34.在不進行培養的情況下，多路鑑定泌尿道感染該圖表示實施例34描述的試驗。將不同泌尿道病原體的捕獲抗體平行固定在載玻片的帶上。將載玻片浸入已經用螢光染料處理過的尿液中，其中所述螢光染料與細菌細胞中的核酸結合。細菌病原體如果存在，與載玻片上捕獲抗體的相應系粘著，然後進行不放大的大面積成像。
圖35.血源性病毒HIV，HCV，HBV，和CMV的快速多路鑑定該圖表示實施例35描述的試驗。被微量滴定皿的光學透明底部吸收的是含有4種不同捕獲抗體的4個不同點，所述4種抗體分別對4種不同的病毒(HIV，HBV，HCV，和CMV)特異。將血液(圖中含有HIV)加入到孔中，使病毒與捕獲抗體結合。除去血液後，將4種類型的病毒-特異性螢光粒子的混合物加入到孔中。每種類型的粒子是用具有不同光譜特徵的螢光團(信號標誌)染色的，然後用不同的病毒-特異性抗體塗覆。在孔表面上捕獲的病毒粒子與相應的螢光粒子結合，利用基於CCD的不放大的大面積成像檢測並量化。結合粒子的位置和信號標誌都可鑑定血液中的病毒。
圖36.利用不放大的大面積成像對甲型流感病毒進行超靈敏的側流試驗該圖表示利用不放大的大面積成像，對用螢光標記粒子標記的甲型流感病毒進行側流試驗並分析的結果。該圖表示在塗覆了樣品的試驗帶上，捕獲及對照系的像，所述樣品(從左到右)含有0，105，106，107和108個病毒/ml。螢光信號隨著甲型流感病毒濃度的增加而增加。該數據表明，所述試驗可檢測低至105個病毒/ml的濃度。因此，該實驗可證實基於本發明的側流試驗的靈敏度。
圖37.目測結核分枝桿菌的快速側流試驗該圖表示實施例36描述的試驗。上面表示側流試驗構造的側視圖。試驗區含有與吸水薄膜結合的抗-結核分枝桿菌捕獲抗體系。陽性對照區含有與薄膜結合的結核分枝桿菌。將樣品(圖中含有結核分枝桿菌)塗在樣品墊上。毛細流沿著薄膜牽引病原體細胞，如此它們就可遇到並被試驗區中的捕獲抗體捕獲。將與抗-結核分枝桿菌抗體和鹼性磷酸酶偶聯的粒子塗在樣品墊上。在經由毛細流向吸收墊遷移的過程中，所述偶聯物與試驗區中的捕獲結核分枝桿菌細胞和對照區中濾器-結合的結核分枝桿菌結合。這些結合的偶聯物可在使用鹼性磷酸酶底物進行產色染色後直接觀察。
圖38.利用不放大的大面積成像檢測很多不同生物競爭劑的快速側流試驗該圖表示實施例38描述的試驗。其策略與圖37所述的相似，只是有下列區別。該試驗掃描含有很多不同生物競爭劑，包括細菌，病毒和毒素的樣品。(值得注意的是，為簡單起見，該圖沒有描述實施例38所述試驗中的所有靶，偶聯物，和捕獲抗體)。在該實施例中，樣品遇到並使偶聯物墊中的偶聯物移動。最後，該試驗利用鹼性磷酸酶的化學發光底物和CCD成像來檢測特異性結合的偶聯物粒子。
圖39.利用基因組扣除分離肺炎鏈球菌類目特異性序列該圖表示實施例39所述的肺炎鏈球菌-特異性序列的分離。圖39A表示肺炎鏈球菌與其最近親緣之間的種系發生關係(Kawamura等，International Journal Of Systematic Bacteriology 45406-8，1995)。分離類目特異性序列的策略可分為兩步基因組扣除(圖39B)和篩選(圖39C)。首先，基因組扣除(Straus，1995，supra)是利用致病株(在這種情況下是肺炎鏈球菌)的DNA作為「+」基因組差異樣品進行的(圖39B)。「-」基因組差異樣品是通過將若干最近親緣菌株(通常不引起肺炎的菌株)混合而構造的。所得扣除產物是與病原體基因組雜交，而不是與緊密相關種類的基因組雜交的片段。克隆扣除產物後，分離類目特異性的亞組。這些是與所有肺炎鏈球菌菌株雜交，而不與其它分類群任一菌株雜交的DNA片段。選擇與試驗過的所有肺炎鏈球菌菌株雜交，而不與其它種類的鏈球菌屬菌株雜交的探針。見實施例39的詳細描述。
圖40.使用核酸探針全面檢測呼吸道病原體該圖表示實施例39描述的試驗。病原體-特異性探針的整體與包括兩個部分的載玻片雜交一個部分含有呼吸道樣品，一個部分含有斑點的陣列，其中每個斑點包括不同類目的對照呼吸道病原體。整體中的每個探針家族是用不同的信號標誌標記的。臨床樣品中病原體的信號標誌與對照斑點中信號標誌的比較可鑑定臨床樣品中的病原體。通過像分析軟體找到的物體數和強度可量化樣品中的病原體數。詳細描述見實施例39。
圖41.類目特異性序列的間接組合標記該圖表示實施例40中，用於獲得高信號複雜度的方法。類目特異性寡核苷酸類目結合分子的每個家族是利用與表5相似的方案，用特定的信號標誌標記的。因此，如圖所示，肺炎鏈球菌探針是用紫色或藍色量子點間接標記的，而金色鏈球菌探針是用黃色或綠色量子點標記的。例如，用紫色量子點標記的探針是用兩個相鄰部分合成的即類目特異性寡核苷酸和「紫色標記」。紫色標記序列可與偶聯紫色量子點的「紫色標記互補序列」雜交。
圖42.CNS帶狀試驗該圖表示實施例41描述的試驗。
圖43.利用實際扣除精確識別用於擴增基因組差異序列的雙PCR引物該圖表示實施例43中，用於擴增存在於砂眼衣原體，但不存在於肺炎衣原體中的區(-200-500bp)的PCR引物。所述PCR引物是用雙結構設計的。「左引物」具有與20bp引物連接的XhoL引物序列(5』-GGG CCC CCC CTC GAT C-3』)，而所述20bp引物與砂眼衣原體中插入/缺失區的「左」端相應(5』-XhoL-砂眼衣原體左引物-3』)。「右引物」具有與20bp引物連接的XhoR引物序列(5』-ATC GAT ACC GTCGAC CTC-3』)，而所述20bp引物與砂眼衣原體中插入/缺失區的「右」端相應(5』-XhoR-砂眼衣原體右引物-3』)。
發明詳述發明概述.本發明可迅速並節省成本地掃描含有少量、多種類型(例如，細胞，病毒，或蛋白分子)的顯微和亞顯微靶的最少加工樣品。本發明提供的有效特徵是由一種新的診斷方法提供的，它結合了現代高-強度標記，低-成本成像技術，和不放大的大面積檢測。
為了理解本發明是如何檢測相對較大樣品中的少數顯微靶，首先檢驗具體的實施方案。圖1表示本發明其中一個實施方案的簡單略圖，它可檢測在較大面積上擴散，在這種情況下是指在顯微鏡載玻片的一部分上擴散的少數細菌。標記細菌，從而使它們在不久後發光。在下面很多實施例中使用的、檢測「正在發光」細菌的方法使用數位照相機(CCD晶片)捕獲比各個細菌大很多的樣品區域的像。CCD晶片具有光敏像素元件的陣列。來源於樣品其中一個位置上的「正在發光」細菌的光影響CCD晶片相應位置的像素元件。終端用戶從計算機接收有關樣品中細菌數的信息，而計算機可加工從CCD晶片獲得的像數據(即，受照像素的數量和強度)。
接下來，實施方案的具體應用(圖1)可掃描含有重要細菌病原體—結核分枝桿菌的呼吸道樣品。在該試驗中，如圖2所述，用螢光化學品，螢光團標記細菌，如此當用不同顏色的光(激發光譜)照射時，它們就可發射特定顏色的光(發射光譜)。為了使標記細菌的試劑顯色，首先選擇類目結合分子。理想的類目結合分子應當是一種單克隆抗體，它與結核分枝桿菌結合，但不與可能存在於呼吸道樣品中的其它類型的細菌或物質結合。所述抗體可，例如，特異性結合特定的分子位點，一種「類目特異性結合位點」，而這種位點只能在結核分枝桿菌的表面上找到。接下來，通過與螢光團，例如，螢光素偶聯而標記結核分枝桿菌-特異性類目結合分子。螢光素分子也被稱作「信號傳遞部分」，這是因為它可提供在試驗中檢測的信號。製備用信號傳遞部分(螢光素)標記的類目結合分子(抗-結核分枝桿菌抗體)後，進行結核分枝桿菌的診斷試驗。
圖2說明本試驗如何確定患者是否感染了結核分枝桿菌。將痰液樣品塗抹並固定於載玻片上。用螢光團-標記抗體培養載玻片後，清洗除去樣品中的未結合抗體。用螢光素激發範圍的光照射樣品，可引起塗覆在樣品中結核分枝桿菌細胞表面的螢光素-標記抗體發射螢光。收集細胞的螢光像，在不放大的情況下，將發射的光聚焦在CCD晶片的表面上。因此，共同掃描塗抹面積較大，通常約1-2cm2樣品中的結合分枝桿菌細胞。每個細胞的螢光會撞擊一小簇像素，引起局部電信號從CCD晶片向計算機傳送，並以像文件的形式存儲在計算機中。像分析軟體可通過計算響應細胞所發出光的像素簇數，並將響應像素的總光子強度積分而計算樣品中的結核分枝桿菌數。
本發明利用多種類型的形式，包括標記方法，類目結合分子，和檢測方法構造試驗。然而，該試驗有若干共有的重要特徵。下面將描述本發明很多實施方案共有的步驟和過程。
本發明應用的一般構造由下列步驟組成步驟1設計試驗問題，選擇用於檢測靶的類目結合分子步驟2選擇並製備信號傳遞部分步驟3製備生物樣品步驟4使樣品中的靶與類目結合分子及信號傳遞部分結合步驟5選擇靶以及結合的類目結合分子步驟6通過檢測與靶結合的信號傳遞部分而鑑定並量化樣品中存在的靶步驟1設計試驗問題，選擇用於檢測靶的類目結合分子選擇試驗所要檢測的靶的類目.在功能上，將類目定義為與試驗目的相同的相關靶的範圍。選擇由試驗鑑定的靶的類目相當於確定診斷試驗的目標。選擇靶還是確定試驗所用的分子試劑，類目結合分子的中心。
當基於本發明構造一個新的試驗時，第一步是確定試驗所要鑑定並區別的靶的類目。例如，為了構造一個試驗來鑑定引起患者肺炎的感染劑，選擇通常會引起肺炎的病原體類目，如呼吸道合胞病毒和肺炎鏈球菌；或，為了試驗食源性病原體，選擇引起毒性的細菌類目。本發明可鑑定包括多細胞生物，細菌，和病毒在內的多種靶。此外，還可在同一測定法中試驗各種類目的靶(例如，細菌和病毒)。
本發明的重要用途是鑑定人的體液樣品，如血液，尿液，腦脊髓液，痰液，或糞便中的病原體。(該方法還可用於其它類型的臨床樣品，包括組織樣品)。根據樣品的身體來源和患者症狀的不同，可決定所要鑑定生物的重要類型。例如，在有下呼吸道症狀的患者的痰液樣品中，人們可選擇檢測屬於肺炎共同原因的病毒，細菌和真菌。
類目的選擇取決於試驗提出的診斷問題。因此，當兩個試驗解答兩個不同的診斷問題時，可選擇不同的類目，即使試驗可掃描含有相同靶的同類型樣品。當相對於泌尿道感染篩選尿液樣品時，診斷問題常常是「尿液中有大量的細菌細胞嗎？」。對於這種試驗而言，試驗類目可能包括所有細菌。即，該試驗不能將不同的細菌種類彼此區別開來。因此，例如，大腸埃希氏菌和Enterococcus facacium落在為了這種類型篩選試驗目的的相同「全-細菌」類目中。相反，不同類型泌尿道感染試驗的目的是鑑定種類水平的病原體。對於這種類型的試驗而言，將通常引起泌尿道感染的細菌的每個種類定義為不同的類目(例如大腸埃希氏菌和Enterococcus facacium是獨立的試驗類目)。
對於某些試驗而言，選擇跨越多界的多個生物類目。確定一組不同的病原體中哪個是引起患者症狀的原因在臨床上常常較為重要。本發明為節省成本的有效試驗提出了重要的未滿足需要，該試驗可同時掃描患者樣品中存在的各種病毒，細菌，和真菌。類目複雜度是試驗所掃描的靶類目數的測量值。(見定義部分)。
類目特異性結合位點和類目結合分子.靶的不同類目是通過它們不同的分子組分區別的。例如，認為下列不同病原體組中，每個都可引起下呼吸道疾病甲型流感病毒，RSV，流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，和結核分枝桿菌。每個病原體類目都具有屬於類目特徵，但不存在於其它類目成員或其它呼吸道樣品組分中的分子組分。基於本發明的試驗可通過掃描類目特異性分子組分的存在而檢測特定類目的成員。
為了檢測靶類目的存在，本發明使用特異性結合類目特異性分子組分的分子。存在於靶上的類目特異性分子組分也被稱作類目特異性結合位點，而特異性結合它們的分子被稱作類目結合分子。值得注意的是，類目特異性結合位點是可能存在於所要檢測樣品中的靶的性質。相反，類目結合分子是在診斷試驗試劑盒中提供的試劑。
本發明的優點在於可使用廣譜的類目結合分子。這一點很重要，這是因為不同類型的類目結合分子可用於問不同類型的診斷問題(例如，較寬的界-水平篩選對較窄的-水平鑑定)。類目結合分子(有時也稱作探針)的種類包括核酸(寡核苷酸，適體，克隆序列，基因組DNA，RNA等)，與核酸有關的化學變體，如肽核酸(PNA)；抗體；酶(結合靶底物)；非-酶蛋白，如抗生物素蛋白(結合靶分子生物素)；特異性結合細胞組分的分子(例如，結合肌動蛋白的毒傘素或結合抗生物素蛋白的生物素)；染料和著色劑，如碘化丙錠，金胺-若丹明，或SYTO-17)；配體(例如，表皮生長因子，它可特異性結合表皮生長因子的受體)；和已經利用體外進化技術(例如，Zhang等，Nat.Biotech.1871-74，2000)選擇的多肽或核酸結合試劑。
類目結合分子可摻入其它功能結構域或修飾。例如，類目結合分子常常與信號傳遞部分(即，標記結構域，如螢光團或染色的微粒)或選擇部分(例如，磁性粒子或固體表面)共價或非-共價締合。可選擇性地，類目結合分子可與連接物部分連接，促進與其它功能部分的連接。有時，類目結合分子具有雙重不可分開的功能。例如，碘化丙錠，一種核酸染料，可被用作類目結合分子(例如，類目特異性結合位點可能是酵母中的細胞核酸)，同時，該結合的染料可發揮信號傳遞部分的作用(即，當與類目特異性結合位點結合時，它可發螢光)。以本發明為基礎的試驗可摻入不止一種類目結合分子(例如，抗體及核酸染料，或抗體及寡核苷酸)。
最簡單的試驗可摻入單一類型的類目結合分子，從而掃描單一類目的靶。例如，結核分枝桿菌的試驗可使用單克隆抗體，它與結核分枝桿菌表面上的類目特異性結合位點特異性結合。可選擇性地，例如，當篩選泌尿道感染時，單一類目是「所有細胞」—或，如果人類細胞被溶解，「所有非-人類細胞」—和單一類型的類目結合分子可以是一種核酸染料(例如，碘化丙錠)。
類目結合分子的家族是一組不同的類目結合分子，它們結合靶相同類目的成員。例如，相對於C型肝炎病毒培養的多克隆抗體是抗體的一個家族，這是因為它含有多個類目結合分子，這些類目結合分子特異性結合靶—在這種情況下是HCV的相同類目。類目結合分子家族的另外一個例子是一組80個類目特異性基因組DNA序列，它們存在於所有大腸埃希氏菌O157:H7菌株中，但不存在於其它分類群細菌的成員中。該家族的類目結合分子可與適當製備的大腸埃希氏菌O157:H7細胞雜交，但不與其它類型的細胞雜交。
為了檢測靶的多個類目，一個試驗包括每個類目的一個類目結合分子家族。一組類目結合分子家族被稱作類目結合分子的整體。例如，肺炎試驗或藥物濫用試驗必需將靶的若干類目彼此區別開來。類目結合分子的一個家族被用於靶的每個類目。對於肺炎試驗而言，可使用與引起肺炎的微生物表面上的類目特異性抗原反應的抗體整體。該類目結合分子整體的其中一個家族含有來源於抗血清免疫球蛋白部分並針對肺炎鏈球菌的多克隆抗體，所述抗血清是在兔子宿主中培養的。另外一個家族可含有針對腺病毒外被蛋白的重組抗體或單克隆抗體。
所檢測整體中的靶不同分類群或類目數，即，類目複雜度，是由整體中的類目結合分子家族數反映的。整體中的家族數可由整體的「最小類目衍生」量來準確限定。家族複雜度是結合試驗整體中類目結合分子每個家族的薄膜所需的不同靶的最小數。例如，類目特異性抗體的整體可用於同時檢測痰液樣品中結核分枝桿菌，軍團菌，Coccidoidesimmitus，流感病毒，及呼吸道合胞病毒的存在。該整體的家族複雜度可能為5，這是因為最少有5個靶，每個靶來源於一個病原體類目，這是結合整體中每個類目結合分子家族成員所需的。本發明在單一試驗中鑑定廣譜靶的能力是其利用具有較大家族複雜度的類目結合分子的整體掃描樣品的能力。
與本發明聯合使用的類目結合分子應當是特異性的，其中它們應當在測定條件下結合預定的靶(分析物)，而不結合其它類型的靶(是指由測定法區別的)，或樣品或試驗的其它可能組分。因此，對於上呼吸道細菌感染試驗而言，篩選可能的類目結合分子，從而除去與上呼吸道正常(共生的)微生物組分交叉反應的那些。
用於獲得並描述類目結合分子的代表性方法包括在下面的實施例中。
步驟2選擇並製備信號傳遞部分用信號傳遞部分標記類目結合分子。在不進行光學放大或不使用昂貴器械的情況下，本發明檢測各個顯微靶的能力取決於以高信號強度特異性標記靶。標記是經由與類目結合分子締合使信號傳遞部分與靶特異性結合而獲得的。然而，應注意的是，對於本發明的某些應用而言，利用靶的固有性質作為信號傳遞部分時，無需標記(例如，細胞自身螢光)。
本發明以兩種一般途徑區別靶的類目。其中一種方法，也被稱作信號區別，是用信號傳遞部分標記類目結合分子的每個類目特異性家族，這樣它就具有獨特的信號標誌。產生並檢測大量不同信號標誌的能力(即，高信號複雜度)可構造掃描靶若干類目的試驗(即，高度多路的試驗)。區別靶多個類目的其它方法，幾何區別，依賴於在檢測面積的不同區中沉積不同類目的靶。可不依賴於信號傳遞部分的信號標誌的幾何區別在下面討論(步驟5)。
本發明可利用不同類型的信號特徵，包括螢光，散射光，光偏振，無線電波，粒度，磁場，化學發光和放射性。信號傳遞部分的例子和利用各種信號特徵的檢測方案在下面給出。在一個信號特徵內可有多個信號傳遞種類。例如，如果信號特徵是螢光，各種特徵發射光譜包括信號傳遞種類(例如，紅色螢光，綠色螢光，和藍色螢光)。可選擇性地，作為另一個例子，認為紅色螢光微粒是用不同濃度的相同螢光團染色的。螢光也是信號特徵，然而在這種情況下，不同強度的粒子構成信號特徵的種類，即，螢光強度是區分一組粒子與另一組粒子的信號特徵的性質。
如下面實施例所證實的，多種信號傳遞部分都可與本發明聯合使用。信號傳遞部分可包括簡單的螢光團，上調型磷光體，天然的螢光蛋白(如綠色螢光蛋白及其相關物)，染料，酶底物系統(產生底物產物顏色改變或化學發光)，螢光微粒，光散射粒子，磁性粒子，或無線電傳輸微型器件。
獲得高信號複雜度對於發展掃描若干類型靶的試驗(即，具有高度類目複雜度的試驗)很有用。
獲得高信號複雜度。混合物中可區別的標記(或信號傳遞部分)數被稱作信號複雜度。對於高度多路的試驗而言，使用具有高信號複雜度的信號傳遞部分有時是有利的。可與本發明聯合使用產生高信號複雜度的3種一般方法是(1)區別標記。(2)組合標記。和(3)比例標記。
1.對於區別標記而言，不同探針家族中的探針是用單一信號傳遞部分標記的，其可在所有其它信號傳遞部分存在的實驗中很容易地檢測。迄今為止，很難獲得高信號複雜度的區別標記。這是因為絕大多數標記方法使用光學信號(例如，產色，螢光，化學發光)或放射性標記。由於光學信號的光譜帶寬和現有儀器可檢測信號的有限範圍，可使用光學信號分辨的信號複雜度較小。例如，由於光譜重疊，具有不同發射光譜的很多螢光團的分辨目前是不可能的。
2.本發明所用獲得高信號複雜度的其它方法是應用組合標記方法。組合標記是使用相對少數的不同信號傳遞部分獲得高信號複雜度的技術。使用這種方法，不同組合的信號傳遞部分與不同的靶結合。原理在圖5(還可見實施例1)中舉例說明。目前，螢光團是分子診斷學的一類有益信號傳遞部分。然而，由於涉及分析多個不同螢光團的複雜情況(出現激發和發射光譜的大部分重疊)，目前在實踐中只能摻入大約7種或更少的常規螢光團。然而，組合使用時，7種螢光團可用於產生127種不同的信號(N個螢光團產生2N-1種組合)。高信號複雜度還可利用其它類型的信號傳遞部分，經由組合標記獲得。例如，用不同染料浸滲的粒子，落在不同離散大小種類中的粒子，或發射不同無線電信號的轉發器都可用於該方法中。使用螢光團的組合標記近來已經成功用於人類的染色質組型(Speicher等，1996，supra；Schrck等，1996，supra)。用於分析組合標記實驗的儀器和軟體可從市場上購買。
3.高信號複雜度還可使用比例標記方法獲得(Fulton等，1997，supra)。在比例標記中，就像組合標記那樣，很多不同類型的信號傳遞部分可使用相對少數的不同信號元件產生。然而，與組合標記相反，比例標記中的信號傳遞部分是通過信號傳遞元件的比例區別的。例如，兩個螢光團X和Y，具有不同的激發/發射特徵，可用於將聚苯乙烯粒子染色。將不同相對濃度的螢光團([X]，[Y])用於不同的粒子組。例如，8種不同濃度的X和8種不同濃度的Y用於將粒子染色時，所有組合方式(X1Y1，X1Y2，X8Y7，X8Y8)產生64類可區分的粒子。比例標記可將簡化儀器，只需使用少數信號類型。除了螢光團之外，還可使用包括非-光學信號元件的信號元件，利用比例標記方法產生高信號複雜度。
產生較強信號可促進單一顯微靶的檢測。所需信號強度的水平當然取決於信號特徵的類型(光學，粒度等)和檢測方法/儀器(見下面)。
標記類目結合分子的各種方法都可用於獲得所需的靈敏度。優化信號強度的其中一個方法是用高度螢光信號傳遞部分標記靶分子。例如，量子點，螢光染色的納米球，及聚合的螢光團分子都可產生較強的螢光信號。摻入若干信號元件可增加信號傳遞部分的螢光強度。例如，螢光納米球(-20nm直徑；Molecular Probes)可產生與大約180個螢光素分子相等的信號。螢光染色的聚苯乙烯微粒(例如，1μm直徑)可摻入上百萬個螢光團信號元件。用於在信號傳遞部分中摻入多個螢光團的方法與在克隆類目特異性序列的PCR擴增過程中，在螢光團-dNTP偶聯物中摻入核酸類目結合分子有關。將多個螢光團摻入到核酸類目結合分子中的可選擇性方法包括使用與多個信號傳遞部分結合的dendrimer，支鏈DNA，或滾環模板，或用若干聚合螢光團標記的核苷酸加尾。類目結合分子與多個信號傳遞部分的偶聯也可增加信號強度。例如，信號擴大還可通過使大量信號酶(例如，鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶)與納米粒子偶聯而獲得。
獲得強信號的其它方法是使若干標記的類目結合分子與每個靶結合。這一點可通過各種方式做到，包括使用多個類目結合分子(識別同一靶中的多個類目特異性結合位點)或選擇與在靶中佔多數的靶分子結合的類目結合分子。例如，標記的微生物-特異性多克隆抗體可通過結合微生物靶上的若干不同抗原決定部位而獲得高信號強度(例如，見實施例11)。實施例1還描述了使用標記的類目結合分子，它們可結合每個靶生物中的多個不同類目特異性結合位點。選擇在每個靶中大量存在的類目特異性結合位點的策略先前已經頻繁使用過。這種策略的實施例包括使用核糖體RNA的核酸探針(這取決於靶生物和以每個細胞中上千個拷貝存在的細胞類型)。同樣，某些抗原靶分子是以成百上千個拷貝存在於每個靶生物細胞中的。本發明可利用這些策略。作為另一個例子，當使用核酸-結合螢光染料Syber Green I作為類目結合分子/信號傳遞部分時，細菌中存在的大量類目特異性結合位點可產生較強的信號強度(例如，見實施例)。
使若干信號傳遞部分與靶結合不僅能夠增加信號強度，而且它可賦予本發明穩定性，這是因為在沒有靶存在的情況下，使用預期的複合信號標誌觀察大量信號傳遞部分若干聚簇的機會比較小。
使信號傳遞部分與類目結合分子偶聯。本發明可利用本領域那些技術人員熟知的各種方法摻入直接與類目結合分子偶聯的若干類型的信號傳遞部分(見，例如，Hermanson，G.，Bioconjugate Techniques(AcadamicPress，1996)和下面的具體實施例)。例如，抗體或寡核苷酸類目結合分子可與螢光團或量子點信號傳遞部分直接偶聯。可選擇性地，例如，抗體或寡核苷酸類目結合分子可用於塗覆基於螢光微粒或光散射納米粒子的信號傳遞部分。信號傳遞部分可間接與類目結合分子偶聯。例如，如圖6所示，信號傳遞部分可與標記互補序列直接偶聯，然後標記互補序列與標記序列雜交，其是含有類目-偶聯序列的寡核苷酸的一部分。可選擇性地，例如，抗生物素蛋白可與多個信號元件直接偶聯，構成信號傳遞部分。然後，標記的抗生物素蛋白分子與生物素化的類目特異性抗體結合。在結合步驟之前，之中，或之後，信號傳遞部分可與類目結合分子偶聯。例如，在本發明其中一個實施方案中，洋地黃毒苷-標記的核酸探針可用作類目結合分子。類目結合分子與樣品中靶的類目特異性結合位點結合之後，洗去未結合的探針。然後使抗-洋地黃毒苷抗體鹼性磷酸酶偶聯物(信號傳遞部分)與結合的洋地黃毒苷-標記探針偶聯。然後將鹼性磷酸酶底物(例如，化學發光底物CDP-Star；NEN)加入到結合的鹼性磷酸酶中，產生信號。
步驟3製備生物樣品樣品的製備.本發明的重要特徵是其快速且簡單的樣品製備方案。與其它靈敏的診斷方法，如基於核酸擴增的技術相比，它具有更多的優點，而基於核酸擴增的技術對樣品製備過程有更多的要求，從而除去酶抑制劑。
根據樣品性質和試驗形式的不同，樣品製備可有若干功能。在某些情況下，樣品製備可使靶濃縮和/或沉積在底物上。例如，水源性微生物試驗可利用過濾濃縮微生物，並使細胞沉積在濾紙上用於檢測。其它樣品塗抹在固體底物(例如，顯微鏡載玻片)上。
利用類目結合分子使靶上的類目特異性結合位點更容易結合是樣品製備的一個重要功能。在某些情況下，需要進行很少的處理或不進行處理，例如，當類目特異性結合位點是自由接近類目特異性抗體的含水樣品中微生物表面上的抗原決定部位時(例如，見實施例8)。在其它情況中，需要進行樣品製備從而使內部的類目特異性結合位點容易接近。例如，當類目特異性DNA序列用於結合基因組DNA上的類目特異性結合位點時。所製備的靶細胞必需可滲透探針，且它們的基因組DNA必須是變性的。當檢測同一樣品中大量不同類型的靶時，樣品製備對於靶的整個譜都必須有效。樣品製備方法的其它具體實施例在下面的實施例中詳細描述。
如果測定法產生了負結果，那麼它對於了解樣品是否真的沒有靶生物，或測定法本身失敗，即，結果是否是假陰性而言很重要。為了鑑定假陰性結果，可向實驗樣品中加入一種或多種陽性對照靶。陽性對照靶含有的類目特異性結合位點並不存在於所檢測靶的範圍中。與陽性對照靶相應的類目結合分子也包括在試驗所用的其它類目結合分子中。這些靶將在所有測定法中檢測，除非一個或多個測定步驟不成功。檢測陽性對照信號失敗可表示假陰性結果。
步驟4使樣品中的靶與類目結合分子及信號傳遞部分結合在該步中，類目結合分子及締合的信號傳遞部分在促進特異性結合的條件下與樣品中的靶接觸。例如，在該步中，類目特異性核酸序列的整體與樣品中的互補靶序列雜交。同樣，樣品中的類目特異性抗原與相應的類目特異性抗體結合。對於結合步驟而言，存在很多可能的物理結構。例如，結合可在顯微鏡載玻片上的液相中進行(例如，見實施例8)，或在硝酸纖維素帶上進行，使用側流色譜(例如，見實施例38)。優化類目結合分子的濃度，從而獲得快速結合動力學。用於選擇特異性結合的選擇條件取決於類目結合分子的特徵及其與靶分子的相互作用。具體條件和過程在下面的實施例中描述。
步驟5選擇與類目結合分子及信號傳遞部分複合的靶將與信號傳遞部分結合的靶與未結合的信號傳遞部分進行物理分離可提高隨後的檢測過程。選擇步驟的另外一個目的是使靶沉積在檢測區(例如，成像裝置焦面中的範圍)中。複合物通常與固相結合，而未結合的類目結合分子和信號傳遞部分仍留存在液相中。在某些情況下，洗去未結合的物質。在其它試驗形式(例如，均相液相形式和基於薄膜的測定法)中，無需清洗。
對於在結合步驟之前，將樣品固定在固體底物上的測定法而言，未結合的類目結合分子和信號傳遞部分通常通過清洗除去。下面代表性的實施例包括使用原位雜交和免疫細胞化學方法。
其它試驗形式是在液相，例如，微量滴定孔中進行的。在這些實施例中，靶/類目結合分子/信號傳遞部分複合物通常在結合步驟之後沉積在表面上(見，例如，實施例8)。使靶複合物沉積在表面上的方法包括離心，過濾，重力沉降，磁性選擇，或與表面結合的類目結合分子(例如，捕獲抗體，如實施例18)結合。在某些情況下(例如，磁性分離不同的部分)，使用選擇部分。塗覆了類目特異性抗體的磁性微粒是選擇部分的例子(見，例如實施例8)。未結合的類目結合分子和信號傳遞部分通常留存在液相中，而且可除去。如果選擇過程(例如，光學成像)可選擇性分析具有狹窄視野深度的固體表面，那麼有時無需除去未結合的物質(位於焦面外部)(例如，見實施例8)。這些和其它方法的其它例子在下面給出。
在關注點(point-of-care)試驗中，側流和流通形式是可論證的最成功的試驗形式。這些形式利用吸水薄膜中毛細流的優點。它們通常使用表面-結合的類目結合分子選擇靶複合物。未結合的類目結合分子和信號傳遞部分通過毛細作用流到捕獲區外面。基於薄膜測定法的其它重要優點是很容易利用幾何區別而成為多路的。
構造多路試驗的幾何區別。當掃描靶的多個類目時，幾何區別是一個重要的方法(即，在多路試驗中)。與高信號複雜度的多路試驗(見步驟2)相比，幾何區別具有下列優點，即對於多路試驗而言，只需要單一的信號標誌。在使用幾何區別的典型免疫測定法中，不同的類目特異性捕獲抗體沉積在檢測區的不同範圍中(例如，側流試驗中的不同帶或流通試驗或基於微量滴定孔的試驗中的不同斑點)。因此，靶的不同類目在捕獲區的不同預定範圍被捕獲。與捕獲抗體類似的其它類型捕獲部分包括抗原，配體，及核酸。幾何區別的若干實施例在下面給出(例如，見實施例38和實施例34)。
