神經延長促進劑及延長抑制劑的製作方法

2023-08-09 06:52:01 2

神經延長促進劑及延長抑制劑的製作方法
【專利摘要】本發明提供有助於帶狀皰疹後神經痛的機理的闡明，促進損傷的神經再生的技術方案，還提供對由於帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、皰疹後神經痛、腦卒中、退行性疾病等伴隨的神經細胞死亡所導致的障礙，或上述疾病的預防或治療有效且副作用少的技術方案。神經突的延長促進劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分，神經性疾病的預防或治療劑，含有上述抗體作為有效成分，神經突的延長抑制劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且抑制腦源性神經營養因子的抗體作為有效成分，伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的預防或治療劑，含有上述抑制抗體作為有效成分。
【專利說明】神經延長促進劑及延長抑制劑
[0001]本申請是國際申請日為2007年11月16日、國際申請號為PCT / JP2007 /072284、進入國家階段的申請號為200780050105.6、發明名稱為「神經延長促進劑及延長抑制劑」的PCT申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及神經延長促進劑以及延長抑制劑。具體地說，涉及識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期抗原的抗體用於神經突的延長促進、神經再生或神經突的延長抑制的用途。
【背景技術】
[0003]腦源性神經營養因子(BDNF)是被認識到在發育中和成人中，對存活、分化、突觸可塑性以及末梢和中樞神經元的選擇延長發揮重要作用的神經營養因子家族的成員(專利文獻1，非專利文獻1、2)。BDNF的cDNA編碼由247個胺基酸殘基構成的前體蛋白質。前體蛋白質具有信號肽和前蛋白，切斷它們生成119個胺基酸殘基的成熟BDNF。生物活性的BDNF(27kDa)為通過強的疏水性相互作用由兩個相同亞單位形成的二聚物。熟知BDNF與突觸的長期增強、學習以及記憶等頻率依賴性可塑性機理相關。BDNF與形成臨床上的痛覺過敏症的原因的可塑性相關(非專利文獻3)。
[0004]水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染導致急性小腦共濟失調症(ACA)、帶狀皰疹後神經痛(PHN)等神經學上的併發症 。ACA為伴隨水痘感染的最經常產生的神經學上的併發症。估計小於15歲的幼兒的每4000病例中產生1例。ACA在發疹開始數日前到3周後出現，直至完全恢復持續2~4周。帶狀皰疹在沿著伴隨有感覺異常的生皮節的區域分布中出現水皰疹，一般群體的年發病率在英國每1000人為3.4 (非專利文獻4)。PHN為帶狀皰疹的頻率最高的併發症，7~35%的患者(60歲以上的患者中超過50% )發病。PHN與急性神經炎伴隨的疼痛不同，並發無間斷的持續疼痛、電擊痛和異常性疼痛(非專利文獻5)。雖然PHN的病理生理學還不明確，但是兩神經學上的併發症在病毒感染的恢復期或之後出現暗示對於VZV的免疫應答與它們的致病性過程相關。
[0005]專利文獻1:日本特開平5-328974號公報
[0006]非專利文獻1:Nagappan G.Lu B., Trends in Neurosciences, 28:464-471, 2005
[0007]非專利文獻2:Bramham CR et al., Progress in Neurology, 76:99-125, 2005
[0008]非專利文獻3:Coull, J.A.M.et al.，Nature438:1017-1021, 2005
[0009]非專利文獻4 Johnson, R.ff.et al.，BMJ326:748-750, 2003
[0010]非專利文獻5:Donald H.Gilden et al., Neurology64:21-25, 2005

【發明內容】

[0011]本發明的目的在於，提供有助於帶狀皰疹後神經痛的機理的闡明，促進損傷的神經再生的技術方案。此外，本發明的目的在於，提供對由於帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、皰疹後神經痛、腦卒中、退行性疾病等伴隨的神經細胞死亡所導致的障礙，或上述疾病的預防或治療有效且副作用少的技術方案。
[0012]本發明人由BDNF與導致臨床上痛覺過敏症的可塑性相關，建立了可以分析PHN的病理機理的假說，對水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)與BDNF的免疫學上的相關性進行了調查。VZV在潛伏感染的神經節中表達基因4、21、29、62、63，立即早期蛋白質(immediate-earlyprotein) IE62在感染中對病毒基因的轉錄激活發揮主要作用。包含PHN患者的水痘恢復期血清在Western印跡分析中識別IE62和BDNF。本發明人對IE62與BDNF的免疫學上的關係進行了進一步調查，在它們之間發現了免疫交叉反應性。交叉反應的顯著性差異使用它們各自的單克隆抗體進行檢測。在與BDNF交叉反應的IE62抗體中，本發明人發現存在抑制BDNF的生物活性的抗體，和顯著增加通過BDNF介導的trkB介導的信號轉導和神經突的延長的其它抗體，從而完成了本發明。即，本申請發明如下所述。
[0013][1]神經突的延長促進劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。
[0014][2]上述[1]記載的促進劑，其中，上述蛋白質為IE62，上述抗體識別具有序列號2的414-429位的胺基酸序列的肽。
[0015][3]上述[1]或[2]記載的促進劑，其中，上述腦源性神經營養因子為二聚物。
[0016][4]神經性疾病的預防或治療劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。
[0017][5]上述[4]記載的預防或治療劑，其中，上述蛋白質為IE62，上述抗體識別具有序列號2的414-429位的胺基酸序列的肽。
[0018][6]上述[4]或[5]記載的預防或治療劑，其中，上述腦源性神經營養因子為二聚物。
[0019][7]上述[4]~[6]中任意一項記載的預防或治療劑,其中，上述神經性疾病為伴隨有由於選自腦卒中、缺氧症、窒息、身體損傷、暴露於毒素、惡性新生物、痴呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側索硬化症中的狀態引起的損傷的神經細胞的疾病。
[0020][8]商業包裝，包括上述[1]~[3]中任意一項記載的神經突的延長促進劑、以及記載該促進劑可以或應該用於神經突的延長的關於該促進劑的記載物。
[0021][9]商業包裝，包括上述[4]~[7]中任意一項記載的神經性疾病的預防或治療劑、以及記載該預防或治療劑可以或應該用於神經性疾病的關於該預防或治療劑的記載物。
[0022][10]神經突的延長抑制劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。
[0023][11]上述[10]記載的抑制劑，其中，上述蛋白質為IE62，上述抗體為抑制腦源性神經營養因子的抗體。
[0024][12]上述[11]記載的抑制劑，其中，上述抗體識別具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽。
[0025][13]伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的預防或治療劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。[0026][14]上述[13]記載的預防或治療劑，其中，上述蛋白質為IE62，上述抗體為抑制腦源性神經營養因子的抗體。
[0027][15]上述[14]記載的預防或治療劑，其中，上述抗體識別具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽。
[0028][16]商業包裝，包括上述[10]~[12]中任意一項記載的神經突的延長抑制劑、以及記載該抑制劑可以或應該用於神經突的延長抑制的關於該抑制劑的記載物。
