從聚醯胺製備物中除去不需要的單醯胺化合物的方法

2024-04-05 11:27:05

專利名稱：從聚醯胺製備物中除去不需要的單醯胺化合物的方法
1.發明領域本發明涉及從聚合的醯胺或聚醯胺製備物中除去不需要的單醯胺化合物，如使用能從聚合製備物中除去單體化合物的誘導微生物株的純培養物來從約2到小於6的pH的聚丙烯醯胺製備物中除去不需要的丙烯醯胺單體的方法。
2.發明背景腈是可用於合成各種各樣的化合物，包括胺、醯胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亞胺和雜環的用途極多的化合物。商業上最重要的腈之一是乙腈，它是一種常用溶劑。其它腈化合物被用作除草劑或用於合成去汙劑或防腐劑。另一種商業上最重要的腈是丙烯腈，它被用來製造丙烯醯胺、丙烯酸、丙烯酸纖維、共聚物樹脂和腈橡膠。
一種生產丙烯腈的方法是使用SOHIO/BP過程，它需要在催化劑存在下，通過空氣中的氨蒸汽對丙烯直接進行氨氧化反應(a/k/a丙烯)(一般見丙烯腈，1979，加工經濟學計劃報告，Stanford Research International，Menlo Park，CA；Weissermel和Arpe，1978，工業有機化學，Verlag Chemie-Weinheim New York，pp.266-270)。這種加工得到的廢液中含有腈的複雜混合物，包括高濃度的二腈、醯胺和酸。更具體說，廢液一般含有乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富馬腈等腈和丙烯醯胺。另外，常常存在各種濃度和/或高濃度的氰化物。廢液常含有高濃度和/或各種濃度的硫酸銨。這種有害廢液由於其毒性，不能釋放入環境，而且在美國，常通過注入地下巖層的深井來埋掉。這種埋藏不能被認為是廢液「處理」，而只是類似於填埋過程。
在美國之外，通過將廢液稀釋到約250ppm或更低的低總腈濃度，並用常規通氣生物廢液系統(即活性汙水汙泥)處理(在潮溼/空氣氧化除去揮發物，並部分氧化許多有機組分後)來「處理」丙烯腈生產中的廢液已是一般慣例。由於下列理由，這種「處理」方法並不適於充分處置腈生產設備廢液(1)潮溼/空氣氧化導致揮發性化合物揮發，產生了空氣汙染問題；(2)廢液的稀釋需要大型廢水處理設備來解決獲得充分「處理」所需的流動和長停留時間；和(3)潮溼/空氣氧化聯合活化汙水汙泥生物處理導致高處理費用。在腈生產工業中對高效的、成本實在的、環境保護良好的處置腈生產廠廢液的方法，仍有長期和急切的需要。
早已知道，某些微生物可用於將腈化合物生物轉化成其對應的醯胺或酸化合物。科學和專利文獻有許多描述轉化腈的微生物在生產具體化學藥品，如從丙烯腈生產醯胺和丙烯酸或丙烯酸酯中的用途。一般見，Kobayshi等，1992，生物技術趨勢，10402-408。已顯示，轉化腈的微生物含有包括腈酶(將腈化合物轉化成其對應酸化合物)；腈水解酶(將腈化合物轉化成其對應醯胺化合物)；和醯胺酶(將醯胺化合物轉化成其對應酸化合物)等活性。
然而，對於本發明者的知識，在所有這些使用腈降解微生物的具體化學生產中，只有一種化合物已被用來誘導相關活性和僅轉化了一種腈化合物來生產一種所需具體化合物。
2.1.能利用腈化合物的微生物文獻含有某些參考文獻，它們公開了許多可利用腈或醯胺化合物作為碳和/或氮的唯一來源的微生物。
例如，Asano等，1982，農業生物化學，461165-1174描述了一種能用乙腈作為唯一碳和氮來源生長的節桿菌(Arthrobacter)。
Nawaz等，1989，43rdPurdue Ind.Waste Conf.Proc.，pp251-256(Nawaz，1989)，描述了能利用各種腈化合物，包括乙腈，作為碳和能量的唯一來源的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的分離。然而，該菌株不能利用其它腈化合物，如丙烯腈、丙烯醯胺、苄腈和丙二腈。
Nawaz等，1992，應用環境微生物學，5827-31(Nawaz)，描述了一種在用苄腈馴化後，能降解苄腈和另一種選自丁腈、乙腈、戊二腈、丙腈、琥珀腈和甲基丙烯腈的混合物的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pnoeumonia)NCTR1菌株。和不需要存在芳族腈的目前誘導方法完全相反，Nawaz的微生物需要苄腈來誘導降解苄腈和另一種腈的混合物的活性。另外，而且更重要的是，為了實現任何腈混合物的降解，苄腈必須存在。因為腈生產設備的廢液中不含苄腈，Nawaz公開的這種微生物和方法將是完全不實際的，而且實際上，對於處理這種廢液是無效的。
Chapatwala等，1993，應用生物化學，生物技術39/40655-666，描述了能利用乙腈作為碳和氮唯一來源的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)菌株的分離。然而，沒有公開該菌株對任何其它含腈化合物的利用。
Narayanasamy等，1990，印度實驗生物學雜誌，28968-971，公開了節桿菌亞種對丙烯腈、乙腈、丙烯醯胺和乙醯胺的利用。但未指出該菌株能否降解二腈或腈混合物。
O』Grady和Pembroke，1994，生物技術通信1647-50，描述了土壤桿菌亞種的分離，和該分離菌株利用或分別分裂許多不同腈化合物的能力。但未指出該分離菌株能否利用或分裂腈化合物的混合物。
Martinkova等，1992，Folia Microbiol，37373-376，公開了幾種細菌菌株，包括棒狀桿菌亞種(Corynebacterium sp.)3B株和放射形土壤桿菌8/4/1株(它們能利用乙腈作為碳和氮的唯一來源)的分離。但未公開這些菌株能否利用任何其它腈化合物或腈化合物的混合物。
Nawaz等，1994，應用環境微生物學，603343-3348，描述了從被除草劑草不綠(alachlor)汙染的土壤中分離的一種臨時命名為紅球菌亞種(Rhodococcussp.)的細菌。顯示該細菌能利用丙烯腈作為碳和氮的唯一來源。
Nawaz等，1993。加拿大微生物雜誌，39207-212，描述了一種假單胞菌亞種和嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas maltophilla)的分離。它們各自都能利用丙烯腈作為碳和氮的唯一來源。
Armitage等，國際專利出版物WO 97/06248(1997年2月20日出版)，公開了通過在醯胺或醯胺前體，如腈，或其混合物存在下，在醯胺或醯胺前體形成至少20％摩爾和優選基本全部碳的連續培養、碳有限的條件下，培養合適微生物，來產生醯胺酶的方法。合適的微生物包括假單胞菌、紅球菌等。還公開了通過在腈或腈前體、或其混合物存在下，在連續培養、碳有限培養條件下培養微生物，來產生腈酶的方法。合適的微生物包括諾卡菌，紅球菌亞種，包括紅球菌ATCC 39484等。然後特別用這些誘導的酶來將腈或醯胺轉化成其對應酸。
雖然利用腈化合物的微生物可能能從一種含腈組合物中除去一種腈化合物，但並不期待用這些生物體來幫助腈生產設備處置廢液，因為腈的利用取決於對一種所用的腈化合物有特異性的腈酶或腈水解酶的表達。特異性腈酶或腈水解酶的表達並不能確保該微生物將有能力轉化腈生產設備的廢液中以高濃度存在的腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物。
2.2.包括腈生產廠廢液的腈廢料的處理許多參考文獻描述了曾嘗試提供一種微生物學方法，來從腈生產廠廢液的腈廢料中除去腈。
Kato等在美國專利號3,940,332(Kato)中描述了採用分離的細菌菌株深紅紅球菌(Nocardia rubropertincta)ATCC登錄號21930，聯合汙水處理站的活化汙泥來降解含腈和無機氰化物的廢液。Kato還指出該菌株能降解腈，包括乙腈、丙烯腈、丙腈、丁腈、丁烯腈、富馬腈、戊腈、戊二腈和苄腈，雖然未指出這些腈各自的量，或降解腈的條件，或是否可一起降解腈。未指出Kato公開的菌株能否降解或去除腈化合物的混合物的毒性。另外，Kato處理的腈廢料是低強度廢料，50-250ppm總腈濃度。另外，本發明者已測試了Kato公開的菌株，發現該菌株不能以本發明方法所達到的同樣效率從腈混合物中除去乙腈。
Sunarko和Meyer，1989，DECHMA生物技術會議，3859-862，公開了分枝桿菌UBT5、芽胞桿菌UBT2、棒狀桿菌UBT9和屈撓桿菌UBT4的凍幹細胞(其已通過使細胞在2-戊烯腈存在下生長而被誘導)能降解實驗室HPLC柱廢液中發現的少量乙腈。
Brown等，1980，水研究，14775-778，公開了以0.5ppm到5ppm濃度將丙烯醯胺加到環境的天然和汙染水中，導致丙烯醯胺的降解。
Kincannon等，1983，WPCF雜誌，55157-163公開了一種從城市活性汙水處理站分離到的微生物混合物在一個月的馴化期後，能降解丙烯腈。另外，該作者還顯示了該微生物混合物同樣能降解丙烯醛。
Donberg等，1992，環境毒物化學，111583-1594，公開了在土壤中發現的微生物混合物能在有氧條件下降解丙烯腈。一些混合物能在2天內降解10-100ppm的丙烯腈。然而，對於高濃度的丙烯腈(1000ppm)，降解被抑制。作者推測抑制是由於親代丙烯腈化合物的抑制作用。