步驟6通過檢測與樣品中靶結合的信號傳遞部分而檢測，鑑定，並量化樣品中存在的靶生物本發明的重要優點，包括其靈敏度及其量化靶的能力，來源於利用大面積成像檢測單一靶的能力。一旦複合物位於檢測區中，則用信號傳遞部分標記的靶的檢測就會受到影響。所用的檢測過程取決於信號傳遞部分的信號特徵的類型(例如，螢光，化學發光，或光散射)。對於某些信號特徵(例如，光散射和螢光)而言，檢測區中的複合物必須接受光源的照射。對於其它(例如，化學發光，無線電傳輸，或磁場)而言，無需照射。可以使用的各種檢測模式包括CCD照相機，膠片，和直接目測。
非-顯微鏡檢查的大面積成像可大大增加靈敏度。不使用顯微鏡檢測靶是本發明的其中一個重要方面，在很多情況下，它可獲得比標準原位分析方法中所用的顯微鏡檢查法更為快速，有效，且靈敏的樣品分析。與顯微鏡檢測相比，不使用顯微鏡的大面積檢測的靈敏度增加是由於掃描更大體積含靶樣品的能力。例如，本發明可使顯微鏡載玻片上的區域成像，而這個區域要比利用顯微鏡成像的典型區域大幾千倍。靈敏度的最終增加可由來源於肺結核患者的、含有10,000個細菌/毫升的痰液樣品來說明。進行原位分析時，將樣品的一部分(例如，10μl含有大約100個結核分枝桿菌)在顯微鏡載玻片上塗抹為大約1cm2大小的面積。在這種情況下，本發明可使整個1cm2大小的範圍成像，同時檢測100個單一細胞。相反，當使用顯微鏡分析時，由於檢測的視野較小，單一區域根本不含細菌的可能性很高。因此，當使用顯微鏡分析時，必須仔細檢測多個視野(常常是上百個)。這是一種增加成本-，費力-，和費時間-的方法，可由本發明的試驗避免。
單一靶的檢測很自然就是定量的。在檢測或成像步驟的過程中，本發明可檢測規定體積樣品中的單一靶。定量可通過計算照相或數字圖像中的單一細胞數人工完成或通過對數字圖像進行軟體分析而自動完成。對樣品的信號強度積分也可用於量化靶。信號積分對於含有高濃度靶或相關靶(絲狀真菌)的樣品特別有效。在這些情況下，分辨即時信號常常是不可能的。當適於共同使用它們(例如，當靶水平足夠低，從而可區別分散的靶)時，自動信號積分和粒子計數可提供一種穩定，並因此優選的量化方式。
將標記探針家族的標誌解譯可鑑定靶的若干類目。這一步的重要目標是通過測定與樣品粘著的標記類目結合分子的標誌而鑑定樣品中靶的類目。
成像對照標準品可提供鑑定基準並表明該測定法是正確發揮作用的。穩定性和再現性可通過在本發明中很容易地摻入內部標準品和對照品的能力而大大提高。例如，當掃描含有通常引起肺炎的24種病原體的下呼吸道樣品時，可同時掃描一組含有各種病原體的內部標準品(例如，見實施例1)。除了為所有試劑和過程提供全面且過多的檢查之外，內部標準品還可提供一組基準信號，從而與樣品信號比較而鑑定。
當使用螢光作為信號特徵時，基於CCD照相機的成像器，如圖3所示，是一種用於大面積成像的有效裝置。這種裝置用於收集下面很多實施例的數據。激發光是通過從高強度白光源(1000W Xenon弧光燈，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，MonmouthJunction，NJ)將光引入到液體光導中(5mm芯直徑，Model 380，PhotonTechnology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)而提供的。液體光導可將光傳送給激發濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)，並將濾過的光束(通常直徑9mm)對準含有標記靶的檢測表面。圖3所示裝置可檢測各種檢測表面(例如，微量滴定孔，顯微鏡載玻片，蓋玻片，和平坦、光學透明底部的試管)上的標記靶。入射光穿透檢測表面，誘導經由類目結合分子與靶結合的信號傳遞部分中的螢光。所發射螢光的一部分是由高-收集效率的透鏡系統收集的，並通過發射濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics)傳輸給CCD照相機(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。光學裝置的設計和構造是與本領域技術人員已知的原理和實踐為基礎的。
下面實施例中的試驗使用圖3所示的儀器，其中裝有X-Y定位平臺(BioPoint XY，Ludl Electronics)，從而在激發和收集的光學器件(圖中沒有標出)上移動樣品容器(例如，微量滴定平板)。Image-Pro和Image-Pro附件可控制所有的儀器元件及像的獲得。濾器盤是用ScopePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)控制的，StagePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)操縱平臺的定位，而照相機的控制是通過Hamamatsu Orca II驅動器(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)進行的。Image-Pro Plus也可用於像-處理和下面所述的分析。
可使用捕獲樣品區域的中等分辨像的低成本照相機。對於典型的感染性疾病而言，在20×20mm的樣品面積上，分散了1-10,000個靶。預期單一、非-絲狀的原核生物細胞以直徑小於10μm的點源出現。對於在成本已知的醫學診斷實驗室中進行的常規試驗而言，可使用中等解析度的照相機。例如，具有極好的靈敏度和幹擾指數的便宜照相機(例如，來源於Roper Scientific的SenSys CCD)很容易獲得。這些系統通常具有500×500或更高像素的解析度。用500×500像素的解析度使20mm2的樣品區域成像可提供250,000個像素，超過了典型測定法中預期的，足以區別1個靶-10,000個靶的大半。
成像系統的靈敏度可通過選擇更靈敏的照相機(例如，冷卻至低溫的照相機，或使用後面較薄的晶片的照相機)來增加。可選擇性地，檢測靈敏度和解析度可通過使用線掃描系統(例如，BT Image Array；Hamamatsu)增加。進行線掃描時，線性CCD或光電二極體陣列(例如，1×500或1×1000個像素)用於捕獲像。一維解析度與陣列元件數相對應，而第二維常常通過在線性陣列下垂直移動樣品載玻片而捕獲。因為元件較少，相似靈敏度的線性陣列通常比區域形式的CCD照相機要便宜。
本發明使用白光照射的實施方案利用光譜濾器為每個螢光團提供最佳激發峰。白光的光譜較大，可選擇各種螢光團來消除發射光譜的重疊。通常使用白光照明裝置獲得的斑點大小，例如，2mm-5mm，對於大面積成像是適宜的。因為濾器更換相對簡單，而且可以是自動化的，因此白光系統非常適宜，可在使用不同螢光團組的試驗中使用相同的儀器。
圖3所示系統的收集效率是通過插入由兩個元件組成的、常規設計的收集光學器件而最大化的，這兩個元件是收集物鏡和聚焦元件。收集物鏡具有高收集效率(≥f#/1.2)，並輸出相對準直的光束。聚焦透鏡可捕獲從收集物鏡輸出的光，並將它聚焦在CCD的檢測表面上。光學器件被設計成兩部分，從而使濾器盤插在收集透鏡的路徑中。對於本發明的某些實施方案而言，例如，對於某些不需要更換濾器的實施方案而言，它可包括一個用於獲得高收集效率的錐形光纖束。光纖束包括收集近樣品光的纖維和光直接對準CCD晶片的通道。可選擇性地，本發明可利用直接近檢測而非常靈敏地檢測信號，其中樣品直接塗在CCD晶片上，或與CCD晶片緊密接近(對後面變薄的CCD晶片的後面高度靈敏)。
除了白光、上述多-光譜系統之外，我們還可研製了一種更簡單的單色螢光成像系統，用於不放大的大面積成像。在該系統中，激發光是由532nm的Frequency-Doubled Diode Laser(50mW，Model#BWT-50E，B W Tek，Newark，DE)提供的。所用角形照射系統在圖3中表示。
因為圖3所示的檢測系統是單色的，因此無需濾器盤。單一的激發濾器可除去源於雷射輸出的諧波光譜(Model HQ532/10x，ChromaTechnology，Brattleboro，VT)，且單一發射濾器(Model HQ620/60m，Chroma Technology，Brattleboro，VT)只能允許特異性螢光信號通過CCD照相機。這些系統還可使用較之先前所述更便宜的CCD照相機(Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn，CA)來捕獲像。通過插入多個雷射和濾器裝置，這些圖中所示的儀器很容易適合進行多色分析。
檢測系統中還可插入使靶沉積在檢測表面上的工具。例如，可在儀器中插入磁站。還可裝配磁鐵(Dexter Laboratories)而使磁珠沉積在96-孔微量滴定皿的底面上。使用自動平臺，將微量滴定皿移動到磁鐵上的位置中，時間要足以使磁珠和締合的靶沉積在孔的底面(通常幾分鐘足以)。然後將微量滴定皿從磁站移開，使孔單獨成像。
在包括檢測儀器的系統中還可插入其它選擇工具。例如，過濾站可用於使靶沉積在濾器上，然後自動成像。同樣，還可通過在機載離心機中離心而使靶沉積在檢測表面上。用密集粒子標記的靶的重力選擇只需要簡單在檢測儀器內培養。
在包括檢測裝置的儀器系統中還可連接或插入其它組件。操縱樣品容器，如微量滴定皿的自動組件是其中一個例子。
插入到本發明中的CCD照相機通常冷卻至-5℃--20℃，對於具有最小照相機幹擾累積的10秒-約2分鐘的積分時間(取決於照相機的靈敏度)而言足夠。通過長時間收集螢光團發射的光子，較長的積分時間通常產生更高的靈敏度。較長的積分時間對於線掃描是不適宜的；然而，存在著後面變薄的線性陣列，它具有非常高的量子效率，可增加靈敏度。
本發明還可利用基於幹涉儀的光譜成像檢測和解譯信號(Schrock，E.，1997，supra)。使用這種技術，由信號傳遞部分發射或散射的光分為兩部分通過稜鏡(不同波長行進不同的距離)，從而重組以創造幹涉圖樣。幹涉圖樣的Fourier分析可相對於像中的每個點產生一個光譜。
可選擇性地，便宜的照相用膠片可用於記錄樣品中靶的像。當信號特徵是化學發光時，該方法更容易實行(例如，見實施例15)。
對於本發明使用像檢測器的實施方案而言，計算機軟體可鑑定並量化靶。通常，該軟體可(1)校正照射的不均勻性；(2)如果需要，校正通過去捲曲基質幹擾的螢光；(3)如果需要，利用印在底物上的登記標記排列像；(4)進行計算，從而將靶與其它信號區別開來；(5)給樣品中每個成像的靶分配同一性；(6)計算每個類目中的靶總數；(7)成像並記錄用於樣品鑑定的條形碼；和(8)將輸出的數據(包括內部標準和樣品的數據)，像，和條形碼自動保存在資料庫中，通過網絡瀏覽器界面查詢。市售的像分析軟體包可用於提供這些功能。可使用多色像分析軟體包(例如，Image-Pro，Media Cybernetics；Metamorph，Universal Imaging，MatLab，The Mathworks)。
雖然本發明可計算單一分散的靶，靶可以是完全連接的(例如，絲狀真菌)，或可以是重疊，或同時存在的(常以高密度存在)。因此，本發明所用的軟體分析包優選包括量化靶的組件，它是通過將成像面積上的信號標誌的信號強度積分而進行的。樣品中的靶數常常通過將樣品像的積分信號強度與內部標準對照中單一靶的平均信號強度作比較而確定。通過將若干樣品的輸出與「金本位」方法進行比較，軟體量化組件優選對於每種類型的靶都是「調諧的」。例如，含絲狀真菌的樣品優選使用下列軟體模塊量化，其已經通過與顯微鏡量化比較而校準。或，對於某些細菌而言，通過微生物培養或染色細菌的顯微鏡檢測而進行的量化可用於校準該軟體。下面的實施例提供用本發明獲得的像軟體分析的具體例子。
這裡描述用於分析在下面很多實施例中收集的螢光數據的軟體包和方法。使檢測表面成像，從而測定螢光-標記的複合物數和/或總螢光信號。螢光是通過CCD照相機從測定容器的底部捕獲的，並存儲為TIFF(Tagged Image File Format)像文件，其中包括像素位置和強度的記錄。3種方法都可用於量化測定結果。成像檢測區的總積分信號是通過計算所有像素的螢光信號總和測定的。將樣品的積分信號與陰性對照的進行比較。測量總的積分信號對於含多個靶的樣品特別有效。第2個方法是計算檢測區域中的物體數。第3個方法是將螢光物體內所含的全部像素的強度積分(與計算像中所有像素強度的總和相反)。所有像分析都是用Image-Pro v 4.0(Media Cybernetics，SilverSprings，MD)進行的。
獲得總積分信號是通過最初確定代表容器底部的像上面積(目標面積)而獲得的。Image-Pro可使目標面積轉化成單一物體，其它Image-Pro工具可計算該物體中像素總信號的總和。然後以相同的方法分析沒有加入靶的測定容器的相似像，並用作陰性對照。將陰性對照值從含靶樣品的值中扣除。這樣做可除去兩種測定法和電幹擾。
第2和第3個量化方法使用了Image-Pro’s物體-發現工具。這種工具可連接連續的像素，該像素具有高於自動或用戶-自定義閾值的值(信號)。這樣可確定物體周長的輪廓線。周長像素和那些內部被定義為物體，這些像素值的總和產生物體積分值。然後使用分析軟體自動計算代表樣品容器底部的目標區域中的所有物體數，此外，計算所發現所有物體的積分信號強度。
使用IPP Image-Pro宏語言，上述工具可同時自動批量處理若干像。此外，還可使用其它用戶自定義的IPP小型程序處理數據。例如，可包括或排除低於或高於特定大小(面積)或強度的物體，它是用於除塵的有效工具。
實施例.下面的實施例為實行本發明的各種實施方案提供了技術細節，它們可與各種應用聯合使用，但不是對本發明的限制。
實施例1.用螢光DNA-結合染料標記的各個細菌的大面積成像概述本實施例證實本發明在不放大的情況下，檢測多孔膜上各個細菌細胞的用途。大腸埃希氏菌的細胞靶是用螢光核酸染料標記的，並通過薄膜過濾，利用大面積成像，使用CCD照相機捕獲螢光像。
實驗方法大腸埃希氏菌ATCC 8739的培養物37℃時，在胰腖豆腖培養液(TSB，BD目錄號#211822)中生長18小時。將細胞的1ml等分試樣在微量離心機中旋轉，重懸浮在等體積水中。通過將1ml等分試樣加熱至100℃5分鐘而殺死細胞。將核酸染料Sybr Green I(Molecular Probes；目錄號S-7563)加入到殺死的細胞中，直到終濃度為「10x」。(Sybr Green I原液為10,000X)。將染色的大腸埃希氏菌細胞在水中連續稀釋，並使用真空過濾裝置和塑料漏鬥杯(MilliporeMicrofil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)通過0.22μm的黑色聚碳酸酯濾膜(Osmonics目錄號K02BP04700)過濾。螢光是用裝配有FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40nm)的大面積不放大CCD成像器(上面步驟6所述；圖3所示)檢測的。4.1版本的Image-Pro Plus軟體用於捕獲並處理CCD成像器的像。
結果圖7左面表示用Sybr Green I染色，並進行大面積不放大成像的各個大腸埃希氏菌細胞。可見的白點，即螢光信號數，與預期的大約100個大腸埃希氏菌細胞數一致，這是以所用的稀釋度和視野面積為基礎的。右面表示「沒有細胞」的陰性對照通過薄膜過濾，而以相同方式成像。
實施例2.用DNA-結合螢光染料染色的各個細菌的大面積成像概述在本實施例中，蓋玻片上的大面積成像用於檢測螢光核酸染料標記的各個大腸埃希氏菌的細胞靶。染色的細胞是用白光照射，並用CCD照相機成像的。
實驗設計.大腸埃希氏菌MG1655的培養物37℃時在LB肉湯(BD；Sparks，MD)中生長18小時。通過在熱傳導阻滯區中將18-小時培養物的1ml等分試樣95℃加熱5分鐘而將細胞固定。向固定的培養物中加入核酸染料，Syber Green I(Molecular probes；目錄號S-7563)，獲得1∶1000稀釋的染色原液。(1μl Syber Green I原液(10,000X)，999μl的熱固定培養物)。將大腸埃希氏菌細胞染色10分鐘。然後將細胞在微量離心機中11700g旋轉10分鐘。棄去上清液，將細胞的顆粒狀物重懸浮在等體積H2O(1型質量)中。將染色細胞連續稀釋，從而獲得108-104個細胞/ml的濃度。通過在1∶10稀釋(將5ml聚-L-賴氨酸溶解在45ml的1型H2O中)的聚-L-賴氨酸溶液(Sigma Diagnostics；目錄號P-8920)中浸沒蓋玻片，可將聚-L-賴氨酸塗覆在Corning No.11/2蓋玻片上，然後風乾。一旦被塗覆，在H2O(1型質量)中清洗蓋玻片，並風乾。將稀釋過的染色細胞的5μl等分試樣吸量到聚-L-賴氨酸蓋玻片上，室溫(大約20分鐘)乾燥。螢光是用裝配了FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40nm)的CCD成像器(上面步驟6所述；圖3所示)成像而檢測的。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。使用裝配有相同濾光器裝置的Axioplan II螢光顯微鏡(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)可證實在成像器上檢測的正信號是大腸埃希氏菌。結果圖8表示用Syber Green I染色的細胞是用大面積不放大成像檢測的。利用高倍螢光顯微鏡(1000X；圖8)觀察到的可見白點，即螢光信號與各個大腸埃希氏菌細胞或聚集的細胞相對應。
實施例3.通過與螢光標記的寡核苷酸類目結合分子雜交而標記的各個細菌的大面積成像概述在本實施例中，大面積成像用於檢測各個大腸埃希氏菌細胞的靶，它是通過使細胞rRNA與螢光標記的寡核苷酸類目結合分子雜交而標記的。按照實施例2所述使細胞成像。
實驗過程大腸埃希氏菌細胞是按照實施例2所述生長的。室溫將細胞在2.5％甲醛的PBS溶液中固定30分鐘。通過以11,700g在微量離心機中離心10分鐘，然後將細胞的顆粒狀物重懸浮在等體積PBS中而「清洗」細胞。按照前面所述旋轉細胞，然後重懸浮在50％乙醇中，20℃放置14小時，按照上述用PBS清洗。然後旋轉細胞，並重懸浮在雜交緩衝液(1M NaCl/50mM EPPS/0.5％ Tween 20/0.4μg/μl酵母t-RNA/2％封閉劑，其中封閉劑是100mM馬來酸pH7.65/150mMNaCl/10％封閉劑(Boehringer Mannheim))中。49℃培養細胞30分鐘(預-雜交步驟)。加入FITC偶聯的DNA核糖體探針(1μl；合成基因5』FITC-GCTGCCTCCCGTAGGAGT)，49℃培養細胞1小時(雜交步驟)。雜交後，用清洗緩衝液(PBS-TB)清洗細胞，49℃培養10分鐘。再重複清洗步驟2次，總共清洗3次。使標記細胞(5μl)沉積在聚-L-賴氨酸塗覆的蓋玻片(實施例2所述)上，並利用CCD成像器(如在詳述部分的步驟6所述，和圖3所示)成像。4.1版本的Image-ProPlus軟體用於捕獲並處理CCD成像器的像。
利用螢光顯微鏡(1000X；圖8)對樣品進行的檢測可用於證實不放大的數字圖象中的點與大腸埃希氏菌細胞相對應。
結果.用FITC偶聯的大腸埃希氏菌-特異性rRNA寡核苷酸作為探針與大腸埃希氏菌細胞雜交後，使用CCD成像器可很容易地看到各個細胞(圖8)。通過高倍螢光顯微鏡(1000X；圖8)見到的白點，即螢光信號與各個大腸埃希氏菌細胞或聚集的細胞相對應。
實施例4.通過與螢光標記的PNA類目結合分子雜交而標記的各個細菌的大面積成像概述.在本實施例中，大面積成像用於檢測各個大腸埃希氏菌細胞的靶，它是通過使細胞rRNA與螢光標記的PNA類目結合分子雜交而被標記的。按照實施例2所述使細胞成像。
實驗過程.細胞是按照實施例2所述生長的。製備用於雜交的細胞，並按照PNA micro Dx Fish Reagent試劑盒(Boston Probes；目錄號KT11000)的製造商所述，與對大腸埃希氏菌特異的PNA探針雜交。將標記細胞(5μl)點在聚-L-賴氨酸塗覆的蓋玻片上，並按照實施例2所述成像。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media Cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。
結果.圖8表示用螢光標記的種類-特異性PNA探針標記的各個細菌細胞是在不放大的情況下，利用大面積CCD成像檢測的。用CCD獲得的像中的白點與各個大腸埃希氏菌細胞或多個細胞的聚簇相對應，這是通過利用高倍螢光顯微鏡(1000X；圖8)分析相同樣品獲知的。
實施例5.通過與螢光標記抗體結合而標記的各個細菌的大面積成像實驗過程.細胞是按照實施例2所述生長的。將FITC標記的兔抗-大腸埃希氏菌多克隆抗體(1∶200稀釋；Biodesign；目錄號C65110M)加入到105-102個細胞/ml的細胞稀釋液中，室溫培養1小時。然後通過離心(11,700g，10分鐘)使細胞旋轉，並在PBT中重懸浮而將細胞「清洗」兩次。然後將清洗過的細胞點在實施例2所述的聚-L-賴氨酸塗覆的蓋玻片上。按照實施例2所述進行CCD成像和顯微鏡檢查。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。
結果.圖8表示用螢光團-標記的類目特異性抗體探針標記的各個細菌細胞是在不放大的情況下，利用大面積CCD成像檢測的。用CCD獲得的像中的白點與各個大腸埃希氏菌細胞或多個細胞的聚簇相對應，這是通過使用高倍螢光顯微鏡(1000X；圖8)分析相同樣品而獲知的。
實施例6.用螢光酯酶底物染色的各個活細菌的大面積成像概述和目的.在本實施例中，大面積成像用於檢測各個活的大腸埃希氏菌細胞的靶，它是用螢光酯酶底物的組合染色的(信號傳遞部分)。底物可通過完整活細胞的細胞膜擴散，當受到在代謝活細胞中發現的酯酶的作用時，它們會發螢光並帶電荷。這些帶電荷的螢光產物不再通過細胞膜被動擴散，並在完整細胞中被捕獲。當想要將活細胞與死細胞區別開時，該技術是有效的，只有具有活性酯酶和完整細胞膜的細胞可適當染色。在該實施例中，活的或死的大腸埃希氏菌細胞是通過黑色聚酯膜過濾的，並與螢光底物螢光素二醋酸鹽(FDA)和羧基螢光素二醋酸鹽(CFDA)培養，進行不放大的大面積CCD成像。
實驗方法大腸埃希氏菌ATCC 8739在胰腖豆腖培養液(TSB，BD目錄號#211822)中生長過夜，通過離心清洗細胞一次，除去上清液，將顆粒狀物重懸浮在等體積的PBS中。將清洗過的細胞的1ml等分試樣100℃加熱20分鐘而製備死細胞。在PBS中製備活細胞和死細胞的適宜稀釋物。使用Millipore 1225多功能過濾裝置，通過安裝在吸水墊(Chemunex目錄號#200-C3012-02)上的黑色聚酯薄膜(Chemunex目錄號#200-C2010-01)過濾細胞。在多功能過濾裝置中，用500μl過濾的TSB覆蓋細胞，30℃培養60分鐘。透過薄膜吸出培養基，替換為500μl 20μM CFDA(Molecular Probes目錄號#C-195)，10μM FDA(Polysciences目錄號00615)的ChemSolB16(Chemunex目錄號#200-R2023-02)溶液，37℃培養60分鐘。透過薄膜吸出試劑。拆下所述多功能過濾裝置，將聚酯膜安裝在載玻片上，乾燥。聚酯膜上的螢光信號是用裝配有FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40nm)的CCD成像器(如上面步驟6所述；圖3所示)捕獲的。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。
結果.圖9所示的亮螢光點是活的大腸埃希氏菌細胞(左面)，而死的大腸埃希氏菌細胞(右面)沒有可檢測的螢光信號。活細胞區域中的點數約為400個，與根據加入到濾器中的細胞稀釋物和視野面積預期的細胞數一致。
變化.可使用區別活細胞或死細胞的其它染料。例如，可使用能夠或不能穿過完整細胞膜的其它螢光底物或DNA染料代替或與FDA和CFDA結合使用。多種著色劑和染料可通過使用多種用於螢光檢測的激發和發射波長來區別。與物體締合的螢光譜可用於確定計數的細胞是活的還是死的。此外，對特定類型細菌的生化活性特異的螢光底物可用於測定其存在。例如，螢光β-半乳糖苷酶底物可被β-半乳糖苷酶裂解成其螢光產物，它對於大腸菌是特異的。
實施例7.用高度螢光粒子標記的各個細菌的大面積不放大成像概述在該實施例中，大面積成像用於檢測各個大腸埃希氏菌細胞的靶，它們是用高度螢光粒子標記的。各個細菌粒子複合物是用3種不同波長的光照射的，並按照實施例2所述用CCD照相機成像。
實驗過程大腸埃希氏菌MG1665的培養物37℃時在LB肉湯(BD，Sparks，MD)中生長18小時。將大腸埃希氏菌細胞加入到具有光學透明底部的微量滴定平板(Greiner America，Inc.；目錄號655896)中，至終濃度為105個細胞/孔(105個細胞/50μl)。然後在熱傳導阻滯區上加熱微量滴定平板至95℃，直到含細胞的溶液完全乾燥。將核酸染料，Syber Green I(Molecular probes；目錄號S-7563)加入到固定培養物中，獲得1∶1000稀釋的染色原液。(1μl Syber Green I原液(10,000X)，999μl的熱固定培養物)。與染料接觸10分鐘後，用水「清洗」細胞兩次(每次200μl，然後吸出)。將未稀釋的綿羊血清(Fitzgerald；目錄號88-NS55)加入到每個孔中，室溫培養30分鐘。將孔吸乾，然後將在綿羊血清中1∶500稀釋的兔抗-大腸埃希氏菌抗體(Biodesign；目錄號C65110M)加入到適當的孔中，37℃培養2小時。將孔清洗3次，其中用清洗溶液1(PBT)清洗兩次，用清洗溶液2(PBS-B)清洗一次。接著，將在綿羊血清中1∶500稀釋的生物素標記的山羊抗-兔IgG抗體(Jackson；目錄號111-005-003)加入到適宜的孔中。37℃培養抗體2小時。用清洗溶液1清洗孔2次，用清洗溶液2清洗孔1次。將抗生物素塗覆的Texas Red螢光粒子(0.45μm；Spherotech；目錄號VFP-0562-5)加入到所有孔中，到105個粒子/孔的終濃度。室溫培養平板過夜。然後用溶液1清洗孔5次，用水清洗2次。螢光是通過在裝配有FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40nm)的CCD成像器(如詳述部分步驟6所述，和圖3所示)成像而檢測的，其中對抗生物素塗覆的Texas Red粒子使用SyberGreen I，Texas Red濾光器(Chroma/激發560/55，發射645/75)，而對Syber Green染色的細胞和Texas Red粒子使用GFP Long Pass濾器裝置(Chroma/激發470/40，發射500LP)。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。在成像器上檢測到的正信號經證實是各個大腸埃希氏菌細胞，這是用裝配有相同濾器裝置的Axioplan II螢光顯微鏡(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)獲知的。
結果.圖10表示利用大面積不放大的CCD成像檢測用類目特異性抗體和螢光粒子信號傳遞部分標記的各個大腸埃希氏菌細胞。可見的白點，即螢光信號與具有多個粒子的各個大腸埃希氏菌細胞或被粒子圍繞的細胞聚簇相對應，這是使用高倍螢光顯微鏡(1000X；圖10)觀察到的。這些是抗生物素蛋白-塗覆的粒子。細胞是用分類群-特異性抗體，然後是抗-抗體-生物素，然後是抗生物素蛋白粒子標記的。
實施例8.使用不放大的大面積成像檢測各個細菌的均相免疫測定法目的本實施例可證實用於檢測各個細菌細胞的免疫測定法，包括用於檢測少數致病性大腸埃希氏菌O157:H7細胞的、用戶容易掌握使用的均相免疫測定法。
圖11提供這裡使用的均相免疫測定法和隨後的實施例。均相免疫測定法有利於診斷，這是因為它們簡單、快速、便宜、且很容易自動化。(這裡所用的均相是指抗體與分析物的結合是在將試劑與樣品混合之後檢測的，但沒完全除去-例如，吸出-類目結合分子靶複合物中未反應的類目結合分子)。然而，絕大多數均相免疫測定法都不靈敏(與核酸擴增法相比)，不定量，且非多路的(或非常淺的多路)。這裡，相反，本發明可使均相免疫測定法靈敏，定量，且多路。
在實施例中，將含有大腸埃希氏菌O157:H7的樣品與磁性和螢光粒子混合，進行磁性選擇，並進行不放大的大面積CCD成像。無需清洗步驟。
