一種對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法

2023-08-06 01:57:16 5

專利名稱：一種對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法
技術領域：
本發明屬於對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原技術領域，尤其涉及一種對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法。
背景技術：
免疫分析是基於抗原、抗體的特異性反應的一種分析方法，在醫學上已廣泛應用於微量物質的檢測。免疫分析具有特異性強、靈敏度高，甚至更低、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優點，近年來得到迅速發展。 建立免疫分析方法，首先必須製備出對農藥特異性強親和力高的抗體。一般農藥的分子量小於1000，不具備刺激機體產生針對農藥抗原決定簇的特異性抗體，為小分子半抗原，因此必須與大分子載體偶聯後才具有免疫原性。要實現與大分子物質的偶聯，半抗原分子上必須具備能共價結合到載體上的一個活性基團(如氨基、羧基、羥基和巰基等)，對多數不具備活性基團的農藥則通常進行衍生化製備或由原料合成，也可以用其他代謝及降解產物作為半抗原。一般理想的半抗原應儘量具備與待測物類似的立體化學特徵，以減少免疫交叉汙染，而且應儘量保證半抗原與載體的大分子複合物的特徵結構能最大限度地被免疫活性細胞所識別。典型的半抗原結構中應具備適當末端活性基團，如-NH2、-C00H、-0H、_SH等；同時活性基團與載體之間應具備一定長度的間隔臂，一般為4-6個碳鏈長度(0. 5-0. 8nm)。間隔臂一般為非極性，且除供偶聯的活性基團外，不應有其它高免疫活性的結構，如苯環、雜環等，以降低抗體對間隔臂的識別和間隔臂對待測物結構特徵的影響；間隔臂還應遠離待測物的特徵結構部分和官能團，有利於高選擇性和高親合性抗體的產生。半抗原合成以後，通過化學方法使半抗原分子與載體蛋白連接製備免疫原。用作載體的蛋白通常有牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、人血清白蛋白(HAS)和鑰孔血藍蛋白(KLH)等。農藥人工抗原合成成功後通常需要經過透析或過柱的方法對其進行純化。對純化後人工抗原進行鑑定，一方面是定性判斷半抗原與載體是否偶聯成功；另一方面是定量測定結合比和蛋白質含量等。判斷是否偶聯成功最簡單的方法為紫外掃描法，如果人工抗原的紫外吸收特徵兼具有或不同於原半抗原和載體蛋白的紫外吸收特徵，則可初步判斷偶聯成功。

發明內容
本發明目的是建立一種以溴氰菊酯為原料，通過硝化、還原、重氮化、引入羧基活性基團等四步反應合成半抗原方法，以利於製備出對擬除蟲菊酯類農藥特異性強親和力高的抗體。本發明實施例是這樣實現的，一種對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特徵在於，該合成方法包括以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物；
通過重氮化反應,合成半抗原Hp-I ;利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I與載體蛋白BSA相偶聯，製備溴氰菊酯人工免疫抗原。進一步，以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物，合成步驟如下向150mL的三口燒瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿攪拌溶解，溶液呈透明黃色，取發煙硝酸10. 2ImL與16mL乙酸置於恆壓滴液漏鬥中充分混勻，緩慢向反應瓶中滴加，
I.5h滴加完畢，反應液控制在25V _30°C範圍內，待滴加完畢，保持該條件繼續攪拌反應3. 5h ;將反應液倒入200mL的冰水中，攪拌，出現大量淡黃色粘稠物質；用乙酸乙酯對水液進行萃取，然後再用蒸餾水反覆洗滌多次，收集有機相，無水Na2SO4乾燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘稠液體。粗產物未經純化，直接進行下一步反應；