Knowles和Wyatt，歐洲專利號274 856 B1和Wyatt和Knowles，1995，生物降解693-107，描述了用微生物混合物降解腈生產廠(使用丙烯腈生產的BP/SOHIO過程)廢液的腈和醯胺混合物。使用微生物混合物，而不用純培養物，是Knowles和Wyatt的方法的嚴重缺點。維持混合培養物是困難的，因為隨著反應條件的變化，在混合培養物中的某些菌株將在不同生長時間佔優勢，從而使降解效率下降。
有許多缺點與上面的參考文獻有關。例如，上述許多單個微生物菌株能降解的腈或醯胺化合物的範圍有限。降解/利用腈和醯胺化合物所需的時間是以天或周計的。另外，用傳統活性汙泥處理的方法具有其自身的缺點，如產生大量最終也需處置的生物物質。而且最重要的，使用微生物混合物，而不使用純培養物，使處置非常困難，因為難於維持該混合培養物。由於反應條件變化，混合培養物中的某些菌株將在不同的生長時間佔優勢，從而使混合培養物的特性隨時間變化，降解效率下降。混合培養物不容易再生或維持。
2.3.處理聚丙烯醯胺製備物來除去丙烯醯胺單體許多參考文獻描述了提供微生物方法，來從聚丙烯醯胺製備物中除去不需要的丙烯醯胺單體。
聚丙烯醯胺聚合物被廣泛用於許多工業，包括汙水處理、造紙、採礦和生物學和化學研究中。然而，其應用受到限制，而且不能將其用於食料有關的工業，因為它們通常被未反應的丙烯醯胺單體(它是累積性神經毒素和致癌原)汙染。一種減少未反應單體量的方法是「熱處理」方法。然而，該處理增加了製造費用，並由於產生不需要的聚合物分枝而降低了聚合物生產的效率。
另一種方法是利用從微生物獲得的醯胺酶。例如，Carver等，歐洲專利出版物EP 272,025 A2和EP 2072,026 A2，描述了用從曾加熱到溫度40℃到80℃的嗜甲基菌亞種(Methylophilis sp.)等生物體獲得的醯胺酶分解聚丙烯醯胺製備物中的丙烯醯胺。然而，Carver等描述的該方法不能在其天然pH值(即約4的天然pH)下，從陽離子聚丙烯醯胺製備物中除去丙烯醯胺單體。見EP 272,025 A2的圖6，其清楚的顯示，為了從陽離子聚合物中除去丙烯醯胺單體，必須將pH從pH4提高到pH6。
Westgrove等的美國專利號4,687,807和4,742,114描述了用於從已形成的丙烯醯胺聚合物中除去不需要的丙烯醯胺單體的醯胺酶油包水乳劑的生產。
Farrar等，歐洲專利出版物EP 329,325 A2描述了獲自表達醯胺酶的微生物的醯胺酶水凝膠，除去聚丙烯醯胺中的丙烯醯胺單體。Farrar，國際專利出版物WO 92/05205，描述了通過將醯胺酶加入用於聚(甲基)丙烯醯胺放熱聚合反應的可聚合混合物中，來減少聚合的(甲基)丙烯醯胺中殘餘的(甲基)丙烯醯胺單體。
Armitage等，國際專利出版物WO 97/06248(1997年2月20出版)，還公開了在丙烯醯胺聚合反應中或反應後，通過在醯胺或醯胺前體(如腈)，或其混合物存在下，在連續培養，碳源有限條件下(其中醯胺或醯胺前體形成至少20％摩爾和優選基本全部碳源)培養該微生物，而獲得的合適微生物中受誘導的醯胺酶，可將甲基(丙烯醯胺)轉化成甲基(丙烯酸)銨。合適的微生物包括假單胞菌、紅球菌等。然而，未提供成功的例子(其中誘導出的酶確實轉化聚丙烯醯胺製備物中的丙烯醯胺單體)，況且，未公開其轉化反應發生的pH範圍。
本申請中的第2節或任何一節引用的參考文獻或鑑定都不能被當成是承認這些參考文獻可作為本發明的現有技術。
3.發明簡述本發明提供了從聚醯胺或聚合的醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體，例如，從聚丙烯醯胺製備物中除去丙烯醯胺單體的方法。一示範性方法需要使含有丙烯醯胺單體的聚丙烯醯胺製備物(所述聚丙烯醯胺製備物具有約2到小於6的pH)，與已被多重誘導的微生物菌株的純培養物或粗抽提物接觸充分時間，通過將丙烯醯胺轉化成對應丙烯酸來減少丙烯醯胺單體的量。優選的，聚丙烯醯胺製備物具有約2到約5的pH，更優選的是約3到約4的pH。還有，聚丙烯醯胺製備物中的丙烯醯胺單體量優選被減少至100ppm以下。
可在含有腈化合物或腈和醯胺化合物的混合物的完全營養培養基上培養微生物菌株的純培養物，來多重誘導用於從聚丙烯醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的微生物菌株。另外，可在含有腈化合物或腈和醯胺化合物的混合物，作為唯一碳源和能源和/或氮源的極限培養基上培養微生物菌株的純培養物，來多重誘導用於從聚丙烯醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的微生物菌株。該多重誘導方法不需要芳族腈的存在。
在誘導後，可將微生物的純培養物儲藏一段時間，即，在正常冷藏溫度下，即，約4℃，至少4個月，在正常冷凍溫度下，即-20℃或更低，或當使用凍幹或低溫時貯藏，更長時間(年)，而不損失除去醯胺的活性。某些微生物能利用至少一種腈化合物作為碳和能量的唯一來源。某些微生物能利用至少一種腈或醯胺化合物作為碳和能量和氮的唯一來源。
根據本發明，一旦被誘導，對於除去醯胺單體，該純微生物培養物不一定必須活躍的分裂增殖，或者即使死亡也可以。這種細菌生長與除去醯胺單體的分離使得抑制生長的條件下也能快速除去不需要的醯胺單體；例如，在腈化合物非常高的濃度下，強鹼性或酸性pH，高溫，如55℃等條件下。另外，這種分離(1)意味著由於不需要細胞生長來除去醯胺單體，因此不需大量產生細胞(生物體)或細胞生產可最小化。當細胞大量生長時，還必須處理因生長而產生的廢生物物質；(2)因為細胞不再生長，可不規則的除去不起生長底物作用的化合物；和(3)該方法導致產生較少的毒性或非毒性中間產物，這種中間產物易於自然降解(在反抗中降解，毒性亦同)3.1.定義如本申請中所用，「腈」化合物將包括含有一個或多個腈基團，即C≡N基團，和除C≡N之外的至少一個碳原子。如本文使用的，術語「腈」包括丙烯醛氰醇等化合物。注意到在反應性氰化物存在下的丙烯醛以丙烯醛氰醇的形式存在。腈解毒微生物能將氰醇的腈轉化成相應的酸。例如，將丙烯醛氰醇轉化成丙烯酸。如本文所用，術語「腈」包括但不限於，乙腈、丙烯腈、富馬腈、琥珀腈、丁烯腈、己二腈、苄腈、丁腈、β-丙烯磺醯腈、異戊腈、戊腈、苯基腈、丙烯醛氰醇等。
如本申請所用，「陰離子」聚醯胺製備物是含有一條陰離子主鏈和/或側鏈基團的聚醯胺製備物，並具有淨負電荷。
如本申請所用，「陽離子」聚醯胺製備物是含有一條陽離子主鏈和/或側鏈基團的聚醯胺製備物，並具有淨正電荷。
如本申請所用，「非離子」聚醯胺製備物是不含陰離子和/或陽離子主鏈和/或側鏈基團，或如果存在一個或多個這些基團，具有淨中性電荷的聚醯胺製備物。3.2.發明目的本發明的一個目的是提供通過從pH約2至小於6的聚醯胺製備物中將醯胺單體轉化成對應的酸化合物，除去不需要的醯胺單體的方法。
本發明的其它目的和/或優點對本領域技術人員是明顯的。
4.發明詳述本發明包括通過使用一種受誘導而能將單醯胺分子轉化成酸分子的微生物菌株的純培養物，從pH約2至小於6的聚醯胺或聚合的醯胺製備物中，將醯胺單體轉化成對應的酸化合物，來除去不需要的醯胺單體的方法。
可使用任何本領域技術人員已知的方法，如用氣-液色譜和火焰電離檢測器(GLC-FID)檢測醯胺，和用高效液相層析(HPLC)檢測對應的酸化合物評估單醯胺化合物的消失，和/或對應的酸化合物的同時出現，從而監測單醯胺從製備物中的除去情況。轉化成對應的酸導致各原先存在的醯胺基團產生可化學計量的氨。可用Fawcett和Scott，1960，臨床病理學，13156-159的技術測量氨釋放量，來監測醯胺化合物轉化的程度。如果由於氨或銨鹽的存在，不能測量氨釋放，那麼可用本領域技術人員已知的方法，包括但不限於GLC-FID等來監測存在的醯胺的濃度。另外，可通過評估對應酸化合物的產生(可衍生酸化合物並用GLC-FID檢測衍生產物來監測)來測定醯胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲矽烷基化，可衍生醯胺和酸，用於GLC-FID分析(常見，Supelco層析產物分類，1997，653-656頁(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
然後，如需要，可將酸和其它非聚醯胺化合物進一步降解成CO2、H2O和生物物質。
為了公開內容清晰，和不受限制，將本發明分成下面幾節予以詳述(1)誘導和鑑定具有去除醯胺能力的微生物菌株的方法；(2)分離的微生物菌株的特徵分析；和(3)除去醯胺單體所用的誘導的微生物菌株的應用和方法。
4.1.誘導和鑑定具有除醯胺能力的微生物菌株的方法通過在腈化合物的混合物存在下，或腈和醯胺化合物的混合物存在下培育某微生物菌株，可分離並獲得用於從聚醯胺或聚合醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體化合物的微生物菌株。驚人的是已發現，為了誘導廣譜去除醯胺的能力，即去除各種單醯胺的能力，必須用一種以上腈化合物補充培養基。更具體的說，已發現可使用腈和醯胺化合物的混合物來誘導微生物除去廣譜單醯胺的能力。多重誘導後，純培養菌株能從聚醯胺或聚合的醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體化合物。所選的受誘導的微生物菌株可選自己知來源，或可以是新分離的微生物，還可以是嗜熱的或其它嗜極端細菌，如嗜滷素菌或嗜酸菌。有利的是，多重誘導方法不需要芳族腈，如苄腈。