實驗方法抗-大腸埃希氏菌磁性粒子是通過用活性甲苯磺醯基(Dynal，Oslo，Norway，目錄號140.03)，使磁性粒子與相對於大腸埃希氏菌O157:H7培養的多克隆抗體(BioTrace親和純化的；Kirkegaard Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，目錄號01-95-90)偶聯而製備的。在微量離心機試管(1.5ml)的PB(清洗3次，每次1ml)中清洗磁性粒子(30mg/ml；100μl；Dynal，Oslo，Norway，DynaparticlesM-280 Tosylactivated目錄號140.03)，然後利用粒子的磁性分離除去上清液(本實施例中的所有磁性分離，除非另有說明，都是利用Polysciences Inc.的裝置進行的，目錄號8MB4111S)。將粒子重懸浮在PB(70μl)中。相對於大腸埃希氏菌O157:H7培養的親和純化多克隆抗體(60μg；Kirkegaard Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，目錄號01-95-90)是按照製造商的指導，通過使從製造商處獲得的溶液通過離心過濾裝置(Millipore Microcon Model No.YM-30；名義上分子量限制為30,000道爾頓)而純化的。將在濾器上收集的抗體重懸浮在PB(30μl)中。使抗體(30μl)與磁性粒子(70μl)在微量離心機試管(1.5ml)中結合，短暫渦旋。37℃旋轉培養反應物20分鐘(除非另有說明，大約30rpm)。20分鐘後，加入BSA(沒有IgG)至0.1％的終濃度，並於37℃旋轉培養過夜。用PBS-B清洗磁性粒子2次(每次1ml；利用磁性分離)。將磁性粒子重懸浮在緩衝液(補充了0.1％(w/v)BSA(沒有IgG)的0.2M Tris pH8.5)中，37℃旋轉培養4小時。最後，清洗磁性粒子2次(利用磁性分離在PBS-B中進行)，並重懸浮(終濃度為在PBS-B中含0.1％固體)。
抗-大腸埃希氏菌螢光粒子是利用塗覆磁性粒子的相同抗體的被動吸附，塗覆螢光粒子(Fluospheres；Molucular Probes，SulfateMicrospheres，1μm，紅色螢光(580/605，目錄號F-8851)而製備的。兔抗-白色念珠菌抗體(1.25nmol A型多克隆純化IgG；Biodesign目錄號B65411R，Lot No.3B03200)是按照上面所述純化的。為了使表面硫酸鹽基團被動吸附抗體，通過離心(5分鐘；10,200xg；EppendorfCentrifuge Model 5417C，Eppendorf Swinging Bucket Rotor Model A-12-11)並將顆粒狀物重懸浮(1ml PBS/.15M NaCl)而反覆清洗(3次)粒子(62.5μl；2％固體；Molecular Probes目錄號F8851，1μm，紅色螢光(580/605))。將顆粒狀物重懸浮在PBS(125μl，1％固體濃度)中，邊渦旋邊滴加純化抗體(1.25nmol，1nmol抗體/mg粒子)。25℃旋轉培養混懸液2小時，接著4℃過夜培養。清洗粒子(3次，但離心後在PBS-TB中重懸浮)，在PBS-TB(200μl)中重懸浮，旋轉培養(30分鐘，25℃)。按照上面所述清洗粒子2次，並重懸浮在PBS-TB(125μl，1％固體的濃度)中。
製備粒子後，培養(200ml LB；4小時；250rpm，37℃)大腸埃希氏菌O157:H7(Strain DEC 3B，Dr.Tom Whittam，Pennsylvania StateUniversity)的接種物(200μl的過夜培養物)，並通過平板接種下列連續稀釋物而滴定。立即將培養物放在冰上，防止進一步生長。直接向含細菌的培養基中加入福馬林(終濃度＝2.5％)而將10ml等分試樣固定。(在PBS中，以1∶10)製備培養物等分試樣(100μl)的連續稀釋物，平板接種每份稀釋物的等分試樣，測定固定細菌原液中的細菌濃度。將這種原液稀釋到1×106個細菌/ml的濃度。通過離心(950×g)和重懸浮(1ml；PBS)清洗原液(1ml)，接著將細菌顆粒物重懸浮在PBS(1ml)中。
對抗-大腸埃希氏菌磁性和螢光粒子(每種類型1×106個/μl)的混合物進行超聲波處理(1分鐘；8檔；Fisher Scientific 550 SonicDismembrator)。用Gel Slick(Biowhittaker Molecular Applications，目錄號50640)處理96孔玻璃底平板的孔(Whatman Inc.，Clifton，NJ，目錄號7706-2370)1分鐘。吸出Gel Slick，並通過向每個孔中加入無菌水，然後吸出而清洗3次。在加入樣品前，將孔乾燥5分鐘。向孔中加入緩衝液(PBS-TB；6個孔中的每個孔為115μl)或血液(6個孔中的每個孔為115μl)，接著加入經過超聲波處理的粒子漿(每個孔10μl)。將固定的大腸埃希氏菌O157:H7細胞(1×103個/10μl)加入到3個含有緩衝液和3個含有血液的孔中。利用保鮮膜(CorningCOSTAR，目錄號3080)將孔密封。室溫旋轉(30rpm；Dynal SampleMixer，Oslo，Norway，目錄號947.01)培養樣品1小時。使用磁性分離裝置(Dexter Magnetics，Sliver Spring，MD，LifeSep，目錄號2501008)在孔底的檢測表面上捕獲磁性粒子。
為了測試均相免疫測定法檢測血液中各個細菌細胞的效率，使用圖3A所示的CCD成像器使在小鼠血液中進行的免疫測定成像。檢測面積，即微量滴定孔光學透明底部的像是用Texas Red濾器裝置(激發560/55，發射645/75)和Image-Pro Plus數字成像軟體(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)捕獲的(20毫秒曝光)。接下來，為了測試插入清洗步驟的免疫測定法的效率，用緩衝液(PBS-TB；200μl；上下吸量10次，如此清洗3次)清洗所有樣品(即，先前成像的含有緩衝液的那些，和含有血液的那些)。在清洗步驟過程中，使用磁性分離裝置(Polysciences，Inc.，Warrington，PA，目錄號8MB4111S)將磁性粒子，以及含磁性粒子的複合物捕獲並固定在孔表面。每次清洗後，進行磁性選擇(5分鐘)，並吸出上清液。將樣品重懸浮在含螢光DNA嵌入染料YOYO-1(10nm；Molecular Probes，目錄號Y-3601)的PBS-TB(200μl)中，(使用Dexter Magnetics的裝置)進行磁性選擇。按照上面所述用CCD成像器使96-孔平板成像。CCD成像後，將平板翻轉，並用螢光顯微鏡(Axioplan II螢光顯微鏡，Cart，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)檢測。從在血液中進行的均相免疫測定法獲得的(即，在清洗步驟之前獲得的像)像(一式三份；20毫秒曝光)是用軟體分析量化的。宏(Image-Pro Plus)用於限制含檢測面積的目標區，所述檢測面積包含每個孔的周邊內。限制範圍內的物體數和物體積分強度是利用一系列Visual Basic小型程序分析Image-Pro Plus分析數據(如詳述部分的步驟6所述)而完成的。繪製代表了血液中均相測定分析的兩個柱形圖(圖12；Microsoft Excel；Microsoft Crop.)。對於在每個實驗中進行比較的樣品使用同一閾值。
結果圖12表示利用不放大的大面積成像靈敏檢測大腸埃希氏菌的免疫測定法結果。用類目特異性抗體塗覆的磁性和螢光粒子首先與細菌細胞結合，然後利用磁力將複合物牽引至光學透明孔的底部表面(檢測面積)，並利用不放大的大面積CCD成像檢測該複合物。圖12比較了在血液中進行的均相免疫測定法(下面)與在血液(上面)和緩衝液(中間)中進行的非-均相(清洗過的)免疫測定法的結果。最簡單的形式，均相免疫測定法，可有效檢測具有極好的信號背景比(見圖中均相測定法的量化(下面右側的條形圖))的細胞。
最左面的兩幅圖表示利用不放大的大面積CCD成像獲得的像。當大腸埃希氏菌存在(左面)時，所有三種測定法都可產生較強的信號，當沒有加入大腸埃希氏菌時，背景信號較低。使用CCD照相機獲得的信號與塗覆了粒子的大腸埃希氏菌細胞相對應的事實是利用高倍螢光顯微鏡分析(1000X；上面兩排，最右面兩欄)獲得的。像代表含有大腸埃希氏菌細胞，磁性粒子，和螢光粒子的典型複合物。每個複合物的兩個像是用兩個濾器裝置造成的一個觀察DNA螢光(SyberGreen I；右數第二幅)，一個觀察螢光粒子(最右面那幅)。該圖表示被磁性和螢光粒子圍繞的大腸埃希氏菌細胞所組成的複合物。
通過免疫測定法選擇的大腸埃希氏菌細胞的百分比始終大於95％，這是通過測量未選擇的物質以及免疫測定前後樣品的顯微比較表示的(這裡沒有給出)。顯微測量顯示，含大腸埃希氏菌細胞的選擇複合物與每孔3.33個螢光粒子的平均值相關(n＝10；最小值＝2；最大值＝10)。
像的定量分析是通過軟體進行的，該軟體可計算螢光物體數(圖12，下面，左側的條形圖)並求所有物體強度的積分(圖12，下面，右側的柱形圖)。在兩次測量中，含大腸埃希氏菌(1000個細胞)樣品的得分明顯比不含大腸埃希氏菌的樣品要高。應注意的是，軟體分析中的總物體(1.5×104個物體)比樣品中的細胞數(1000)高15倍。此觀察結果與下面所述複合物的顯微鏡分析相一致。通過軟體分析可知，與沒有大腸埃希氏菌的樣品相比，含有大腸埃希氏菌的樣品具有大於75倍的物體和約400倍的積分強度。分析顯示，用樣品中1×103個大腸埃希氏菌細胞獲得的信號要比從沒有細胞的對照組產生的信號高3個標準偏差。
雖然，複合物的形成主要取決於免疫測定中大腸埃希氏菌細胞的存在(可通過比較最左側兩欄的圖看出)，但是顯微檢查還是揭示出很多複合物都缺少大腸埃希氏菌細胞。這是大腸埃希氏菌免疫測定法的一致特徵。很可能缺少細胞的複合物的形成是由於非-細胞結構的存在，如不能在顯微鏡下觀察到的大腸埃希氏菌鞭毛的片段。可選擇性地，很可能較大粒子細胞的複合物在測定過程中斷裂成幾部分，產生一些含有細胞的片段和一些沒有細胞的片段。除了含有各個細胞的複合物和缺少細胞的複合物外，顯微鏡分析還揭示出某些複合物含有一個以上細胞。
在這些結果的基礎上，簡單，快速且用戶容易掌握使用的均相免疫測定法可與不放大的大面積成像聯合，檢測並鑑定血液中的少數細菌。
變化.如下面的實施例所示，本實施例的方法可用於檢測若干樣品類型中的其它靶(生物和非生物)。例如，通過使用適宜的抗體塗覆粒子，實施例所述的方法可用於檢測特定的病毒(例如HIV)，細菌，真菌，寄生蟲，蛋白，小分子，或人的細胞(如癌細胞或感染的細胞)。
其它形式也可與實施例的方法聯合使用。通過對本實施例所述儀器中的磁鐵和光學組件進行重新配置，各種容器都適用。例如，可在其它類型的容器中使用較大或較小體積的樣品(例如，具有光學透明底部和/或側面的試管)。
標記類目結合分子的各種方法都是可能的。可使用各種大小並具有各種信號特徵的粒子。可使用含有一種或多種具有不同光譜特徵的螢光染料或含有螢光級聯的螢光粒子(例如，來源於Molecular Probes的Transfluorospheres)。還可使用其它類型的螢光粒子，如量子點。在本實施例中，可用散射光的粒子(例如，RLS，PRP，或納米金粒子)替換螢光粒子。可使用可見染料標記的粒子(例如，染色的聚苯乙烯粒子或含染料的脂質體)。可選擇性地，可用螢光團(或其它信號傳遞部分)直接標記抗體，或其它類型的類目結合分子。這種直接標記的抗體可塗覆靶，從而使它們變得可以檢測。同樣，可用選擇部分直接標記類目結合分子。例如，抗體可與鐵蛋白，一種磁性選擇部分偶聯。
靶染色還可替代螢光粒子進行檢測。在這種情況下，特異性是由選擇部分，類目特異性磁性粒子賦予的。例如，核酸染料(例如，碘化丙錠，STYO 17，或DAPI)可用於非特異性標記靶。結合病原體-特異性磁性粒子的靶可被選擇帶到樣品孔的底部，並通過非特異性染色觀察。還可使用類目特異性染色過程(例如，見實施例9)。
將抗體與粒子偶聯的可選擇性方法也是可行的。這種方法是本領域那些技術人員已知的，並在很多篇參考文獻中詳細描述(例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，San Diego，CA，1996)；和Edwards編輯，(1999)ImmunodiagnosticsA PracticalApproach.OxfordOxford University Press)。
還可使用其它形式的抗體(例如，Fab，Fab』，Fv)。可將不同的類目特異性抗體組合使用。例如，在上述應用中，不同結核分枝桿菌抗原的抗體可與單獨的黃綠色螢光粒子結合，然後組合。可選擇性地，不同抗體可與相同粒子結合。還可用其它類型的類目結合分子(例如，凝集素，多肽或配體)替換抗體。
實施例9.「模擬痰液」中抗酸染色的分枝桿菌的大面積成像背景1995年，肺結核導致超過3百萬人死亡，是當年AIDS/HIV死亡的約3倍。在發展中國家，大約25％的可避免死亡是由結核分枝桿菌感染所引起。不幸地是，診斷結核分枝桿菌感染還有疑問。因此，對於便宜，快速，簡單，和快速的診斷試驗還有很廣泛的需求。在大半感染肺結核病的發展中國家佔主導地位的抗酸桿菌(AFB)試驗方法不靈敏，並因此耽誤了一大部分感染患者。因此，顯示假陰性試驗結果且沒有經過治療的肺結核患者繼續在社會中傳播這種非常容易傳染的疾病。AFB試驗還很耗時而且費力，這是因為要仔細檢測很多顯微鏡視野中是否存在染色細胞。培養，試驗的金本位，是非常緩慢的—在實驗室中，通常需要花費幾周的時間使結核分枝桿菌的集落生長。新的基於擴增的分子試驗快速而且靈敏，但高昂的花費甚至會限制它在最富裕國家的使用。
目的在本實施例中，本發明用於構造一種快速且靈敏的螢光抗酸桿菌試驗。與在基於顯微鏡的試驗中檢測相比，本試驗可通過使一個更大的面積成像(少於1秒)而獲得其靈敏度，並節省勞力。
實驗方法用金胺O和金胺-若丹明將製備的載玻片(Remel；目錄號40-146)染色，該載玻片含有「模擬痰液」的汙跡和與引起肺結核的試劑非常相似的分枝桿菌(瘰癘分枝桿菌)。每個載玻片的模擬痰液汙跡中都含有陽性(瘰癘分枝桿菌)和陰性對照(大腸埃希氏菌)。用TB金胺-若丹明染料(Remel目錄號40090)或TB金胺O染色試劑盒(Remel目錄號40086)製備載玻片。使載玻片在火焰中短暫穿過4次。用金胺O染料或金胺-若丹明染料浸沒載玻片，室溫培養15分鐘，接著在去離子水中清洗3次。用TB脫色劑(Remel目錄號40-107)使載玻片脫色2分鐘，接著在去離子水中清洗3次。用高錳酸鉀復染劑(目錄號40-092)浸沒載玻片3分鐘，接著用去離子水清洗3次。然後將載玻片風乾。金胺-若丹明染色的載玻片是用螢光顯微鏡(Axioplan II螢光顯微鏡；Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY；Cy3通道激發546/11，發射567/15，400X放大率；500msec曝光)成像的，以及使用CCD成像器進行不放大的大面積成像(如詳述部分的步驟6所述和圖3A所示；使用相對於TRITC優化的濾器裝置(激發545/30，發射610/75)，1秒曝光)。
結果圖13表示基於螢光的大面積成像可檢測用金胺-若丹明試劑染色的各個分枝桿菌細胞。大面積像中的螢光信號與各個分枝桿菌細胞或細胞的一小簇相對應，這是通過使用高倍螢光顯微鏡(1000X；圖13)獲知的。經歷相同過程的大腸埃希氏菌沒有顯示出明顯的螢光。
變化.結核分枝桿菌感染與其它分枝桿菌種類(例如，鳥分枝桿菌)的區別通常較為重要。實施例27提出了這個實施例的改變，它可使用類目特異性抗結核分枝桿菌抗體特異性鑑定結核分枝桿菌。
實施例10.利用大面積成像的快速抗微生物敏感性試驗概述抗微生物敏感性試驗的目的是確定在中和從患者中分離出來的病原體時，哪種抗微生物療法最有效。快速抗微生物敏感性試驗是很重要的—有時可挽救生命—特別是在感染性疾病的診斷中。抗微生物療法的及時有效選擇取決於抗微生物敏感性試驗的結果。
鑑定後，通常測試感染劑抵抗各種濃度的若干抗微生物化合物的能力。牢固方法的缺點是結果的周轉時間較長(從樣品取得時間開始，最快2-4天)。這對於時間-危急的醫療急症，如中樞神經系統和血流感染而言是成問題的。
在該實施例中，大面積成像用於快速檢測模型大腸埃希氏菌細胞對抗生素四環素的敏感性。測試兩株細胞，一株抗性，一株敏感，在抗生素中生長若干小時的能力。生長是通過用螢光核酸染料染色的各個細胞的大面積成像檢測的。
實驗過程.四環素敏感性試驗是按照抗微生物敏感性的NCCLS方針中描述的肉湯稀釋法(Methods for Dilution Antimicrobial SusceptibilityTests for bacteria That Grow Aerobically，第5版，NCCLS，M7-A5 Vol.20No.2，2000年1月)，在兩個大腸埃希氏菌菌株MG1655(敏感株)和MG1655/pLAFRI(抗性株)上進行的。在試驗培養基接種後的6個時間點(0，1，2，4，6，和18小時)，從每種四環素稀釋物(對於抗性和敏感株而言，分別為0μg/ml-320μg/ml，和0μg/ml-4μg/ml)中採集抗性和敏感株培養物的1ml等分試樣。並在這些時間點進行可見渾濁度生長檢查和平板計數。渾濁度檢查是按照NCCLS肉湯稀釋方針進行的。「+」表示渾濁的培養物，「-」表示不渾濁的培養物。然後按照實施例2所述，用Syber Green I將1ml的等分試樣染色。將染色細胞的等分試樣(10μl)放在96孔平板(Greiner America，Inc.；目錄號655896)的各個孔(具有光學透明的底部)中，其中含有90μl水(I型質量)。以600g將平板在離心機(Beckman Allegra)中旋轉10分鐘，然後成像。螢光是用裝配有FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40nm)的CCD成像器(如在詳述部分的步驟6中所述，和圖3所示)成像而檢測的。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。通過使用裝配有相同濾器裝置的螢光顯微鏡(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)可證實利用大面積成像檢測的正信號是各個大腸埃希氏菌細胞。
結果.圖14表示利用各個細胞檢測並通過不放大的大面積成像量化的抗微生物敏感性試驗的結果。比較下面的兩幅圖可顯示出，對於測定細胞生長而言，不放大的大面積成像可與培養相比較。(通過計算瓊脂平板上的集落數也可產生可比較的結果)。通過CCD成像和培養測定的抗生素最小抑制濃度(MIC)是可進行比較的，但多少低於過夜生長後測定的MIC(圖14上數第2幅)。
該圖證實了這種快速成像法很容易將抗生素抗性株(圖14右面)和抗生素敏感株(圖14左面)區別開來。生長4小時後，抗性株的急劇生長在抗菌濃度(64μg/ml)下很明顯，該濃度比抑制抗生素敏感株生長的濃度(0.25μg/ml)高几百倍。當利用CCD成像時(下面)，其結果可與液體培養(下數第2幅)，或集落計數(沒有標出)的結果相比較。
因此，培養4小時後，大面積不放大成像提供可與培養測定法(記錄混濁度)和平板計數相比較的抗微生物敏感性試驗結果。
優點和應用.這裡描述的方法與傳統的抗微生物敏感性試驗技術相比，具有很多在臨床上較為重要的優點。通過用類目特異性結合分子標記(例如，見實施例2-實施例6)，細菌的鑑定可在與抗生素存在條件下量化細菌生長的同一時間獲得。檢測和量化少數鑑定細胞的能力可滿足重要的診斷學需要即在不進行細菌再次培養的情況下，進行抗微生物敏感性試驗。實現此目的可通過顯著降低確定適宜抗微生物療法所需的時間而為患者提供較大的益處。
實施例11.已經磁性選擇的各個螢光標記的白色念珠菌細胞的大面積檢測目的本實施例可證實不放大的大面積成像檢測各個細胞的用途，所述各個細胞已經過磁性選擇並沉積在微量滴定平板底部的檢測區中。白色念珠菌是一種常見的人類病原體，它可引起包括血源性感染和陰道黴菌感染在內的疾病。在該實施例中，白色念珠菌細胞是用螢光核酸染料染色的，並用兔IgG抗白色念珠菌抗體標記，然後在微量滴定平板的孔中與用抗兔IgG抗體塗覆的磁性粒子混合。磁場的應用可使細胞粒子複合物在孔底部排列。然後利用基於CCD的不放大的大面積成像檢測細胞。
實驗過程白色念珠菌10453(美國典型培養物保藏中心，ManassasVA)22℃時在YM培養基(BD，Sparks，MD)中生長18小時。將細胞在2.5％甲醛的PBS溶液中固定5分鐘，在PBS-B中清洗2次，然後用YOYO-1(1μM)核酸染料(Y-3601 Molecular Probes，Eugene，OR)和兔抗白色念珠菌多克隆抗體(B65411R，Biodesign International，Saco，ME)染色並標記30分鐘。然後在PBS-TB中清洗細胞3次，除去未結合的染料和抗體。使細胞等分試樣與具有表面結合的山羊抗-兔IgG抗體(8430050，Polysciences Inc.，Warrington，PA)的磁性粒子在PBS-TB緩衝液中的混懸液於光學透明、平坦、玻璃底微量滴定盤(Uniview；目錄號7706-2370，Whatman，Inc.Ann Arbor，MI)的孔中混合。15分鐘後，使用磁鐵塊(Cortex Biochem，Inc.，San Leandro，CA)的磁場使磁性粒子在孔底的表面上基本均勻排列。孔底的像是用裝配有FITC濾器裝置(480/40nm激發，535/50nm發射；ChromaTechnology Corp.，Brattleboro，VT)和MetaMorph像捕獲軟體(UniversalImaging Corp.，West Chester，PA)的CCD成像器(如詳述部分的步驟6所述，和圖3所示)捕獲的。在大面積成像中見到的離散信號與各個細胞相對應，這是用1200倍放大的高倍顯微鏡和具有相同FITC濾器裝置的Zeiss Axioplan II螢光顯微鏡，Carl Zeiss Inc.，Thornwood，NY)獲得的。
結果.圖15表示含細胞的微量滴定盤反應孔的不放大的大面積成像可產生點狀的螢光信號。這些螢光信號與各個白色念珠菌細胞或細胞的一小簇相對應，這是利用相同反應孔的高倍(1200X)螢光顯微鏡檢查獲知的。相反，不含細胞的孔或含有未染色細胞的孔(陰性對照孔)沒有產生(或產生很少的)正信號。陰性對照像中的少數螢光物體很可能是塵粒或其它非生物物質。
實施例12.特異性結合螢光和順磁聚苯乙烯粒子的各個白色念珠菌細胞的大面積檢測目的.在本實施例中，各個白色念珠菌細胞是用細胞-特異性順磁粒子分離並用白色念珠菌-特異性螢光粒子標記後，利用不放大的大面積成像檢測的。
實驗過程.下列混合物是在光學透明、平坦、玻璃底的微量滴定盤(Uniview 7706-2370，Whatman，Inc.，Ann Arbor，MI)的孔中製備的含有YOYO-1(50nM)的PBS-TB緩衝液，如先前實施例6所述、表面吸附了兔抗-白色念珠菌多克隆抗體(B65411R，BiodesignInternational，Saco，ME)的5×107個磁性粒子(MEO3N 1μm直徑；Bangs Labs Inc.，Fishers，IN)，和利用標準EDAC偶聯化學，將相同抗體共價偶聯到表面的5×107個螢光粒子(Fluospheres F-8821，1μm直徑，紅色螢光，Molecular Probes，Eugene，OR)。為了使抗體與粒子共價偶聯，可通過室溫離心(5分鐘；11,000xg；Eppendorf CentrifugeModel 5417C，Swinging Bucket Rotor A-12-11)在MESB(2ml)中清洗螢光羧化粒子(1μm，25ml，2％固體，Red(580/605)，聚苯乙烯，Molecular Probes目錄號F-8821)，然後通過渦旋和吸量重懸浮。在利用磁性粒子進行的偶聯實驗中，清洗是利用SPHEROTMFlexiMagSeparator Jr.裝置(Spherotech，目錄號FMJ-1000)進行的，它可在5分鐘內，從混懸液中分離出磁性粒子。粒子清洗重複2次後，將粒子重懸浮在MESB中(500μl；濃度為10mg/ml)。加入新鮮製備的EDAC(Sigma目錄號E-6383)至0.2mg/ml的終濃度，室溫輕輕混合5分鐘。向該混懸液中渦旋滴加兔抗-白色念珠菌抗體(5nmol；A型多克隆；Biodesign目錄號B65411R，Lot No.3B03200；按照實施例8所述純化)，室溫旋轉(約30rpm)培養2小時。按照上面所述，通過離心在MESB中清洗粒子4次。將粒子重懸浮在含乙醇胺的MESB中(0.03％；Sigma目錄號E9508)，室溫旋轉培養30分鐘。按照上面所述，通過離心在MESB中清洗粒子4次，在pH4.0的0.1M醋酸鈉中清洗3次。最後，將粒子在PBT中清洗2次，並在PBT中重懸浮至含0.1％固體。
加入重懸浮在PBS-TB緩衝液中的白色念珠菌細胞，使終反應體積達到200μl。在搖動器上培養混合物60分鐘。使釹-鐵-硼磁鐵與96孔微量滴定盤(8MB4109S Polysciences Inc.，Warrington，PA)相互接觸，通過3次200μl PBS-TB緩衝液的清洗將所有未結合的螢光粒子從磁性粒子複合物中分離出來。螢光是通過使用CCD成像器(如詳述部分的步驟6所述，和圖3所示)進行不放大的大面積成像檢測的，其中CCD成像器裝配有適於紅色螢光粒子(Texas Red濾器裝置，560/55nm激發，645/75nm發射；Chroma Technology Corp.，Brattleboro，VT)及核酸-結合染料YOYO-1(FITC濾器裝置，480/40nm激發，535/50nm發射)的濾光器裝置。與磁性粒子共同純化的螢光粒子的存在可表明白色念珠菌細胞的存在。在CCD成像器上檢測的正信號經證實是細胞，螢光粒子，和磁性粒子的複合物，這是通過使用AxioplanII螢光顯微鏡(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)獲知的，它裝配有觀察螢光粒子的相同Texas Red濾器裝置和觀察YOYO-1染色細胞核酸的FITC濾器裝置。使用Image-Pro Plus像捕獲軟體(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)和100ms的曝光時間捕獲像。結果。圖16表示含細胞反應物的不放大的大面積成像可產生點狀螢光信號，而沒有細胞的反應物則不產生這種信號。這些螢光信號與圍繞在各個YOYO-1(綠色)-染色的白色念珠菌細胞(或一小簇細胞)周圍的紅色螢光粒子相對應，這是利用相同反應孔的高倍螢光顯微鏡檢查獲知的。
實施例13.特異性結合螢光抗體和磁性粒子的各個白色念珠菌的大面積檢測目的本實施例可證實不放大的大面積成像利用螢光團標記的抗體(信號傳遞部分類目結合分子)和抗體塗覆的順磁粒子(選擇部分)檢測並鑑定各個細胞的用途。在該實施例中，使順磁粒子和螢光團標記抗體與細胞結合後，在微量滴定皿中進行不放大的大面積成像，從而單獨檢測白色念珠菌和大腸埃希氏菌細胞。
實驗過程室溫時，用『Block Aid』(B-10710 Molecular Probes，Eugene，OR)封閉光學透明、平坦、玻璃底的微量滴定盤(Uniview7706-2370，Whatman，Inc.，Ann Arbor，MI)的孔30分鐘。將按照實施例6所述製備的，表面吸附了兔抗白色念珠菌(B65411R，BiodesignInternational，Saco，ME)或抗-大腸埃希氏菌多克隆抗體(B65003R，Biodesign International，Saco，ME)的大約5×107個磁性粒子(MEO3N1μm直徑，Bangs Labs Inc.，Fishers，IN)加入到孔中的PBS-TB緩衝液中，使終反應體積達到200μl。將白色念珠菌或大腸埃希氏菌細胞在2.5％甲醛的PBS溶液中固定5分鐘，在PBS-B中清洗2次。將細胞加入到順磁粒子的混懸液中，室溫在搖動器上培養混合物30分鐘。加入FITC-標記的抗-白色念珠菌多克隆抗體(5μg)(CR2155RF，CortexBiochem，San Leandro，CA)或按照製造商的說明用Alexa FlourTM488(Molecular Probes，Eugene，OR.，目錄號A10235)標記的抗-大腸埃希氏菌抗體(1mg；Biodesign，Saco，ME.B65001R)，再培養混合物15分鐘。將未結合的抗體從磁性粒子細胞複合物中分離出來，分離是通過反覆清洗，並利用磁鐵塊(CD2001，Cortex Biochem，Inc.，San Leandro，CA)的磁場進行的，利用磁場可使磁性粒子基本均勻地排列在孔底的表面上。通過利用CCD成像器(如詳述部分的實施例6所述和圖3所示)成像來檢測螢光，該CCD成像器裝配有FITC濾器裝置(480/40nm激發，535/50nm發射濾器，用於檢測FITC和Alexa488螢光團)。與磁性粒子共同純化的螢光信號可表示白色念珠菌或大腸埃希氏菌細胞的存在。經證實，在成像器上檢測到的正信號是細胞螢光抗體複合物，這是用紅色螢光的核酸-結合染料YOYO-3(1μM)(Y-3606，Molecular Probes，Eugene，OR)將細胞核酸染色後，使用高倍螢光顯微鏡(1200X)和Axioplan II螢光顯微鏡(Carl ZeissInc.，Thornwood，NY)獲知的。