稱取上一步得到的產物5g，溶於裝有50mL乙醇的燒瓶中，加入9. 8gSnCl2 2H20，攪拌得白色的濁液，反應體系用N2保護，70°C -75°C下反應35min。反應液冷卻後，倒入150mL H2O中，攪拌，乳白色漿狀，加入200mL乙酸乙酯，並用10%的NaHCO3溶液調節pH =7，過程中溶液產生大量的氣泡，隨後加入適量的硅藻土，抽濾，再用蒸餾水和乙酸乙酯洗滌濾餅，收集濾液中的有機相，無水Na2SO4乾燥，溶液逐漸由黃色變為紅棕色溶液，抽濾，減壓蒸餾除去溶劑得紅褐色的油狀物。粗產物通過矽膠柱層析，乙酸乙酯/石油醚=I 2，脫色純化得淡黃色粘稠物，下一步進行重氮化反應。進一步,通過重氮化反應,合成半抗原Hp-I,合成步驟如下在半抗原Hp-I的基礎上引入羧基活性基團，並加入連接臂；取上步反應產物溶於鹽酸中，在冰冷卻下保持溫度在0_5°C之間，然後在攪拌情況下逐漸加入亞硝酸那溶液；反應時，酸的用量為產物量的3倍，反應式為Ar-NH2+2HCL+NaN02 = ArN2CL+NaCL+2H20重氮化反應後，取上步產物0. 4g，加4mol/L的HCL溶液0. 1925mL, 15min後加入
0.5mol/L的NaNO2溶液I. 54mL,反應45min，得淡黃色液體。後加入丁二酸酐I. 155g，反應2h以上，反應處於室溫中磁力攪拌下進行，過夜後結束反應；反應液經減壓蒸餾除去溶劑，殘留固體用四氫呋喃處理，矽膠柱分離純化，薄層矽膠板上表現為一個斑點乙酸乙酯石油醚=4 I, Rf = 0. 65 ；進一步，利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I與載體蛋白BSA相偶聯，製備溴氰菊酯人工免疫抗原，具體步驟如下稱取0. 31g半抗原Hp-1，再稱取0. 131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解於反應裝置中，反應在磁力攪拌下室內溫度進行IOh ;反應終液置4°C冰箱冷卻2h以上，經I. 2萬rpm離心5分鐘,取上清，即活潑酯液,並緩慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反應；反應緩衝液為0. 2mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩衝液，反應在磁力攪拌下室內溫度進行4小時；將反應終液置透析袋內，於0. 01mol/L pH7. 4的PBS溶液中4°C攪拌透析，每4_8小時換一次透析液，共透析3天，透析結束後將透析袋中的蛋白溶液，即為溴氰菊酯人工抗原Hp-1-BSA，分成若干等份分裝於Iml離心管中，於_20°C冰箱中存放備用。本發明目的是建立一種以溴氰菊酯為原料，通過硝化、還原、重氮化、引入羧基活性基團等四步反應合成半抗原方法，以利於製備出對擬除蟲菊酯類農藥特異性強親和力高的抗體。


圖I溴氰菊酯化合物I合成路線；圖2半抗原Hapten-I的合成路線；圖3Hp-l-BSA、Hp-I和BSA的紫外掃描光譜。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
本發明實施例是這樣實現的，一種以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物I。合成路線為向150mL的三口燒瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿攪拌溶解，溶液呈透明黃色，取發煙硝酸10. 2ImL與16mL乙酸置於恆壓滴液漏鬥中充分混勻，緩慢向反應瓶中滴加，