已注意到，能被多重誘導而具有去除醯胺單體能力的微生物看來在含有腈或醯胺作為碳的唯一來源或作為碳和氮的唯一來源的培養基中，與在含有易於利用的碳源如糖類等的培養基的生長比較時，生長較慢。優選的，將可被多重誘導而具有去除醯胺單體能力的微生物菌株培養在含有易於利用的碳源(如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乙酸酯、苯甲酸酯等)的培養基中。以遞增量或連續加入碳和氮源，從而使反應體系中的碳和氮水平低於1％。以這種方式可迅速和低廉的產生大量細胞。一旦達到所需的細胞量，可根據在下文4.1.1或4.1.2節中描述的方法多重誘導該微生物，例如在一個生產循環的最後20個小時中。
4.1.1.使用腈或腈和醯胺化合物和完全營養培養基的誘導一種誘導去除醯胺單體能力的方法包括使用補充了腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物的完全營養培養基。更具體的說，該方法包括在補充了腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物的完全營養培養基中培養微生物，並收集培養的微生物。當在瓊脂平板上培養時，在腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物存在下，培養該微生物約24到48小時。當在發酵罐中培養時，在加入腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物之前，在完全營養培養基中培養該微生物1到48+小時，優選1到20小時，更優選16到20小時；然後在加入腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物4到5個小時後收集該微生物。如果需要更大的生物量，可在加入腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物之前，在發酵罐中更長時間的培養該微生物。如本領域技術人員所知，如需要可加入額外的營養物來維持生長。
在另一個方法中，在補充了腈化合物的混合物的完全營養培養基中誘導微生物。有用的腈化合物的混合物包括下列約50到約500ppm的乙腈；約50到500ppm的丙烯腈；和約25到約100ppm的琥珀腈。可任選的，可在混合物中加入約1-10ppm的KCN或NaCN。雖然不是要受任何具體機制的限制，本發明人相信，誘導過程中KCN或NaCN的存在使微生物對無機氰化物馴化。另外可任選的，可在混合物中加入約1-25ppm濃度的鈷。還可任選的，可在混合物中加入濃度約1-10克/升的尿素。
優選的，用含有濃度各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各約50ppm的琥珀腈和富馬腈的腈化合物的至少一種的混合物補充完全營養培養基。更優選的，腈混合物含有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度約50ppm的琥珀腈。可任選的，在培養基中加入濃度各約10ppm的KCN和鈷，和濃度約7克/升的尿素。而更優選的，用各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和約50ppm濃度的琥珀腈，各約10ppm的KCN和鈷，和約7g/l的尿素補充完全營養培養基(它是BACTOTMR2A培養基(Difco，Detriot，Michigan)，或YEMEA培養基、或含有YEMEA各成分的比率，但不含瓊脂的培養基。
在另一種方法中，在補充了腈和醯胺化合物的混合物的完全營養培養基中誘導微生物。有用的腈和醯胺化合物的混合物包括(1)約25到100ppm的琥珀腈，約50到150ppm的乙腈和約50到150ppm的丙烯腈中的至少一種；和(2)約50到500ppm的乙醯胺和約50到500ppm的丙烯醯胺。可任選的，可以約1到10ppm加入KCN或NaCN。也可任選的，以約1到25ppm加入鈷，而且可以約1-10克/升加入尿素。優選的，用50ppm琥珀腈和各150ppm的乙醯胺和丙烯醯胺補充完全營養培養基。
完全營養培養基是為微生物提供了所有生長必需的營養物，如碳，和/或氮的生長培養基。例如，但不是為了限制，含有葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4、MgSO4、酪蛋白胺基酸、酵母抽提物、可溶性澱粉和丙酮酸鈉的BACTOTMR2A培養基(Difco，Detroit，Michigan)是一種合適的完全營養培養基。另一種可用於本發明的完全營養培養基是YEMEA培養基，它含有葡萄糖、麥芽抽提物和酵母抽提物，而不含瓊脂。另一種用於本發明的完全營養培養基是含有葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4、MgSO4、可溶性澱粉和丙酮酸鈉的完全營養培養基。可使用本領域技術人員已知的任何完全營養培養基。
在包括3.0和11.0之間的pH，優選約6.0和8.0之間；4℃和55℃之間的溫度，優選約15℃和37℃之間的條件下培養微生物。另外，溶氧張力應在0.1％和100％之間，優選4％和80％，更優選4％和30％之間。可監測溶氧張力，並以空氣、純氧、過氧化物、和/或其它能釋放氧的過氧組合物形式提供氧，而將其維持在所需範圍內。
在培養期末，通過刮、離心、過濾等，或通過本領域技術人員已知的方法收集並濃縮培養的微生物。
在一個示範性方法中，4℃收集細胞，將其製備成細胞濃縮液，然後快速冷凍(乾冰和乙酮)，然後儲藏在-20℃或以下。可使用冷凍細胞濃縮液或然後可將其固定。
一旦根據上述方法多重誘導，可通過在培養的微生物中加入一種或多種底物來穩定所收集的微生物的除醯胺單體能力。雖然不是要受任何機制所限，本發明人注意到，醯胺酶通常在底物存在時最穩定，這是本領域技術人員熟知的。因此，例如加入酸性化合物，如異丁烯酸，能穩定醯胺酶，使其活性能長期保持。
可將誘導的微生物固定在聚丙烯醯胺或丙烯醯胺塊中，或固定在已與聚乙烯亞胺交聯的海藻酸鹽中，來實現穩定化。優選固定在與聚乙烯亞胺交聯的海藻酸鹽中來穩定細胞。
4.1.2.使用腈或腈和醯胺化合物和極限培養基的誘導另一種誘導去除醯胺單體能力的方法包括使用補充了腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物的極限培養基。更具體的說，該方法包括在補充了腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物的極限培養基中培養微生物，並收集培養的微生物。當在瓊脂平板上培養時，將微生物培養約24到48小時。當在發酵罐中培養時，在補充了腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物的極限培養基中培養微生物1到48+小時，優選1到20小時，更優選16到23小時；然後在加入腈化合物的混合物或腈和醯胺化合物的混合物後4到5個小時收穫。如果需要更大的生物量，可在發酵罐中更長時間的培養微生物。
有用的腈化合物的混合物包括約50到約500ppm的乙腈；約50到500ppm的丙烯腈；和約25到約100ppm的琥珀腈。可任選的，可在混合物中加入1-10ppm的KCN或NaCN。還可任選的，可在混合物中加入約1-25ppm濃度的鈷。也可任選的，可在混合物中加入濃度約1-10克/升的尿素。
優選的，用含有濃度各約150ppm的乙腈和丙烯腈的至少一種，和濃度各約50ppm的琥珀腈和富馬腈的腈化合物的混合物補充極限培養基。更優選的，腈混合物含有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度約50ppm的琥珀腈。可任選的，在培養基中加入濃度各約10ppm的KCN和鈷，和濃度約7克/升的尿素。
在另一種方法中，在補充了腈和醯胺化合物的混合物的極限培養基中誘導微生物。有用的腈和醯胺化合物的混合物包括(1)約25到100ppm的琥珀腈，約50到150ppm的乙腈和約50到150ppm的丙烯腈中的至少一種；和(2)約50到500ppm的乙醯胺和約50到500ppm的丙烯醯胺。可任選的，可以約1到10ppm加入KCN或NaCN。也可任選的，以約1到25ppm加入鈷，而且可以約1-10克/升加入尿素。優選的，用50ppm琥珀腈和各150ppm的乙醯胺和丙烯醯胺補充極限培養基。
極限培養基是營養不完全的培養基，它不向微生物提供其生長所需的有機碳。因此，必須用微生物能用作碳源和/或能源的化合物補充極限培養基。例如，但不是為了限制，Stanier’s極限培養基(Stanier等，1966，遺傳微生物學雜誌，43159-271)和磷酸緩衝鹽(PBS)是可接受的用於該誘導方法的極限培養基。
在包括3.0和11.0之間的pH，優選約6.0和8.0之間；4℃和55℃之間的溫度，優選約15℃和37℃之間的條件下培養微生物。另外，溶氧張力應在0.1％和100％之間，優選4％和80％，更優選4％和30％之間。可監測溶氧張力，並以空氣、純氧、過氧化物、和/或其它能釋放氧的過氧組合物形式提供氧，而維持其在所需範圍內。
在培養期末，通過刮、離心、過濾等，或通過本領域技術人員已知的方法收集並濃縮培養的微生物。
一旦根據上述方法多重誘導，可通過在培養的微生物中加入一種或多種底物來穩定所收集微生物的去除醯胺單體能力。雖然不是要受限於任何機制，本發明人注意到，醯胺酶通常在底物存在時最穩定，這是本領域技術人員熟知的。因此，例如加入酸性化合物，如異丁烯酸，能穩定醯胺酶，使其活性能長期保持。