結果.圖17表示含有白色念珠菌或大腸埃希氏菌細胞的孔可產生若干螢光點。這些螢光信號與各個細胞(或細胞的一小簇)相對應，這是使用紅色螢光染料YOYO-3(Molecular Probes，Eugene，OR)將細胞核酸染色，並利用高倍螢光顯微鏡(1200X)獲知的。不含細胞的孔則不產生這種信號(或信號非常少)。陰性對照像中的少數螢光物體很可能是塵粒或其它非生物物質。
實施例14.用CCD照相機對各個化學發光的酵母細胞進行不放大的大面積檢測目的本實施例的目的是利用不放大的大面積成像觀察用化學發光信號傳遞部分標記的各個細胞。在本實施方案中，白色念珠菌細胞的表面是用螢光素-偶聯抗體塗覆的，然後用鹼性磷酸酶偶聯的抗-螢光素抗體，並與CDP Star底物反應產生光。各個細胞在化學發光像中的存在是利用螢光顯微鏡檢查加以證實的。檢測各個細胞時無需像增強器。
材料和方法白色念珠菌90028(美國典型培養物保藏中心)25℃時在YM培養基(VWR目錄號DF0711-17)中生長48小時。將細胞在2.5％甲醛的PBS溶液中固定5分鐘，然後在PBS中清洗，4℃貯存。將10個體積的封閉緩衝液(0.5％NEN封閉試劑，目錄號FP329，0.1MTris-HCl pH8，0.15M NaCl)加入到細胞的等分試樣中，培養混懸液30分鐘。加入1/100稀釋的多克隆兔抗-白色念珠菌異硫氰酸鹽偶聯抗體(BioDesign目錄號B65411F)。輕輕混合培養細胞混懸液60分鐘。將細胞旋轉，用封閉緩衝液清洗2次，然後在1/25稀釋的抗-螢光素，鹼性磷酸酶偶聯抗體(NEN目錄號NEF-709)的封閉緩衝液中重懸浮。再次輕輕混合培養細胞60分鐘。將細胞旋轉，並在0.1M Tris-HCl pH8，0.15M NaCl中清洗3次，然後在0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl中清洗。細胞的終混懸液是pH9.5的緩衝液。
進行大面積成像時，將細胞稀釋物點在覆蓋了CAST尼龍的載玻片(Schleicher and Schuell目錄號10484181)上，該載玻片是用pH9.5的緩衝液預潤溼，並用CDP Star試劑(NEN NEL-601)覆蓋的。曝光10分鐘後，用沒裝配發射濾器的CCD成像器(如詳述部分的步驟6所述和圖3所示)觀察化學發光。捕獲化學發光的像後，將Slow Fade試劑(Molecular Probes目錄號S-2828)點在載玻片上，加上蓋玻片。以400x的放大率，使用具有FITC濾器(Chroma #SP101)的螢光顯微鏡觀察載玻片，鑑定各個細胞。
結果如圖18所示，用化學發光信號傳遞部分標記的各個白色念珠菌細胞可在不放大的情況下檢測。從左到右，3個不同的稀釋度分別代表約200，60，和20個細胞。在最低稀釋度下，當利用螢光顯微鏡觀察時，化學發光像上的每個點可能對應於一個細胞或一小簇細胞。立體定向是在有成束網格線存在和細胞相對位置的幫助下進行的。較大、較亮的斑點，特別是在左面看到的，代表一個以上細胞。
實施例15.利用瞬時膠片的直接曝光對各個化學發光的酵母細胞進行不放大的大面積檢測目的本實施例的目的是用瞬時照相用膠片對用化學發光信號傳遞部分標記的各個細胞進行不放大的大面積檢測。在本實施方案中，白色念珠菌細胞的表面用螢光素偶聯抗體類目-偶聯分子塗覆，與鹼性磷酸酶抗體偶聯物結合，並與CDP Star底物反應，產生光。
材料和方法白色念珠菌90028(美國典型培養物保藏中心)是按照實施例14所述生長並標記的。在Polaroid膠片上成像時，將一片Hybond-N薄膜(Amersham-Pharmacia RPN1782B)放在一張吸收濾紙上，用0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl預溼潤。將細胞的稀釋物點在薄膜上，然後加入CDP Star試劑(NEN NEL-601)。按製造商說明，將薄膜裝到SpotLight照相機(Boston Probes DT10000)中，與ASA 2000膠片(Boston Probes DT20000)接觸30分鐘。
結果用化學發光信號傳遞部分標記的各個白色念珠菌細胞可按照圖19所示，直接在瞬時膠片上檢測。該圖表示標記細胞3個不同稀釋物的像。圖19所示樣品稀釋物與實施例14(圖18)中成像的那些相同，代表約200，60，和20個細胞(分別是圖中從左到右)。大的亮點，特別是在左面所見的，與含有若干細胞的聚簇相對應。圖右面的點代表各個的細胞或若干細胞的聚簇。
實施例16.利用不放大的大面積成像對涉及下呼吸道感染的生物進行檢測目的利用不放大的大面積成像鑑定涉及下呼吸道感染的生物肺炎衣原體，肺炎支原體和侵肺軍團菌。
概述肺炎是全世界死亡的主要原因，是美國死亡的第6大原因。該數字的上升趨勢是由於＞65歲個體比例的增加和其它因素造成的。現有的診斷常常是憑經驗，然而確切的診斷可通過使用適宜的抗生素而提高患者的結果。通過將痰液直接螢光染色，然後聯合不放大的大面積成像而對特定生物(有些生物很難培養)進行的檢測可幫助診斷，由此降低肺炎所造成死亡的發生率以及健康護理的費用。
實驗方法製得肺炎衣原體和肺炎支原體的對照載玻片(Bion，ParkRidge，IL；目錄號分別為CP-4212和MP-1212)。將載玻片溫熱至室溫，然後在封閉溶液(PBS/1％BSA，15分鐘，25℃)中培養。吸去封閉溶液，將初級抗體(抗-肺炎衣原體；DAKO Corporation，Carpinteria，CA，Code NM660，Clone RR402，1/5稀釋，和抗-肺炎支原體；Fitzgerald International Industries，Inc.，Concord，MA，Cat.No.10-M40，1/1000稀釋)在封閉溶液中的稀釋物加入到肺炎衣原體對照載玻片和肺炎支原體對照載玻片的各個孔中。培養載玻片(30分鐘，25℃)，然後清洗(PBS-BT，每次4×5分鐘)，並與次級Cy3偶聯抗體培養(15分鐘，25℃，山羊抗-小鼠IgG-Cy3，Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA，目錄號111-165-144)。通過用PBS-BT和1型無菌水浸沒孔而清洗載玻片(分別為每次4×5分鐘，和每次2×5分鐘)。為了對侵肺軍團菌進行大面積檢測，獲得侵肺軍團菌血清分類群1(目錄號92-103-FL)以及熱固定的侵肺軍團菌血清分類群1(Philadelphia 1，目錄號92-103-H)和6(Chicago 2，目錄號92-110-H)的FITC-偶聯抗體(mTECHTMMonoclonal Technologies，Alpharetta，GA)。在聚-賴氨酸塗覆的載玻片(Sigma，目錄號P0425)上製備兩種通過熱殺死的侵肺軍團菌血清分類群(1和6)的細胞汙跡。用封閉溶液浸沒載玻片，培養(15分鐘，25℃)，然後吸出。用侵肺軍團菌血清分類群1的FITC-偶聯初級抗體浸沒載玻片(30分鐘，25℃)，然後吸出，並用PBS和1型水(分別為每次2×5分鐘，和每次2×5分鐘)清洗。將所有載玻片風乾，並利用不放大的大面積成像捕獲像(TRITC濾器裝置，Chroma Id.No.41002b，對於Cy3偶聯物及FITC濾器而言，激發545/30nm，發射610/75nm，Chroma Id.No.SP101，對於FITC偶聯物而言，激發470/40nm，發射522/40nm)。安裝載玻片(Pro Long Antifade Reagent，Molecular Probes，Eugene，OR，目錄號P-4781)，使用螢光顯微鏡(Axioplan II螢光顯微鏡，Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY；Cy3.5濾器裝置，Chroma Id.No.41002，對於Cy3偶聯物或FITC濾器裝置而言，激發545/30nm，發射610/75nm，Chroma Id.No.SP101激發470/40nm，發射522/40nm)觀察(400x)。
結果本實施例證實了利用不放大的大面積成像，聯合直接螢光抗體染色技術，可檢測涉及下呼吸道感染的生物。陽性對照和陰性對照的大面積成像表明，這種檢測是特異性的(圖20)。利用大面積成像見到的信號對於通過標記細菌細胞產生的是特異性的，這一點可由顯微鏡分析證實。
變化不放大的大面積成像可用於檢測其它細菌，酵母和黴菌，以及其它種類的疾病，包括泌尿道感染，敗血症，和性傳播疾病。
實施例17.利用不放大的大面積成像同時掃描含有3種不同微生物的樣品的多路直接螢光免疫測定法概述.在本實施例中，不放大的大面積成像被用於檢測並鑑定3種類型微生物的多路試驗中。將細胞與3種類目特異性(在這種情況下，是種類-特異性的)抗體的混合物一起培養，其中每個是用不同的螢光染料標記的。使用CCD成像器檢測各個細胞。
實驗過程.大腸埃希氏菌和白色念珠菌分別是按照實施例2和實施例11所述生長和固定的。釀膿鏈球菌在Brain Heart Infusion(Difco目錄號237500)中過夜生長，並按照實施例2所述固定和清洗。將所有這3種類型的細胞單獨在水中稀釋，直到通過相差顯微鏡觀察到20-50個細胞/高倍視野(40X)。將這些稀釋物的等分試樣(3μl)放在聚-L-賴氨酸塗覆的蓋玻片上，擴散成大約5mm直徑的面積，然後乾燥。
按照製造商的說明(Molecular Probes，Eugene，OR)，抗大腸埃希氏菌抗體(1mg；Biodesign，Saco，ME.B65001R)，抗白色念珠菌抗體(1mg；Biodesign，Saco，ME.B65411R)，和抗鏈球菌Grp A抗體(1mg；Biodesign，Saco，ME.B10601R)分別用Alexa FlourTM488(目錄號A10235)，Alexa FlourTM350(目錄號A10170)，和AlexaFlourTM546(目錄號A10237)，蛋白標記試劑盒標記。
標記抗體的混合物是以20μg/ml在標準兔血清(Cat#88-NR50；Fitzgerald，Concord，MA)中製備的。用抗體混合物塗覆點在蓋玻片上的細胞，並於室溫時，在含有水飽和紙巾的溼潤塑料吸量盒蓋中培養1小時，用Saran Wrap塗覆。然後將蓋玻片在含有1％標準兔血清的PBS中清洗1次，在PBS中清洗2次(每次10分鐘)。清洗除去蓋玻片，並使用壓縮空氣吹乾所有殘留的液體。每個蓋玻片的相關區域是1秒內在CCD成像器中成像的(如詳述部分的步驟6所述，和圖3所示)，該CCD成像器帶有FITC(激發480nm/40nm和發射535nm/50nm)(Alexa488特異性)，Texas Red(激發560nm/55nm和發射645nm/75nm)(Alexa 546特異性)及DAPI(激發360nm/40nm和發射460nm/50nm)(Alexa 350特異性的)通道。
結果.多路細菌測定法的結果在圖21中給出。對於各種不同的細菌樣品而言，物體的數目和強度在預期的螢光通道中最高。因此，對於大腸埃希氏菌樣品而言，在FITC(Alexa 488)通道所見的物體數目和強度最高。同樣，白色念珠菌樣品，和釀膿鏈球菌樣品分別在DAPI和Texas Red通道中具有最強的強度和最多的物體數。因此，利用不放大的大面積成像的測定法可將具有抗體類目結合分子混合物的細胞的3個類目區別開來。
實施例18.腺病毒的固相捕獲測定法目的本實施例表示在固體支持物上捕獲的少數病毒可用螢光粒子標記，並通過不放大的大面積成像觀察。96孔平板的孔首先用抗腺病毒抗體塗覆。接著將腺病毒和用抗腺病毒抗體塗覆的粒子加入到孔中，通過抗體塗覆的表面捕獲病毒和粒子。除去未偶聯的粒子，通過大面積螢光像分析檢測代表捕獲病毒的捕獲粒子。
材料和方法通過加入50μl 0.2mg/ml的100mM碳酸氫鈉pH10的溶液，並室溫培養而用生物素化的BSA(Sigma目錄號A-8549)塗覆96孔Greiner平板(Greiner Labortechnik目錄號655097)的孔。用100μl PBS清洗孔1次。然後室溫用50μl 0.1mg/ml鏈黴抗生物素(JacksonImmunoresearch Laboratories目錄號016-000-113)的PBS溶液塗覆生物素化的BSA層2小時，接著用PBS清洗，然後室溫用50μl 0.1mg/ml生物素化-抗-腺病毒抗體(用Molecular Probes試劑盒目錄號F-6347生物素化的Chemicon目錄號MAB8052抗體)的PBS溶液塗覆。在100μlPBS-TB中將孔清洗3次，4℃貯存。
通過室溫在4％甲醛/PBS(終濃度)中重構30分鐘而將2型腺病毒(ATCC VR-846)及呼吸道合胞病毒(RSV)(ATCC VR-1302)固定。加入甘油至16％的終濃度，-80℃冷凍等分試樣。病毒粒子滴定度是基於由製造商提供的滴定度評估的，並以TCID50表示，然後按照製造商(ATCC)的建議，通過乘以0.7的因數，轉化成pfu(噬斑形成單位)。假定pfu約等於製品中的病毒粒子數。使用前，將等分試樣在冰上溶解。溶解後，將沒有使用的部分在4℃貯存，用於進一步的實驗。
按照實施例8所述，用抗腺病毒抗體(Chemicon目錄號MAB8052)塗覆粒子，區別在於以1％固體使用0.2μm直徑的螢光粒子(MolecularProbes目錄號F-8848)。
為了完成測定，除去孔中的貯存緩衝液。將大約10,000個病毒粒子和3×108個粒子加入到含有100μl終體積的Block Aid緩衝液(Molecular Probes目錄號10701)的孔中。室溫在搖動平臺上培養微量滴定盤1小時。在PBS-TB中清洗該孔3次，然後在水中清洗1次。除去水後，利用CCD成像器使孔成像(如詳述部分的步驟6所述和圖3所示)，其中CCD成像器裝配有FITC激發(470nm/40nm)和發射濾器(522nm/40nm)裝置。像是用Image-Pro Plus軟體(MediaCybernetics)處理並分析的。物體計數功能用於評估孔中的粒子數。結果本實施例表明，在固相上捕獲的病毒粒子可用螢光粒子信號傳遞部分標記，且如圖22所示，可在不放大的情況下檢測。使用Image-ProPlus軟體對像進行的分析(下面)表明，物體(粒子)數約為13,000，基本與所加入的腺病毒粒子數(-10,000)匹配。然而，應注意的是，並不能精確測定製品中的病毒數。而且不知道製品中存在多少感染組織的培養物細胞或這種細胞的片段。RSV陰性對照(上面)中的物體數約為800，並代表非-特異性的背景。
實施例19.血液中病毒的固相捕獲目標該實施例表示血液樣品中的少數病毒可在固體支持物上被捕獲，用螢光粒子標記，並通過不放大的大面積成像觀察。將含有腺病毒的血液加入到96孔平板中的抗-腺病毒抗體塗覆的孔中。捕獲病毒後，加入抗-腺病毒抗體塗覆的螢光粒子。除去未結合的粒子，並通過CCD螢光成像檢測代表捕獲病毒的捕獲粒子。
材料和方法96孔平板(Greiner Labortechnik目錄號655097)的孔是用生物素化的抗腺病毒抗體塗覆的。重構2型腺病毒(ATCC VR-846)和RSV(ATCC VR-1302)，並按照實施例18固定。按照實施例8所述，用抗腺病毒抗體(Chemicon目錄號MAB8052)塗覆粒子，區別在於以1％固體使用0.2μm直徑的螢光粒子(Molecular Probes目錄號F-8848)。為了進行測定，除去孔中的貯存緩衝液。向孔中加入約10,000個病毒粒子，孔中50％是Block Aid緩衝液(Molecular Probes目錄號10701)，50％是小鼠血液，終體積為100μl。室溫在搖動平臺上培養微量滴定盤1小時。在PBS-TB中清洗孔2此，加入3×108個粒子的100μl Block Aid緩衝液。搖動培養1小時後，用PBS-TB清洗孔3次，用水清洗1次，並用CCD成像器(如詳述部分的步驟6所述和圖3所示)觀察，該CCD成像器裝配有FITC激發(470nm/40nm)和發射濾器裝置(522nm/40nm)。
結果該實施例表示特定的病毒粒子(在這種情況下，是腺病毒)可在有50％血液存在的固相上被捕獲，用螢光粒子信號傳遞部分標記，在不放大的情況下檢測，如圖23所示。使用Image-Pro Plus軟體進行的像分析(下面)表明物體(粒子)數為13,489，大概與所加入的腺病毒粒子數(10,000)相匹配。RSV陰性對照(上面)中的物體數為2,173，代表非-特異性背景。該測定法的結果與實施例18的結果相似，表明血液的存在不會干擾在固相上捕獲病毒粒子，用螢光粒子標記它們，以及在不放大的情況下對它們進行檢測。
實施例20.腺病毒的液相測定法目的本實施例表示本發明可利用液相夾層-形成法掃描少數病毒。將含有腺病毒的樣品與塗覆了抗病毒抗體的螢光和磁性粒子組合培養。在有腺病毒(但沒有對照病毒)存在的條件下，誘導形成磁性和螢光粒子的複合物。這些螢光複合物是通過磁性選擇的，沉積在光學透明的表面上，並進行不放大的大面積成像。
材料和方法將腺病毒和RSV重構，並按照實施例18所述固定。抗體塗覆的螢光和磁性粒子是按照實施例8所述，使用抗腺病毒抗體(Chemicon目錄號MAB8052)塗覆1μm直徑的紅色螢光粒子(Molecular Probes目錄號F-8851)，和2.8μm直徑的磁性粒子(Dynal；目錄號142.03)製備的。在本實施例中，將5×105個紅色螢光粒子和5×106個磁性粒子在Block Aid緩衝液(Molecular Probes目錄號B-10710)中混合，終體積為250μl。以大約1000個病毒/樣品的滴定度加入腺病毒或RSV。室溫混合4小時後，使用微量離心機試管的Polysciences BioMag磁性分離器分離磁性粒子和所有結合粒子，並在PBS-TB中清洗3次。將清洗過的磁性粒子轉移到微量滴定孔(Greiner Labortechnik目錄號655097)中，在裝配有Texas Red激發(560nm/55nm)/發射(645nm/75nm)濾器裝置的CCD成像器(如詳述部分的步驟6所述和圖3所示)中觀察。按照實施例18所述用Image-Pro Plus軟體(Media Cybernetics)捕獲並分析像。
結果本實施例表示特定的病毒粒子可由使用磁性和螢光粒子的液相夾層-形成法捕獲，並在不放大的情況下檢測，如圖24所示。在測定中大約加入了1000個病毒粒子。在圖下面，利用Image-Pro Plus物體計數分析檢測到2324個腺病毒粒子，而在陰性RSV對照(上面)中，只檢測到代表非-特異性背景結合的46個粒子。
實施例21.血液中的腺病毒均相測定法實施例概述.有效且低成本的病毒加樣試驗—測定人樣品中的病毒濃度—代表了醫療診斷中的一種很大的需求。本實施例可證實本發明如何快速計算樣品中的病毒。本實施例測試腺病毒，一種重要的人類病原體。在技術上，該實施例與實施例8相似。
用抗體塗覆粒子.按照實施例8所述，用抗體塗覆粒子，並以2％固體濃度重懸浮。在本實施例中，抗腺病毒單克隆抗體(抗-六鄰體；目錄號MAB8052；Chemicon)用於塗覆黃綠色螢光粒子(TransFluoSpheres；目錄號T-8871；Molecular Probes)和磁性納米粒子(羧基聚合物-塗覆的鐵流；Immunicon；目錄號F3000)。混合相等體積的螢光和磁性粒子，使混合物中每種類型粒子的終濃度為1％固體。按照實施例8所述，利用超聲波處理分散粒子混合物。
檢測並量化血液中的腺病毒.本實施例所述的試驗可檢測血液中的腺病毒。向全血和粒子混合物中加入含有各種量(0，103，104，105pfu)純化腺病毒(CsCl梯度純化；Frank Graham，McMaster University)的樣品(在PBS-B中，10μl)，並按照實施例8所述進行反應。實驗樣品中的螢光粒子簇數減去陰性對照樣品中的平均簇數表示樣品中的腺病毒粒子數。
實施例22.同時掃描細菌和病毒的多路大面積成像免疫測定法目標本實施例證實本發明可用於構造同時掃描含有多種不同分析物—這裡指細菌和病毒的樣品的試驗。成對的抗體-塗覆微粒—一個螢光微粒和一個順磁微粒—可用於結合靶，如先前若干實施例(例如，實施例8)所述。然而這裡使用了兩對這樣的粒子-一組用抗大腸埃希氏菌抗體塗覆，一組用抗腺病毒抗體塗覆。為了將兩種類型粒子分析物的複合物彼此區別開來，每個分析物使用不同的螢光粒子。大腸埃希氏菌-特異性粒子具有綠色螢光特徵，而腺病毒-特異性粒子具有紅色螢光特徵。將樣品與分析物-特異性粒子混合後，利用磁性選擇所得的粒子分析物的複合物到檢測區，並進行不放大的大面積成像。通過對兩個CCD像進行分析可鑑定並量化病毒和細菌靶，這些像是用調諧為紅色或綠色粒子的濾光器裝置獲得的。
材料和方法大腸埃希氏菌細胞是按照實施例8所述生長並固定的，腺病毒是按照實施例18所述重構並固定的。抗體塗覆的螢光和磁性粒子是按照實施例8所述製備的。抗腺病毒抗體(Chemicon目錄號MAB8052)用於塗覆紅色螢光粒子(Molecular Probes目錄號F-8851)，抗大腸埃希氏菌抗體(KPL目錄號01-95-90)與綠色螢光粒子(Molecular Probes目錄號8852)一起使用，而磁性粒子(Dynal目錄號142.03)是用各種抗體製備的。測定時，以下列量將粒子混合在250μl終體積的Block Aid緩衝液(Molecular Probes目錄號B-10710)中每種螢光粒子為2.5×107個，每種磁性粒子為5×106個。以大約1000個病毒粒子/細胞的量加入腺病毒和/或大腸埃希氏菌。室溫混合1小時後，在磁場中分離磁性粒子和所有結合粒子，並在PBS-TB中清洗3次。使用裝配有FITC和Texas Red激發/發射濾器裝置(見實施例18和實施例20的濾器說明)的CCD成像器(如詳述部分的步驟6所述和圖3所示)在Greiner微量滴定孔(Greiner Labortechnik目錄號655097)中觀察清洗過的磁性粒子。
結果本實施例可證實細菌和病毒可在同一樣品中掃描，並利用不放大的大面積成像檢測。如圖25所示，當把約1000個腺病毒加入到混合物中時，所檢測到的大部分粒子是抗腺病毒紅色螢光粒子(Texas Red濾器裝置)(上排)。當加入約1000個大腸埃希氏菌時，抗大腸埃希氏菌綠色螢光粒子是用FITC濾器裝置(第二排)檢測的，而當同時加入腺病毒和大腸埃希氏菌時，粒子是在兩個通道(第三排)中檢測的。當不加入病原體時，可檢測到較少數量級的粒子，它們代表非-特異性背景(下排)。
實施例23.利用不放大的大面積成像檢測各個細菌的濾器流通測定法概述.在本實施例中，快速流通測定法與不放大的大面積成像聯合檢測用高度螢光粒子標記的少數細菌。將細菌和珠子一起培養後，使所得含有細菌珠子複合物的溶液通過濾器，其已經被抗細菌抗體塗覆。然後按照實施例1所述，利用不放大的大面積成像檢測由濾器捕獲的複合物。
實驗設計.將硝基纖維素薄膜(Pall Biodyne A；5μm孔；目錄號BNCF810S)切成1cm×1cm的正方形。將正方形浸泡在含抗大腸埃希氏菌O157的溶液(在PBS中，200μg/ml)中。室溫乾燥後，封閉薄膜(200ml；30分鐘；室溫，1％酪蛋白(Hammerston級；EM sciences；目錄號CX0525-1)和0.1％Tween 20(Sigma；目錄號P1379))。然後在吸水紙上將薄膜吸乾。將薄膜轉移到石蠟膜上，並用PBS(300μl)使薄膜飽和。將大腸埃希氏菌O157(105個細胞)的溶液和用抗大腸埃希氏菌O157抗體(Kirkegaurd and Perry Laboritories；目錄號01-95-90；抗體按照實施例8所述被動吸附)塗覆的紅色螢光珠(106個珠子/Molecular Probes；lμm；硫酸鹽；580/605nm，目錄號F-8851)共同混合在試管中，培養15分鐘，然後加入到其中一塊硝基纖維素正方形上。在另外一個正方形上，只加入抗體塗覆的螢光珠(該濾器是「沒有細菌」的陰性對照)。再培養15分鐘後，將薄膜放在一片濾紙(Whatman 50μm孔)上，吸收多餘的液體。然後清洗薄膜(PBS-T；50ml；20分鐘)。通過用CCD成像器成像來檢測螢光，該成像器裝配有紅色螢光珠的FITC濾光器裝置(激發560/55nm，發射645/75nm)。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。經證實，在成像器上檢測到的正信號是結合大腸埃希氏菌的珠子，這是通過裝有相同濾器裝置的Axioplan II螢光顯微鏡(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)檢查獲知的。
結果.圖26表示利用流通測定法檢測細菌的結果，所述細菌使用特異性結合的高度螢光珠修飾。使含細菌樣品通過的實驗濾器的CCD像包括很多白點，而使沒有細菌的樣品通過的對照濾器包括很少的珠子。高倍顯微鏡檢查證實了實驗濾器含有由珠子圍繞的細菌組成的若干複合物，而對照濾器不含複合物，只含分散的各個珠子。
實施例24.利用螢光酯酶底物染色的細胞的大面積成像量化細菌目的在很多應用中，它具有較大的動態範圍，用於量化活的細菌細胞。理想的系統能夠準確計算從0或1個細菌細胞到幾百萬或幾億個細菌細胞，從而取消連續稀釋和固有的缺少準確性，而這又是傳統微生物平板接種法所需的。在該實施例中，我們說明如何用螢光底物將活細胞染色，與基於CCD的不放大的大面積成像聯合用於量化至少5個數量級的細胞。
實驗方法大腸埃希氏菌ATCC 8739細胞是按照實施例Y(Cell Direct實施例)所述生長並處理的。在PBS中製備細胞的連續10-倍稀釋物，樣品一式兩份通過黑色聚酯薄膜(Chemunex目錄號200-C2010-02)過濾，該薄膜固定在Millipore 1225多功能過濾裝置中的吸收墊(Chemunex目錄號200-C3012-02)上，按照實施例Y(Cell Direct實施例)所述染色。此外，一式三份將10μl 10-5稀釋物平板接種在TSA(BD目錄號236950)上，37℃過夜生長，達到細胞滴定度。聚酯薄膜上的螢光信號是用裝配有FITC濾光器裝置(Chroma/激發470/40nm，發射522/40nm)的CCD成像器捕獲的(如上面步驟6所述；圖3所示)。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。將從每個濾器產生的信號定義為所有物體像素強度的總和(在本具體實施例中定義的物體具有350-65301的像素強度)。這種限定信號的方法可消除不含任何染色細胞的濾器區背景，但不能掩飾或不完全計算重疊物體的強度。(因為細胞很小而且十分透明，信號是累積的，只要細胞層較薄。)結果如圖28所示，這種方法產生的信號在至少5個數量級上是線性的，本試驗具有較大的動態範圍。
變化物體數較低時，準確的量化可通過計算各個物體數而獲得，而不是利用它們像素強度的總和，這是因為物體不太可能重疊。這可發展到準確計算少至0或1個細胞，特別是如果使用多種染料和多個激發和/或發射波長確定哪個物體代表活細胞。此外，更複雜的物體查找算法可用於考慮局部背景強度和照射的改變。
實施例25.利用不放大的大面積成像檢測濾器上的各個染色細菌概述.在該實施例中，大面積成像用於檢測各個大腸埃希氏菌細胞的靶，它是用結合核酸的螢光染料染色的。染色細胞通過黑色聚碳酸酯濾器過濾，用白光照射，並用CCD照相機成像。
