微量核酸釋放劑的製作方法
2024-04-04 23:21:05
專利名稱：微量核酸釋放劑的製作方法
技術領域：
本項發明屬醫學生物技術生物製品領域。發明的微量核酸釋放劑在世界上首先實現「一步B肝病毒DNA提取」操作，即微量核酸釋放劑與微量待測血清直接進入PCR擴增管，不需離心，不需振蕩，只需一個吸頭即可完成B肝病毒DNA(HBV DNA)提取，使B肝病毒DNA定量檢測真正實現一室化「無汙染」、「快速」及「重複性良好」的PCR檢測。
背景技術：
目前常用的HBV DNA提取方法有(1)煮沸發將50μl～100μl的病毒裂解液與50μl～100μl待測血清振蕩混勻，100℃煮沸10min，4℃放置30min～60min，高速離心，吸取上清液進行PCR擴增。(2)濃集煮沸法將100μl～200μl的病毒促沉液與50μl～100μl待測血清振蕩混勻，高速離心10min，使病毒顆粒沉澱，棄去上清液，收集沉澱病毒，然後加入病毒裂解液，100℃煮沸10min，高速離心5min～10min，吸取上清液進行PCR擴增。(3)Trizol裂解提取法將300μl～500μl Trizol裂解液與100μl～150μl待測血清充分混勻，加入氯仿混勻後離心使分層，取上層液體與異丙醇混勻使DNA沉澱，用75％的乙醇洗滌1次，65℃烤乾10min，加洗脫液溶解，吸取上清液進行PCR擴增。以上3種方法需經2～5次的離心、3～7次的開蓋等開放操作，提取30個標本的DNA約需1～3個小時，需嚴格的實驗要求，不但費時費力，易導致操作過程中的汙染、並且導致核酸丟失的因素較多、檢測結果重複性較差。
發明內容
本項目發明的「微量核酸釋放劑」，使HBV DNA完全釋放到液相，而且將待測血清中的蛋白等物質封閉沉澱，消除其對PCR擴增的幹擾，使血清直接從採血管中進入PCR擴增管，不需離心、不需振蕩、只需一個吸頭即可完成DNA的提取過程。整個處理過程只需15min左右，不但操作快速、簡便，更重要的避免了操作過程中的汙染問題，並且檢測結果具有良好的重複性，準確反映血清中病毒的含量，可使B肝病毒DNA定量檢測實現「一室化」檢測。該技術若能推廣應用將導致PCR檢測的一場革命，對全面提高我國的HBV DNA診斷技術具有重要意義。
具體實施例方式
將3μl核酸釋放劑和3μl待測血清直接加到PCR擴增管中，輕輕混勻，加30μl無菌石蠟油，置PCR擴增儀99℃處理10min→4℃置1min，直接加入PCR擴增液，進入擴增程序。
權利要求
1.按權利要求規定，「一步法」B肝病毒DNA提取，其特徵是3μl本項發明的微量核酸釋放劑和3μl待測血清混勻，置99℃處理10min到4℃放置1min，直接加入PCR反應液，進入PCR擴增程序。
2.本項發明的微量核酸釋放劑具有使血清中蛋白質封閉沉澱的作用，從而對PCR擴增無幹擾。
全文摘要
技術領域本項發明屬醫學生物技術生物製品領域。技術問題微量核酸釋放劑(MNRR)組成如下1N的氫氧化鈉、0.01％Triton X－100、5mg/L的蛋白酶K、0.001％的石綠及0.01％的明膠；將待測血清直接加到PCR擴增管中，可使用血清質控品與血清樣本在同時進行核酸釋放和擴增。技術方案MNRR可使血清蛋白等幹擾PCR擴增的物質封閉、沉澱且使HBV DNA充分析出。操作步驟將3μl核酸釋放劑和3μl待測血清直接加到PCR擴增管中，輕輕混勻，加30μl無菌石蠟油，置PCR擴增儀85℃處理10min→4℃置1min，直接加入PCR擴增液，進入PCR擴增程序。用途實現標準質控品與待測標本同步提取和擴增，避免反覆離心和開蓋所引起的汙染和核酸丟失，實現PCR檢測的「一步法」和「一室化」操作。
文檔編號C12Q1/68GK1621529SQ200310116699
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月27日 優先權日2003年11月27日
發明者王海濱 申請人:王海濱