可通過將誘導的微生物固定在聚丙烯醯胺或丙烯醯胺塊中，或固定在已與聚乙烯亞胺交聯的海藻酸鹽中，來實現穩定化。優選固定在與聚乙烯亞胺交聯的海藻酸鹽中來穩定細胞。
4.1.3.有用的微生物的鑑定根據一個實施例，本發明提供了篩選微生物，來鑑定和分離可用於從聚醯胺或聚合的醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體化合物的方法。該方法通常需要將測試微生物暴露於上文4.1.1和4.1.2節中所述的，用來多重誘導去除醯胺能力的條件下，然後評估推測已受到「誘導」的測試微生物從聚醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的能力。
篩選可用於從聚醯胺製備物中除去醯胺單體的微生物的方法包括在補充了腈化合物的第一混合物(見上文4.1.1和4.1.2節)的完全營養培養基或極限培養基中，在瓊脂平板上，有利生長的條件下培養測試的微生物約24到48小時，來獲得推定性誘導的微生物；並使所述微生物與含有醯胺單體的聚醯胺製備物接觸，和監測醯胺單體的消失，來評估推測已受到誘導的微生物從聚醯胺製備物中除去醯胺單體的能力，其中製備物中醯胺單體化合物的消失表明，測試微生物具有從聚醯胺製備物中除去醯胺單體化合物的能力。優選的，聚醯胺製備物含有聚丙烯醯胺和單體丙烯醯胺，而所有醯胺單體在約30分鐘內消失表明，測試微生物具有從聚醯胺製備物中除去醯胺單體的能力。最優選的，聚醯胺製備物中所有醯胺單體在約10分鐘內消失表明該微生物具有所需的能力。如果需要微生物在硫酸銨存在下，具有除去醯胺單體的能力，可在第二混合物中包括約1-8％的硫酸銨。
根據本發明的一個優選例，用含有濃度各為150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各約50ppm的琥珀腈和富馬腈的至少一種的混合物的腈化合物的第一混合物補充完全營養或極限培養基。更優選的，腈的第一混合物含有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度約50ppm的琥珀腈。可任選的，在培養基中加入濃度約10ppm的KCN。
根據該優選例的另一個優選模式，用腈和醯胺化合物的第一混合物(見上文4.1.1和4.1.2節)補充完全營養或極限培養基。
上文4.1.1和4.1.2節中描述了有用的完全營養培養基和極限培養基。在包括pH約2.0和11.0之間，優選約2.0和小於6.0之間；和約4℃和55℃之間的溫度，優選約15℃和37℃之間的條件下培養試驗微生物。
可使用Fawcett和Scott，1960，臨床病理學雜誌，13156-159的技術測量氨釋放，來監測除去單醯胺化合物的程度。如果由於存在氨或銨鹽，而不能測量氨釋放，可通過本領域技術人員已知的方法，包括但不限於，GLC-FID等來監測存在的醯胺濃度。另外，可通過評估對應酸化合物的產生((可衍生酸化合物並用GLC-FID檢測該衍生產物來監測)來測定醯胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲矽烷基化，可衍生醯胺和酸，用於GLC-FID分析(常見，Supelco層析產物分類，1997，653-656頁(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
4.2.微生物菌株的特徵確定已發現，下文所述的從已知來源分離或獲得的微生物菌株，在如上文4.1節所述多重誘導後，具有使醯胺單體化合物轉化成對應的酸化合物，而從聚醯胺製備物中除去醯胺單體化合物的能力。
下文表I和II給出了兩種紅球菌菌株，DAP 96622和DAP 96253(分別衍生自從美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD，ATCC登錄號33278和ATCC登錄號39484獲得的兩種菌株，已發現它們在如上所述多重誘導後，具有使醯胺單體轉化成對應酸化合物，而從聚醯胺製備物中除去醯胺單體的能力)的某些特異性菌株特徵。在一個說明性例子中，用各150ppm的丙烯腈、乙腈，和50ppm琥珀腈，用或不用50ppm KCN多重誘導了這兩種紅球菌菌株。
用普通細菌學方法手冊，1981，Philip Gerhardt，編，Am.Soc.Microbiol.，Washington，D.C.中描述的方案進行了糖利用試驗。通過將微生物在補充了各150ppm的乙腈和丙烯腈，和50ppm琥珀腈的完全營養培養基上培養，來誘導菌株後，進行了腈利用試驗。在補充有特定的試驗化合物作為碳和/或能量的唯一來源的極限培養基上進行了實際利用試驗。
表I紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)株DAP 96622差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 無變化生長於 5℃ (-)25℃ (+)35℃ (+)45℃ (+)利用 葡萄糖 (+)蔗糖 (+)果糖 (+)乳糖 (+)甘露糖醇 (+)甘露糖 (+)阿拉伯糖 (-)肌醇 (+)，無氣體鼠李糖 (+)，無氣體脲酶(-)腈降解 (-)明膠水解(-)抗生素抗性慶大黴素 S紅黴素 S鏈黴素 S妥布拉黴素 S利福黴素 S青黴素 S
四環素 S對碳和氮的利用含有腈作為唯一碳和氮源的Stanier’s極限培養基丙烯腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)乙腈 (150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)富馬腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)丙烯腈/乙腈/琥珀腈(各150ppm/300ppm)(+)/(+)丙烯腈/乙腈/富馬腈(各150ppm/300ppm)(+)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈/富馬腈 (各150ppm/300ppm)(-)/(-)碳源利用含1g/l硫酸銨的Stanier’s極限培養基P-甲酚(150ppm/300ppm) (+)/(+)甲苯 (150ppm/300ppm) (NT)/(NT)苯乙烯(150ppm/300ppm) (NT)/(NT)甲苯/苯乙烯 (各150ppm/300ppm)(NT)/(NT)乙酸酯(150ppm/300ppm) (+)/(+)丙烯酸酯 (150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀酸酯 (150ppm/300ppm) (+)/(+)富馬酸酯 (150ppm/300ppm) (+)/(+)碳源利用含1g/l硫酸銨和10ppm KCN的Stanier’s極限培養基富馬腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)碳源利用不含1g/l硫酸銨但含10ppm KCN的Stanier’s極限培養基富馬腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)
表II紅球菌亞種菌株DAP 96253差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 無變化生長於 5℃ (-)25℃(+)35℃(+)45℃(+)利用 葡萄糖 (+)蔗糖(+)果糖(+)乳糖(+)甘露糖醇(+)甘露糖 (+)阿拉伯糖(-)肌醇(+)，無氣體鼠李糖 (+)，無氣體脲酶 (-)腈降解 (-)明膠水解 (-)抗生素抗性慶大黴素I*紅黴素 S鏈黴素 S妥布拉黴素 S利福黴素S青黴素 S
四環素 S*I表示在敏感和抗性「之間」對碳和氮的利用含有腈作為唯一碳和氮源的Stanier’s極限培養基丙烯腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)乙腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀腈 (150ppm/300ppm)(+)/(-)富馬腈 (150ppm/300ppm)(+)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈 (各150ppm/300ppm) (+)/(+)丙烯腈/乙腈/富馬腈 (各150ppm/300ppm) (-)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈/富馬腈(各150ppm/300ppm) (-)/(-)碳源利用含1g/l硫酸銨的Stanier’s極限培養基P-甲酚 (150ppm/300ppm)(+)/(+)甲苯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)苯乙烯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)甲苯/苯乙烯 (各150ppm/300ppm) (+)/(+)乙酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)丙烯酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)富馬酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)碳源利用含1g/l硫酸銨和10ppm KCN的Stanier’s極限培養基富馬腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)碳源利用不含1g/l硫酸銨但含10ppm KCN的Stanier’s極限培養基富馬腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)