[0029][17]商業包裝，包括上述[13]~[15]中任意一項記載的預防或治療劑、以及記載該預防或治療劑可以或應該用於伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的關於該預防或治療劑的記載物。
[0030][18]製備上述[1]~[7]中任意一項記載的抗體的方法，包括使用具有選自序列號2的414-429位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。
[0031][19]上述 [18]記載的方法，其中，上述抗體文庫為人抗體文庫。
[0032][20]製備上述[10]~[15]中任意一項記載的抗體的方法，包括使用具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。
[0033][21]上述[20]記載的方法，其中，上述抗體文庫為人抗體文庫。
[0034][22]神經性疾病的預防或治療方法，包括向對象給予有效量的識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體。
[0035][23]上述[22]記載的預防或治療方法，其中，上述蛋白質為IE62，上述抗體識別具有序列號2的414-429位的胺基酸序列的肽。
[0036][24]上述[22]記載的預防或治療方法，其中，上述腦源性神經營養因子為二聚物。
[0037][25]上述[22]記載的預防或治療方法，其中，上述神經性疾病為伴隨有由於選自腦卒中、缺氧症、窒息、身體損傷、暴露於毒素、惡性新生物、痴呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側索硬化症中的狀態引起的損傷的神經細胞的疾病。
[0038][26]伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的預防或治療方法，包括向對象給予有效量的識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體。
[0039][27]上述[26]記載的預防或治療方法，其中，上述蛋白質為IE62，上述抗體為抑制腦源性神經營養因子的抗體。
[0040][28]上述[27]記載的預防或治療方法，其中，上述抗體識別具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽。
[0041]根據本發明的神經突的延長促進劑，由於通過增強BDNF的作用可以促進神經突的延長，即使在少量BDNF存在下也可以期待有效地發揮效果。上述延長促進劑中含有的抗體由於與BDNF本身相比在生物體內的半衰期長，持續BDNF的增強作用的同時，活化BDNF的自分泌系統，促進BDNF自身的產生和分泌，持續地對神經細胞發生作用的BDNF活性升高。隨著時間的進一步推移，BDNF本身的活性降低，但是通過半衰期長的抗體帶來的持續性效果，可以持續提高BDNF的作用。根據本發明的神經性疾病的預防或治療劑，可以使迄今為止沒有有效技術方案的神經損傷後的神經再生。此外，本發明的神經突的延長抑制劑，由於通過抑制BDNF的作用可以抑制神經突的延長，期待對迄今為止沒有有效技術方案的帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛等發揮效果。上述延長抑制劑中含有的抗體通過中和BDNF的作用，可以抑制BDNF的自分泌系統的活化，進一步地，通過這種協同或相加的抑制效果，還可以抑制由於分泌的BDNF而導致的神經細胞進一步誘導產生BDNF的二次反應。進一步地，本發明的預防或治療劑也期待通過BDNF作用的抑制來改善經驗依賴性社會厭惡(experience-dependent social aversion)、壓力等伴隨有神經過敏的疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1A為表示水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)的立即早期(IE)62蛋白質的片段的位置關係的簡圖。
[0043]圖1B為IE62片段-GST融合蛋白質的電泳照片。
[0044]圖1C為表示調查帶狀皰疹和PHN患者的血清對IE62和BDNF的反應性的Western印跡的總結。
[0045]圖1D表示調查帶狀皰疹和PHN患者的血清對IE62和BDNF的反應性的Western印跡的一例。
[0046]圖2A為表示抗IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體對IE62片段的反應性的電泳照片。
[0047]圖2B表示使用抗IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體的VZV感染細胞的免疫組織染色。
[0048]圖2C為BDNF蛋白質的SDS-PAGE照片以及使用抗IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體的Western印跡的照片。
[0049]圖3為確定抗IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體的表位的電泳照片。
[0050]圖4A表示抗IE62單克隆抗體提高BDNF外顯子3~5的轉錄以及Arc的轉錄。
[0051]圖4B表示通過(a)不添加和(b)添加IE62和BDNF培養的皮質(GABA性)神經元的神經突的形態。比例尺表示40 μ m。 [0052]圖4C表示抗IE62單克隆抗體增加神經細胞體的面積。
[0053]圖4D表示抗IE62單克隆抗體增加神經分枝點的數目。
[0054]圖4E表示抗IE62單克隆抗體增加樹突的總長度。
[0055]圖5A表示抗IE62單克隆抗體增加脊髓神經細胞體的面積。
[0056]圖5B表示抗IE62單克隆抗體增加脊髓神經元的分枝點的數目。
[0057]圖5C表示抗IE62單克隆抗體增加脊髓神經元的神經突的總長度。
[0058]圖?表示通過(a)不添加(對照)以及(b)添加IE62和BDNF培養的脊髓后角神經元的神經突的形態。比例尺(seal bar)表示40 μ m。
[0059]圖6A為使用單克隆抗體KSG1的大腦皮質細胞的免疫染色的照片。倍率為1000倍。
[0060]圖6B為使用單克隆抗體KSG1的中腦細胞的免疫染色的照片。倍率為1000倍。
[0061]圖6C為使用單克隆抗體KSG4的大腦皮質細胞的免疫染色的照片。倍率為400倍。
[0062]圖6D為使用單克隆抗體KSG4的中腦細胞的免疫染色的照片。倍率為1000倍。[0063]圖7為表示往大鼠胎兒原代培養大腦皮質中添加用PHN患者血清處理過的BDNF時的BDNF mRNA表達量的變動結果的圖。
【具體實施方式】
[0064]本發明的神經突的延長促進劑含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。該抗體與後述的本發明的神經突的延長抑制劑中含有的抑制抗體區別時稱為促進抗體。
[0065]上述抗體為識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質的抗體。其中，水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)為α皰疹病毒屬的成員，是水痘(varicella)和帶狀皰疹(zoster)的病原介質。VZV基因組為直鏈狀雙鏈DNA分子，例如J.Gen Virol.(1986)，67，1759-1816中公開了其全部核苷酸序列以及編碼的蛋白質的胺基酸序列。此外，作為VZV(人皰疹病毒3)，在Genbank Accesion No:Nc_001348中，公開了全部基因組的核苷酸序列和由該基因組編碼的蛋白質的胺基酸序列。VZV基因組編碼約70種蛋白質。認為VZV的全部基因在立即早期(immediate-early) (IE)、早期(E)和後期(L)的三個寬動態類別(dynamic class)中，在受感染細胞中表達。VZV IE62蛋白質參與VZV蛋白質的三個動態類別的所有表達的活化。
[0066]上述抗體是在VZV編碼的蛋白質中，將立即早期蛋白質、更優選IE62作為抗原製備的。作為抗原的IE62蛋白質在上述文獻和Genbank等中也公開了其胺基酸序列。例如，人抱疫病毒3VZV_0ka株的情況下，在Genbank Accession No:AY016449中公開了 IE62的核昔酸序列(序列號1)和胺基酸序列(序列號2)。此外，人皰疹病毒3VZV-野生株(Kawaguchi株)參照 Journal of Virology2002pl 1447-144459 ?