I.5h滴加完畢，反應液控制在25V _30°C範圍內，待滴加完畢，保持該條件繼續攪拌反應3. 5h。將反應液倒入200mL的冰水中，攪拌，出現大量淡黃色粘稠物質。用乙酸乙酯對水液進行萃取，然後再用蒸餾水反覆洗滌多次，收集有機相，無水Na2SO4乾燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘稠液體。粗產物未經純化，直接進行下一步反應。稱取上一步得到的產物5g，溶於裝有50mL乙醇的燒瓶中，加入9. 8gSnCl2 2H20，攪拌得白色的濁液，反應體系用N2保護，70°C -75°C下反應35min。反應液冷卻後，倒入150mL H2O中，攪拌，乳白色漿狀，加入200mL乙酸乙酯，並用10%的NaHCO3溶液調節pH =7，過程中溶液產生大量的氣泡，隨後加入適量的硅藻土，抽濾，再用蒸餾水和乙酸乙酯洗滌濾餅，收集濾液中的有機相，無水Na2SO4乾燥，溶液逐漸由黃色變為紅棕色溶液，抽濾，減壓蒸餾除去溶劑得紅褐色的油狀物。粗產物通過矽膠柱層析(乙酸乙酯/石油醚=I 2)，脫色純化得淡黃色粘稠物。下一步進行重氮化反應。I. I. 15. 2重氮化反應半抗原Hp-I的合成路線如下，在半抗原Hp-I的基礎上引入羧基活性基團，並加入
連接臂。取上步反應產物溶於鹽酸中，在冰冷卻下保持溫度在0_5°C之間，然後在攪拌情況下逐漸加入亞硝酸那溶液。反應時，酸的用量為產物量的3倍，反應式為Ar-NH2+2HCL+NaN02 = ArN2CL+NaCL+2H20重氮化反應後，取上步產物0. 4g，加4mol/L的HCL溶液0. 1925mL, 15min後加入0. 5mol/L的NaNO2溶液I. 54mL,反應45min，得淡黃色液體。後加入丁二酸酐I. 155g，反應2h以上，反應處於室溫中磁力攪拌下進行，過夜後結束反應。反應液經減壓蒸餾除去溶劑，殘留固體用四氫呋喃處理，矽膠柱分離純化，薄層矽膠板上表現為一個斑點(乙酸乙酯石油醚=4 : I, Rf = 0.65)。免疫抗原的合成，利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I與載體蛋白BSA相偶聯，製備溴氰菊酯人工免疫抗原。具體步驟如下
稱取0. 31g半抗原Hp-1，再稱取0. 131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解於反應裝置中，反應在磁力攪拌下室內溫度進行10h。反應終液置4°C冰箱冷卻2h以上，經I. 2萬rpm離心5分鐘,取上清(即活潑酯液)，並緩慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反應。反應緩衝液為0. 2mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩衝液(PBS液)，反應在磁力攪拌下室內溫度進行4小時(從加樣結束開始記時)。將反應終液置透析袋內，於0. 01mol/L pH7. 4的PBS溶液中4°C攪拌透析，每4-8小時換一次透析液，共透析3天。透析結束後將透析袋中的蛋白溶液(即為溴氰菊酯人工抗原Hp-I-BSA)，分成若干等份分裝於Iml離心管中，於_20°C冰箱中存放備用。溴氰菊酯人工抗原鑑定採用活潑酯方法，將合成半抗原分別偶聯到載體蛋白BSA，製備成溴氰菊酯免疫抗原。
人工抗原、載體蛋白和半抗原的紫外掃描結果見圖3人工抗原在305nm處出現強吸峰，明顯不同於載體蛋白及半抗原的吸收曲線，這說明在載體蛋白上偶聯上了溴氰菊酯分子，抗原合成成功。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特徵在於，該合成方法包括 以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物； 通過重氮化反應，合成半抗原Hp-I ； 利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I與載體蛋白BSA相偶聯，製備溴氰菊酯人工免疫抗原。
2.如權利要求I所述的對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特徵在於，以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物，合成步驟如下 向150mL的三口燒瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿攪拌溶解，溶液呈透明黃色，取發煙硝酸10. 2ImL與16mL乙酸置於恆壓滴液漏鬥中充分混勻，緩慢向反應瓶中滴加，I. 5h滴加完畢，反應液控制在25V _30°C範圍內，待滴加完畢，保持該條件繼續攪拌反應3. 