已發現下文表中給出特徵的下列微生物菌株，在如上所述多重誘導後，具有使醯胺單體轉化成對應酸化合物，而從聚醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的能力。在WO96/18724中描述了這些微生物的分離。簡單說，在同一工業區的汙染土壤中分別培養了200種以上純微生物分離物。將所有這些純分離物合併，並與含有芳族、硝基芳族、滷素-芳族、脂肪族和滷素-脂肪族化合物混合物的汙泥/廢料一起有氧培養。從培養材料中收集微生物的混合培養物，並維持在BACTOTMR2A培養基(Difco，Detroit，Michigan)上。
稱為DAP-2的混合培養物(已保藏於美國典型培養物保藏中心，指定ATCC登錄號55644)，能有氧降解至少下列化合物或其混合物中的一種苯、甲苯、二甲苯、乙苯、萘、氯苯、苯酚、甲酚、硝基苯、苯胺、蒽、二甲基苯酚、苯乙烯、滷素萘、2-，3-或4-氯甲苯、2-，3-或4-氯苯甲酸酯、1，3-二氯苯甲酸酯、1，2-，1，3-或1，4-二硝基苯、1-氯-2-硝基苯、1-氯-4-硝基苯、1-或2-甲基萘、芘、苊、熒蒽、菲、苯並-(b)-熒蒽、二香豆酮、_、鄰苯二酚、m-甲苯酸、乙酸肉桂酯、香草醛、反-肉桂醛、均三甲苯、水楊酸酯、密胺、氰尿酸、δ-(-)-薴烯、十六烷、甲醛和三氯甲烷。
在補充了各150ppm的硝基苯、萘和甲苯的BACTOTMR2A培養基上通過分離單菌落，從稱為DAP2的混合培養物中分離並確定了下列純培養物的特徵。
微生物DAP 623DAP623是一種革蘭氏陰性可運動性桿菌，通常是小的單桿菌，雖然可見一些成對。染色可以是不均勻的，有一些絮狀物形成。菌落在BACTOTMR2A培養基上呈白色至奶油色。另外，該生物體能利用下列物質均三甲苯、乳酸、琥珀酸、薴烯、m-甲苯酸、氯苯、水楊酸酯、2-，3-和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來源。DAP 623保藏在美國典型培養物保藏中心，指定了ATCC登錄號55722，並進一步如表III所示確定了特徵。
表IIIDAP R23差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶(+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 來自葡萄糖的酸生長於 15℃ (-)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (+)利用 葡萄糖(+)果糖 (+)乳糖 (-)甘露糖醇 (+)甘露糖(+)2-甲基萘 (-)α-酮戊二酸 (+)穀氨酸酯 (+)乙醇 (-)十六烷(-)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶 (+)賴氨酸脫羧酶 (+)鳥氨酸脫羧酶 (+)明膠水解 (+)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2(-)氨苄青黴素R卡那黴素 (-)四環素R壯觀黴素 R
鏈黴素 (-)微生物DAR 626DAP 626是一種革蘭氏可變桿菌，其尺寸可變，以單個或成對出現。可見在鞭毛平板上生長，表明其鞭毛運動性。另外，該微生物體能利用下列物質均三甲苯、乳酸、琥珀酸、薴烯、乙酸肉桂酯、鄰苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來源。DAP 626保藏於美國典型培養物保藏中心，指定了ATCC登錄號55723，並如表4中所示，進一步確定了特徵。
表IVDAP 626差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用 (-)三糖鐵瓊脂 產生H2S生長於 15℃(+)25℃(+)35℃(+)41℃(+)利用 葡萄糖 (-)果糖(+)乳糖(-)甘露糖醇(+)甘露糖 (-)2-甲基萘(-)α-酮戊二酸 (+)穀氨酸酯(+)乙醇(+)十六烷 (+)NO3-NO2(-)精氨酸脫羧酶 (-)賴氨酸脫羧酶 (-)鳥氨酸(-)明膠水解 (-)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2(-)氨苄青黴素 R卡那黴素 (-)壯觀黴素 R鏈黴素 (-)微生物DAP 629DAP 629是小型革蘭氏陰性可運動性桿菌，幾乎是球桿菌。當在BACTOTMR2瓊脂上生長時，菌落呈帶微弱螢光的白色。另外，該微生物體能利用下列物質熒蒽、均三甲苯、乳酸、琥珀酸、薴烯、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來源。DAP 629保藏於美國典型培養物保藏中心，指定了ATCC登錄號55726，並如表V中所示，進一步確定了特徵。
表VDAP 629差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用 (-)三糖鐵瓊脂 無發酵生長於 15℃ (+)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (-)利用 葡萄糖(+)
果糖(-)乳糖(-)甘露糖醇(-)甘露糖 (-)2-甲基萘(-)α-酮戊二酸 (+)穀氨酸酯(+)乙醇(-)十六烷 (-)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶(-)賴氨酸脫羧酶(+)鳥氨酸脫羧酶(-)明膠水解(+)脲酶(-)抗生素抗性HgCl2(-)氨苄青黴素 R卡那黴素(-)四環素 (-)壯觀黴素(-)鏈黴素 (-)微生物DAP 632DAP 632是革蘭氏可變可運動性細長桿菌，可見單個或成對。當在BACTOTMR2瓊脂上生長時，菌落呈微黃色至奶油色。另外，該微生物體能利用下列物質熒蒽、苊、均三甲苯、乳酸、薴烯、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來源。DAP 632保藏於美國典型培養物保藏中心，指定了ATCC登錄號55727，並如表VI中所示，進一步確定了特徵。
表VIDAP 632差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 無發酵生長於 15℃ (+)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (+)利用 葡萄糖 (-)果糖 (-)乳糖 (-)甘露糖醇 (-)甘露糖 (-)2-甲基萘 (-)α-酮戊二酸 (-)穀氨酸酯 (+)乙醇 (-)十六烷 (-)NO3-NO2(-)精氨酸脫羧酶(-)賴氨酸脫羧酶(-)鳥氨酸脫羧酶(-)明膠水解(+)脲酶(+)抗生素抗性HgCl2R氨苄青黴素 R
卡那黴素 R四環素 R壯觀黴素 R鏈黴素 R微生物DAP 115DAP 115是革蘭氏陰性可運動性桿菌，可見單個或成對。可觀察到在鞭毛平板上生長，表明其鞭毛運動性。當在BACTOTMR2瓊脂上生長時，菌落呈白色，但在營養肉湯中生長時呈黃色。另外，該微生物體能利用下列物質苯並-(b)-熒蒽、熒蒽、二香豆酮、苊、水楊酸酯、乳酸、琥珀酸、乙醛酸、均三甲苯、香草醛、薴烯、乙酸肉桂酸、鄰苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來源。DAP 115保藏於美國典型培養物保藏中心，指定了ATCC登錄號55724，並如表VII中所示，進一步確定了特徵。
表VIIDAP 115差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用(+)三糖鐵瓊脂產生H2S，從葡萄糖產生酸和氣體生長於15℃ (+/-)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (+)利用 葡萄糖(+)果糖 (+)乳糖 (-)甘露糖醇 (+)甘露糖(+)
2-甲基萘 (+)α-酮戊二酸 (+)穀氨酸酯 (+)乙醇 (-)十六烷 (+)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶 (-)賴氨酸脫羧酶 (-)鳥氨酸脫羧酶 (+)明膠水解 (+)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2R氨苄青黴素 R卡那黴素R四環素 R壯觀黴素R鏈黴素 R微生物DAP 120DAP 120是革蘭氏陰性可運動性桿菌。可觀察到在鞭毛平板上生長，表明其鞭毛運動性。另外，該微生物體能利用下列物質_、芘、乳酸、琥珀酸、乙醛酸、水楊酸酯、均三甲苯、香草醛、薴烯、乙酸肉桂酸、鄰苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來源。DAP 120保藏於美國典型培養物保藏中心，指定了ATCC登錄號55725，並如表VIII中所示，進一步確定了特徵。