[0067]上述促進抗體優選識別具有序列號2的IE62的胺基酸序列中414-429位胺基酸序列(PGYRSISGPDPRIRKT:序列號3)的肽。上述識別所述肽的促進抗體由於更顯著地具有與後述BDNF的交叉反應性，所以優選。上述肽發揮作為本發明中的促進抗體的表位的功能，只要不喪失作為抗原決定簇的功能，則可以從序列號3的胺基酸序列的N末端和/或C末端缺失1~3個左右的胺基酸。此外，上述肽只要不喪失作為抗原決定簇的功能，則可以在其N末端或C末端具有1個~數個(通常1~5個、優選為1~3個)追加的胺基酸序列。作為追加的胺基酸殘基，可以舉出為了與後述高分子化合物(蛋白質)結合而導入的半胱氨酸殘基等。
[0068]上述抗體的特徵在於，可以高靈敏度且高特異性地識別立即早期蛋白質、優選為IE62，並且與腦源性神經營養因子(BDNF)交叉反應。
[0069]腦源性神經營養因子(BDNF)，在GenBank Accession N0.NM_170731_170735、NM_001709中公開的是人BDNF的核苷酸序列和胺基酸序列。與上述促進抗體交叉反應的BDNF為成熟體，優選為成熟體的二聚物。
[0070]本說明書所稱的「抗體」中，包括多克隆抗體、單克隆抗體等天然型抗體，使用基因重組技術製備的嵌合抗體、人源化抗體或單鏈抗體，可以使用產生人抗體的轉基因動物等製備的人抗體，通過噬菌體展示製備的抗體及它們的結合性片段。
[0071]結合性片段指的是上述抗體的一部分的區域，具體地說，可以舉出例如F(ab』)2、Fab，、Fab、Fv (抗體的可變區)、sFv、dsFv ( 二硫鍵穩定性FV)、dAb (單域抗體)等(Exp.Opin.Ther.Patents, Vol.6，N0.5，p.441-456，1996)。
[0072]對抗體類別不特別限定，還包括具有IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任意同種型的抗體。優選為IgG或IgM，若考慮到純化的容易性等，則更優選為IgG。
[0073]多克隆抗體或單克隆抗體可以通過已知的常規製備方法來製備。具體地，例如將免疫原、根據需要與弗氏佐劑一起免疫接種到哺乳動物中，例如多克隆抗體的情況下，免疫接種到小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、貓、狗、豬、山羊、馬或牛等，優選小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、山羊、馬或兔，單克隆抗體的情況下，免疫接種到小鼠、大鼠、倉鼠。
[0074]在一個實施方式中，作為免疫原的IE62肽可以通過公知的方法製備。例如，可以根據常規方法合成含有序列號3的胺基酸序列的肽，與牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵白蛋白(0VA)、匙孔蜮.血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白(TG)或免疫球蛋白等高分子化合物(蛋白質)形成複合體後，用作免疫原。
[0075]為了形成上述IE62肽與高分子化合物的複合體和其它目的，可以附加1個或數個胺基酸。對附加的胺基酸的數目不特別限定，但是若考慮到所製備的抗體的特異性，優選為1~10個、更優選為1~5個、進一步優選為1~2個、最優選為1個。附加的胺基酸的位置可以為多肽的N末端或C末端中的任意一端，但是優選為C末端。
[0076]複合體可以通過公知的方法形成，不特別限定。例如，可以通過混合酸酐法或活性酯法等使上述IE62肽的羧基與上述高分子化合物的官能團反應，形成複合體。此外，也可以向上述IE62肽的C末端導入半胱氨酸殘基， 通過該半胱氨酸的側鏈SH基使上述肽與上述高分子化合物結合。
[0077]在另一實施方式中，例如，可以使用將編碼含有序列號3的胺基酸序列的肽的核苷酸與編碼其它的蛋白質(例如，穀胱甘肽-S-轉移酶(GST))的核苷酸連結而成的表達載體，通過常規方法作為與其它蛋白質的融合蛋白質在宿主中表達，進行純化，將純化物用作免疫原。
[0078]多克隆抗體具體地說可以如下製備。即，對小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、山羊、馬或兔，優選山羊、馬或兔，更優選兔，皮下、肌內、靜脈內、足墊內或腹腔內注射1次~數次免疫原，實施免疫致敏。通常，從初次免疫起約每1天~14天進行1次~5次免疫,從最終免疫起約1天~5天後，從免疫致敏的該哺乳動物取得血清。
[0079]雖然血清可以用作多克隆抗體，但是優選通過超濾、硫酸銨分級分離、優球蛋白沉澱法、己酸法、辛酸法、離子交換色譜(DEAE或DE52等)，使用抗免疫球蛋白色譜柱、蛋白A/G色譜柱、或免疫原交聯而成的色譜柱等的親和柱色譜進行分離和/或純化。
[0080]單克隆抗體如下製備:通過由上述免疫致敏動物得到的產生該抗體的細胞和無自身抗體產生能力的骨髓瘤細胞製備雜交瘤，克隆該雜交瘤，選擇產生對於哺乳動物的免疫中使用的免疫原表現出特異性的親和性、且表現出與BDNF的交叉反應性的單克隆抗體的克隆。
[0081]單克隆抗體具體地說可以如下製備。即，對小鼠、大鼠或倉鼠(包括產生人抗體的轉基因小鼠等製成產生來自其它動物的抗體的轉基因動物)的皮下、肌內、靜脈內、足墊內或腹腔內注射1次~數次免疫原或移植免疫原，實施免疫致敏。通常，從初次免疫起約每1天~14天進行1次~4次免疫，從最終免疫起約1天~5天後，從免疫致敏的該哺乳動物取得產生抗體的細胞。[0082]分泌單克隆抗體的雜交瘤(融合細胞)的製備可以通過Kohler和Milstein等的方法(Nature，Vol.256，p.495-497,1975)以及基於此的修飾方法來進行。即，通過使如上所述從免疫致敏的哺乳動物取得的脾臟、淋巴結、骨髓或扁桃體等，優選脾臟中含有的產生抗體的細胞與優選來自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人等哺乳動物，更優選來自小鼠、大鼠或人的無自身抗體產生能力的骨髓瘤細胞的細胞融合來製備。
[0083]細胞融合中使用的骨髓瘤細胞的例子包括來自小鼠的骨髓瘤P3 /X63-AG8.653(653 ；ATCC N0.CRL1580)、P3 / NSI / 1-Ag4_l (NS-1)、P3 / X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2 / 0-Agl4(Sp2 / 0、Sp2)、PA1、F0 或 BW5147，來自大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，來自人的骨髓瘤 U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或 CEM-T15。
[0084]產生單克隆抗體的雜交瘤克隆的篩選可以如下進行:將雜交瘤例如在微量滴定板中培養，對於已經見到增殖的孔的培養上清對在上述免疫致敏中使用的免疫原的反應性、以及上述上清對BDNF的反應性，例如通過ELISA等的酶免疫測定法進行測定。
[0085]上述雜交瘤可以使用培養基(例如，含有10%胎牛血清的DMEM)進行培養，將該培養液的離心上清作為單克隆抗 體溶液。此外，可以通過將該雜交瘤注入到其來源的動物的腹腔中，生成腹水，將得到的腹水作為單克隆抗體溶液。單克隆抗體與上述多克隆抗體同樣地優選進行分離和/或純化。
[0086]此外，嵌合抗體例如可以參考《實驗醫學(臨時增刊號)，Vol.6, N0.10，1988》、日本特公平3-73280號公報等來製備，人源化抗體例如可以參考日本特表平4-506458號公報、日本特開昭62-296890號公報等來製備。人抗體可以參考例如《Nature Genetics,Vol.15，p.146-156，1997》、《Nature Genetics, Vol.7, p.13-21，1994》、日本特表平
4-504365號公報、國際申請公開W094 / 25585號公報、《Nikken Science、6月號、第40頁~第50頁、1995年》、《Nature, Vol.368,p.856-859，1994》、日本特表平6-500233號公報等來製備。
[0087]通過噬菌體展示進行的抗體製備中，由為了篩選抗體而製備的噬菌體文庫，例如通過生物淘篩(biopanning)回收、濃縮對抗原具有親和性的曬菌體，可以容易地得到Fab等抗體。此時，優選使用具有選自序列號2的414-429位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽作為抗原，對抗體文庫進行篩選。對於優選的抗體文庫和抗體的篩選方法，參照國際公開第01 / 062907號小冊子、日本特開2005-185281號。