實驗設計.大腸埃希氏菌MG1655的培養物是按照實施例2所述用SyberGreen I染色的。將培養物稀釋，並用真空泵和塑料漏鬥杯(MilliporeMicrofil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)使大約105個細胞通過黑色聚碳酸酯濾器過濾。然後用水清洗濾器(50ml；1型質量)。螢光是用大面積CCD成像器(圖3)和適於檢測Syber Green I的FITC濾光器裝置(激發470/40nm，發射522/40nm)檢測的。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Media cybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。經證實，在成像器上檢測到的正信號是細胞，這是通過用裝有相同濾器裝置的Axioplan II螢光顯微鏡(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)獲知的。
結果.圖27表示在濾器上捕獲並檢測細菌。濾器表面上的Syber Green I染色的細胞顯示為白點。當在高倍放大率下觀察時，所見的斑點是染色的細胞。
實施例26.在不放大的情況下，少數細菌細胞的非儀器檢測概述.在本實施例中，用鹼性磷酸酶和抗大腸埃希氏菌抗體塗覆的粒子用於在液體捕獲測定法中檢測大腸埃希氏菌O157。細菌在液體中與雙層塗覆的粒子和抗體-塗覆的磁性粒子結合，利用磁力分離並清洗粒子分析物複合物，從而將粒子複合物與未結合的粒子分開。複合物過濾沉積在0.2μm孔的硝基纖維素薄膜上，然後利用化學發光和比色底物觀察。
實驗過程.雙層塗覆的粒子是通過向鏈黴抗生物素塗覆的粒子(108個粒子；Bangs；0.95μm，非-螢光；目錄號CP01N)中加入生物素化的鹼性磷酸酶(5μl 2.9mg/ml的原液；Pierce；目錄號29339)和生物素化的驢抗-山羊IgG抗體(5μl 1.6mg/ml原液；Jackson；目錄號705-065-147)而製備的。用PBS將反應水平增加至100μl。培養30分鐘後，清洗粒子2次。每次清洗是以3000g在微量離心機中旋轉粒子5分鐘，然後棄去上清液，並將粒子重懸浮在PBS(100μl)中。清洗後，向粒子中加入山羊抗-大腸埃希氏菌O157抗體(5μl 1mg/ml原液；Kirkegaurd and Perry Laboratories；目錄號01-95-90)。室溫培養粒子30分鐘，然後按照上面所述清洗2次。製備雙層塗覆粒子後，將大腸埃希氏菌O157培養物固定在2.5％甲醛(見實施例1，用DNA-結合螢光染料染色的各個細菌的大面積成像)中，並以10倍增量連續稀釋獲得107-103個細胞/ml。在獨立的1.5ml試管中，使10μl各稀釋物與山羊抗-大腸埃希氏菌O157抗體塗覆的磁性粒子(106個粒子；Dynal；2.8μm；甲苯磺醯化；目錄號M-280；按照實施例8製備)和雙層塗覆粒子(106個粒子)結合(一式兩份)。用PBS-TB將粒子細菌混懸液加至100μl，室溫混合培養1小時。培養後，在PBS-TB中清洗試管4次。每次清洗是利用磁性分離將磁性粒子細菌粒子夾層結構牽引至試管的一側，然後吸去上清液，在PBS-TB(100μl)中重懸浮。單獨過濾清洗粒子細菌夾層的各稀釋物複製品。將各複製品加入到PBS(50ml)中，使用真空泵和塑料漏鬥杯(Millipore Microfil V UserGuide，PF07114，Rev A 3/00)通過0.2μm孔的硝基纖維素薄膜過濾。將BM Purple AP底物(500μl；Roche；目錄號1442074)加入到其中一組濾器裝置中。其它濾器中加入CDP-Star(500μl；NEN；目錄號NEL-601)。培養1小時後，在水中清洗BM紫薄膜，除去剩下的BMPurple，將薄膜風乾。按照製造商的說明，將CDP-Star薄膜安裝在SpotLight照相機(Boston Probes；目錄號DT10000)上，並與ASA 2000膠片(Boston Probes；目錄號DT20000)接觸2秒。然後接觸相同的濾器，進行不放大的大面積成像。4.1版本的Image-Pro Plus軟體(Mediacybernetics)用於捕獲並處理CCD成像器的像。
結果.圖29表示雙-功能粒子，它與類目特異性結合分子及酶信號傳遞部分偶聯，可利用產色或化學發光信號傳遞部分檢測。這裡使用雙標記粒子的測定法較為靈敏，可檢測少數細菌(大約100個細胞)。大腸埃希氏菌珠子複合物通常只能在高倍顯微鏡下觀察，使用肉眼觀察的能力是由於含有大量酶分子的這些粒子的巨大信號能量。事實上，當按照本實施例所述製備、在濾器上沉積，並用產色底物處理時，各個分散的顯微珠可用肉眼檢測。本實施例所用的方法證實了與目前的快速試驗相比，本發明可提供簡單，便宜，而且是非儀器的關注點試驗。
實施例27.快速、均相、靈敏、且定量地對臨床樣品中的結核分枝桿菌進行免疫測定概述.診斷測試結核分枝桿菌的醫療重要性在實施例9的概述中討論。在本實施例中，本發明使用類目特異性抗-結核分枝桿菌抗體構造均相免疫測定法(見實施例8和圖11)。這種類型的試驗快速、靈敏、便宜、且易於使用。這裡所述的測定法可補充實施例9中證實的抗酸桿菌法，將結核分枝桿菌與其它微生物種類區別開來。
結核分枝桿菌-特異性抗體.本實施例中的類目結合分子是與結核分枝桿菌特異性結合的抗體。本實施例利用對結核分枝桿菌複合物中的種類特異的單克隆抗體(MPB64-1CA)(Abe等，J.Clin.Microbiol.373693-2881，1999)。可選擇性地，可使用單克隆抗體。例如，本發明可使用與結核分枝桿菌反應的兔多克隆抗體(BioDesign目錄號B65601R)。
類目特異性多克隆抗體優選使用本領域那些技術人員已知的方法，通過免疫親和色譜法純化。在本實施例中，結核分枝桿菌-特異性抗體是用含有固定在活化粒子上的靶病原體的柱子純化的(例如，Affigel 10；BioRad)(Harlo等，Using AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1999))。以這種方式對預定抗體進行積極選擇後，檢查抗體與其它下呼吸道病原體及呼吸道共生菌叢交叉反應的抗體(例如，見第3章，表1，Murray等編輯(1999)，Manual of Clinical Microbiology，7th ed.Washington，D.C.American Society for Microbiology)，包括不會引起肺結核的分枝桿菌種類(例如，鳥分枝桿菌病原體被固定(Amann等，Appl Environ Microbiol 561919-25，1990)，點在聚-賴氨酸塗覆的載玻片(Sigma；目錄號P-0425)上，用抗-結核分枝桿菌抗體(在PBS-B中1∶500稀釋；20分鐘；RT)處理，並用PBS-TB(50ml)清洗4次，然後用螢光素標記的山羊-抗-兔IgG處理。與抗體交叉反應的生物用於除去特異性反應抗體中的交叉反應抗體。交叉反應抗體與粒子粘著，並按照上面結核分枝桿菌-特異性抗體的積極選擇所述，用於通過免疫親和色譜吸收交叉反應抗體。然而，為了除去交叉反應抗體，收集未結合的抗體，棄去結合抗體。所得抗體對結核分枝桿菌特異。
可選擇性地，非-生產用抗體(多克隆或單克隆)或重組抗體可使用本領域那些技術人員已知的、在各種著作和參考文獻中描述的標準方法生產(例如，Coligan，J.等編輯，(1994)Current Protocols inImmunology.New YorkJohn Wiley Sons；Knott，C等(1997)Development of Antibodies for Diagnostic Assays.In Principles andPractice of Immunoassay，C.Price和D.Newman編輯Stockton Press；George，A.(1997)Antibody EngineeringPotential Applications forImmunoassays.In Principles and Practice of Immunoassay，C.Price和D.Newman編輯Stockton Press)。
用類目特異性抗體塗覆磁性和螢光微粒.類目特異性抗體用於按照實施例8所述塗覆磁性粒子和螢光染色的聚苯乙烯粒子。
使結核分枝桿菌-特異性粒子與下呼吸道樣品結合.在下一步中，使螢光和磁性結核分枝桿菌粒子與下呼吸道樣品中的結核分枝桿菌結合。將液化的下呼吸道樣品(200μl)與結核分枝桿菌-特異性粒子混合物(每種類型1×106個粒子)在具有光學透明底部的96孔微量滴定皿的孔中(Greiner Labs目錄號665097)混合。BAL下呼吸道樣品在不進行處理的情況下使用。痰液樣品是用NALC-NaOH法(Isenberg編輯，(1992)Clinical microbiology procedures handbook.Washington，D.CAmerican Society of Microbiology).Section 3.4)製備的。
檢測並量化樣品中的結核分枝桿菌.按照實施例8所述將樣品處理，成像並分析。
對照.陽性和陰性對照實驗優選與臨床樣品同時進行。陽性對照樣品，它是按照與臨床樣品相同處理的，優選在PBS中含有已知量(大約1000個細胞)的結核分枝桿菌。對陽性對照中正確細胞量的檢測表明了生物化學和像分析過程在正常工作。陰性對照樣品含有PBS，但沒有細胞。如果所有過程都正常工作，那麼在陰性對照實驗中不應見到正信號。
變化.靶染色可替代螢光粒子或在使用螢光粒子之外(見實施例8的變化，結核分枝桿菌的特異性染色過程，如還可利用金胺O或金胺-若丹明染色(見實施例9))用於檢測。
實施例28.利用螢光染色對臨床樣品中的結核分枝桿菌進行快速均相的抗微生物敏感試驗概述.結核分枝桿菌的快速鑑定(見實施例9)和快速敏感性試驗有很高的醫療重要性。本實施例既可利用簡單而靈敏的抗酸塗抹技術使結核分枝桿菌直接在臨床樣品中生長(實施例9，圖13)，又可減少目前為肺結核患者提供敏感性數據所需的幾周時間。
對於結核分枝桿菌而言，敏感性試驗的周轉時間為幾周到幾個月，在這段時間內，用次優抗微生物療法治療的患者可在很多其它人群中傳播這種疾病。現有的敏感性試驗從培養樣品開始。因此，鑑於絕大多數生物的敏感性試驗通常在樣品收集後的24-48小時開始，對於結核分枝桿菌而言，試驗的開始常常延遲幾周。現有的快速試驗通常在進行抗生素敏感性試驗之前，需要在沒有藥物的條件下生長7-12天。因此迫切需要更快速的結核分枝桿菌敏感性試驗，這是因為多種藥物抗性的結核分枝桿菌在全世界的流行性發展。
這裡描述的抗微生物敏感性測定法可提供臨床上有價值的特徵，包括最少的生長需要(多代)，簡單，成本低，若干抗微生物療法的平行分析，直接測試細菌滴定度較低的生物複合物臨床樣品的能力。該試驗的獨特特徵是本發明在不使用顯微鏡的情況下，鑑定並計算樣品中少數微生物的能力。本發明通過省略其它形式必須的、在沒有藥物的條件下進行培養的步驟，並將用抗生素培養的時間縮短至4天而將典型敏感性試驗的周轉時間縮短幾周。本發明試驗的周轉時間比最快速的新興快速試驗(例如，Norden等，J.Clin.Micro.331231-1237，1995)少了一半。與其它快速敏感性試驗方法(例如，BACTEC-460，和流式細胞術)相比，本發明需要更少的昂貴儀器。
本實施例所用的方法還可用於監測正在進行抗微生物療法的患者-其它重要的、未滿足的臨床需要。監測接受抗生素患者的活細胞數對於測定治療功效較為重要。目前以核酸擴增為基礎的結核分枝桿菌快速試驗不能用於患者的監測。這是因為含有可擴增核酸的非活性結核分枝桿菌長時間存在於患者體內，即使在治療有效的條件下也是如此。活生物數可通過在若干代生長(在這種情況下，沒有抗生素存在)的培養前後，評估樣品中的細胞數而測定。
鑑定結核分枝桿菌.製備痰液樣品，並用金胺-若丹明抗酸法(Isenberg編輯，1992，supra)染色，按照實施例9所述測試結核分枝桿菌。如果存在結核分枝桿菌，痰液的等分試樣用於分析病原體的抗微生物敏感性。
使用各種抗生素時，結核分枝桿菌在臨床樣品中的直接生長.抗生素敏感性試驗是利用肉湯微量稀釋法在含有結核分枝桿菌的樣品上進行的。向含有濃縮7H9肉湯(100μl；標準濃度的3倍；DIFCO#211417)的試管(2ml聚丙烯螺旋帽試管；Sarstedt)中加入液化痰液的等分試樣(100μl；按照實施例27製備)，並用先前所述(Moore等，J.ClinMicrobiol 37479-83，1999)各種濃度的乙胺丁醇，異煙肼，和利福平(每個試管中加100μl抗生素；Sigma)接種。除抗生素外，還用PBS(100μl)接種兩個試管。使這些試管中的一個與測量細菌在沒有藥物條件下生長的敏感性試驗樣品(陽性對照)同時培養。其它試管在4℃培養，防止生長(陰性對照)。所有試管培養4天，然後按照先前所述(Moore等，1999，supra)，通過用1％低聚甲醛處理而殺死它們。利用螢光抗酸桿菌試驗測定抗微生物敏感性。利用實施例9所述的螢光抗酸桿菌計算在有或沒有抗生素存在時生長的樣品。將樣品的等分試樣(100μl)塗抹在載玻片上，進行不放大的大面積成像，並按照前面所述分析(實施例9)。對於所測試的抗生素而言，利用樣品計數數據繪製2條曲線。一條曲線是以像的總積分強度為基礎的，另一條是以利用成像軟體找到的物體總數為基礎的。各種抗生素的最小抑制濃度(MIC)是通過檢測這些曲線而測定的(見實施例10)。
使用均相免疫測定形式的變化.本發明的其它實施方案也可使用，如實施例27(還可見圖11)所用的均相免疫測定形式。當使用液相形式時，將在各種抗生素濃度生長的樣品等分試樣(100μl)加入到結核分枝桿菌-特異性螢光和磁性粒子的混合物中，並按照實施例27所述處理。
實施例29.快速、均相、定量檢測血液中的人免疫缺損病毒概述.檢測和測量血液中的HIV水平在HIV感染的所有階段都非常重要。HIV感染的早期診斷取決於檢測血漿中低水平病毒的能力。量化血漿中的病毒水平是監測AIDS患者健康的重要策略，且對於隨後抗病毒治療的有效性較為重要。HIV檢測法所需的靈敏度少於100個病毒/ml。目前超靈敏的方法是以核酸檢測為基礎的(例如，PCR，TMA，和bDNA)。然而，這些方法較為昂貴，而且相對於免疫測定法而言較慢。然而，目前的免疫測定法不足以靈敏測量血漿中的低水平病毒。
本實施例證實了本發明以簡單、快速、且經濟的均相免疫測定形式提供核酸擴增試驗的超靈敏度的能力。本發明的重要特徵，即檢測並鑑定非-顯微樣品中的各個靶，對於同時獲得靈敏度和簡單性而言很重要。
用抗體塗覆粒子.為了製備HIV-特異性粒子，按照實施例8所述，用抗體塗覆黃綠色螢光粒子(FluoSpheres；目錄號T-8803；MolecularProbes)和磁性粒子(羧基聚合物塗覆的鐵流；Immunicon；目錄號F3000)，區別在於使用的是抗-HIV gp 160/120(Chemicon；目錄號MAB8836)。
對照粒子.本實施例可同時摻入陽性和陰性內部對照。如果所有過程和試劑都正確發揮作用，那麼陽性對照粒子顯而易見，但檢測到的陰性對照粒子數較少。陽性對照粒子由橙色螢光粒子(TransFluoSpheres；100nm目錄號T-8872)和磁性納米粒子(鐵流)組成。陽性對照粒子用抗-噬菌體Fd抗體(Accurate；目錄號BYA-3163-1)塗覆。將已知數目(～1000)的噬菌體Fd病毒加入到各實驗樣品中。如果所述過程能夠正確發揮作用，那麼所有Fd病毒同時與Fd-特異性橙色螢光納米粒子和Fd-特異性磁性納米粒子結合。
陰性對照粒子是用抗-洋地黃毒苷抗體(Roche；目錄號1 333 062)塗覆的深紅色螢光粒子(TransFluoSpheres；100nm目錄號T-8876)。測定中檢測到的深紅色螢光粒子表示背景水平(即，所檢測到的粒子數與磁性標記的靶無關)。
製備粒子整體.將HIV-特異性粒子和對照粒子混合，使得總粒子濃度為2％固體。粒子是按照實施例8所述通過超聲波處理分散的。
製備血漿.使用EDTA作為抗凝劑將血液收集在無菌試管中(例如，Bection-Dickinson；目錄號6454)。室溫時以900RPM在螺旋帽微量離心機試管(例如，Sarstedt；目錄號782.694.006)中離心10分鐘而把血漿從全血(1.5ml)中分離出來。將血漿在-20℃冷凍貯存幾周或如果不冷凍，在1天內使用。向每份血漿樣品(200μl)中加入約1000Fd噬菌體(10μl PBS中的100pfu/μl原液；ATCC目錄號15669-B2)。免疫測定和HIV檢測。將粒子混合物(100μl)和樣品在微量滴定皿的孔中混合，培養，進行磁性選擇，並按照實施例22所述成像，只是3個像是用適於3種類型粒子的濾器裝置收集的，包括一個各個激發濾器(Chroma HQ480/40x)和3個不同的發射濾器，即黃綠色粒子的Chroma HQ522/40m，橙色粒子的Chroma HQ567/15m，和深紅色粒子的Chroma HQ667/30m。黃綠色粒子(HIV-特異性)數減去深紅色粒子(陰性對照)數表示樣品中的病毒數。深紅色粒子數與所加入Fd噬菌體粒子數的比值表示試驗效率。
實施例30.通過免疫分型分析人的細胞量化AIDS患者中的CD4+細胞人類疾病，包括癌症和免疫缺損的診斷，取決於人類細胞的鑑定，這是以它們不同的分子組分為基礎的。免疫分型，一種鑑定特異性細胞類型的重要工具，使用抗體將靶細胞標記並染色。免疫分型的普通技術形式包括流式細胞術和高倍顯微鏡檢查(免疫組織化學)。然而，流式細胞術需要昂貴的儀器，而高倍顯微鏡檢查不靈敏。相反，利用本發明的免疫分型測定法既靈敏又相對便宜。利用本發明的本實施例的試驗對於確定免疫狀況，以及AIDS患者健康很重要。該測定法可測定血液中CD4+T細胞的濃度。本實施例在技術上與實施例8相似，只是本實施例中的靶細胞是人的細胞，樣品是血液。
製備磁性和螢光粒子.CD4+-特異性螢光和磁性粒子是按照實施例8所述製備的，只是這裡使用的是CD4-特異性抗體(Biodesign；目錄號P54400M)。按照實施例8混合塗覆粒子，並加入到含有PBS-TB(175μl)、具有光學透明底部的96孔微量滴定皿(例如，Greiner；目錄號655896)的6個孔中。
量化全血中的CD4+細胞.將AIDS患者的全血(5μl)加入到6個微量滴定皿孔的2個中的粒子混合物中(構成一式兩份的實驗樣品孔)。將健康供體(具有已知的CD4+細胞濃度)的全血(5μl)加入到兩個孔中(構成一式兩份的陽性對照孔)。將人血清(缺失細胞；Biochemed；目錄號758AB)加入到第3對含粒子混合物的孔中(構成一式兩份的陰性對照孔)。室溫培養細胞和粒子20分鐘。按照實施例8所述，利用磁鐵將與CD4+-特異性磁性粒子締合的CD4+細胞牽引至孔的底面。在維持磁場的同時，通過清洗(3次；每次200μl PBS-TB)除去未結合的物質。按照實施例8使CD4+細胞成像並量化。試驗效率是通過將陽性對照中的CD4+細胞數與已知濃度進行比較而測定的。測定的背景水平是根據陰性對照孔測定的。
實施例31.砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌的快速均相免疫測定法概述.本實施例中研究的診斷測定法測試了兩種性傳播病原體，砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌，它們通常會引起尿道炎。感染會導致嚴重的後遺症，包括骨盆炎性疾病，不孕症，和HIV感染敏感性的增加。1995年，據估計，有大約1.5億人新感染了這兩種病原體中的一種(1998年，在美國，幾乎有1百萬人感染)。每年要花費大約十億美元檢測砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌。目前的檢測使用從革蘭氏染色(對於淋病奈瑟氏球菌)到DNA擴增的方法。不幸地是，這些檢測或者便宜但不靈敏(例如，革蘭氏染色，直接螢光測定)或者靈敏而昂貴(例如核酸擴增試驗)。
本實施例利用本發明構造一種可便宜並靈敏地檢測，鑑定，並計算尿液樣品中砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌的試驗。
製備病原體-特異性和對照粒子.病原體-特異性粒子是利用實施例8所述的過程製備的。用抗-衣原體抗體(BioDesign；目錄號C65641M)塗覆綠色螢光粒子(FluoSpheres；目錄號T-8803；Molecular Probes)和磁性粒子。用抗-淋病奈瑟氏球菌抗體(BioDesign；目錄號C65618M)塗覆紅色螢光粒子(Molecular Probes TransFluoSpheres，目錄號T-8861)和磁性粒子。陽性和陰性對照粒子是按照實施例29製備的。
檢測並量化尿液中的淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原體.使用市售試劑盒(B-D Urine Collection Kit(Becton-Dickinson，BD VacutainerTMBrand尿液收集杯))收集尿液樣品(10ml)。以4000xg將尿液旋轉10分鐘，棄去上清液。將顆粒狀物重懸浮在400μl PBS-B中。按照實施例20所述將樣品與粒子混合，培養，進行磁性選擇，成像並分析。然而，在本實施例中，取得了4個樣品的像，3個使用實施例29所述的濾器裝置，1個是適於使紅色螢光粒子(Chroma HQ617/40m)成像的濾器。黃綠色螢光粒子數表示樣品中的砂眼衣原體數。紅色螢光粒子數表示樣品中的淋病奈瑟氏球菌數。
變化.本實施例的試驗可擴展至包括掃描可引起尿道炎的其它病原體(例如，陰道毛滴蟲，解脲尿支原體和生殖道支原體)。利用其它不同的信號傳遞部分(即，具有可區別螢光特徵的粒子)或組合標記策略可檢測並鑑定其它靶。定量檢測多形核白細胞的存在可幫助診斷尿道炎，並可摻入到通過使用對這些細胞特異的抗體塗覆粒子的試驗中。
實施例32.檢測下呼吸道病原體的快速，多路，均相的細胞計量術肺炎.肺炎在美國是由於感染性疾病死亡的最普遍原因。疾病的病因學取決於年齡和免疫狀況。病毒引起絕大多數兒童肺炎，而細菌病原體是引起成人肺炎的最普遍病原體。在無免疫應答宿主中引起肺炎的病原體根據影響免疫系統或保護表面(黏膜或皮膚)的癌症患者，移植受體，和HIV-感染患者的不同而變化。
為了成功治療肺炎，主要是快速鑑定病原體。然而，目前的診斷不能有效鑑定病原體。為確定肺炎原因所作的診斷超過一半都不能鑑定病原劑。(這還不包括其中沒打算鑑定病原體的一大部分情況)。常規的微生物培養方法不能鑑定引起下呼吸道感染的很多細菌病原體和所有病毒和真菌病原體。例如，需要特定的方法來鑑定引起肺結核，百日咳，legionnaire’s疾病，和由支原體引起的肺炎的病原體。下呼吸道的診斷較為複雜，這是因為難以獲得未被正常上呼吸道菌叢汙染的下呼吸道樣品。此外，對上呼吸道無害的正常菌叢當被患者吸入時，也可引起肺炎。辨別由診斷鑑定的菌株是上呼吸道汙染物還是病原劑需要認真進行樣品質量對照的測量和微生物的量化。
肺炎通常分為兩類公共獲得性肺炎和醫院獲得性肺炎。在美國，公共獲得性肺炎引起大約20,000人死亡，而且每年要擔負$8百萬的治療費用。醫院獲得性肺炎是最嚴重和第二普遍的醫院獲得性感染類型。而在醫院的加強護理單位中，超過10％的患者患上肺炎。死亡率很高大約1/3醫院肺炎患者死於這種疾病。快速且準確的診斷至關重要，這是因為最佳的挽救生命的抗生素療法取決於究竟是哪種潛在的病原體引起疾病。潛在病原體的較寬範圍，它們中的一些在表2中列出，對下呼吸道診斷提出了挑戰。
在美國，下呼吸道感染患者大約有75％口服抗生素。每年大約要花費近$1百萬在無效的抗生素上，這是由於目前的診斷不能鑑定絕大多數下呼吸道感染中的病原體。對於病毒感染不正確地使用抗生素在很大部分上要對抗生素的過量使用和目前抗生素-抗性病原體的廣泛流行負責。因此，非常需要一種各個診斷測定法，它可檢測下呼吸道病原體的複雜組合。
試驗的優點.在本實施例中，本發明用於使均相免疫測定法成為超靈敏，定量，且高度多路的。通過同時檢測共有的細菌，病毒，和真菌病原體，這裡所述的方法可大大改善目前的實踐。無需培養，擴增，或酶步驟的靈敏的免疫測定法是用戶容易掌握使用的，成本低，快速，且能夠商業化(見實施例8，均相免疫測定法的優點)。該試驗可在診斷有效性方面提供較大改善，產生適宜且及時的抗微生物療法，最終挽救很多人的生命。
實施例的技術概述.圖32表示本實施例所用的方案。將具有下呼吸道感染症狀患者的下呼吸道樣品(例如，BAL或液化痰液)與粒子整體混合，其中每個粒子用結合特定靶病原體的抗體塗覆。每個病原體-特異性粒子是通過放射性標記單獨編碼的。在這個更高度多路的試驗中使用與實施例31所用類似的方法。
表2.共有的下呼吸道病原體
病原體-特異性抗體.本實施例中的類目結合分子是特異性結合表2所列下呼吸道病原體的抗體。在可能的情況下，從商業來源(例如，BioDesign，Biotrend Gmbh，Cologne，Germany，Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.，Concord，MA，和Accurate Chemical and ScientificCorporation，Westbury，NY))獲得每個病原體的抗體。可選擇性地，獲得抗體，親和純化，並按實施例27所述檢測。
測試抗體的結合特異性和標記靶病原體的能力。為了獲得最佳標記，優選將對特定病原體特異的若干抗體彼此進行比較。將靶病原體(在10μl PBS-T中有大約105個病原體細胞或病毒感染細胞)與類目特異性抗體(大約10μg，10μl PBS-T)和過量(例如，20μg)螢光標記的(例如，螢光素)次級抗體(例如，山羊抗-小鼠或山羊抗-兔，這取決於類目特異性初級抗體的來源)混合，室溫培養20分鐘。在PBS-T(1ml)中清洗2次，除去未結合的抗體。清洗是通過在微量離心機(12,000xg；1分鐘)中將稀釋生物旋轉而進行的。然後使螢光標記的靶生物在螢光顯微鏡(Zeiss Axioplan 2)中成像，並用成像軟體(Im-age-Pro Plus，Media Cybemetics，Silver Spring，MD)記錄。
使用類似的測定法，測試可提供靶病原體最佳標記的抗體的特異性，這是通過使抗體與一組呼吸道病原體和在下呼吸道中找到的共生菌叢結合而實現的。同樣，為了確保抗體不與呼吸道的內源性組分反應，還測試了每種抗體與來源於正常患者和下呼吸道疾病患者(已知並不是由靶病原體所引起)的上下呼吸道樣品的結合。
使用這些試驗，選擇有效結合靶病原體，而不結合在呼吸道樣品中找到的任何其它微生物或組份的抗體。
構造類目結合分子-塗覆的粒子整體.將表2所列各下呼吸道病原體的類目特異性抗體用於按照實施例8所述塗覆兩種粒子聚苯乙烯-塗覆的磁性粒子和螢光染色的聚苯乙烯粒子。然而在本實施例中，每個家族的病原體-特異性抗體與單獨放射性標記的螢光粒子偶聯。因此，對於每個病原體類目而言，要製備包含磁性粒子和螢光粒子的一對類目特異性粒子。本實施例所用的螢光粒子是定製的、放射性標記的硫酸鹽-衍生的珠子(Bangs Laboratories；5種不同濃度螢光素(505/515)和Texas Red(595/615)的組合)。珠子被標記。將粒子整體結合，終粒子濃度達到2％固體(在PBS-TB中)。按照實施例29所述製備陽性和陰性對照粒子，並包括在粒子整體中，區別在於本實施例中的對照粒子是用放射性標記的粒子構造的，具有與病原體-特異性粒子不同的顏色編碼。
樣品中病原體的檢測，鑑定和量化.將液化的下呼吸道樣品(200μl BAL樣品，其中按照實施例29所述加入了1000個對照噬菌體)與粒子整體(100μl)在微量滴定皿中混合。按照實施例8培養樣品，並進行磁性選擇。使用適於進行放射性標記的兩種染料的兩個濾器裝置收集兩個像(螢光素激發Chroma HQ480/40x和發射Chroma HQ535/50m；Texas Red激發Chroma HQ560/55x和發射Chroma HQ645/75m)。使用Image-Pro Plus軟體排列像。記錄通過軟體找到的每個物體的螢光標誌(即，放射性標記所用兩種染料的比例)，並與查表(憑經驗，使用不同種類的放射性標記螢光粒子創造的)進行比較，該查表可將螢光標誌和病原體-特異性聯繫起來。使用Image-Pro Plus軟體包的定製軟體模塊將物體的數目和分類制表。試驗效率是通過計算與陽性和陰性對照粒子相對應的物體數而監測的。試驗背景是通過分析平行運行的試驗評估的，其中用BAL樣品替換PBS(200μl)。