表VIIIDAP 120差異特徵結果過氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 產生H2S生長於 15℃(+)25℃(+)35℃(+)41℃(+)利用 葡萄糖 (+)果糖(+)乳糖(-)甘露糖醇(+)甘露糖 (-)2-甲基萘(+)α-酮戊二酸 (+)穀氨酸酯(+)乙醇(-)十六烷 (+)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶 (-)賴氨酸脫羧酶 (-)鳥氨酸脫羧酶 (-)明膠水解 (+)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2R氨苄青黴素 R卡那黴素R四環素 R壯觀黴素(-)鏈黴素 (-)
下文表IX顯示了從稱為DAP 2的混合培養物中分離出來的，上文確定特徵的純培養物能在補充了各150ppm的乙腈和丙烯腈的Stanier’s極限培養基上單獨生長。培養物在25-27℃生長，14天後測定菌落大小。數值代表各次測定中5個重複菌落的平均值。
表IX乙腈和丙烯腈的利用培養物生長*菌落大小DAP 626 +++5.3mmDAP 115 +++6.3mmDAP 632 +++6.2mmDAP 623 +++5.0mmDAP 120 +/++aaDAP 629 +++5.3mm*生長記分為++++繁茂，+++好，++良，+中等，+/-稀少，-無生長a菌株DAP 120的生長非常薄，但擴散迅速，因此，不可能精確定量測定。
如表IX中所示，該菌株能利用乙腈和丙烯腈作為碳和氮的唯一來源。
4.3.用微生物從聚醯胺製備物中除去醯胺單體化合物的應用和方法根據本發明的一個實施例，提供了一種通過使醯胺單體轉化成對應的單體酸化合物(該酸化合物易於通過任何本領域技術人員已知的化學分離方法從製備物中除去)，除去聚醯胺或聚合的醯胺製備物(該醯胺製備物中含有不需要或不想要的醯胺單體)中的醯胺單體的方法。例如，可將丙烯醯胺轉化成丙烯酸而作為銨鹽輕易除去。
該方法包括使含有不需要的醯胺單體化合物的聚醯胺或聚合的醯胺製備物，與如4.1.1和4.1.2節中所述多重誘導的有用微生物菌株的純培養物接觸足夠的時間，來將醯胺單體轉化成對應的酸。該方法對純化聚醯胺或聚合的醯胺製備物，如含有丙烯醯胺的聚丙烯醯胺製備物或共聚物特別有用。可根據本發明的該實施例處理任何含有不需要單體的聚醯胺或聚合的醯胺製備物，包括pH約2到小於6，優選pH約3到約5，更優選的pH約3到約4的陽離子、陰離子和非離子聚醯胺製備物。有利的，可在pH小於約6.0，優選pH約2到4，和最優選pH約3到約4下處理含有醯胺單體的陽離子聚醯胺或聚合醯胺，從而使陽離子側鏈基團在除去不需要的單體之前，不像pH被調整到約6或以上時那樣喪失其官能性。
受誘導的微生物菌株可以是正在生長(即，正在活躍分裂)或正在休眠(即，不活躍分裂)或死亡的。當方法需要使用活躍生長的微生物培養物時，與聚醯胺或聚合的醯胺製備物接觸的條件應能支持細菌生長。這些條件包括例如，pH在2.0和11.0之間，優選在約2.0和小於6.0之間；溫度在4℃和55℃之間，優選在約15℃和37℃之間；溶氧張力飽和度在0.1％和100％之間，優選在約4％和80％之間，更優選在4％和40％之間，其中，可使用含氧或釋氧組合物來補充氧。含氧或釋氧組合物可以是空氣、純氧、過氧化氫、或其它能釋放氧的過氧化合物或其混合物。另外，可攪拌或不攪拌培養液，視溶氧張力為正或為負。
當方法需要使用不活躍分裂的微生物培養物時，與含有不需要醯胺單體的聚醯胺製備物接觸的條件應能支持除醯胺(酶)的活性。例如，將溫度保持在約0℃和65℃之間，優選約4℃和55℃之間。pH可以是鹼性或酸性，而且最佳保持在約pH2到小於6的範圍內。該具體實施例是可能的，因為醯胺單體的除去不是生長依賴性的，即，一旦誘導了除去醯胺的活性，不再需要微生物生長來除去醯胺單體。可在厭氧條件下進行該具體方式。
可將微生物的純培養物包裹或固定，而不是自由式動，以便於收集和重新使用。在一個優選例中，將該微生物固定。可通過吸附、靜電結合、共價結合等，將純培養物固定在固相載體上以幫助從反應混合物中回收微生物。合適的固相載體包括但不限於顆粒狀活性炭，灰泥、木材剩餘產物(如木塊、熔核、鍘碎託板或樹木)，氧化鋁、釕、氧化鐵、離子交換樹脂(如AmberliteTMIRA-93或IRA-96(RohmHaas)，DowexTM(Dow Chemical Co，Inc.)，DEAE纖維素、DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia，Inc.)、陶瓷珠、交聯聚丙烯醯胺珠或塊或其它凝膠形式、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊以及由於其固有的磁性能從水溶液中被回收的固體顆粒。海藻酸珠可以是Ca++海藻酸珠或硬化的海藻酸珠。κ-角叉菜膠塊可以是硬化的κ-角叉菜膠塊。作為一個說明性例子，可將海藻酸鈉溶液和氯化鈣與受誘導的微生物的純培養物混合，使微生物被固定在海藻酸珠中。在優選例中，將受誘導的微生物固定在已用聚乙烯亞胺交聯的海藻酸珠中，或固定在聚丙烯醯胺型的聚合物中。
根據本發明的另一個實施例，從聚醯胺或聚合的醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的方法包括使按照本發明多重誘導的，有用的微生物菌株的純培養物的抽提物，與含有不需要的醯胺單體的聚醯胺或聚合醯胺製備物接觸足夠時間，來將醯胺單體轉化成對應的酸。優選的，該抽提物是一種微生物的粗抽提物。製備微生物的抽提物可通過本領域技術人員已知的方法，包括但不限於下列方法通過超聲、碾壓、使用弗氏壓碎器等，來打碎受誘導的微生物的純培養物樣品中的細胞，產生細胞裂解液。過濾或離心裂解液，以除去細胞碎片和未裂解的細胞，得到粗抽提物。也可如上所述象完整細胞那樣，固定裂解物，或用固定酶所用的已知技術固定。
在如上所述本發明應用的具體說明性實施例中，使用了該除去方法來將聚丙烯醯胺製備物中不需要的丙烯醯胺單體轉化成丙烯酸。使本文所述經多重誘導和固定的有用微生物菌株的純培養物或抽提物，與含有不需要的丙烯醯胺單體的聚丙烯醯胺製備物(所述製備物具有約2到小於6的pH)接觸足夠時間，來減少聚丙烯醯胺製備物中的丙烯醯胺單體量至100ppm以下。另外，使本文所述經多重誘導和固定的有用微生物菌株的純培養物或抽提物，在約2到小於6的pH下，同時與丙烯醯胺單體製備物和聚合劑(導致醯胺單體聚合成聚丙烯醯胺的試劑)接觸，從而使剩餘的丙烯醯胺單體(在聚合反應後)轉化成對應的丙烯酸。這些聚合劑包括但不限於過硫酸鹽、硫酸鹽、溴酸鹽、鹽酸鹽、過氧化物或其混合物等試劑。聚丙烯醯胺製備物中丙烯醯胺單體的濃度可高達100,000ppm，而且通常在不足10,000ppm到約40,000ppm，用本發明的方法，可將丙烯醯胺單體的水平降低到1000ppm以下，優選降到100ppm以下。
優選抽提物是一種微生物菌株的粗抽提物。本申請上文中描述了製備微生物菌株抽提物的方法。優選使用上文4.2節所述，受誘導的微生物的純培養物或抽提物。另外，使用了4.1.3節中所述篩選方法鑑定的，能從聚丙烯醯胺製備物中除去醯胺單體化合物的微生物的純培養物或抽提物。任選的，可用本領域已知的酶純化方法，如離子交換柱層析，在接觸前進一步純化該粗抽提物。
在一個優選例中，固定了微生物菌株或其抽提物。在本申請上文中描述了固定微生物菌株或其抽提物的方法。更優選的，將誘導的微生物或其抽提物固定在聚乙烯亞胺交聯的海藻酸珠中，或固定在聚丙烯醯胺型聚合物或DowexTM(DowChemical Co.，Inc.)，一種離子交換樹脂上。另外，在另一個實施例中，將微生物或其抽提物固定在材料的平坦表面上。使聚醯胺(如聚丙烯醯胺製備物)通過具有固定化微生物或其抽提物的平坦表面。在一個實施例中，聚醯胺製備物是水相製備物。在一個說明性實施例中，平坦表面是材料的一薄板形式，或一系列薄板，在其上固定了誘導的微生物或抽提物。在一實施例中，通過簡單的使新製備物從平坦表面流過，可輕易的重新使用固定的多重誘導的微生物或抽提物，而且不需要從聚醯胺產物中回收多重誘導的微生物或其抽提物。固定化能最大限度的保持和重新使用微生物或其抽提物，來除去更多單體，從而減少了使用的微生物或其抽提物的量，從而降低了成本。另外，混合對賦予額外能量的需要和對聚醯胺製備物中微生物或其抽提物的量的需要降至最小。還有，通過接觸醯胺單體製備物和聚合劑以及交聯劑來固定微生物或其抽提物，從而使微生物或其抽提物固定在所得到的聚醯胺製備物中，而除去其中剩餘的醯胺單體。
另外，在聚丙烯醯胺製備物的製造中，也可能存在不需要的剩餘單體腈化合物，除存在的剩餘醯胺單體化合物外，上文詳述的除去方法也可使這些腈單體化合物轉化成對應的酸化合物，從而易於以其鹽形式被除去。
根據本發明可使用任何能使誘導的微生物菌株和含有聚醯胺和單醯胺的化合物接觸的方法。這些接觸方法包括但不限於在密封容器或器皿中接觸，或與含有誘導的菌株的裝置接觸等。