[0088]在噬菌體文庫中，存在可以與所有抗原反應的克隆。因此，若抗原為IE62，則得到對於IE62中存在的所有表位的抗IE62抗體的克隆。對於該克隆組，若使用BDNF作為第二抗原進行篩選，則得到交叉的抗體。基於對BDNF活性的作用，可以選擇具有抑制或促進人型BDNF活性的機能的抗體。所得到的人型抗體對人的應用是有利的。
[0089]F(ab』)jPFab』可以通過分別用作為蛋白分解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶對免疫球蛋白進行處理來製備。Fab可以通過對Fab表達噬菌體文庫與通過上述噬菌體展示進行的抗體製備法同樣地進行篩選來製備。
[0090]如此得到的識別IE62蛋白質的抗體可以通過利用通常的抗原-抗體反應的方法對IE62蛋白質進行檢測或定量。上述方法不特別限定，可以舉出放射性同位素免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(例如ELISA)、螢光或發光測定法、凝聚法、Western印跡法、免疫色譜法等(Meth.Enzymol.,92, p.147-523(1983), Antibodies Vol.1I IRL PressOxford(1989))o
[0091]作為本發明神經突的延長促進劑的有效成分上述促進抗體與迄今為止已知的VZV的抗體不同，具有促進通過BDNF的神經突的延長的作用。其中，神經突包括形成在神經細胞外側的軸突、樹狀突和軸突側枝。神經突的延長促進指的是，在顯微鏡下觀察神經細胞測定神經突的總長度時，其總長度與對照相比增加。此時的對照指的是，除了未添加本發明的促進劑之外，置於相同條件下的神經細胞。
[0092]本發明的促進劑中含有的抗體的量只要發揮上述作用和效果則不特別限定，但是通常為0.001~90重量％、優選為0.005~50重量％、更優選為0.01~10重量％。
[0093]本發明的促進劑除了上述抗體以外還可以含有載體。作為上述載體，可以使用在製劑領域中通常使用的載體，可以舉出例如，蔗糖、澱粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、磷酸鈣、碳酸鈣等賦形劑，苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯等保存劑，檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸等穩定劑，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鋁等懸浮劑，表面活性劑等分散劑，水、生理鹽水等稀釋劑，甘油、聚乙二醇等底蠟等，但是不限於此。
[0094]作為本發明的促進劑作用的細胞，可以舉出神經細胞，特別是損傷的神經細胞等。
[0095]本發明的促進劑可以用作研究用試劑。此外，可以在體內促進神經細胞的突起的延長。為了體內應用，可以舉出例如，通過將本發明的促進劑添加到培養基中使其與培養中的神經細胞進行接觸，並繼續適當培養的方法。
[0096]本發明的促進劑可以向生物體給藥，以促進神經細胞的突起的延長。作為向生物體給藥的方法不進行限定，可以舉出例如，皮下注射、肌肉注射、腹腔內注射、點滴注射等。除了口服給藥、靜脈內給藥、肌內給藥等全身給藥之外，還可以舉出向腦內或髓腔內(脊髓液中)、一側背側海馬的局部給藥。向腦內局部給藥時，本發明的促進劑可以包含在含膠原的載體中。
[0097]具有促進神經突延長的作用的上述促進抗體期待使神經細胞、特別是損傷的神經細胞再生。本發明提供含有上述抗體作為有效成分的神經性疾病的預防或治療劑。
[0098]本發明的預防或治療劑中含有的促進抗體的量只要發揮上述作用效果則不特別限定，但是通常為0.001~90重量％、優選為0.005~50重量％、更優選為0.01~10重量％。
[0099]本發明的預防或治療劑除了上述促進抗體之外，還可以含有載體。作為上述載體，可以舉出上述促進劑中舉出的載體。
[0100]適用本發明的預防或治療劑的神經性疾病，是通過促進神經突的延長，可以期待病理的改善的疾病。可以舉出例如，伴隨有由於腦卒中、缺氧症、窒息、身體損傷、暴露於毒素、惡性新生物、痴呆、糖尿病相關的末梢神經障礙、神經退行性疾病(帕金森病、阿爾茨海默病、亨延頓舞蹈症、肌萎縮性側索硬化症、脊髓小腦變性症等)、免疫性神經疾病(多發性硬化症、格-巴症候群、重症肌無力、肌炎等)、感染性疾病(腦炎、腦膜炎等)、血管障礙(腦梗塞、腦出血等)、其它的神經性疾病(肌營養不良、癲癇、線粒體性腦肌病等)等狀態引起的損傷的神經細胞的疾病。優選為缺氧症、窒息、身體損傷、暴露於毒素、惡性新生物、痴呆、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側索硬化症。
[0101]作為本發明的促進劑、預防或治療劑的給藥對象，可以舉出小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、馬、綿羊、猴、人等哺乳動物。
[0102]由於腦卒中發病時血腦屏障局部被破壞，可以期待本發明的促進劑容易地運送到腦中。作為血腦屏障開放劑，可以同時給予甘露糖醇、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗果低聚糖(fructoligosaccharide)、葡糖醒酸、甘油、鹿糖、亞戍基四唑(metrazol)、依託泊苷(etopside)、合成膽汁鹽、膽酸類、二甲基亞碸、腺苷酸類、無機鹽類或有機酸類。
[0103]促進劑、預防或治療劑可以以口服、直腸內、胃腸外、腦池內(intracistemally)、陰道內、腹腔內、局部(以粉末、軟膏、凝膠、點滴注射劑或透皮貼劑等形式)、口內、經口或鼻腔噴霧的形式給藥。本說明書中使用的用語「胃腸外」指的是包括靜脈內、肌內、腹腔內、胸骨內、皮下和關節內注射以及注入的給藥方式。 [0104]促進劑、預防或治療劑還可以通過緩釋性系統適當地給藥。緩釋性試劑的適當的例子，包含適當的聚合物物質(例如，成型品(例如，膜或微囊)形態的半透性聚合物基質)、適當的疏水性物質(例如，可以接受的質量的油中的乳液的形式)或離子交換樹脂、以及難溶性衍生物(例如，難溶性鹽)。
[0105]使用本發明的促進劑、預防或治療劑，考慮到各患者的臨床狀態、給藥部位、給藥方法、給藥方案以及本領域技術人員公知的其它因素，以遵守醫療實施基準(Good MedicalPractice)的方式制定處方以及給藥。因此，本說明書中，所需的「有效量」進行這種考慮來決定。作為通常的提案，胃腸外給藥的單位劑量的治療劑中總的藥學有效量為患者體重的約1 μ g / kg /天~10mg / kg /天，但是如上所述其依賴於治療上的考慮。進一步優選該用量至少為0.01mg/kg /天，最優選對於人為約0.01mg/kg /天與約lmg / kg /天之間。連續給藥時，代表性地以約1 μ g / kg /小時~約50μ g / kg /小時的給藥速度通過每天1次~4次的注射或連續皮下注入(例如使用微型泵)中的任意一種給予治療劑。此外還可以使用靜脈給藥用的袋溶液。為了觀察變化，根據所需的效果改變必要的處置時間和產生應答的處置後的間隔。
[0106]本發明的神經突的延長抑制劑含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質、且與腦源性神經營養因子(BDNF)交叉反應的抗體作為有效成分。上述抑制劑中作為有效成分含有的抗體，與迄今為止已知的VZV的抗體不同，是通過與BDNF交叉反應抑制BDNF的作用，具有抑制神經突的延長的作用的抗體。上述抗體也簡稱為抑制抗體。
[0107]上述抑制抗體，優選識別具有選自序列號2的IE62的胺基酸序列中，268-341 位的胺基酸序列(GPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP:序列號18)中的至少7個連續胺基酸的肽。識別上述肽的抗體由於與BDNF交叉反應且抑制BDNF的作用，所以優選。上述肽發揮作為本發明中的抗體的表位的功能。