5h ;將反應液倒入200mL的冰水中，攪拌，出現大量淡黃色粘稠物質；用乙酸乙酯對水液進行萃取，然後再用蒸餾水反覆洗滌多次，收集有機相，無水Na2SO4乾燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘稠液體。粗產物未經純化，直接進行下一步反應； 稱取上一步得到的產物5g，溶於裝有50mL乙醇的燒瓶中，加入9. 8gSnCl2 · 2H20，攪拌得白色的濁液，反應體系用N2保護，70°C -75°C下反應35min。反應液冷卻後，倒入150mLH2O中，攪拌，乳白色漿狀，加入200mL乙酸乙酯，並用10%的NaHCO3溶液調節pH = 7，過程中溶液產生大量的氣泡，隨後加入適量的硅藻土，抽濾，再用蒸餾水和乙酸乙酯洗滌濾餅，收集濾液中的有機相，無水Na2SO4乾燥，溶液逐漸由黃色變為紅棕色溶液，抽濾，減壓蒸餾除去溶劑得紅褐色的油狀物。粗產物通過矽膠柱層析，乙酸乙酯/石油醚=I 2，脫色純化得淡黃色粘稠物，下一步進行重氮化反應。
3.如權利要求I所述的對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特徵在於，通過重氮化反應，合成半抗原Ηρ-l,合成步驟如下 在半抗原Hp-I的基礎上引入羧基活性基團，並加入連接臂； 取上步反應產物溶於鹽酸中，在冰冷卻下保持溫度在0-5°C之間，然後在攪拌情況下逐漸加入亞硝酸那溶液；反應時，酸的用量為產物量的3倍，反應式為Ar-NH2+2HCL+NaN02 = ArN2CL+NaCL+2H20 重氮化反應後，取上步產物O. 4g，加4mol/L的HCL溶液O. 1925mL, 15min後加入O.5mol/L的NaNO2溶液I. 54mL,反應45min，得淡黃色液體。後加入丁二酸酐I. 155g，反應2h以上，反應處於室溫中磁力攪拌下進行，過夜後結束反應；反應液經減壓蒸餾除去溶劑，殘留固體用四氫呋喃處理，矽膠柱分離純化，薄層矽膠板上表現為一個斑點乙酸乙酯石油醚=4 I, Rf = O. 65。
4.如權利要求I所述的對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特徵在於，利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I與載體蛋白BSA相偶聯，製備溴氰菊酯人工免疫抗原，具體步驟如下 稱取O. 31g半抗原Hp-I，再稱取O. 131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解於反應裝置中，反應在磁力攪拌下室內溫度進行IOh ;反應終液置4°C冰箱冷卻2h以上，經I. 2萬rpm離心5分鐘,取上清，即活潑酯液,並緩慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反應；反應緩衝液為O. 2mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩衝液，反應在磁力攪拌下室內溫度進行4小時；將反應終液置透析袋內，於O. 01mol/L pH7. 4的PBS溶液中4°C攪拌透析，每4_8小時換一次透析液，共透析3天，透析結束後將透析袋中的蛋白溶液，即為溴氰菊酯人工抗原Hp-1-BSA，分成若干等份分裝於Iml 離心管中，於_20°C冰箱中存放備用。
全文摘要
本發明公開了一種對丁二單醯氧溴氰菊酯半抗原合成方法，該合成方法包括以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物；通過重氮化反應，合成半抗原Hp-1；利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1與載體蛋白BSA相偶聯，製備溴氰菊酯人工免疫抗原。本發明目的是建立一種以溴氰菊酯為原料，通過硝化、還原、重氮化、引入羧基活性基團等四步反應合成半抗原方法，以利於製備出對擬除蟲菊酯類農藥特異性強親和力高的抗體。
文檔編號C07C255/39GK102807615SQ20121029535
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者李相前, 任世英 申請人:淮陰工學院