本發明的方法還可包括通過用本領域技術人員已知的任何方法，如用帶有火焰電離探頭的氣—液色譜(GLC-FID)檢測醯胺，和高效液相層析(HPLC)檢測對應酸化合物，來評估單醯胺化合物的消失和/或對應酸化合物的同時出現，監測單醯胺化合物轉化成對應的酸化合物。轉化成對應的酸導致各原先存在的醯胺基團產生可化學計量的氨。可用Fawcett和Scott，1960，臨床病理學，13156-159的技術測量銨釋放量，來監測醯胺化合物轉化的程度。如果由於氨或銨鹽的存在，不能測量氨釋放，那麼可用本領域技術人員已知的方法，包括但不限於GLC-FID等來監測存在的醯胺的濃度。另外，可通過評估對應酸化合物的產生(可衍生酸化合物並用GLC-FID檢測該衍生產物來監測)來測定醯胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲矽烷基化，可衍生醯胺和酸，用於GLC-FID分析(一般見，Supelco層析產物分類，1997，653-656頁(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
含有不需要的醯胺單體的聚醯胺或聚合醯胺製備物可以是固體、液體、和/或氣體形式。當聚醯胺製備物是氣體和/或液體形式時，可以將其吸附到材料，如固體上。
可通過例如，賦予機械能量，如攪拌；賦予聲學能量，如在液體中設置持續聲波；或賦予電場或靜電場來賦予能量。
可在不同時間點採樣並通過本領域技術人員已知的方法，如GLC-FID等測量醯胺單體或聚醯胺或聚合的醯胺化合物的濃度。
4.3.1.操作方式可以各種方式，包括分批方式，依次分批方式，或半連續方式，和用生物濾膜流通方式，來實施從聚醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體化合物的方法。
在所有操作方式中，可定時取出樣品內容物，來監測感興趣化合物的除去情況。另外，攪動和/或混合反應內容物可導致發泡。就此而言，可加入抗發泡劑來防止發泡。合適的抗發泡劑包括含有抗發泡乳劑(如，DowANTIFOAM-A_；基於矽的抗發泡劑)的矽。
4.3.1.1.分批方式操作分批方式操作需要將含有不需要的醯胺單體化合物的液體置於一容器(如生物反應器)中，用4.1節中所述誘導的微生物接種，培養混合物以培養能除去不需要的醯胺單體化合物的微生物。在預定時間後，停止培育，取出內容物，如果存在固體，可通過過濾將其從液體中分離出來。然後可從固相和液相中取出樣品並用GLC-FID測試，來評估單醯胺化合物的水平，並確定單醯胺化合物已被除去。隨後對反應物固體進行脫水，並進一步加工成填埋廢渣或可作為接種的細菌菌種，用於下一批方式。在分批方式中，重新以約2％-40％重量或體積，優選約5％-20％加入脫水固體殘餘物。可將空氣或氧氣泵入反應物中，並機械攪動生物反應器中的內容物。
4.3.1.2.依次分批方式操作與分批方式相同操作依次分批方式，除了在培育期結束後將反應物沉降一段時間，通常約15分鐘，並除去反應內容物頂部的60％-95％，剩下底部沉降的固體(如存在)，作為下一批中和液體的接種物。優選除去70％和90％之間的內容物。依次分批方式是除去含有不需要醯胺單體的液體的一種優選實施方案，因為減少了滯後或馴化期，在反應物中保留了高水平的生物物質，更好的容納了廢料進樣組合物中的變化性，大大減少了生物處理後剩餘的殘餘固體。
4.3.1.3.半—連續/連續方式半—連續/連續方式與分批和依次分批方式相似。然而，不在預定時間後停止培育，而是將含有不需要醯胺單體的新鮮液體以一段給定時間內的固定量泵入生物反應器，而將處理後的液體從生物反應器中抽出。這提供了不需要停止除去過程的連續液體處理。
4.3.2.生物濾膜可用生物濾膜來從廢料如空氣、水蒸氣、煙霧、和水或水溶液中的聚醯胺或聚合醯胺製備物中除去醯胺單體化合物。例如，如果存在揮發性醯胺單體，可從發現它們的固體或水溶液中除去該揮發物，並以將揮發物捕獲在生物濾膜中的方式來實施這些步驟。一旦揮發物被捕獲，可將其與多重誘導的微生物菌株的純培養物或抽提物接觸，來除去單醯胺化合物。可用經典型生物濾膜，其中使含有聚醯胺製備物(含不需要的醯胺單體)的空氣通過生物濾膜裝置。可用涓流床生物濾膜，其中使含有不需要的醯胺單體的空氣和水相聚醯胺溶液通過生物濾膜裝置。
生物濾膜可包括具有上述方法誘導的微生物的純培養物或其抽提物，固定於固相載體上的裝置。微生物可以是正在活躍分裂或不活躍分裂的。該微生物也可在與生物濾膜結合前已凍幹。合適的固相載體包括但不限於顆粒狀活性碳、灰泥、木材剩餘產物(如木塊、熔核、鍘碎託板或樹木)，氧化鋁、釕、氧化鐵、離子交換樹脂(如AmberliteTMIRA-93或IRA-96(RohmHaas)，DowexTM(Dow Chemical Co，Inc.)，DEAE纖維素、DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia，Inc.)、陶瓷珠、聚丙烯醯胺珠、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊以及由於其固有的磁性能從水溶液中回收的固體顆粒。優選的固相載體是聚乙烯亞胺交聯的海藻酸珠。另外，可將微生物或其抽提物固定在材料的平坦表面上。生物濾膜裝置可具有流入和流出口，從而使要處理的材料可流過該裝置。優選的，粘著在固相載體上的微生物選自具有ATCC登錄號55899，55898，55722，55723，55726，55727，55724，和55725的微生物，它們已如上文所述受過誘導。
在一方法中，可採用此生物濾膜，此法包括使含有聚醯胺或聚合醯胺製備物和不需要的醯胺單體化合物的廢液，流過含有上述誘導的微生物的純培養物，或其抽提物(固定在固相載體上的)的裝置的生物濾膜。該方法還可包括監測廢液，來確定確實已除去了醯胺單體化合物。優選的粘著在固相載體上的微生物選自具有ATCC登錄號55899，55898，55722，55723，55726，55727，55724和55725的微生物，其已如上所述受過誘導。
僅為了說明，而不是為了在任何方面限制本發明的範圍，給出了下列實施例。
5.實施例完整細胞在聚丙烯醯胺中的固定將紅球菌菌株DAP 96253的完整細胞固定在聚丙烯醯胺中，將細胞錨定在穩定的基質中。另外，聚丙烯醯胺提供了機械完整性和強度，這導致將細胞更有效的保持在反應容器中，並能穩定細胞中的醯胺酶活性。
將10克DAP96253多重誘導的細胞(溼重)懸浮在40毫升蒸餾水中。將這40毫升細胞加到含有4.5克丙烯醯胺和0.5克N-，N-亞甲基雙丙烯醯胺的蒸餾水中。在該80毫升溶液中，加入5毫升α-二甲基氨基丙腈和10毫升2.5％的過硫酸鉀溶液，猛烈攪拌得到的混合物，然後將其置於冰上。在溶液聚合後，將聚合溶液切成小塊，用蒸餾水洗滌，除去任何未聚合的單體。
6.從陽離子聚丙稀醯胺製備物中除去汙染的丙烯醯胺單體6.1固定化抽提物的使用在一系列實驗中，將如上文4.1節所述，在補充了150ppm的丙烯腈，150ppm的乙腈和50ppm的琥珀腈的完全營養培養基上培養細胞，獲得多重誘導的DAP96253細胞的粗抽提物，將其固定在DOWEXTM離子交換樹脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。直接將固定化的抽提物加到pH約3.5的商品陽離子聚丙烯醯胺製備物中。將製備物和固定化抽提物25℃-27℃混合2小時，來進行該反應。
2小時後，陽離子聚丙烯醯胺製備物中的剩餘丙烯醯胺單體濃度降低了約50％到60％。
在另一系列實驗中，如下獲得了多重誘導的DAP 96253細胞的細胞粗抽提物。如上文4.1節所述，在補充了150ppm乙腈、150ppm的丙烯腈和50ppm的琥珀腈的完全營養培養基中多重誘導細胞。收穫細胞，洗滌並重懸浮在磷酸緩衝鹽中。裂解多重誘導的細胞，如4.1節中所述，獲得了該細胞的粗抽提物。
如下將粗抽提物固定在DOWEXTM離子交換樹脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。用50％乙醇預洗1克DOWEXTMWR2陰離子樹脂，然後與150微克的粗抽提物接觸，使其反應並洗滌兩次。評估固定化粗抽提物在pH7，30℃將丙烯醯胺轉化成丙烯酸的能力，測定了固定化粗抽提物的醯胺酶活性。該固定化抽提物顯示了20單位/克的醯胺酶活性(1單位等於在pH7，30℃每分鐘轉化1微摩爾丙烯醯胺)。
直接在兩種不同的商品陽離子聚丙烯醯胺製備物(Cytec Industries，Stamford，CT)(各具有小於4的pH，並具有剩餘濃度為1000-1100ppm的單丙烯醯胺)中加入約0.5克固定化抽提物(10.3單位)。將製備物與固定化抽提物混合進行反應，並在各時間點取樣，用氣—液色譜測定丙烯醯胺濃度。
360分鐘內，第一陽離子聚丙烯醯胺製備物中的剩餘丙烯醯胺單體濃度降到了1ppm以下。在第二製備物中，360分鐘內，丙烯醯胺單體的濃度降到了約400ppm。
在另一系列實驗中，當該具體抽提物未固定時，該具體抽提物在pH小於4時，不顯示具有除去單醯胺的活性。
6.2固定化微生物的使用將如上文13節中所述獲得的多重誘導的細胞DAP 96253固定在DOWEXTM離子交換樹脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。將固定化細胞直接加到商品陽離子聚丙烯醯胺製備物中，其pH為約3.5。將製備物與固定化細胞在環境溫度(如25-27℃)下混合足夠時間(如2小時)，進行反應，並監測醯胺單體的濃度。