[0108]上述抑制抗體，除了使用由序列號18的胺基酸序列構成的肽或具有選自序列號18的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽來替代由序列號3的胺基酸序列構成的肽之外，可以與上述促進抗體的製備方法同樣地製備。
[0109]本發明的抑制劑中含有的抑制抗體的量只要發揮上述作用效果則不特別限定，通常為0.001~90重量％、優選為0.005~50重量％、更優選為0.01~10重量％。
[0110]本發明的抑制劑除了上述抑制抗體以外還可以含有載體。作為上述載體，可以使用在製劑領域中通常使用的載體，可以舉出例如，蔗糖、澱粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、磷酸鈣、碳酸鈣等賦形劑，苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯等保存劑，檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸等穩定劑，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鋁等懸浮劑，表面活性劑等分散劑，水、生理鹽水等稀釋劑，甘油、聚乙二醇等底蠟等，但是不限於此。
[0111]作為本發明的抑制劑作用的細胞，可以舉出神經細胞，特別是損傷的神經細胞等。
[0112]本發明的抑制劑可以用作研究用試劑。此外可以在體內抑制神經細胞的突起的延長。為了適用於體內，可以舉出例如，通過將本發明的抑制劑添加到培養基中使其與培養中的神經細胞接觸，並繼續適當培養的方法。
[0113]本發明的抑制劑可以向生物體給藥，以抑制神經細胞的突起的延長。作為向生物體給藥的方法不進行限定，可以舉出例如，皮下注射、肌肉注射、腹腔內注射、點滴注射等。除了口服給藥、靜脈內給藥、肌內給藥等全身給藥之外，還可以舉出向腦內或髓腔內(脊髓液中)、一側背側海馬的局部給藥。向腦內局部給藥時，本發明的抑制劑可以包含在含膠原的載體中。
[0114]具有抑制神經突延長的作用的`上述抑制抗體期待抑制神經的過敏狀態。本發明提供含有上述抗體作為有效成分的伴隨有神經過敏的疾病的預防或治療劑。
[0115]本發明的預防或治療劑中含有的抑制抗體的量只要發揮上述作用效果則不特別限定，通常為0.001~90重量％、優選為0.005~50重量％、更優選為0.01~10重量％。
[0116]本發明的預防或治療劑除了上述抑制抗體之外，還可以含有載體。作為上述載體，可以舉出上述抑制劑中舉出的載體。
[0117]作為適用本發明的抑制劑、預防或治療劑的疾病，是通過抑制神經突的延長，可以期待病理的改善的疾病。可以舉出例如，帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡、壓力等。慢性疼痛分類為:
[0118](1)認為傷害性感受器被持續刺激而產生的傷害性疼痛，
[0119](2)由與疼痛傳遞或抑制機理相關的神經纖維的功能異常引起的神經源性疼痛，以及
[0120](3)感情或情緒方面受到負荷的心因性疼痛。本說明書中的慢性疼痛指的是神經源性疼痛(神經的損傷、壓迫等引起的疼痛)、傷害性疼痛(癌症、風溼等中的疼痛)兩種。經驗依賴性社會厭惡(社會的挫折壓力)是指中腦緣多巴胺路徑中的BDNF發揮必需的作用的狀態。
[0121]作為本發明的抑制劑、預防或治療劑的給藥對象，可以舉出小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、馬、綿羊、猴、人等哺乳動物。
[0122]抑制劑、預防或治療劑可以以口服、直腸內、胃腸外、腦池內(intracistemally)、陰道內、腹腔內、局部(以粉末、軟膏、凝膠、點滴注射劑或透皮貼劑等形式)、口內、經口或鼻腔噴霧的形式給藥。本說明書中使用的用語「胃腸外」指的是包括靜脈內、肌內、腹腔內、胸骨內、皮下和關節內注射以及注入的給藥方式。
[0123]抑制劑、預防或治療劑還可以通過緩釋性系統適當地給藥。緩釋性試劑的適當的例子，包含適當的聚合物物質(例如，成型品(例如，膜或微囊)形態的半透性聚合物基質)、適當的疏水性物質(例如，容許品質油中的乳液的形式)或離子交換樹脂、以及難溶性衍生物(例如，難溶性鹽)。
[0124]使用本發明的抑制劑、預防或治療劑，在考慮各患者的臨床狀態、給藥部位、給藥方法、給藥方案以及本領域技術人員公知的其它因素的基礎上，以遵守醫療實施基準(GoodMedical Practice)的方式制定處方以及給藥。因此，本說明書中，所需的「有效量」進行這種考慮來決定。作為通常的提案，胃腸外給藥的單位劑量的治療劑的總藥學有效量為患者體重的約1 μ g / kg /天~10mg / kg /天，但是如上所述其依賴於治療上的考慮。進一步優選該用量至少為0.01mg / kg /天，最優選對於人為約0.01mg / kg /天與約lmg/kg/天之間。連續給藥時，代表性地以約1 μ g/kg /小時~約50yg / kg/小時的給藥速度通過每天1次~4次的注射或連續皮下注入(例如使用微型泵)中的任意一種給予治療劑。此外還可以使用靜脈給藥用的袋溶液。為了觀察變化，根據所需的效果改變必要的處置時間和產生應答的處置後的間隔。
[0125]實施例
[0126]以下通過實施例對本發明進行具體的說明，但是本發明不被這些實施例所限定。
[0127]病毒和細胞培養
[0128]使VZV的Oka株(用來自減毒水痘病毒Oka株(日本特公昭53-41202號或美國專利第3985615號)的病毒作為種子來製備，在世界各國廣泛供於實用(Requirements forVaricella Vaccine(Live)Adoptedl984 ；Revisedl993:WH0 Technical Report Series,N0.848，pp.22-38,1994)。該減毒Oka株以保藏編號VR-795於1975年3月14日保藏在ATCC。)和 VZV 的 Kawaguchi 株(Journal of Virology, Nov.2002，P.11447-11459)在人胚胎肺細胞或人肺癌細胞株A549細胞中增殖。上述細胞分別在補加有10%和2%胎牛血清的Eagle』 s最低必須培養基中生長、維持。
[0129]大鼠皮層神經元的原代培養細胞根據已經報導的方法(Tabuchi，A.，et al.，J.Biol.Chem.277，3592`0-35931 (2002))，由 17 ~18 天齡大鼠胚胎(Sprague-Dawley)的大腦皮質製備。簡要地說，將大腦皮質的小片依次通過酶(DNase I (Sigma)處理和胰蛋白酶(Sigma))處理以及機械分離形成片斷，將該細胞以5X106個的密度接種到60_的培養皿(Iwaki)中。使上述細胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s培養基(Nissui)中生長48小時，接著將培養基更換為含有葡萄糖(4.5mg / ml)、轉鐵蛋白(5 μ g / ml)、胰島素(5yg / ml)、亞硒酸鈉(5yg / ml)、牛血清白蛋白(lmg / ml)和硫酸卡那黴素(100 μ g / ml)的無血清Dulbecco’s改良Eagle’s培養基(TIS培養基)。加入阿糖胞苷(Sigma) 2 μ M，抑制神經膠質細胞的增殖。在DNA轉染的2小時前，將培養基更換為新鮮的TIS培養基(不含阿糖胞苷)。
[0130]實施例1
[0131]GST-1E62融合蛋白質的表達和多克隆抗體的產生
[0132]將VZV的IE蛋白質的一部分分割成片段，合成為GST融合蛋白質。上述GST融合蛋白質如圖1A所示，相互重疊覆蓋分子整體。表達穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)-1E62融合蛋白質的重組質粒通過擴增VZV基因的IE62基因，並將擴增DNA片段插入到載體pGEX-4T~l (Pharmacia)中來構建。
[0133]1) RNA的分離和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)
[0134]全RNA使用IS0GEN(日本Gene)從培養細胞中提取。RT-PCR根據已經報導的方法(Kawasaki,E.S.,et al., Amplification of RNA.1n PCR Protocol,A Guide to methodsand applications,Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991))進行。簡要地說，將全RNA(1 μ g)在20μ 1的IX第一鏈緩衝液中逆轉錄到cDNA。上述緩衝液含有下述物質:
[0135]作為引物的0.5μΜ Oligo(dT) 15(5，-AAGCTTTTTTTTTTV-3 』 )(序列號 6)，200 單位的 SuperScript II 逆轉錄酶(Invitrogen), 400 μ M dNTPs,以及 10 單位的 RNase 抑制劑(Invitrogen)。
[0136]逆轉錄反應後，對反應混合物用1.1單位的RNase H(Invitrogen)在37°C下處理20分鐘，作為cDNA溶液用於PCR。PCR在含有1 μ 1的cDNA溶液、1.25單位的AmpliTaqGold DNA 聚合酶(PerkinElmer Life Sciences) ,1.5mM MgCl2、200yM dNTPs 和 0.5 μ M 引物對的50 μ 1的1XPCR緩衝液中進行。為了區別大鼠BDNF基因的四個外顯子(外顯子1、外顯子I1、 外顯子III和外顯子IV)，使用
[0137]E-1 (5，-ACTCAAAGGGAAACGTGTCTCT-3』 )(序列號 7)、
[0138]E-1I (5，-CGGTGTAGGCTGGAATAGACT-3』 )(序列號 8)、
[0139]E-1II (5，-CTCCGCCATGCAATTTCCACT-3，)(序列號 9)、
[0140]E-1V(5，-GTGACAACAATGTGACTCCACT-3，)(序列號 10)和
[0141]E-Vas (5，-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3，)(序列號 11)。
[0142]作為內標，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)cDNA用GAPDH正義(5』 -TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3』)(序列號 12)和反義(5』-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3，)(序列號 13)引物對進行擴增。K)NF cDNA 的擴增中，PCR條件為，在95°C下預熱10分鐘後，如下進行:以在94°C變性1分鐘，在55°C退火1分鐘，在72°C延長1.5分鐘作為一個循環，進行32個循環(外顯子I)、31個循環(外顯子II)、26個循環(外顯子III)和29個循環(外顯子IV)，並在72°C最終延長10分鐘。GAPDH的擴增在與上述相同的條件下進行31個循環。PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠上的電泳分離，用溴化乙錠染色的DNA的帶的密度，使用Bit-Map loader (ΑΤΤ0)和軟體(NIH Imagel.52)分析。
[0143]2) GST-1E62融合蛋白質的表達
[0144]將構建的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21中，得到轉化體。培養該轉化體，並往其中添加ImM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，在37°C下培養4小時或在室溫下培養一夜，由此誘導融合蛋白質的表達。誘導的融合蛋白質通過SDS-PAGE確認(圖1B)。誘導的融合蛋白質，使用穀胱甘肽瓊脂糖4B (Pharmacia)基於製造者的指令及用SDS-PAGE確認的分子量進行純化。重組質粒的構建通過它們的序列確認。IE62融合蛋白質的抗原性通過免疫印跡程序確認。
[0145]3)多克隆抗體的產生
[0146]根據常規方法，將融合蛋白質1~5免疫接種到兔中，將其免疫血清用於免疫印跡和對於VZV感染細胞的免疫螢光抗體試驗。
[0147]實施例2
[0148]IE62的單克隆抗體的產生
[0149]IE62的單克隆抗體，使用GST-1E62融合蛋白質，本質上根據已經報導的方法(Okuno et al，Virologyl29，357-368 (1983))進行製備。通過對於 GST 蛋白質的 ELISA 和對於VZV感染細胞的免疫螢光抗體，篩選雜交瘤的培養上清，克隆產生IE62單克隆抗體的雜交瘤。[0150]實施例3
[0151]免疫螢光抗體(IFA)分析
[0152]在_20°C下用丙酮固定VZV感染細胞，分別使用BDNF或IE62的單克隆抗體以及與螢光素結合的抗小鼠IgG血清作為一次抗體和二次抗體進行染色。所產生的GST-1E62融合蛋白質的兔抗血清使用與突光素結合的抗兔IgG血清(Jackson)作為二次抗體，通過VZV感染細胞的免疫螢光抗體來確認。
[0153]實施例4
[0154]Western 印跡
[0155]將GST-1E62融合蛋白質或VZV感染細胞的溶解液負載在SDS凝膠上，通過電泳進行分離，轉印到硝酸纖維素膜(Millipore)上。上述膜通過GST-1E62融合蛋白質的兔抗血清、抗IE62單克隆抗體(1:10000稀釋、阪大微生物學病研究所制)或抗人BDNF單克隆抗體(稀釋成0.5yg / ml、R&D Systems制)進行探針標記。與過氧化物酶結合抗兔IgG血清或山羊抗小鼠IgG血清一起進一步培養1小時後，通過ECL法(Nacalai Tesque)展開免疫印跡。
[0156]實施例5
[0157]被抗IE62單克隆抗體識別的IE62的表位的決定
[0158]被抗IE62單克隆抗體識別的IE62的表位，通過使用合成肽的IE62的Western印跡的封閉進行分析。表位為圖1A所示的融合蛋白質C與F之間的重複區域，對應於IE62的414-447位的胺基酸。
[0159]將上述區域分為三個部分，使用含有下述胺基酸序列的三種肽180μ g:
[0160]肽1:PGYRSISGPDPRIRKT(序列號:3)
[0161]肽I1:KRLAGEPGRQRQKSF(序列號:4)，和
[0162]肽II1:SLPRSRTPIIPPVSG(序列號:5)
[0163]在Western印跡中封閉抗IE62單克隆抗體與IE62的相互作用。
[0164]實施例6
[0165]BDNF和抗IE62抗體對於原代培養神經元的作用
[0166]用氯胺酮(50mg / kg, 1.p.)麻醉Sprague-Dawley大鼠(出生後0~1天)，接著通過頸椎脫白處死。全部的努力是為了使所用的動物數目和它們的痛苦為最低限度來進行的。實驗方法符合大阪大學醫學部的動物管理委員會規則以及涉及實驗動物的處理的NIH 的指南。通過通常的微島法(Kimura et al., J Neurophysiol.May ；77 (5).2805-2815，1997)，培養孤立神經元。從腦取出視覺皮質的一片，用木瓜蛋白酶(20U / ml)進行酶解離，用磨光玻璃移液管進行粉碎。在置於瓊脂糖片上的膠原點上，在前面製備的膠質細胞微島上載置神經元，在以補 加有B27(Gibco)的神經基礎A培養基(Gibco)為基本的溶液中發育。如此將由相同的動物培養的神經元分為兩組，以規定的濃度向培養基中添加BDNF(在大腸桿菌中表達的重組蛋白質:Sigma制、在昆蟲細胞中表達的重組蛋白質:R&D Systems制)和實施例2中製備的抗IE62單克隆抗體，由日齡一致的姐妹培養物得到數據。平板接種後10~15天進行記錄。
[0167]接著，就BDNF和抗IE62抗體以及作為TrK受體酪氨酸激酶的抑制劑的K252a對脊神經後根神經元的作用進行研究。結果如圖5A-?所示。[0168]實施例7
[0169]形態的分析
[0170]記錄螢光圖像後，將神經元和與生物素結合的抗小鼠IgGl —起在37°C下培養1小時。然後，使用ABC試劑盒(Vector Laboratories),使MAP2可視化。使用設置在倒置顯微鏡(TE300 ;Nikon)上的Neurolucida(MicroBrightField),描繪神經元的神經突。神經突的形態的定量評價使用分析軟體Neuroexplore (MicroBrightField)進行。
[0171]實施例8 [0172]通過抗IE62單克隆抗體實現的Arc (Activity-regulatedcytoskeleton-associated protein)和 BDNF 的轉錄增強