Chroma HQ560/55和發射(Chroma HQ645/75m)Chroma激發560/55，發射645/75實施例33.利用不放大的大面積成像平行掃描若干下呼吸道病原體的免疫測定法概述.本實施例的醫療目的和重要性與實施例32的那些相同。這裡，正如該實施例中，類目特異性抗體用於同時掃描含有若干引起肺炎的不同病原體(包括病毒，細菌和真菌)的下呼吸道樣品。然而，在本實施例中，將樣品固定在載玻片上。下呼吸道病原體的同一性是通過進行平行免疫組織化學分析，然後通過不放大的大面積成像使各個靶成像而測定。圖33表示本實施例所用的方案。
下呼吸道樣品的間接螢光測定法.將下呼吸道樣品塗抹在載玻片上，並按照先前所述固定(例如，Isenberg，編輯，1992，supra；部分9.5)。為了使不同抗體與載玻片的不同部分結合，將粘著孔(例如，粘著矽氧烷flexiPerm細胞培養室，常製成具有30個孔；IVSS；Sartorius)固定於載玻片上。本實施例所用的類目特異性抗體在實施例32描述。向不同的孔中加入各種類型的類目特異性抗體(200μl；在PBS中為10μg/ml)。作為陰性對照，將從兔免疫前血清純化的IgG(200μl；在PBS中為10μg/ml；Rabbit IgG Reagent Grade，Sigma，Cat.No.，I5006)和從小鼠免疫前血清純化的IgG(Mouse IgG Reagent Grade Sigma，Cat.No.，5381)加入到單獨的孔中。室溫培養載玻片30分鐘。用PBS清洗孔(200μl；4次)。然後除去粘著孔，這樣就可將整個載玻片作為一個各個單位有效處理。將載玻片浸入PBS中後(在玻片染色缸中)，再放在蒸餾水中，然後將載玻片風乾。用山羊-抗兔和山羊抗-小鼠生物素化的多克隆次級抗體的混合物(每種多克隆抗體在PBS中為5μg/μl)完全覆蓋樣品，然後在溼潤的載玻片室(Boekel)中室溫培養30分鐘。清洗後(2次用PBS；1次用蒸餾水；在玻片染色缸中)，用鏈黴抗生物素-塗覆的螢光粒子(Molecular Probes；目錄號F-8780；0.5％固體)完全覆蓋樣品，培養，並按照前面的步驟清洗。
成像和分析.按照前面所述，使用基於CCD的成像器使樣品成像(如詳述部分的步驟6所述和圖3所示)。成像器可獲得載玻片每個部分的像，它們與含病原體-特異性抗體或對照抗體的孔相對應。像分析軟體(Image-Pro Plus)可計算每個像中的總螢光和螢光染色物體數。比陰性對照具有明顯更多螢光物體和更高螢光強度的孔表示相應病原體引起感染的可能性。
變化和相關實施方案.在本化合物測定法中它可能是有效的捆綁試驗(在其它孔中)，它可測試通常在口腔/咽喉區中找到的、汙染下呼吸道樣品的共生物種。它還可用於包括對鱗狀上皮細胞(它可表示下呼吸道樣品的質量)和/或免疫系統細胞(它可告知有關感染的可能性)特異的抗體。
可能獲得高信號複雜度的其它類型信號傳遞部分可代替放射性標記的粒子使用。例如，可類似地使用螢光團標記的抗體。用兩個或多個螢光團標記各病原體-特異性抗體的兩個混合物可產生高信號複雜度。測定所用的終抗體家族是通過混合獨特比例的差異標記的病原體-特異性抗體而創造的。例如，對病原體X特異的抗體家族可能具有一個部分的紅色螢光抗體，一個部分的黃色抗體，和一個部分的藍色抗體。對病原體Y特異的抗體家族可能具有兩個部分的黃色抗體，和一個部分的藍色抗體等。應注意的是，與實施例所用的高度螢光粒子相比，用螢光抗體標記的靶信號強度通常明顯降低。信號強度還取決於靶上的抗原數。因此，對於較小的靶，和具有相對較少類目特異性結合位點的其它靶而言，本發明可能需要更靈敏的信號檢測儀器。
與本實施例其中一個類似的方法還可用於原位核酸雜交試驗。在這種情況下，應按照實施例1所述製備、固定、和雜交細胞，區別在於每個家族的類目特異性探針應使用生物素標記(使用標準方法；例如，在PCR過程中摻入)。雜交和清洗後，應按照本實施例對載玻片進行處理和成像(即，在除去未結合的生物素化次級抗體後發生的步驟)。
實施例34.在不進行培養的情況下，多路鑑定泌尿道感染泌尿道感染(UTI)很常見—每年大約有1.5億人發病—而且要花費上百萬美元在保健上。UTI的診斷通常需要進行尿液培養，對於某些病原體而言它很耗費時間，而且不能使用標準微生物方法和培養基(例如砂眼衣原體)。本實施例描述了本發明用於構造簡單且靈敏的UTI試驗的用途，這個試驗是高度多路的，而且無需細菌培養。試驗方法的方案在圖34中表示。
結合共有UTI病原體的抗體.表3給出普遍引起UTI的細胞病原體。特異性結合每種病原體的抗體是按照實施例27和實施例32所述那些類似獲得並選擇的。除了物種-特異性抗體外，本實施例使用了與多種細菌反應的抗體。結合絕大多數革蘭氏陰性菌(例如，目錄號15306，QED Bioscience，Inc.，San Diego，CA)和絕大多數革蘭氏陽性菌(例如，目錄號15711，QED Bioscience，Inc.，San Diego，CA)的抗體也包括在內，用於檢測其中不包括物種-特異性抗體的不太普遍的生物。
表3.引起泌尿道感染(UTI)的細菌病原體
將捕獲抗體粘著於載玻片上。抗體與含有乙醛的載玻片(TeleChemInternational；SuperAldehyde Substrates)共價結合。為了使不同抗體與載玻片的不同部分結合，將粘著孔(例如，粘著矽氧烷flexiPerm細胞培養室，常製成具有24個孔；IVSS；Sartorius)固定於載玻片上。向不同的孔中加入各種類型的類目特異性抗體(在PBS中為10μg/ml；-2.5mm深度)，然後按照先前所述處理(MacBeath，G等，Science2891760-3，2000；包括在網際網路上提供的補充材料，http//www.sciencemag.org/feature/data/1053284.shl)。在通過清洗除去孔中游離抗體後，和在進行隨後的處理步驟之前，除去矽氧烷孔。
尿液樣品中的UTI病原體與固定捕獲抗體的直接結合.尿液樣品是按照標準過程(Isenberg編輯，1992，supra)收集的。通過加入1M EPPSpH8.0(4ml；鈉鹽)，100mM NaEDTA pH8.0(4ml；鈉鹽)，和10XPBS-TB(4ml；見定義)中和樣品(28ml，在50ml一次性聚丙烯試管中；Falcon)。將具有結合捕獲抗體的顯微鏡載玻片浸沒在尿液樣品中，輕輕攪拌室溫培養2小時(Bambino旋轉器；Boekel)。在培養過程中，細菌與含有相應捕獲抗體的載玻片部分接觸並粘著。本測定法的可行性通過細菌UTI感染通常以較高的病原體滴定度(例如，103-105個細胞/ml)出現的事實來證實的。
將捕獲的細胞染色並成像.從尿液樣品中除去載玻片，清洗(3X；50mlPBS-TB；5分鐘；輕輕攪拌；接著用50ml EE清洗；輕輕攪拌15秒)，風乾，熱固定(在熱傳導阻滯區的表面上加熱至100℃，5分鐘)。然後用含有Syber Green I的溶液(10,000X原液的1∶1000稀釋物；Molecular Probes；#S7563)塗覆載玻片，培養(室溫10分鐘)，清洗(在50ml EE中2次；每次1分鐘；輕輕攪拌)。
使用圖3A所示的成像器和上面詳述部分的步驟6，通過不放大的大面積螢光成像分析載玻片的每個部分。
可選擇性的試驗，方法，和形式.本實施例所述的試驗具有很多用途，包括，例如，鑑定呼吸道，感染的手術傷口，食物，或環境樣品中的病原體。還可使用可選擇性的標記技術(例如，螢光粒子，鹼性磷酸酶/抗體-塗覆的粒子，辣根過氧化物酶抗體偶聯物，螢光抗體，RLS粒子，磁性粒子)，形式(例如，微流或側流和流通形式，其中捕獲抗體與吸水薄膜結合)，及成像方法(例如，產色測定法的目測或反射計檢測和化學發光及生物發光測定法的膠片發光繪圖法)構造類似的測定法，它們中的很多已經別處描述。
實施例35.血源性病毒HIV，HCV，HBV，和CMV的快速、多路鑑定血源性病毒的檢測對於測試單個患者樣品和血庫中的樣品很重要。常常使用的是血清學試驗(檢測對靶病毒特異的抗體)。然而，與血清學方法相比，直接檢測靶病毒的方法具有在感染過程早期檢測感染樣品的優點。這是因為對病原體特異的抗體在3-4周的時間內，通常不會出現在感染個體的血液中(血清轉化)。不幸地是，病毒的直接檢測或不靈敏(多數抗原試驗)或昂貴(多數核酸試驗)。
本實施例描述了本發明構造一種快速、多路試驗的用途，該試驗無需使用顯微鏡即可檢測血液樣品中的各個游離病毒粒子。試驗的方案在圖35給出。
用抗-病毒抗體塗覆螢光粒子和孔.對靶病毒特異的抗體可從很多商業來源購買。例如，下列抗體是從指定批發商購買的抗-HIV(抗-gp120；單克隆；Biodesign；目錄號C65199M)；抗-HCV(Biodesign；目錄號C8A024M)；抗-HBV(抗-B型肝炎表面抗原；單克隆；Biodesign；目錄號C86132M)；和抗-CMV((抗-糖蛋白B；單克隆；Biodesign；目錄號C8A024M)。
抗體是通過被動吸附，以每個孔4個相鄰的不同點，與微量滴定皿的孔結合的(1個點/抗體)。將每種抗-病毒抗體點在96孔微量滴定平板(Greiner America；目錄號55896)的孔中(1μl；1μg/μl)，在溼潤的室(Boekel Slide Moat；model 240000)中，室溫培養2小時。然後按照前面所述清洗並封閉該孔。
彩色-編碼的病毒特異性螢光粒子是按照實施例8所述的方法，用抗病毒抗體塗覆具有不同發射譜的螢光染色聚苯乙烯粒子而製造的。螢光粒子(Molecular Probes)編碼如下HIV-特異性粒子(黃綠色；目錄號F8823)；HCV-特異性粒子(橙色；目錄號F8820)；HBV-特異性粒子(深紅色；目錄號F8816)；和CMV-特異性粒子(紅外；目錄號F8818)。以相等濃度(在PBS-T中，107個粒子/ml)混合這4種類型的抗體-塗覆粒子。使用前，抗體經過超聲波處理並清洗(實施例8)。值得注意的是，各抗體在孔中被分開，還可相對於各種病毒使用相同類型的螢光粒子。然而，不同信號傳遞部分的使用可增加試驗的穩定性。
檢測血液樣品中的病毒.血液樣品是從各種來源收集的，包括，例如患者[使用標準方法，包括按照上面所述用抗凝劑EDTA處理，例如，(Isenberg，ed.，1992，supra)]；供血單位；或血液成分(例如，血漿)。將全血(200μl)加入到含有各捕獲抗體點的微量滴定皿孔中。37℃培養樣品2小時，確保病毒與捕獲抗體在孔表面粘著。徹底清洗(4X；每次使用200μl PBS-TB)除去孔中的血液樣品。將病毒特異性粒子的混合物(200μl)加入到孔中，輕輕旋轉(Beckman Allegra 6；GH-3.8轉子；1200g)，使粒子覆蓋孔的底部。簡單培養(室溫10分鐘)後，通過攪拌(渦旋4X 200μl PBS-TB；每次1分鐘)清洗除去未結合的粒子。最後，用EE(200μl)清洗孔，並乾燥。然後按照實施例8所述，使用CCD成像器使孔成像並分析，只是多個像是用適宜的濾器裝置獲得的(黃綠色激發Chroma HQ480/40x和發射ChromaHQ535/50m；橙色激發Chroma HQ535/50X和發射ChromaHG610/75m；深紅色激發Chroma HQ560/55x和發射ChromaHQ645/75m；和紅外激發Chroma HQ710/75x和發射ChromaHQ810/90m)。病毒是由粘著了結合粒子的斑點鑑定的。如果測定成功，診斷穩定性是根據只有預期顏色的粒子與特定斑點結合的事實提供的。
實施例36.利用不放大的大面積成像對甲型流感病毒進行超靈敏的側流試驗目的本實施例可證實本發明利用用戶容易掌握使用的側流測定形式和不放大的大面積成像快速檢測低水平病毒的用途。在下述實驗中，將甲型流感粒子的稀釋物塗在多孔膜帶上，與偶聯物墊中的標記粒子接觸，並通過毛細作用移動，越過捕獲抗體，用於選擇病毒標記粒子複合物。然後利用大面積不放大成像觀察這些捕獲的複合物。
實驗方法按照所述匯集側流試驗帶。抗體線是通過將甲型流感特異性捕獲線(QED，目錄號1302)和對照線(Jackson Immuno ResearchLaboratories，Inc.；生物素抗-小鼠IgG，目錄號115-165-146)粘在薄膜(距墊5-10mm)上的而製備的。使用前，將線乾燥(至少15分鐘)。鏈黴抗生物素標記的螢光珠(Bangs Laboratories Inc.；目錄號CP01F-5121)是通過將珠子(10μl 1.23×1011原液)，抗體(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)結合併混合(1.5小時/室溫)而用生物素抗-甲型流感抗體(Virostat；目錄號1307)標記的。然後將珠子旋轉(5000，10分鐘)並重懸浮在PBS-B(100μl)中。將抗-甲型流感塗覆的螢光珠(2μl)加入到每個帶的偶聯物墊上。使用PBS-B連續稀釋純化甲型流感的原液(Advanced Biotechnologies Inc甲型流感/PR/8/34(H1N1)，目錄號10-210-000)。將試驗樣品(100μl IL-2稀釋物)與PBS-TB(50μl)結合，加入到試驗帶的樣品墊中。測定(-15分鐘)後，利用不放大的大面積成像使帶成像。
結果圖36表示用螢光標記粒子標記，不放大的大面積成像分析的甲型流感病毒的側流試驗結果。該圖表示上面塗覆樣品的試驗帶的捕獲和對照線的像，所述樣品含有(從左到右)0，105，106，107和108個病毒/ml。螢光信號隨著甲型流感病毒濃度的增加而增加。數據表明，本試驗可檢測低至105個病毒/ml的濃度。因此本實驗證實了基於本發明的側流試驗的靈敏度。
實施例37.目測結核分枝桿菌的快速側流試驗概述.快速側流，或「帶狀」試驗形式對於提供關注點(例如，在醫生辦公室，急救室，和家庭中測試)診斷變得越來越重要。然而，側流試驗常常因為不靈敏以致不能用於檢測以較低水平存在於臨床樣品中的病原體所引起的感染。例如，檢測痰液中的結核分枝桿菌感染時，需要檢測幾千個細胞/ml的痰液-低於目前帶狀試驗的靈敏度閾值。因此，在發展中國家，仍然需要通過簡單的、非儀器檢測結核分枝桿菌來滿足公共衛生方面尚未滿足的需要。雖然核酸擴增試驗可檢測較低滴定度的結核分枝桿菌，但是這些試驗太昂貴，而且複雜，不能用於絕大多數臨床情況中。
本實施例描述了一種針對結核分枝桿菌的便宜、簡單、快速、且高度靈敏的側流試驗。用戶可在不使用儀器的情況下目測。
使抗-結核分枝桿菌抗體和鹼性磷酸酶與納米粒子結合.單克隆抗-結核分枝桿菌抗體(MPB64-1CA；Abe等，1999，supra)和鹼性磷酸酶(Pierce；31391)按照製造商的建議，通過被動吸附，以等摩爾濃度與金偶聯粒子(30nm；Nanoprobes；CG3054)結合，並以1011個粒子/ml重懸浮。
通過側流試驗領域那些技術人員了解的詳細內容、材料，和過程設計並構造側流單位。設計和構造的結果在由側流試驗製造商提供的技術注意事項(例如，Millipore’s Short Guide for DevelopingImmunochromatographic Test Strips，2nded.，Millipore，技術注意事項#TB500，1999；Lateral Flow Tests，1sted.，Bangs Laboratories，技術注意事項#303，1999)和其它文獻(例如，Chandler，J.等，IVD Technology637-49，2000；Weiss，Alan，IVD Technology 548-57，1999；Wild，D.，ed.(2001).The Immunoassay Handbood.2nd.ed.New York，NYNaturePublishing Groop，2001)中描述。
側流組分是按照製造商的說明從試劑盒(Millipore；目錄號HFMI-DAK015；Hi-Flow Plus Membrane Assortment Assembly Kit)匯集的。按照製造商的建議，使用試劑調配裝置(基質1600；Kinematics)將檢測區中的抗體和對照區中的試劑塗成帶狀。
將液化痰液或BAL樣品(200μl；實施例27)點在樣品墊上。樣品通過毛細作用移動，穿過薄膜。將PBS-T(200μl))塗在樣品墊上(3分鐘)後，使樣品利用毛細作用通過薄膜。一段較短的時間(3分鐘)後，重複該PBS-T清洗步驟。3分鐘後，將金偶聯物(10μl；用抗-結核分枝桿菌/鹼性磷酸酶塗覆的109個粒子)塗在樣品墊上，進行兩次PBS-T清洗(如前所述)。將鹼性磷酸酶底物(1ml；BM紫；BoehringerMannheim)直接塗在薄膜上，顯色，直到在陽性對照區看到斑點(30分鐘-1小時)，之後，傾出剩餘的比色檢測試劑，將水(1ml)直接塗在薄膜上。3分鐘後，傾去水。如果試驗正常進行，那麼在陽性對照區可看到約1000個斑點。試驗區中的斑點數表示樣品中的結核分枝桿菌數。
各種選擇性的免疫色譜構型也是可能的，包括「流通」排列(見實施例23)。
實施例38.利用不放大的大面積成像檢測若干不同生物競爭劑的快速側流試驗由於生物競爭劑造成的診斷感染在常規感染性疾病診斷中遇到的那些之外，又提出了若干挑戰。很可能用於生物脅迫或生物競爭的試劑與在平常醫療實踐中見到的那些不同，並因此難於利用標準診斷方法識別。非常規試劑在本領域的診斷用途需要利用可攜式、用戶容易掌握使用的系統掃描不同的物質(包括毒素，病毒和細菌)，其中該系統可檢測滴定度非常低時的早期感染。
本實施例描述了一種側流免疫測定法，它快速、便於攜帶、而且用戶容易掌握使用，可掃描各種物質含量較低的臨床或環境樣品。技術上，該實施例類似實施例36，區別在於若干病原體是在一個測定法中檢測的，且化學發光信號是電檢測的。
表4.可能用於生物競爭或生物脅迫中的非常規試劑
對很可能用於生物競爭或生物脅迫中的試劑特異的納米金-抗體偶聯物。本實施例掃描含有表4所列物質的樣品(例如，血液)，這些樣品中的一些是細菌，病毒，和蛋白毒素。獲得對表4所列各種物質特異的抗體，親和純化，並按照實施例32和實施例27所述測試特異性。值得注意的是，對於蛋白毒素而言，具有不同和非重疊抗原決定部位的單克隆抗體與納米金粒子和側流薄膜上的檢測區(或捕獲區)偶聯(見下面)。
對表4中物質特異的納米金偶聯物是按照實施例26所述，通過各種類型的親和純化抗體及等摩爾鹼性磷酸酶的被動吸附而製備的。將PBS-TB中的物質-特異性偶聯物以等摩爾濃度混合，這樣最終總的偶聯物濃縮物在PBS-TB中是固體。
側流裝置.按照實施例36的測定法構造並運行本實施例中的側流試驗，區別在於所檢測分析物的數目較大，信號特徵不同(本實施例是化學發光，實施例36是比色)，及偶聯墊在本實施例中的使用。圖38表示側流試驗的構造。該圖已經簡化(例如，該試驗只描述了表4中的3種物質和偶聯物墊上所示的3種偶聯物，上面的圖代表物質-特異性偶聯物的總體)。如實施例36中所述，可攜式側流裝置具有一個檢測區和一個對照區，但在這種情況中，檢測區包括固定的物質-特異性抗體的平行帶-每種物質-特異性抗體為一個帶。對照區包括固定的非常規物質的平行帶-每種靶物質為一個帶。如各種參考文獻(例如，Millipore，技術注意事項#TB500，1999，supra；Bangs Laboratories，技術注意事項#303，1999，supra；Chandler，J.等，2000，supra；Weiss，A.，1999，supra；Wild，2001，supra)中所述，物質-特異性偶聯物的混合物嵌入在偶聯物墊中。
側流測定法.將液化樣品(200μl，例如，唾液，液化痰液，血清)塗在樣品墊上，然後3次將200μl PBS-TB塗在樣品墊上(每次塗在樣品墊上之間，等待60秒)。液化樣品可使偶聯物流動，這是因為它可通過毛細作用從樣品墊移動到偶聯物墊(圖38)。可能存在於樣品中的任何靶物質都可與相應的納米金抗體AP偶聯物結合。物質納米金複合物繼續利用毛細作用移動，直到它們遇到與特定物質相應的測試區帶中的相應物質-特異性抗體，物質納米金複合物即在那裡固定。沒有與物質結合的納米金偶聯物前進至對照區，並結合對照抗原的相應帶。
用CDP-Star(PE Biosystems)塗覆檢測帶，培養5分鐘。然後按照圖38所述用CCD成像器(Orca II；Hamamatsu)使帶成像。各個物質(生物，病毒，或蛋白)是利用與物質結合的鹼性磷酸酶塗覆粒子所發射的化學發光而檢測的。如果測定正常進行，所有對照帶都被化學發光粒子塗覆。如果樣品中存在一種(或多種)物質，相應帶應含有固定的化學發光粒子。物質的同一性是通過陽性檢測帶到對照帶的距離(每種物質的試驗帶到對照帶的距離是已知的)測定的。成像軟體(Image-Pro Plus)處理由CCD照相機收集的像，其中使用可量化試驗帶中斑點數的宏，並通過測量距對照帶的遠近而賦予物質同一性。
實施例39.使用核酸探針全面檢測呼吸道病原體目的和優點.在本實施例中，各個測定法可全面檢測患有下呼吸道疾病患者的樣品中是否存在共有呼吸道病原體的不同排列。本實施例的醫療目的和重要性與實施例32的那些相同。然而，本實施例使用基因組DNA探針和原位雜交形式，而不是抗體類目結合分子和免疫測定形式。
實施例的技術概述.類目特異性序列是利用基因組扣除(細菌和真菌)，或計算機分析(病毒)從各種下呼吸道病原體中分離出來的。寡核苷酸探針家族是相應於對各致病種類特異的類目特異性序列合成的。每個家族的類目特異性探針是用不同組合的螢光量子點標記的。整個探針整體(即，所有探針家族)與樣品雜交，固定於載玻片上，然後洗去未結合的探針。使用CCD照相機，通過確定病原體-特異性探針的哪個家族-即量子點標記的哪種組合-與樣品中的微生物雜交而測定臨床樣品中病原體的同一性。
從引起下呼吸道疾病的病原體中分離類目特異性序列.表2列出了引起下呼吸道感染的共有病原體。基因組扣除法(Straus，1995，supra)用於從細菌和真菌(即，非病毒)病原體中分離類目特異性序列。下列部分通過描述純化和鑑定對肺炎鏈球菌特異的診斷標記而舉例說明扣除方法。肺炎鏈球菌是肺炎最普遍的原因；它導致所有公共獲得性肺炎病例中約30-50％(在美國，每年500,000)。
利用基因組扣除分離一組含有肺炎鏈球菌類目特異性序列的DNA片段。圖39A表示肺炎鏈球菌與其最緊密親緣之間的種系發生關係(Kawamura等，International Journal Of Systematic Bacteriology45406-8，1995)。分離類目特異性序列的方法可分為兩步基因組扣除(圖39B)和篩選(圖39C)。首先，基因組扣除(Straus，1995，supra)是利用作為「+」基因組差異樣品的致病株(在這裡是肺炎鏈球菌)DNA進行的(圖39B)。「-」基因組差異樣品是通過將若干最緊密相關株混合而構造的-這些株通常不會引起肺炎。所得扣除產物是與病原體基因組雜交，但不與最緊密相關種類的基因組雜交的片段。然後利用部分補平法(Corrette-Bennett等，Nucleic Acids Res 261812-8，1998)將這些片段克隆到pBluescript I載體的XhoI位點中。
鑑定屬於類目特異性序列的扣除產物.下一步是分離肺炎鏈球菌-特異性扣除產物的亞組，它是類目特異性的，即與所有肺炎鏈球菌雜交，但不與其它種類的任何菌株雜交。應注意的是，並不是所有扣除產物都是類目特異性序列。扣除產物組不包括所有預期的類目特異性序列片段，但包括某些非類目特異性片段。這是因為基因組扣除實驗(見上一段)可選擇與各個肺炎鏈球菌(基因組扣除中的「+」菌株)雜交，而不與若干相關種類的各個菌株雜交的片段。因此，例如，某些扣除產物不與某些其它肺炎鏈球菌雜交，某些與扣除中所用的緩症鏈球菌的不同菌株雜交。
為了鑑定屬於類目特異性序列的扣除產物亞組，通過與很多不同鏈球菌分離物的基因組DNA雜交而篩選克隆片段。因為它不能檢測與所有肺炎鏈球菌雜交的探針，最近似的方法是檢測與上百種肺炎鏈球菌雜交的探針，所述上百種肺炎鏈球菌是從全世界分離的，而且在幾個世紀以前就已經分離出來了(肺炎鏈球菌是從American TypeCulture Center，和疾病控制中心獲得的)。同樣檢測與很多鏈球菌中的非-肺炎鏈球菌雜交的探針。圖39C表示檢測探針是否是類目特異性序列的適當方法。基因組DNA是從肺炎鏈球菌和相關鏈球菌種類的不同分離物製備的(使用Graves and Swaminathan Graves等的方法，(1993)Universal B acterial DNA分離過程.In Diagnostic molecularmicrobiologyprinciples and applications，D.Persing，T.Smith，F.Tenover和T.White，eds.(Washington，D.C.American Society forMicrobiology)，pp.617-621，使之變性，並以斑點印跡陣列的形式(Ausubel 1987，supra)點在帶正電的尼龍濾器上(例如，GeneScreenPlus，NEN)。(對於可進行集落雜交的種類而言，除了「斑點印跡」外，菌株可在尼龍濾器上原位生長並溶解，從而避免從大量菌株純化DNA)。
為了檢測克隆扣除產物是否是類目特異性序列，它與排列的基因組DNA雜交。如果克隆與所有肺炎鏈球菌的基因組DNA雜交，但不與相關鏈球菌種類的基因組DNA雜交，那麼它被分為類目特異性序列(圖39C)。克隆扣除產物是通過在克隆重組質粒的PCR擴增過程中摻入洋地黃毒苷而標記的。所用的標準PCR條件(見定義)是用XhoL和XhoR引物(它與克隆扣除產物在Bluescript載體中直接側面連接)，區別在於用洋地黃毒苷-dUTP(100μM；Boehringer Mannheim)補充反應。然後使用高度嚴格雜交的標準方法(Ausubel 1987，supra)使各個標記的探針與基因組DNA的斑點印跡陣列雜交，接著按照製造商建議的方案(Boehringer Mannheim)，使用鹼性磷酸酶抗-洋地黃毒苷抗體偶聯物(Genius；Boehringer Mannheim)和CDP-Star(NEN)檢測。化學發光項是利用裝在light-tight盒(Alpha Innotech Corp.，Multilmage II cabinet，目錄號DE-500-110)中的CCD照相機(ORCA II；Hamamatsu)獲得的，並使用Image-Pro Plus像軟體包(MediaCybernetics，Silverspring，MD)分析。
合成類目特異性寡核苷酸家族.接下來，合成寡核苷酸探針，它與通過上述斑點印跡鑑定的30個類目特異性克隆相對應。首先，對所選擇的30個肺炎鏈球菌類目特異性序列進行測序。所有DNA測序是使用Pekin Elmer的ABI 377自動測序儀並按照製造商的建議進行的。合成寡核苷酸探針時，使用程序「Primer3」(S.Rozen，H.Skaletsky(1998)Code availabe athttp//www-genome.wi.mit.edu/-genome_software/other/primer3.htm)選擇來源於30個類目特異性序列的、大約20個鹼基長的2個亞序列，其中對於內部雜交寡核苷酸挑取而言使用預設參數設置，只是將最小解鏈溫度定為59℃，將最大解鏈溫度定為61℃。
每個寡核苷酸是在5』末端進行氨基修飾而合成的(MidlandCertified Scientific Reagent Co.)。氨基修飾的寡核苷酸能夠與高度螢光量子點共價連接(見下面)。
表5.使用量子點組合標記.將5種不同類型著色的量子點組合，可產生31(25-1)種不同的顏色組合。對於表2上面所列的24種病原體而言，病原體-特異性寡核苷酸亞組與表中用菱形標記的量子點結合。因此，相對於每種病原體構造具有不同信號標誌的探針家族。應注意，表中沒有標出5種標記顏色的31種可能組合中的7種(即，與沒有顏色，1種顏色，和5種顏色相對應的組合)。
用量子點組合標記類目特異性寡核苷酸探針.為了達到全面檢測下呼吸道感染的目的，肺炎鏈球菌探針家族必須以這種方式標記，即把它與對應於表2中其它病原體的探針家族區別開來。在本實施例中，每個探針家族是用不同組合的量子點標記的。組合標記的原理在圖5中給出。量子點是納米大小的半導體晶體，它發出的螢光很亮，足以作為各個粒子使用簡單且便宜的儀器(Bruchez等，Science 2812013-6，1998；Chan等，Science 2812016-8，1998；Service，Science 2811930-1，1998)檢測。總之，量子點對於本發明非常有用的性質包括發射譜非常狹窄；發射譜是通過納米晶體的大小確定的—通過改變大小，可產生具有若干不同發射譜的量子點標記試劑(對於這種多色應用很重要)；發光非常強，這樣各個粒子就可成像；與小蛋白相比，粒子非常小(在原位分析過程中，提高探針進入固定細胞中靶的可能性)；量子點可用生物上非常重要的分子(例如，核酸，蛋白，生物素)共價修飾；以及各個波長的光可引起從具有不同發射譜的量子點發射。