7.微生物保藏1996年12月10日，將下列菌種保藏在美國典型培養物保藏中心，(ATCC)，Rockvill，MD，並指定了登錄號微生物ATCC登錄號紅球菌亞種DAP 96253 55899紫紅紅球菌DAP 96622 558981995年11月30日，將下列菌種保藏在美國典型培養物保藏中心，(ATCC)，Rockvill，MD，並指定了登錄號微生物ATCC登錄號DAP 623 55722DAP 626 55723DAP 629 55726DAP 632 55727DAP 115 55724DAP 120 55725本文描述的和要求權利的本發明範圍不受本文公開的具體實施例的限制，因為這些實施例只是本發明幾個方面的說明。任何等價實施例都將在本發明的範圍內。事實上，除本文顯示和描述的例子以外，對本發明的各種修改從前面的描述來看，對本領域技術人員是顯而易見的。這些修改也將落在權利要求的範圍內。
本文引用了一些文獻，在此全部引入以供參考。
國際申請號PCT//
PCT/RO/134表(1981年1月)國際申請號PCT//PCT/RO/134表(續)美國典型培養物保藏中心10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209美國登錄號保藏日期55723 1995年11月28日55724 1995年11月28日55725 1995年11月28日55726 1995年11月28日55727 1995年11月28日55898 1996年12月11日55899 1996年12月11日
權利要求
1.一種通過將醯胺單體轉化成對應的酸，而從含有所述單體的聚醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的方法，其特徵在於，該方法包括使多重誘導的微生物的純培養物或抽提物與含有醯胺單體的聚醯胺製備物接觸足夠時間，將κ-醯胺單體轉化成對應的酸，所述聚醯胺製備物具有約2到小於6的pH。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述純培養物或抽提物被包裹或固定。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述純培養物或抽提物被固定在選自顆粒狀活性炭、木片、氧化鋁、釕、氧化鐵、陶瓷珠、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊和離子交換樹脂的固相載體上。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述培養物或抽提物被固定在平坦表面上。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述聚醯胺製備物是聚丙烯醯胺製備物。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物選自具有美國典型培養物保藏中心登錄號55899、55898、55722、55723、55726、55727、55724和55725的微生物，而且所述微生物已被多重誘導。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過一種方法，所述方法包含在補充了含有濃度各為約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各為約50ppm的琥珀腈和富馬腈的至少一種的腈化合物的混合物的培養基中，培養所述微生物的純培養物，來獲得多重誘導的微生物。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述培養基補充有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和約50ppm的琥珀腈的腈化合物的混合物。
9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述培養基還補充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過一種方法，該方法包含在補充了含有(a)約50ppm的琥珀腈、約150ppm的乙腈和約150ppm的丙烯腈的至少一種和(b)各150ppm的乙醯胺和丙烯醯胺的，腈和醯胺化合物的混合物的培養基中，培養所述微生物的純培養物，獲得多重誘導的微生物。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述培養基補充有約50ppm的琥珀腈和約150ppm的乙醯胺和約150ppm丙烯醯胺的腈和醯胺化合物的混合物。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述培養基還補充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
13.一種通過將醯胺單體轉化成對應酸，從含有所述單體的聚醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體的方法，其特徵在於，該方法包括在約2到小於6的pH下，使多重誘導的微生物的純培養物或抽提物，與醯胺單體和聚合劑接觸。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述純培養物或抽提物是被包裹或固定的。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述純培養物或抽提物被固定在選自顆粒狀活性炭、木片、氧化鋁、釕、氧化鐵、陶瓷珠、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊和離子交換樹脂的固相載體上。
16.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述培養物或抽提物被固定在平坦表面上。
17.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述醯胺單體是丙烯醯胺。
18.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述微生物選自具有美國典型培養物保藏中心登錄號55899、55898、55722、55723、55726、55727、55724和55725的微生物，而且所述微生物已被多重誘導。
19.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，通過一種方法，該方法包括在補充了含有濃度各為約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各為約50ppm的琥珀腈和富馬腈的至少一種的腈化合物的混合物的培養基中，培養所述微生物的純培養物，來獲得多重誘導的微生物。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述培養基補充有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和約50ppm的琥珀腈的腈化合物的混合物。
21.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述培養基還補充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
22.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，通過一種方法，該方法包括在補充了含有(a)約50ppm的琥珀腈、約150ppm的乙腈和約150ppm的丙烯腈的至少一種和(b)各150ppm的乙醯胺和丙烯醯胺的，腈和醯胺化合物的混合物的培養基中，培養所述微生物的純培養物，獲得多重誘導的微生物。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述培養基補充有約50ppm的琥珀腈和約150ppm的乙醯胺和約150ppm丙烯醯胺的腈和醯胺化合物的混合物。
24.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述培養基還補充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
25.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述聚丙烯醯胺製備物含有濃度約1,000-40,000ppm的丙烯醯胺單體。
26.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述聚丙烯醯胺製備物還含有不需要的腈單體，而且通過將單體轉化成對應酸除去了所述腈單體。
27.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述聚丙烯醯胺製備物還含有不需要的腈單體，而且通過將單體轉化成對應酸除去了所述腈單體。
全文摘要
本發明公開了在約2到約6的pH下,通過使用能將醯胺分子轉化成酸分子的誘導的微生物菌株的純培養物,將醯胺單體化合物轉化成對應酸化合物,而從聚醯胺或聚合醯胺製備物中除去不需要的醯胺單體化合物的方法。
文檔編號C02F3/12GK1307595SQ99807801
公開日2001年8月8日 申請日期1999年6月25日 優先權日1998年6月25日
發明者G·E·皮爾斯 申請人:Cytec技術有限公司