[0173]由實施例6中使用的大鼠原代培養神經元，使用IS0GEN(日本GENE)提取全RNA。定量PCR如下進行。對於大鼠BDNF基因的外顯子III~V(Imamura L.et al., JPharmacol., Exp.Ther316:136-143, 2006) Arc cDNA 和 β-肌動蛋白 cDNA,分別使用 Arc 正義(5』-CGCTGGAAGAAGTCCATCAA-3，)(序列號 14)、Arc 反義(5 』-GGGCTAACAGTGTAGTCGTA-3 』)(序列號15)、β -肌動蛋白正義(5』 -TTTGAGACCTTCAACACCCC-3』 )(序列號16)、β -肌動蛋白反義(5』 -ACGATTTCCCTCTCAGCTGT-3』 )(序列號17)引物，進行定量PCR擴增。
[0174]PCR的溫度分布是在95°C預變性10分鐘後如下所述:以在95°C變性45秒，在55°C退火45秒以及在72°C延長1分鐘作為1個循環，進行45個循環(外顯子I)、31個循環(外顯子II)、26個循環(外顯子III)和29個循環(外顯子IV)，並在72°C最終延長10分鐘。BDNF基因的外顯子III~V的擴增使用57°C的退火溫度。螢光在各72°C的延長步驟的最終階段獲得。各mRNA的表達水平使用β-肌動蛋白mRNA的水平進行歸一化。
[0175]結果
[0176]融合蛋白質
[0177]重組質粒的構建通過它們的序列確認。GST-1E62融合蛋白質1~5的免疫原性通過使用VZV抗血清的Western印跡確認。該抗血清通過IFA試驗確認VZV感染細胞的核染色為陽性，用Western印跡檢出IE62蛋白質。接著，對IE62-GST融合蛋白質進行定量，作為IE62蛋白質進一步用於特性評價。圖1A表示含有整個IE62分子和它們的產物的GST-1E62融合蛋白質1~5和A~G的簡圖。
[0178]通過帶狀皰疹恢復期血清識別IE62和BDNF
[0179]圖1C和圖1D表示來自帶狀皰疹患者的血清與BDNF、GST_IE62融合蛋白質2反應的總結，以及Western印跡的代表性圖案的一例。帶狀皰疹患者血清(N0.23)在Western印跡中識別IE62的片段2和F以及BDNF。另一方面，患者血清(N0.28)識別IE62的片段2，但是未識別IE62的片段F或BDNF。6名患者的血清與BDNF反應，其中5名患者的血清識別IE62融合蛋白質。2名患者的血清識別IE62，但是未識別BDNF。IE62與BDNF的識別雖然在全部患者中不相關，但是來自6名患者的血清表現出與對IE62和BDNF的抗體應答的相關。
[0180]通過各單克隆抗體進行的BDNF和IE62的交叉識別
[0181]本發明人製備了 IE62-GST融合蛋白質的單克隆抗體。該單克隆抗體對於覆蓋整個IE62分子的IE62-GST融合蛋白質的反應性如圖2A所示。如圖2A所示，抗BDNF單克隆抗體和抗VZV IE62單克隆抗體兩者都同樣地識別VZV IE62的相同區域。圖2B表示通過抗BDNF單克隆抗體和抗VZV IE62單克隆抗體染色的IFA圖案，兩抗體主要染色受感染細胞的核。通過Western印跡和IFA確認抗BDNF單克隆抗體識別IE62蛋白質。
[0182]如圖2C所示，BDNF蛋白質被抗VZV IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體兩者印跡、探針標記，兩抗體同樣地識別BDNF。用抗IE62單克隆抗體探針標記BDNF時，與BDNF的二聚物反應，而不是與其單體反應。這暗示了抗IE62單克隆抗體識別通過BDNF 二聚物形成的立體結構的表位。識別IE62的抗BDNF單克隆抗體與抗IE62單克隆抗體同樣地，與BDNF的二聚物反應，而不是與BDNF的單體反應。VZV IE62與BDNF的這種免疫學交叉反應性通過各自的單克隆抗體確認。
[0183]BDNF與IE62的交叉反應表位的鑑定
[0184]抗IE62單克隆抗體除了識別GST融合蛋白質2之外，還識別區域C和F(圖2A)。區域C和F的重疊區域表示IE62蛋白質的胺基酸414-447位，使用含有該區域的3個構建肽，在Western印跡中封閉反應，由此決定VZV IE62的表位。含有414位~429位胺基酸的肽封閉抗VZV IE62抗體與抗BDNF抗體兩抗體的相互作用。這表示IE62的胺基酸414-447位的肽的表位被抗VZV IE62抗體和抗BDNF抗體識別(圖3)。但是，該肽不能在Western印跡中封閉抗IE62和抗BDNF單克隆抗體與BDNF的反應。因此，兩單克隆抗體的表位為IE62的胺基酸414-447位的線狀的表位，但任意一種單克隆抗體都不能在相同條件下封閉通過二聚物形成的BDNF的立體結構的表位。
[0185]以上的結果暗示了交叉反應表位為VZV IE62的胺基酸414~429位。
[0186]本發明人使用培養神經元，將抗VZV IE62單克隆抗體對BDNF的生物活性的作用特徵化。抗VZV IE62單克隆抗體如圖4A所示，顯著地促進Arc和BDNF外顯子3_5的轉錄。進一步地，抗VZV I E62單克隆抗體顯著地增加神經細胞體的面積、分枝點、被BDNF刺激的神經突的長度(圖4C~圖4E)。因此，抗VZV IE62單克隆抗體從生物學和生化學標誌方面考慮，未中和反而增大BDNF的活性。因此，2個生物活性BDNF作為二價BDNF通過抗VZV IE62單克隆抗體連接，該二價的BDNF可能與兩個相鄰的TrkB分子結合，與一價的BDNF-TrkB相互作用相比傳遞更強的信號，其結果是促進Arc和BDNF的轉錄，促進神經細胞的神經突的發展。或者，認為抗體與BDNF的結合使BDNF的結構穩定化，促進與TrkB受體的結合。
[0187]通過BDNF促進GABA性神經元的形態學發展
[0188]為了評價BDNF對神經元的發育抑制的效果，本發明人對確認與抗GAD65抗體反應的皮質(GABA性)神經元的形態進行了定量分析。如圖4B(a)和圖4B(b)所示，與抗VZVIE62單克隆抗體和BDNF —起培養的皮質神經元與其它的對照神經元相比具有大的細胞體，具有更多的神經突的分枝。
[0189]為了對該發現進行定量，本發明人對體細胞區域和各神經元的神經突形態的三個參數進行計算(圖4C~圖4E)。與BDNF —起培養的10個神經元的體細胞的平均區域與11個對照神經元的平均區域相比顯著增大(P < 0.01, AN0VA)(圖4C)。BDNF處理過的神經元的原代神經突的平均數目與對照神經元的數目相比顯著增大(P<0.01、AN0VA)。此外，處理神經元的神經突的總長度的平均值與對照神經元相比顯著增大(P < 0.0UAN0VA)(圖4E)。最後，BNDF處理神經元的神經突的分枝點的平均數目與對照神經元的數目相比顯著增大(P < 0.01, AN0VA)(圖4D)。這些結果暗示了 BDNF促進皮質神經元的體細胞神經元和神經突的發育。
[0190]通過BDNF促進脊神經後根神經元的形態學的發展
[0191]為了確認BDNF的這種作用通過TrkB受體的活化引起，將Trk受體酪氨酸激酶的抑制劑K252a適用於用BDNF處理過的脊神經後根神經元。我們發現上述試劑的處理阻斷BDNF對脊神經後根神經元的增殖作用。這在神經突的體細胞區域和三個參數的定量分析中表現出來(圖5A~圖5D、從各圖(panel)的右側開始第三個柱)。用K252a處理過的10個神經元的體細胞的平均區域與對照神經元的平均區域無顯著性差異。此外，K252a處理神經元的一次神經突的數目與對照神經元的值無顯著性差異。K252a處理神經元的神經突的總長度與對照神經元的值無顯著性差異。K252a處理神經元的神經突的分枝點的平均數目與對照神經元的值無顯著性差異。可知K252a抑制BDNF的作用的同時抑制IE62抗體(IE10)的增強作用(圖5A~圖各圖的右邊三個柱)。脊神經後根神經元為興奮性神經元，該神經元直接傳遞痛感，因此可知本發明的抗體通過BDNF的活化促進脊髓后角的興奮性神經元的神經突的延長。
[0192]實施例9
[0193]抑制BDNF活性的抗體的製備
[0194]1)GST-1E62融合蛋白質的表達
[0195]作為IE62蛋白質，使用VZV的野生株(Kawaguchi株)來替代VZV的Oka株，通過PCR擴增編碼序列號2的268-341位的胺基酸序列的DNA，並與編碼GST的DNA連結，除此之外與實施例1中記載的方法同樣地操作，製備GST-1E62融合蛋白質。
[0196]2)單克隆抗體的製備和篩選
[0197]使用上述1)中得到的GST-1E62融合蛋白質，本質上根據已經報導的方法(Okunoet al，Virologyl29，357-368 `(1983))製備單克隆抗體。通過對於GST蛋白質的ELISA和對於VZV感染細胞的免疫螢光抗體篩選雜交瘤的培養上清，克隆產生IE-62單克隆抗體的雜交瘤。以BDNF作用的抑制作為指標對所得到的單克隆抗體(KSG1~13)進行的篩選，根據實施例6記載的方法通過記錄神經元的神經突的延長來進行，由此得到本發明的抑制抗體。