為了區別標記24個類目特異性寡核苷酸探針家族(與表2所列的呼吸道病原體相對應)，可使用不同組合的量子點。將5種不同類型著色的量子點組合，可產生31(25-1)種不同的色彩組合(表2)。從每組病原體-特異性寡核苷酸中，使100個寡核苷酸與使用表2病原體欄中的菱形標記的量子點偶聯。因此，對於肺炎鏈球菌而言，100個不同的肺炎鏈球菌類目特異性寡核苷酸是用紫色量子點標記的。同樣，100個其它肺炎鏈球菌類目特異性寡核苷酸是用藍色量子點標記的。200個量子點標記的肺炎鏈球菌類國特異性寡核苷酸構成肺炎鏈球菌類目特異性探針家族。探針家族與各個肺炎鏈球菌細胞的原位雜交被檢測為藍色和紫色量子點的聚簇。同樣，金黃色葡萄球菌細胞被檢測為紫色和綠色量子點的局部聚簇(如表2的第2欄所示)。寡核苷酸是用製造商建議的過程與量子點(Quantum Dot Corp)共價結合的。
有時，寡核苷酸探針可起類目特異性序列的作用，儘管它是類目特異性序列的亞序列。這是由於較大類目特異性序列內的不完全序列分散而出現的。寡核苷酸是類目特異性序列的確認是按照上面所述，使用適於寡核苷酸的雜交條件(Ausubel 1987，supra)，通過使量子點標記的寡核苷酸與斑點印跡雜交而獲得的。斑點印跡是用benchchtop盒(Alpha Innotech Corp.，MultiImage II cabinet；目錄號DE-500-110)中，具有UV表面照射的ORCAII CCD照相機(Hamamatsu)和成像軟體(MetaMorph Universal Imaging Corporation，Downingtown，PA)分析的。不能起類目特異性序列作用的探針組中的寡核苷酸(與所有肺炎鏈球菌雜交，但不與其它鏈球菌雜交)不包括在類目特異性寡核苷酸探針家族中。
值得注意的是，在本實施例中可使用其它可信號產生的部分替換量子點。例如，利用EDAC化學(按照製造商的說明)，可使羧化-修飾的螢光標記粒子(40納米直徑，TransFluoSpheres，Molecular Probes)與5』末端的氨基修飾的寡核苷酸連接。然後使用具有不同發射譜(560，605，645，685，720nm)和相同吸光度最大值(488nm)的5種類型的TransFluoSpheres標記病原體-特異性寡核苷酸，其組合與使用表5中5種不同類型量子點的組合相似。
可選擇性地，較大的克隆類目特異性序列可使用核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶I，逆轉錄酶，或Taq聚合酶的Klenow片段)，在有修飾核苷酸存在下標記。有效核苷酸修飾的例子包括直接與螢光團偶聯的核苷酸(例如，來源於Molecular Probes的Alexa系列，或含有伯胺(它可在摻入到多聚核苷酸中後，與螢光團偶聯)的螢光素-12-dUTP(NEN Life Sciences；目錄號NEL413)核苷酸)，和半抗原修飾的核苷酸(例如，洋地黃毒苷-dUTP；Boehringer Mannheim)。對於半抗原-修飾的多核苷酸而言，信號傳遞部分(例如，螢光素-標記的抗-洋地黃毒苷抗體)常常在探針與樣品雜交後，與探針偶聯。就寡核苷酸而言，使用聚合酶-標記的類目特異性序列組合標記時，標記方案必須使用一組可區別的信號傳遞部分。
分離其它下呼吸道病原體的類目特異性探針.表2中其它細菌和真菌病原體的類目特異性探針家族是按照上面肺炎鏈球菌所述製備的。然而，如上面和表5中所述，每個類目特異性探針家族是用不同組合的量子點標記的。用於研究本試驗的病原體是從American CultureCollection(ATCC；Manassas VA)獲得的。
同樣製備病毒類目特異性探針家族，區別在於病毒類目特異性序列是通過與公眾可獲得的基因組序列進行比較而分離的。首先，在公共資料庫(例如，GenBank；http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中掃描病毒病原體，例如甲型流感病毒的序列。然後輸入這些序列，並在程序MegAlign(DNAStar)中進行序列對比。從基因組不變區選擇類目特異性序列，該不變區已經根據病毒的一個以上分離物測序。設計、合成寡核苷酸，並使其與量子點連接，然後上面肺炎鏈球菌所述進行檢測。病毒分離物是從培養物保藏單位，如美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的，用於製備基因組核酸(斑點印跡)。例如，ATCC保藏了甲型流感病毒和乙型流感病毒的大量標本。來源於病毒各種分離物的核酸是通過標準方法製備的，用於基因組斑點印跡(見，例如，Stephenson等編輯，(1998)，Diagnostic virology-Laboratory manuals.(Totaowa，NJHumana Press).307 pp)。
將病原體-特異性探針家族結合產生下呼吸道病原體探針整體。探針整體是在EE緩衝液(見定義)中匯集的，每個探針的濃度為10nM。鑑定臨床樣品中存在的病原體。病原體-特異性探針的整體可用於同時掃描含24種病原體的呼吸道樣品(圖40)。樣品和對照品的優選布置在圖40中表示。用樣品和對照區域中的登記標記蝕刻顯微鏡載玻片，從而幫助像的排列(見下面)。
將呼吸道樣品(例如，痰液，支氣管肺泡的灌洗液，或受保護的支氣管刷標本)和對照靶一起塗在顯微鏡載玻片上，風乾。在每個載玻片上構造內部對照部分，其上面是排列的、含有純化呼吸道病原體的斑點。載玻片對照部分是為了證實雜交正常進行，且提供內部螢光標記的標準品，從而與樣品中的信號進行比較。將探針整體中的24種呼吸道病原體(表2所列)點(0.1μl PBS中含250個微生物)於載玻片上，風乾。然後使用Braun-Howland等的方法固定樣品和對照品(Braun-Howland等，Biotechniques 13928-34，1992)。雜交前，通過75℃時，用70％甲醯胺塗覆樣品10分鐘而使固定樣品中的核酸變性。傾去過量的液體，在EE中清洗載玻片，並風乾。
接下來，使探針整體與載玻片上的樣品雜交。雜交是在含5μl探針整體(每個探針的終濃度為lnM)的HYB緩衝液(50μl；見定義)中進行的。用蓋玻片覆蓋雜交溶液，並於50℃時，在溼潤的載玻片槽(Boekel)中培養30分鐘。50℃時，在HYB緩衝液中清洗載玻片5次(每次30秒)。將載玻片冷卻至室溫後，用EE清洗它們，並風乾。
與圖3A所示相似的CCD成像設備(但沒有自動平臺)用於獲得樣品和內部標準品的像。加樣盤有3個位置開口，第1個成像位置，和第2個成像位置。將具有結合量子點-標記探針的載玻片插入到成像設備的加樣盤(在開口位置)中，該成像設備具有接近成像器定位的內部標準品部分。將加樣盤移動到第一個成像位置以觀察載玻片的內部標準品部分。標準品成像後，將載玻片移動到第二個成像位置以分析實驗樣品。
像的獲得優選通過計算機軟體(Image-Pro Plus)控制。5個像都是自動獲得的，每個螢光團信號傳遞部分1個像。當每個螢光團成像時，軟體自動選擇合適的激發和發射濾器，並按照用戶定義的參數(例如，曝光時間，標準品強度值等)收集像。軟體通過將5個像的信息結合而構造一個複合像。像是藉助於登記標記(標記在樣品和對照區域中蝕刻，這樣就可在每個像中看到它們)自動排列的。排列是必需的，這是因為濾器更換過程中，較小的機械幹擾會使連續的像輕微偏移。然後，軟體給複合像中的每個像素賦予相應於這5個像強度的基礎值。
基於軟體的標準品分析具有兩個主要功能。首先，它證實了實驗過程在正常工作。標準品陣列中的24個「斑點」含有靶病原體的各個細胞或病毒，而它們是按照與實驗樣品中的病原體同樣處理的。類目結合分子的每個病原體-特異性家族的信號傳遞部分的組合是已知的。因此，該軟體可檢查每個斑點中的細胞/病毒是否與信號傳遞部分的預期組合相對應。此外，將在每個斑點中觀察到的病原體數與已知數目(約250個生物)進行實驗比較。如果，按照預期通過結合探針標記正確數目的病原體，那麼實驗過程被認為是正常工作的。軟體分析包括將結果與廢止標準進行比較，其可由用戶設置。實驗被廢止的原因優選包括正確或有效標記一個或多個病原體的失敗，過多的背景(由沒有病原體的像部分的分析確定)，和較差的信噪比。優選從標準品和樣品的像中扣除在此階段，相對於5個像評估的背景螢光值。
標準品分析的第二個功能是產生用於將信號標誌與已知病原體聯繫起來的準確關鍵。對於每個病原體，構造這5個像(即，對於用螢光團-優化的激發/發射濾器收集的每個像)的預期基礎值。為了在其中一個像中建立病原體的預期範圍，將斑點中250個微生物的強度值列表。在本發明的優選實施方案中，以在標準品中檢測的強度值範圍為基礎選擇閾值。因此，對於每種病原體而言，構造每個像的一組預期範圍。構造查找表，它可將假色與落在特定病原體預期範圍內的一組值聯繫起來。賦予假色的過程與染色質組型所用的相似(Schrck等，1996，supra；Speicher等，1996，supra.)。
優選將用於樣品鑑定的條形碼(通過塗覆各種厚度的黑條而構造)放在載玻片上，使它與標準品同時成像。條形碼的使用和分析方法對於本領域那些技術人員是可以理解的。
分析標準品後，將載玻片加樣器移動到第二個位置，將載玻片的樣品部分放在成像區。軟體驅動收集樣品的5個像(在標準品之前自動成像)。使用在標準品分析過程中構造的查表，將假色賦予各個物體，其與顏色比值落在特定病原體預期範圍內的那組相對應。計算每種類型假色物體強度的總和，並除以對照樣品中靶的平均強度值，得到存在於每個樣品中的靶數。第一遍像分析可鑑定並計算代表靶各個類目的物體中的病原體。在第二遍分析時，軟體可測試像素登記比值，如果它們具有的比值與不止一種類型的病原體比值相一致，那麼與任何各個靶病原體的多種都不一致。最後，該軟體可為用戶展示診斷(即，感染或未感染)，樣品中病原體的強度和數目，樣品ID號(從載玻片上的條形碼信息提取的)，和標準品及樣品的複合像(具有假色像素)。
實施例40.使用核酸探針同時測試含有很多病原體的血液樣品血流感染.心血管系統的致病性侵害是一種最嚴重的感染性疾病。在美國，每年發生大約200,000例血流感染，其中20-50％是致死的。尤其危險的是非常年輕和非常老的無免疫應答患者，那些具有皮膚或軟組織感染和創傷的患者，和侵入性醫療過程的受者。所有主要類型的病原體都可感染血流，包括細菌，病毒，真菌，和寄生蟲。快速鑑定血流感染中的病原體對於創立適宜的，可挽救生命的療法而言很重要。
療法的選擇取決於病原體的同一性。很多較為昂貴的試驗都需要確定感染源。然而，迅速開始最佳療法常常是生存和死亡的原因。因此，需要一種能夠快速測定各種共有血流病原體同一性的各個測定法。
實施例概述.本實施例描述的試驗通過使用間接標記的病原體-特異性探針進行原位雜交而掃描血液樣品中各種血流病原體的存在。通過同時檢測共有細菌，病毒，和原生動物病原體，該方法可大大改善目前的實踐。試驗的快速(無需微生物培養)尤其適用於快速診斷血流病原體，開始適宜且即時的治療。
表6.引起血流感染的病原體
匯集來源於引起血流感染病原體的組合標記的類目特異性探針整體.表6列出可引起血流感染的一些共有病原體。使用由Tinsley等(1996，supra)改進的代表性差異分析法，從非病毒(即，細菌，真菌，和寄生蟲)病原體中分離類目特異性序列。這種方法在技術上不同於實施例39所用的方法，但它仍然可分離具有相同性質的扣除產物。基因組差異樣品是按照實施例39所述構造的，並使用標準方法(Ausubel1987，supra)克隆到Bluescript II載體中。類目特異性序列的病原體-特異性家族是按照實施例39所述鑑定並測序的。
寡核苷酸探針是按照實施例39合成並測試的。按照先前實施例所述，使用5種光譜不同的量子點的組合標記，和與表5類似的方案。然而在本實施例中，每個寡核苷酸是用兩個部分設計的類目特異性序列和標記序列(圖6和圖41)。標記部分可提供間接標記寡核苷酸探針的工具。為了間接標記探針分子，用信號傳遞部分標記抗-標記(或標記互補)序列，然後與雙功能寡核苷酸探針雜交(圖41)。使用5個不同的標記，每個標記一種顏色。假設，例如，金黃色葡萄球菌的「色彩編碼」是綠色，紫色，和藍色。大約100個金黃色葡萄球菌-特異性探針是用「綠色標記」合成的，另外100個用「藍色標記」，還有100個用「紫色標記」。設計標記序列和類目特異性序列，這樣一來，每個部分及其互補序列的解鏈溫度(Tm；使用Suggs(Suggs，S.V等，Proc Natl Acad Sci U S A 786613-7，1981)算法計算，1M NaCl)為60℃(±1℃)。而且在設計標記時，還要使它們彼此、彼此的互補序列，類目特異性寡核苷酸，或類目特異性寡核苷酸的互補序列不會交叉雜交(即，寡核苷酸的所有這種組合優選具有40℃的解鏈溫度(Tm(不匹配))(即，Tm(理想匹配)-20℃))。這種方法的優點是只需合成5個標記的抗-標記序列(它們可用於若干用途)，且標記和抗-標記可在與樣品雜交的過程中彼此雜交。(在可選擇的實施方案中，各個通用標記序列可在所有寡核苷酸上使用，或可使用家族-特異性標記)。
如實施例39所述，檢查寡核苷酸以確定它們通過與基因組DNA的斑點印跡雜交而起嚴格類目特異性序列的作用。然而在本實施例中，探針是用與鹼性磷酸酶(Synthetic Genetics)偶聯的抗-標記間接標記的。52℃(與寡核苷酸/基因組DNA雜交(60℃)減8℃的解鏈溫度(Tm)相等)時，探針與斑點印跡在HYB緩衝液中雜交。在相同溫度下，在相同的緩衝液中清洗印跡(3次，每次10分鐘)，在150mMNaCl和100mM tris-HCl pH9.5的溶液中清洗，然後用CDPStar(NEN)覆蓋。印跡的數字圖像是按照先前實施例所述獲得的。
因此，與病原體-特異性探針家族相對應的每組寡核苷酸(每個探針家族與表6所列30種病原體中的一種特異性雜交)是利用組合標記方案，通過獨特組合的螢光染料標記的。按照實施例39組合標記探針家族，從而形成血流病原體-特異性探針整體。
血液病原體探針整體與血液樣品的原位雜交.使用標準方法(Isenberg編輯，(1992)Clinical microbiology procedures handbook.Washington，D.C.American Society of Microbiology)收集血液樣品。使用Lischewski等(Lischewski等，J Clin Microbiol 352943-8，1997)的方法製備進行原位雜交的血液樣品(0.5ml)。按照先前實施例所述，將血液樣品點在與對照斑點相鄰的陣列上，區別在於在本實施例中，斑點含有來源於表6所列血流病原體的生物。載玻片也是按照先前實施所述進行條形編碼的。雜交和清洗按照先前實施例所述進行，區別在於本實施例中，包括探針整體(每個探針的終濃度為1nM)和抗-標記(與探針整體中相應標記序列的相應濃度是等摩爾的)。
按照實施例39所述使載玻片成像並進行分析。
實施例41.使用核酸探針快速共同檢測很多中樞神經系統病毒實施例概述.中樞神經系統(CNS)感染屬於醫療急症。感染劑的快速診斷對於最佳醫療效果很重要。病毒感染的診斷還是特別值得懷疑且常常較為昂貴。本實施例描述的方法可用於同時檢測含有各種類型病毒的腦脊髓液(CSF)樣品。
本實施例詳細描述了一種快速高度多路的試驗，它可將樣品、所需儀器、和實驗複雜度減到最低。將CSF樣品點在濾器上並固定，使之變性，用側流色譜法與病毒探針的整體雜交(用量子點組合標記)。通過不放大的大面積CCD成像使結合探針成像並鑑定。
匯集病毒-特異性序列的整體.選擇對表7所列各病毒特異的類目特異性序列。在某些情況下，病毒-特異性類目特異性序列已經在文獻中描述過。在其它情況下，在將序列與資料庫中的其它病毒進行比較後，從公共資料庫中的病毒基因組序列中選擇序列。序列對比是用標準方法進行的(Ausubel等，1987，supra)。選擇類目特異性寡核苷酸，合成，並按照實施例39所述用量子點標記。組合標記方案與表5所示相似，區別在於來源於表7病毒的類目特異性寡核苷酸與量子點偶聯。中樞神經系統病原體-特異性探針整體是通過以(每種寡核苷酸)10nM濃度在EE中結合各種類目特異性寡核苷酸而構造的。
表7.引起CNS感染的病毒
樣品製備.CSF是利用標準方法(Isenberg，1992，supra)收集的。將樣品(1ml)在離心機(12,000Xg；1分鐘)中簡單旋轉，除去細胞和顆粒狀物質。通過在Biomax-5級Ultrafree-4離心部件(目錄號UFV4510XB；Millipore，Bedford，MA)中，以7,500g旋轉而將上清液(1ml)中的病毒濃縮。將剩餘物(10μl)在95℃加熱5分鐘，從而使核酸變性，並點在支持的硝基纖維素帶(0.5×2cm；5μm孔；Osmonics)上。在與樣品不同的帶區中，按照先前所述(Gravitt等，Journal Of ClinicalMicrobiology 363020-7，1988)，將來源於表7各病毒的變性基因組核酸的對照樣品(1×105基因組)點在相鄰帶上(條形碼)。類似塗抹墨水的參考帶。
毛細作用-介導的雜交.通過使用Reinhartz等(Reinhartz，1993，supra)描述的紙色譜雜交測定法使量子點標記的探針整體與樣品和對照組的變性樣品DNA接觸。圖42表示本實施例所用的過程。將探針的雜交溶液塗在帶的一端，通過毛細作用流過固定的變性樣品核酸。雜交溶液是Reinhartz等所用的，補充了1％聚乙烯吡咯烷酮，區別在於溶液所含的DNA是血源性病原體探針整體(每個量子點寡核苷酸探針的終濃度是1nM)。將帶浸泡在雜交溶液(100μl)中，50℃進行雜交色譜25分鐘。37℃將樣品在0.3％Tween/PBS中清洗5分鐘，然後風乾。利用過濾帶的CCD成像鑑定病原體。按照實施例39通過成像鑑定病原體。樣品中的病毒核酸分子與具有特徵組合量子點標記的探針雜交。每個量子點聚簇被賦予一種假色。CSF樣品中病毒的鑑定是通過將樣品中點的假色與對照帶(含有已知的病毒基因組)的假色進行比較而獲得的。
實施例42.用基因組DNA探針快速鑑定結核分枝桿菌的抗微生物敏感性試驗概述.快速靈敏檢測結核分枝桿菌的醫療重要性在實施例28的概述中討論。本實施例與先前實施例(實施例9，實施例27，和實施例28)的不同之處在於使用結核分枝桿菌-特異性基因組DNA序列作為類目結合分子，而不是用結核分枝桿菌-特異性染料，非-特異性染料，或抗體。
通過基因組扣除獲得的結核分枝桿菌-特異性基因組DNA序列是用半抗原洋地黃毒苷修飾的。患者痰液樣品的等分試樣是在含有各種濃度的各種抗生素的生長培養基中培養的。將樣品排列在濾器上後，使用半抗原標記的結核分枝桿菌特異性序列作為探針雜交，利用化學發光和不放大的大面積CCD檢測計算細胞數。
製備半抗原-標記的結核分枝桿菌-特異性類目特異性序列.結核分枝桿菌-特異性序列是按照實施例39所述和圖40所示，通過基因組扣除和量子點篩選分離的。進行基因組扣除時，正基因組差異樣品是結核分枝桿菌，負基因組差異樣品是鳥分枝桿菌。為了確定哪個克隆扣除產物是結核分枝桿菌-特異性序列，按照實施例39所述，用克隆產物作為探針，與50個結核分枝桿菌分離物(來源於不同的地理位置)和50個相關分枝桿菌種類的分離物在斑點印跡中雜交。探針用洋地黃毒苷標記，並按照實施例39所述使斑點印跡成像。收集洋地黃毒苷-標記的類目特異性序列(n＝96)(每個探針的終濃度為250pg/μl)。
檢測下呼吸道樣品中的結核分枝桿菌.用NALC-NaOH法(Isenberg，ed.(1992))製備痰液樣品。然後將預處理過的痰液(10μl)塗在尼龍濾器(GeneScreen；NEN)上，並通過放在一系列濾器上而製備。37℃時，將濾器連續放在(室溫，每次5分鐘)用預溶解溶液(見溶液部分)飽和的一系列濾器上(包裹在塑料套中，防止蒸發)；乾燥濾器(Whatman 3MM)；37℃時用1％SDS/100μg/ml蛋白激酶K(LifeTechnologies)溶液飽和的濾器(包裹在塑料套中)；乾燥濾器；用0.5NNaOH飽和的濾器；乾燥濾器；用1M tris pH7.5飽和的濾器；和乾燥濾器。作為陽性對照，將結核分枝桿菌(10μl中-1000個微生物)在與痰液樣品鄰近處點樣。作為陰性對照，將大腸埃希氏菌(-1000個細胞)在與陽性對照鄰近處點樣。與半抗原-標記探針的原位雜交是按照實施例39所述進行的。然後，使與鹼性磷酸酶(Genius試劑盒；Boehringer Mannheim)偶聯的抗-洋地黃毒苷抗體與雜交探針結合，將濾器放於載玻片上，並按照製造商的建議用CDP-Star(NEN)培養。利用非顯微CCD成像器(圖3)使載玻片成像並進行分析。
用各種抗生素培養臨床樣品.按照實施例28所述，在含有結核分枝桿菌的樣品上進行抗生素敏感性試驗。
將樣品排列在濾器上並準備雜交.使用安裝在真空燒瓶上的一次性過濾裝置(Millipore；Microfil Funnel(100ml)，目錄號MHAWG072)，將培養物樣品的等分試樣(100μl)排列在柵式尼龍濾器上。將樣品(100μl)吸量到同時應用真空(例如，以1/3的最大真空水平使用Gast(Model；DOA-P104-AA)真空泵)的交替柵式方形物上。拆去濾器並風乾。然後按照本實施例前面所述，放置一系列濾器準備進行雜交。
雜交，化學發光成像和分析.按照製造商建議的方案(BoehringerMannheim)，進行高度嚴格的雜交和清洗(Ausubel 1987，supra)，接著與鹼性磷酸酶抗-洋地黃毒苷抗體偶聯物(Genius；BoehringerMannheim)結合，並與化學發光的鹼性磷酸酶底物，CDP-Star(NEN)培養，從而使結核分枝桿菌-特異性探針(洋地黃毒苷-標記的)與排列的結核分枝桿菌結合。化學發光像是按照上面所述，利用基於不放大的CCD照相機成像而獲得的。按照前面本發明詳述部分步驟6所述，計算每個樣品斑點中的不同物體數和積分強度。
將實驗斑點中的靶數與陰性和陽性對照斑點進行比較，從而確定在各種抗生素稀釋物中出現的生長量。含有乙胺丁醇，異煙肼，和利福平樣品的細胞數分別降低了45，50，或25％，表明對已知抗生素療法的敏感性(Moore等，1999，supra)。
上述方法可以相同方式用於其它細菌。
通過非顯微鏡監測小菌落的原位生長而進行的快速敏感性試驗.在含有各種抗生素的培養基上生長的小菌落(例如，由2-1000個克隆相關細胞組成的菌落)可用於評估菌株的抗生素敏感性分布。概念上，本方法類似經典的平板擴散或瓊脂稀釋技術或最新的固定梯度法(例如，E-試驗)。在所有這些方法中，都將細胞放在含有不同濃度的若干抗生素的固體生長培養基中。為了確定菌株的抗生素敏感性分布，給在各種抗生素上生長的細菌分離物評分。
本發明使用這種方法，可大大加速獲得重要抗生素敏感性試驗的數據。例如，平板擴散敏感性試驗可按照NCCLS(NCCLS PerformanceStandards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests；ApprovedStandard Seventh Edition M2-A7 Vol.20 No.1 Jan.2000)建議的進行。然而，除了直接在瓊脂平板上接種細菌外，還可將細菌平板接種在放置於瓊脂培養基平板上的尼龍濾器上。將含有各種抗生素的小濾器平板(2.5mm直徑)放在尼龍濾器上，使細菌生長大約5次雙倍時間(速生細菌通常為幾小時)。然後將濾器連續放在(在每個Whatman 3MM濾器上，室溫5分鐘)乾燥濾器；用100％甲醇飽和的濾器；乾燥濾器；用碘化丙錠(在水中為10μg/μl)飽和的濾器；和乾燥濾器中。使用本實施例所用的不放大螢光成像器直接觀察圍繞在平板周圍的各個細胞。利用成像軟體(Image-Pro Plus，4.1版本；Media cybernetics)自動測量生長抑制區的直徑，其過程與經典平板擴散抗生素敏感性試驗中，通過肉眼測量平板周圍區域或暈輪的過程相似。可選擇性地，細胞可按照本實施例和其它實施例所述，使用病原體-特異性染色或具有散射光，或螢光，或化學發光信號傳遞部分的類目結合分子成像。快速的抗病毒敏感性試驗。目前研製了很多新的抗病毒化合物。由於抗性在HIV中的快速發展，抗病毒抗性的問題越來越突出。因此，敏感性試驗變得越來越重要。雖然越來越多地使用遺傳型方法測定抗性，但是通過檢測核酸序列中的突變組合而評估藥物抗性還是十分複雜，常常不能正確地預測抗性。不幸的是，對病毒傳代培養物進行的表型敏感性試驗很耗費時間。然而，使用與上面相對於結核分枝桿菌描述的那些類似的，監測細胞培養物中病毒複製的方法，本發明可大大提高病毒敏感性試驗的周轉時間。
實施例43.使用核酸探針檢測性傳播疾病的病原體實施例概述.本實施例利用本發明同時檢測含有兩種主要的性傳播病原體的尿液砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌。有關本試驗的更多重要性可參考實施例31的概述。這些株的類目特異性序列是利用基因組扣除(淋病奈瑟氏球菌)和基於計算機的虛擬扣除方法(砂眼衣原體)分離的。類目特異性序列是用半抗原洋地黃毒苷(砂眼衣原體)或螢光素(淋病奈瑟氏球菌)標記的，並與已經在濾器上濃縮並固定的固定細胞雜交。密集信號傳遞部分，也稱作共振光散射粒子(RLS粒子)，用於檢測並鑑定病原體。與抗-洋地黃毒苷抗體(紅色-散射RLS粒子)或抗-螢光素抗體(綠色-散射RLS粒子)偶聯的RLS粒子與樣品中的病原體結合。由於信號傳遞部分的強度，病原體可通過對發光樣品進行簡單目測而鑑定。紅點表示砂眼衣原體感染，綠點信號表示淋病奈瑟氏球菌感染。
利用虛擬扣除分離砂眼衣原體類目特異性序列.砂眼衣原體(Stephens等，Science 282754-9，1998)，肺炎衣原體(Kalman等，Nat Genet21385-9，1999)株中完全基因組序列的存在可使計算機能夠測定不同於其它基因組的一個基因組區。該過程也被稱作虛擬扣除，與基因組扣除實驗相似。可在公共資料庫中(NCBI；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/-Genomes/bacbt/html)獲得的基因組序列是用軟體處理的，該軟體可排列並比較整個基因組(MUMmer；Delcher等，Nucleic Acids Res 272369-2376，1999)。MUMmer(使用20bp的最小MUM長度參數)產生一個描述序列對比中所有缺口的詳細文件。這些缺口包括插入/缺失和高度多形區。使用程序Primer3(S.Rozen等，1998，supra)，選擇在砂眼衣原體，而不是在肺炎衣原體中進行的用於擴增(-200-500bp)區的PCR引物。PCR引物是用圖43所示的二分結構設計的。其中一個引物具有與一個20bp引物連接的XhoL引物序列，所述20bp的引物與砂眼衣原體中插入/缺失區的「左」端(5』-XhoL-砂眼衣原體左引物-3』)相對應。另外一個引物具有5』XhoR-砂眼衣原體右引物-3』結構，其中砂眼衣原體右引物是一個20bp的引物，與相同插入/缺失區的「右」端相對應。使用這些引物，虛擬扣除序列是在將細胞在EE緩衝液中沸騰5分鐘後，從砂眼衣原體細胞擴增的(在10μl EE中有105個細胞；是從ATCC獲得的)。擴增，按照實施例39所述，用洋地黃毒苷-dUTP標記產物，並利用斑點印跡分析篩選類目特異性。
利用基因組扣除分離淋病奈瑟氏球菌類目特異性序列.在本實施例中，潛在的淋病奈瑟氏球菌是按照實施例39所述，利用基因組扣除分離的(Straus，1995，supra)。正基因組差異樣品是由淋病奈瑟氏球菌基因組DNA的Sau3a消化液組成的，負基因組差異序列是由剪切的腦膜炎奈瑟氏球菌DNA組成的。淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌(從ATCC獲得)在適宜的培養基(ATCC；814GC培養基)中生長，並用CTAB法製備(Ausubel 1987，supra)。按照實施例39所述克隆扣除產物，標記，並篩選斑點印跡(含有各種奈瑟氏球菌的DNA)。螢光素-標記的類目特異性序列是按照製造商建議的過程，使用螢光素-12-dUTP(NEN Life Sciences；目錄號NEL413)和引物XhoL和XhoR(見節略部分的序列)，通過擴增重組質粒而合成的。
匯集砂眼衣原體/淋病奈瑟氏球菌探針的混合物.洋地黃毒苷-標記的砂眼衣原體類目特異性序列(n＝96)與螢光素標記的淋病奈瑟氏球菌類目特異性序列(n＝96)結合(將等體積的擴增反應物混合在一起，每個探針的終濃度約為250pg/μl)。
製備探針-特異性RLS信號傳遞部分.通過使由於密集的光散射而很容易觀察的RLS粒子與結合探針結合，可檢測並鑑定各個病原體細胞。兩個不同類型的RLS粒子(按照US 6214560所述製備)用於差異標記結合的砂眼衣原體探針和結合的淋病奈瑟氏球菌探針。紅色散射RLS粒子(160nm直徑的金粒子)用於結合砂眼衣原體探針，而綠色散射RLS粒子(60nm直徑的金粒子)用於結合淋病奈瑟氏球菌探針。對砂眼衣原體探針特異的紅色散射粒子是按照先前所述(Hermanson，1998，supra，和這裡的參考文獻)通過使抗-洋地黃毒苷抗體(Roche，目錄號1333 062)與粒子偶聯而製備的。同樣，對淋病奈瑟氏球菌探針特異的綠色散射RLS粒子是通過使抗-螢光素抗體(Roche，目錄號1 426 320)與粒子偶聯而製備的。以相等濃度(3.8×10-11M)混合紅色和綠色散射RLS:抗體偶聯物。
製備進行原位雜交的尿液樣品.使用市售試劑盒(B-D Urine CollectionKit(Becton-Dickinson))收集尿液樣品(10ml)，通過黑色聚碳酸酯薄膜(0.22μm；Osmonics)過濾，從而使可能存在的細菌濃縮。使細菌DNA變性，並通過處理濾器使菌落轉移(Ausubel 1987，supra)。將含有樣品的濾器連續放在用0.5M NaOH飽和的濾器(Whatman3MM)(5分鐘)；乾燥濾器(5分鐘)；用1M tris pH7.5飽和的濾器(5分鐘)；和乾燥濾器(5分鐘)上。
同樣製備對照濾器。使10ml PBS中的砂眼衣原體(-1000個原體；ATCC)通過濾器過濾，並按照實驗樣品製備。同樣收集GC培養基(10ml)中的淋病奈瑟氏球菌(-1000個細胞)並在獨立的濾器上製備。最後，以相同方式製備在LB(10ml)中含有大腸埃希氏菌的陰性對照濾器。
應注意，在可選擇性的實施方案中，可使用其它底物替換尼龍濾器(例如，載玻片，聚-賴氨酸處理過的載玻片，矽烷化載玻片，硝基纖維素濾器等)。且，還可通過離心(例如，12,000Xg，1分鐘)而不是過濾濃縮尿液樣品。可選擇性地，可將體積較小的尿液樣品(例如，100μl)直接塗在底物上，然後固定並處理，從而產生基因組DNA。使半抗原-標記的砂眼衣原體/淋病奈瑟氏球菌探針整體與過濾的尿液樣品和對照品結合。濾器是在1ml含有上述12稀釋的探針整體混合物的HYB溶液(見定義)中雜交的(每個探針的終濃度約為125ng/μl)。反應在培養箱(Hybaid)中65℃進行4小時。在玻璃雜交瓶(Hybaid)中的0.2XSSC(100ml；見定義)中清洗2次(每次20分鐘)而除去未結合的探針。
使探針-特異性RLS信號傳遞部分與探針-標記的病原體細胞結合.濾器是室溫(22℃)時，在輕微搖動(-60rpm)的旋轉平臺上的塑料盤(RubberMaid)中的BB(封閉緩衝液；100ml；見定義)中培養而「封閉的」。將1XBB(1ml)中的RLS粒子(200μl混合物)加入到密封袋(Seal-A-Meal)中的濾器上，室溫輕輕搖動培養1小時。室溫輕輕搖動在BB(100ml)中清洗2次，除去濾器中未結合的RLS抗體偶聯物。觀察前，將濾器在載玻片上風乾。
目測鑑定樣品中的病原體.將來源於CCD成像器(詳述部分的步驟6所述)中Xenon-弧光燈的光以傾斜於濾器平面的角度對準濾器。使用對應於兩類RLS粒子的激發和發射濾器處理兩個像。通過評估對照濾器而評估實驗過程。砂眼衣原體對照濾器應有-1000個紅點，淋病奈瑟氏球菌濾器應有相似數目的綠點，陰性對照濾器(含大腸埃希氏菌)不應有綠點或紅點。最後，評估含有臨床尿液樣品中的細胞的濾器是否存在砂眼衣原體(紅點)，淋病奈瑟氏球菌(綠點)，混合感染(紅點和綠點)，或沒有砂眼衣原體/淋病奈瑟氏球菌感染(與陰性對照相比，缺少統計學上顯著數目的斑點)。
其它相關應用.沿著與本實施例所述相同的路線，很容易發展很多相關的、臨床上很重要的診斷試驗。可構造測試其它泌尿道病原體(例如，大腸埃希氏菌)的試驗。如果使用組合標記，那麼這種試驗可包括大量病原體。使用利用棉籤收集的樣品對砂眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌(以及生殖泌尿道的其它感染劑)進行檢測，代表了重要的相關應用(Isenberg，1992，supra)。例如，使用尿道(男性或女性)，子宮頸，和陰道棉籤收集的樣品對於生殖泌尿道病原體的診斷很重要。在這些實施例中，可將棉籤上的樣品直接塗在濾器或載玻片上。這種試驗對於診斷生殖泌尿道的重要病毒病原體也是很有價值的(例如，人乳頭瘤病毒，1型單純皰疹病毒，和2型單純皰疹病毒)，真菌(例如，念珠菌)，和寄生蟲(如，陰道毛滴蟲)。本實施例中所用的方法(與適當改進的樣品收集技術聯合)可用於很多不同類型的臨床樣品(例如，外科手術傷口，血液，和呼吸道樣品)。此外，與各種類型的類目結合分子(例如，抗體，mRNA的探針)聯合，類似方法可用於非病原體分析物，包括疾病組織，血清蛋白，和毒素。
技術變化.除了上述樣品收集和底物的改變之外，本發明還可插入其它有效的技術變化。例如，可使用螢光團或螢光粒子標記的螢光類目特異性抗體構造操作更簡單的試驗。這種試驗可省略多個步驟(例如，雜交)。可插入很多類型的信號傳遞部分(例如，螢光納米粒，量子點，和傳統螢光團)，並用CCD照相機自動成像。如一些實施例所述，除了限制-片段大小的類目特異性序列之外，還可使用標記的寡核苷酸。本實施例的高生產率應用可插入微量滴定平板(例如，384-孔平板)，其中每個孔含有不同的樣品。結合步驟之後，可使用能夠檢測光散射的CCD成像器或微量滴定平板閱讀器使每個孔濾器上的標記細胞成像。
其它實施方案本申請引用的所有專利，專利申請，和出版物都引入此處作為參考。根據這裡公開的本發明說明書和實施例，本發明的其它實施方案對於本領域那些技術人員是顯而易見的。說明書和實施例僅僅用於舉例說明，本發明的真正範圍和精神由下面的權利要求來表示。適於這裡所述方法的其它實施方案的例子可在2002年9月6日提交的，名稱為「複製細胞的快速靈敏檢測」的美國申請號＿＿＿＿，和2002年9月6日提交的，名稱為「分子的快速靈敏檢測」的美國申請號＿中找到，這兩篇文獻也引入此處作為參考。
權利要求
1.一種檢測樣品中靶細胞或病毒的方法，其中所述靶a.在至少兩個正交維數中的測量值小於50微米，且b.隨機分散在檢測區中，該檢測區包括一個密度小於100個靶細胞/mm2的檢測面積，其中所述方法包括下列步驟a.照射所述靶細胞，產生可檢測的信號，並b.利用小於或等於20倍的放大率同時檢測所述檢測面積一部分中的信號，其中所述部分的最長線性尺寸大於1mm。
2.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)之前，在使類目結合分子與所述靶上的類目特異性結合位點特異性結合的條件下，使所述靶與類目結合分子接觸，從而形成複合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中用一個或多個信號傳遞部分直接或間接標記類目結合分子。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述檢測是檢測所述複合物。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品與信號傳遞部分接觸，該信號傳遞部分與所述靶細胞直接或間接締合。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述複合物以小於10個複合物/mm2檢測面積的密度隨機分散在檢測區中。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶以小於1個複合物/mm2檢測面積的密度隨機分散在檢測區中。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測無需放大超過5X。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述檢測無需放大超過2X。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述檢測無需放大超過1X。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述檢測無需放大超過0.2X。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶是細菌或真核生物細胞。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶是病毒。
14.根據權利要求1所述的方法，其中類目複雜度為。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述靶。
16.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶細胞包括來源於下列兩個或多個分類群的細胞病毒，細菌，真菌，植物，多細胞動物，和原生生物。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測並鑑定靶的一個以上非重疊類目。
18.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子特異性結合天然或重組的抗體或適體。
19.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子特異性結合DNA，RNA，或PNA探針。
20.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子特異性結合與核酸多態性，包括單核苷酸多態性緊鄰的位點。
21.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品含有從多細胞生物獲得的液體或組織。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述樣品含有動物的體液或組織。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述樣品來源於人類。
24.根據權利要求22所述的方法，其中所述樣品來源於非人脊椎動物。
25.根據權利要求22所述的方法，其中所述樣品是下列的一員、或來源於呼吸道，泌尿生殖道，生殖道，中樞神經系統，尿液，血液，皮膚，血漿，血清，唾液，創傷組織，創傷滲出物，活組織檢查物，糞便，和實體組織的樣品。
26.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品來源於植物。
27.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是通過從環境空氣或水，或與環境接觸的表面，物體，或生物採集樣品而獲得的。
28.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品選自、來源於、或從下列成分獲得在藥物，化妝品，血液，或表面或內部用於人或動物中的其它產品的製造過程中的原料，成品或半成品；食品或飲料製造過程中的原料，成品或半成品；醫療或體外診斷裝置製造過程中的原料，半成品或成品；化學品；工業表面；儀器；和機械。
29.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法檢測一種或多種物質或處理對所述靶細胞的作用。
30.根據權利要求1所述的方法，其中選擇法用於將所述靶沉積在所述檢測表面上，且其中所述選擇法是磁性選擇，離心，沉降，和過濾。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述方法包括使樣品接觸與類目結合分子偶聯的磁性粒子。
32.根據權利要求30所述的方法，其中在不使用選擇部分的情況下，利用所述選擇法中的一種使靶沉積在所述檢測區中。
33.根據權利要求30所述的方法，其中所述靶與靶特異性選擇部分在液體中接觸，該靶特異性選擇部分的平均密度大於所述液體的平均密度，且隨後利用重力，離心力，或向心力在所述檢測表面上沉積。
34.根據權利要求1所述的方法，其中處理所述樣品使其液化和/或均化。
35.根據權利要求1所述的方法，其中所述接觸發生在液相中。
36.根據權利要求1所述的方法，其中所述接觸發生在液相和固相之間的界面上。
37.根據權利要求1所述的方法，其中處理所述樣品，從而將所述靶之外的物質或物體除去。
38.根據權利要求2所述的方法，其中在所述接觸之前，將所述靶固定在所述檢測表面上。
39.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶通過與檢測區的基質或底物結合的類目結合分子而特異性結合在檢測區中。
40.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶通過與檢測區的基質或底物形成化學鍵而特異性結合在檢測區中。
41.根據權利要求1所述的方法，其中利用選自風乾、熱固定、和化學固定法的方法將所述靶固定在所述檢測區中。
42.根據權利要求2所述的方法，其中處理所述樣品，從而使所述靶上的類目特異性結合位點更容易與所述類目結合分子接觸。
43.根據權利要求3所述的方法，其中在所述檢測之前，除去所述複合物中的未結合信號傳遞部分。
44.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分具有光子信號傳遞特徵，且其中可加入膠態或可溶性物質來吸收由不在所述檢測區中的信號傳遞部分發射的信號。
45.根據權利要求1所述的方法，其中將所述樣品細分成用於平行測試靶的不同非重疊類目的存在的各個等分試樣。
46.根據權利要求45所述的方法，其中使每份等分試樣與標記粒子群接觸，而所述標記粒子群與類目結合分子的不同非重疊家族偶聯。
47.根據權利要求45所述的方法，其中所述樣品與特異性結合靶實體的非重疊類目的類目結合分子不同家族連續接觸。
48.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測區包括選自固體玻璃，固體塑料，微量滴定平板孔的表面，吸水薄膜，塑料帶，毛細管的表面，微流室的表面和微流通道的表面的物質。
49.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法包括側流色譜法。
50.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法自動在一系列樣品上重複。
51.根據權利要求50所述的方法，其中所述樣品可自動加樣到包括所述檢測工具的儀器上。
52.根據權利要求50所述的方法，其中所述樣品可自動沉積在一系列檢測區中，其中所述一系列檢測區在物理上關聯，並可自動連續加樣到包括所述檢測工具的儀器上。
53.根據權利要求3所述的方法，其中所述方法檢測由於所述複合物的照射而發射，散射，反射，或吸收的光。
54.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測螢光。
55.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測非照射的化學發光。
56.根據權利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括一束或多束雷射。
57.根據權利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括一個或多個發光二極體。
58.根據權利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括白光源。
59.根據權利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括一個或多個濾光器，該濾光器適合用波長適於檢測所述複合物的光照射所述樣品。
60.根據權利要求3所述的方法，其中所述照射工具包括一個或多個濾光器，該濾光器適合用波長適於檢測所述信號傳遞部分的光照射所述樣品。
61.根據權利要求3所述的方法，其中用於檢測所述發射、散射、透射、或吸收光的工具包括濾光器，該濾光器適於檢測源於所述信號傳遞部分的照射的信號。
62.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測熱輻射。
63.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測吸光度。
64.根據權利要求63所述的方法，其中所述吸光度是指紅外區中的。
65.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測螢光。
66.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測細胞自發螢光。
67.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測螢光偏振。
68.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測光反射。
69.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測光散射。
70.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測拉曼散射。
71.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子直接或間接與標記粒子偶聯。
72.根據權利要求71所述的方法，其中所述標記粒子小於20微米。
73.根據權利要求71所述的方法，其中所述標記粒子小於10微米。
74.根據權利要求73所述的方法，其中所述標記粒子小於5微米。
75.根據權利要求74所述的方法，其中所述標記粒子小於1微米。
76.根據權利要求75所述的方法，其中所述標記粒子小於100nm。
77.根據權利要求76所述的方法，其中所述標記粒子小於10nm。
78.根據權利要求71所述的方法，其中所述標記粒子含有平均密度大於或等於2個酶信號傳遞部分/立方微米粒子體積的酶信號傳遞部分。
79.根據權利要求71所述的方法，其中所述含有信號傳遞部分的標記粒子是用信號傳遞部分染色或與信號傳遞部分偶聯的粒子，所述信號傳遞部分具有螢光信號特徵，並選自有機螢光團，上調型磷光體，鑭系元素，量子點，和從非螢光底物產生螢光產物的酶。
80.根據權利要求71所述的方法，其中所述標記粒子是膠乳粒子，二氧化矽粒子，量子點，共振光散射粒子，向上轉換型磷光體，或主要由金或銀組成的粒子。
81.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分是酶信號傳遞部分。
82.根據權利要求81所述的方法，其中所述信號傳遞部分是鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
83.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分選自有機螢光團，上調型磷光體，鑭系元素，量子點，以及從非螢光底物產生螢光產物的酶。
84.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分具有螢光信號傳遞特徵。
85.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分具有化學發光信號傳遞特徵。
86.根據權利要求85所述的方法，其中所述分子是acridinium酯。
87.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分具有產色信號傳遞特徵。
88.根據權利要求3所述的方法，其中所述信號傳遞部分具有光散射信號傳遞特徵。
89.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子包括抗體。
90.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子包括適體。
91.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子包括核酸或肽核酸。
92.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子包括配體。
93.根據權利要求2所述的方法，其中所述類目結合分子包括分子量小於100kD的分子。
94.根據權利要求93所述的方法，其中所述類目結合分子包括分子量小於10kD的分子。
95.根據權利要求94所述的方法，其中所述類目結合分子包括分子量小於1kD的分子。
96.根據權利要求2所述的方法，其中所述樣品與所述類目結合分子的整體接觸，其中所述整體包括對所要檢測的靶實體的每個非重疊類目特異的其中一個類目結合分子家族。
97.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子的所有家族都用信號傳遞部分標記，該信號傳遞部分可發射相同信號特徵和信號傳遞種類的信號。
98.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子的每個家族是用發射不同種類信號的信號傳遞部分標記的。
99.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子整體的家族複雜度為1。
100.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子整體的家族複雜度大於1。
101.根據權利要求100所述的方法，其中所述整體的家族複雜度≥5。
102.根據權利要求101所述的方法，其中所述整體的家族複雜度≥10。
103.根據權利要求102所述的方法，其中所述整體的家族複雜度≥20。
104.根據權利要求96所述的方法，其中所述整體含有至少10種不同類型的類目結合分子。
105.根據權利要求104所述的方法，其中所述整體含有至少50種不同類型的類目結合分子。
106.根據權利要求96所述的方法，其中類目結合分子的每個類目特異性家族含有至少2種不同的類目結合分子。
107.根據權利要求106所述的方法，其中每個類目特異性家族含有至少10種不同的類目結合分子。
108.根據權利要求96所述的方法，其中所述靶細胞的非重疊類目是通過它們在所述檢測面積中的差別定位鑑定的。
109.根據權利要求96所述的方法，其中類目結合分子的每個家族具有相同的信號標誌。
110.根據權利要求96所述的方法，其中所述靶細胞的非重疊類目是通過檢測並區別由所述信號傳遞部分賦予所述類目結合分子的類目特異性家族的不同信號標誌而鑑定的。
111.根據權利要求1所述的方法，其中所述標記粒子含有不同的群體，其中每個群體與類目結合分子的不同非重疊家族偶聯。
112.根據權利要求96所述的方法，其中所述每個家族特異性結合靶的類目，該靶的類目特異性結合類目結合分子的家族，而該類目結合分子的家族與檢測區的一部分穩定結合，其中與檢測區結合的所述每個家族結合不同的位點，其中所述位點可通過所述檢測區別。
113.根據權利要求96所述的方法，其中所述每個家族具有相同的信號傳遞種類和信號傳遞標誌。
114.根據權利要求96所述的方法，其中所述每個群體具有不同的信號傳遞標誌或信號傳遞種類。
115.根據權利要求96所述的方法，其中所述方法包括適於區別所述類目結合分子家族的信號標誌的濾光器。
116.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子家族的家族複雜度大於1。
117.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子家族的家族複雜度≥5。
118.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子家族的家族複雜度≥10。
119.根據權利要求96所述的方法，其中所述類目結合分子家族的家族複雜度≥20。
120.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測發生在容器中，該容器是條形碼或用於自動追蹤樣品的等同標記。
121.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測發生在具有登記標記的表面上，便於多個像在同一表面上排列。
122.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法可檢測檢測區的指定區域中的對照標記或對照細胞。
123.根據權利要求53所述的方法，其中用於檢測所述發射，散射，透射，或吸收光的工具包括濾光器，該濾光器適於檢測源於所述複合物的照射的信號。
124.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電檢測器的使用。
125.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電陣列檢測器的使用。
126.根據權利要求125所述的方法，其中所述光電檢測器包括CCD或CMOS檢測器。
127.根據權利要求53所述的方法，其中所述用於檢測發射，散射，或吸收光的工具不包括像增強器。
128.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電倍增管檢測器的使用。
129.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電二極體檢測器的使用。
130.根據權利要求1所述的方法，其中檢測和鑑定所述靶的工具包括光敏膠片。
131.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測包括直接目測。
132.根據權利要求1所述的方法，其中靶的數目是通過分析由所述檢測獲得的像而從所述檢測推斷的。
133.根據權利要求1所述的方法，其中靶的類目是使用像分析軟體根據所述檢測推斷的。
134.根據權利要求123所述的方法，其中所述像分析軟體還包括用於分辨由所述複合物產生的信號與其它信號的功能。
135.一種檢測樣品中靶細胞的方法，其中所述靶細胞a.在至少兩個正交維數中的測量值小於50微米，且b.以小於100個靶細胞/mm2的密度隨機分散在基本處於一個平面上的檢測面積中，c.其中所述方法包括在不照射的條件下，使用不包括像增強器的光電檢測器同時檢測所述檢測面積一部分中的靶實體，其中所述部分的最長線性尺寸大於1mm。
136.一種檢測樣品中靶細胞的方法，其中所述靶細胞a.在至少兩個正交維數中的測量值小於50微米，且b.以小於100個靶細胞/mm2的密度隨機分散在含有檢測面積、基本處於一個平面上的檢測表面中，c.其中所述方法同時檢測所述檢測面積一部分中的靶細胞，其中所述部分的最長線性尺寸大於1mm，且其中所述檢測不包括i.使用光檢測器，或ii.照射所述檢測面積，iii.細胞或病毒培養。
全文摘要
本發明提供快速並靈敏地鑑定醫學、工業、和環境樣品中的細胞和病毒靶的有效方法。本發明標記靶，然後利用大面積成像檢測它們。基於本發明的診斷試驗是快速、超靈敏、定量、多路、且自動化的。該試驗可使樣品製備減到最少，而且無需核酸擴增或細胞培養。本試驗可檢測多種細胞和病毒。基於本發明的試驗可提供核酸擴增試驗的高水平靈敏度，用戶容易掌握使用，而且可提供免疫測定法的速度，以及由微生物試驗提供的低成本及量化。本發明實現現有診斷技術的最佳特徵，同時解決了診斷系統中的缺陷。
文檔編號G01N15/14GK1606691SQ02822090
公開日2005年4月13日 申請日期2002年9月6日 優先權日2001年9月6日
發明者D·史特勞斯 申請人:基因描繪系統有限公司