[0198]3)單克隆抗體與IE62肽的反應性
[0199]通過Western印跡確認得到的單克隆抗體(KSG1~6、8、12和13)與IE62肽(圖1A的片段A或片段E)或GST蛋白質的反應性。得到的所有單克隆抗體都不與GST蛋白質反應。KSG1、2和6與片段A反應，其它的單克隆抗體與片段A和片段E反應。
[0200]接著，通過斑點印跡確認單克隆抗體(1?61~8、10、12和13)與IE62肽的反應性。即，通過斑點印跡確認分別用胰蛋白酶、蛋白酶K、凝血酶或V8蛋白酶切斷IE62肽片段A或片段E的GST融合蛋白質得到的切斷物與上述單克隆抗體的反應性。其結果推測是，KSG1、2和6的表位存在於IE62肽片段A的N末端側，KSG3、4、5、12和13的表位存在於IE62肽片段A的中央部並且是片段E的N末端側，KSG8的表位存在於IE62肽片段A的中央部並且是片段E的N末端側和其C末端側的兩部位。
[0201]接著，合成選自序列號
[0202]18 (GPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP)中的兩種肽，肽 1:[0203]GRSSGGKPRAFLALP (序列號 19)和肽 2:DTRPRKHDARGITPR(序列號 20)，用這些肽吸收上述單克隆抗體進行Western印跡後，KSG8被肽2吸收，而KSG3、4、5、12和13不能被肽1和2吸收。
[0204]4)使用抑制BDNF活性的抗體的神經染色
[0205]從大鼠胎兒腦取出大腦皮質和中腦進行原代培養，使用單克隆抗體KSG1和4進行免疫染色。結果如圖6A~圖6D所示。可知抑制BDNF活性的抗體將神經細胞染色。
[0206]實施例10
[0207]往大鼠胎兒原代培養大腦皮質中添加用PHN患者血清處理過的BDNF時BDNF mRNA表達量的變動
[0208]進行大鼠胎兒的大腦皮質的原代培養，對由於添加用PHN患者血清處理過的BDNF蛋白質而引起的BDNF mRNA表達量的變動進行調查。在妊娠的第17天從10隻大鼠的胎兒取出大腦皮質，用胰島素和DNase處理，在用聚_L_賴氨酸塗布的6孔板中，在含有10% FCS的Dulbecco』 s MEM存在下培養。培養3天後，將培養基更換為不含有血清的Dulbecco』 s培養基，進一步培養3天。使PHN患者血清(10倍稀釋的血清20 μ 1)與BDNF蛋白質10ng(10ng / μ 1、1μ 1)在冰中反應4小時後，將反應混合物添加到大鼠胎兒大腦皮質原代培養細胞中，進一步培養3小時。細胞用冰冷卻的PBS洗滌2次後，提取RNA。向得到的RNA中加入PolydT (15)和逆轉錄酶，進行cDNA合成。將所得到的cDNA用由BDNF的外顯子3與外顯子5的序列設計的引物和作為內標的β_肌動蛋白的引物分別進行實時(realtime)PCR，進行BDNF的mRNA的定量。
[0209]結果如圖7所示。由圖7可知，將用PHN患者的血清處理過的BDNF蛋白質添加到大鼠胎兒大腦皮質中時，與單獨使用BDNF蛋白質時相比，BDNF mRNA的表達量增大。
`[0210]實施例11
[0211]人型抗體的產生
[0212]由於與BDNF免疫交叉的IE62的部位已經被鑑定，使用人抗體文庫(AMS4)和表達該部位的IE62-GST融合蛋白，篩選對於該表位的人型抗體。
[0213]將IE62-GST融合蛋白塗布到試管上，與AMS4噬菌體文庫反應，洗滌未反應的噬菌體，向反應的噬菌體中加入大腸桿菌，使該噬菌體增殖。然後，對增殖的噬菌體進一步在塗布IE62-GST融合蛋白的試管中通過洗淘法進行選擇，重複此操作。該增殖的噬菌體在用BDNF塗布的試管中選擇增殖。通過Western印跡檢查所選擇的噬菌體產生的CP3_Fab對於IE62-GST融合蛋白和BDNF的反應性。選擇表現出與和BDNF交叉反應的抗IE62抗體同樣的反應性的抗體克隆。Fab抗體的BDNF活性調節作用用神經培養細胞進行研究。IgG抗體結合到具有活性的克隆上。比較Fab抗體與IgG抗體的調節作用，將適當的一方為了臨床應用而用於實驗中。
[0214]實施例12
[0215]對於小腦的浦肯野細胞的神經突的延長和發育的影響
[0216]給出生後1天的小鼠或大鼠接種本發明的抗體，3周後對小腦的浦肯野細胞的神經突進行染色，研究對於神經突的延長和發育的影響。由於浦肯野細胞是在小腦內均勻分布的細胞，可以對神經突的延長進行定量化，並且適合作為評價對神經細胞的影響的體系。
[0217]由對接種實施例2中得到的抗體後的神經突的平均長度、分枝點進行調查得到的腦的病理數據的評價，來評價實施例2的抗體促進神經突的延長。因此，該抗體與通過BDNF的神經細胞的活化，神經聯繫的促進、再生等神經疾病的治療相關。
[0218]由對接種實施例9中得到的抑制抗體後的神經突的平均長度、分枝點進行調查得到的腦的病理數據的評價，來評價實施例9的抗體抑制神經突的延長。因此如下評價，1)由於抑制通過BDNF的神經突的延長，在帶狀皰疹後神經痛時形成的過量的神經聯繫被限制，因此，可以抑制痛覺過敏的發病；2)慢性疼痛時，同樣地通過抑制利用BDNF的作用形成神經聯繫，可以抑制慢性疼痛的形成。
[0219]實施例13
[0220]在阿爾茨海默病模型小鼠中抗IE62單克隆抗體對記憶障礙、軸突的萎縮、突觸減少的恢復
[0221]為了機能性地修復痴呆的神經迴路網的障礙，以神經突延長促進作用為指標進行合適的抗IE62單克隆抗體的篩選。有些抗IE62單克隆抗體(例如:IE62B)具有神經突延長活性，為了研究表現出神經突延長活性的單克隆抗體對痴呆的記憶障礙是否具有作用，使用單次腦室內給予作為阿爾茨海默病的原因物質的澱粉樣蛋白(amyloid)b(Ab)的活性部分序列25-35肽製備的阿爾茨海默病的模型小鼠。
[0222]給予Ab(25-35)的小鼠中，空間記憶的獲得和保持與對照組相比，顯著減弱。對腦切片進行免疫染色後，在大腦皮質和海馬中，觀察到軸突和突觸顯著減少。
[0223]給予Ab (25-35) 7天後給予抗IE62單克隆抗體(例如:IE62B)的組中，記憶獲得、保持能力都維持在對照組的水平，確認軸突和突觸保持正常水平、樹突的再形成。
[0224]接著，對原代培養的大鼠大腦皮質神經細胞中的抗IE62單克隆抗體(例如:IE62B)的作用進行研究。抗IE62單克隆抗體特異性地使大腦皮質神經細胞的軸突延長。即使在通過處置Ab (25-35)，誘發軸突和樹突萎縮的狀態下使抗IE62單克隆抗體發揮作用時，抗IE62單克隆抗體也特異性地促進軸突延長。由以上的結果暗示了抗IE62單克隆抗體(例如:IE62B)抑制Ab(25-35)誘發的軸突的萎縮、突觸減少，有可能由此恢復記憶障礙，對神經迴路網的再構建是有效的。
[0225]實施例14
[0226]腦卒中易發性高血壓大鼠(SHRSP)的腦卒中預防效果的研究
[0227]使用腦卒中易發性高血壓大鼠(Stroke-ProneSpontaneously HypertensiveRat，SHRSP)，對腦卒中預防效果進行研究。作為SHRSP的腦卒中發病時的主要症狀，可見一側前肢的抬起運動、步行異常、過敏、自主運動量的減少、立毛、體重減少、攝食量減少等。作為特徵性的組織變化，確認有腦軟化、腦出血、血管壞死、心臟肥大、腎硬化症、腸繫膜動脈的結節性多發性血管炎、睪丸萎縮等。
[0228](方法)
[0229]對SHRSP(10周齡)的雄性大鼠給予1%食鹽水或自來水，以規定的用量靜脈內給予抗IE62單克隆抗體(IE62B)，進行觀察。實驗期間中，每周測定攝食量、飲水量、體重1次的同時，記錄腦卒中發病日和死亡日。血壓使用小動物自動血壓測定裝置(Ueda製作所、UR-5000)，通過tail cuff法進行測定。
[0230](結果)
[0231]1.食鹽負荷的影響:[0232] 可知1%食鹽負荷幾乎不影響體重而促進血壓升高，與自來水飼養相比存活時間縮短至1 / 2以下。
[0233]2.腦卒中預防效果:
[0234]可知抗IE62單克隆抗體(IE62B)極其顯著地延長存活時間，表現出食鹽負荷組的約3.5倍、比自來水飼養組進一步長期存活100天的顯著效果。
[0235]實施例15
[0236]對於Gerbil大鼠腦血管障礙模型的抗IE62抗體的神經細胞死亡抑制作用、再生促進作用
[0237]由於Gerbil大鼠為不受橈動脈影響的大鼠，預先給予抗IE62抗體，結紮頸內動脈5分鐘，引起血管障礙(由於血腦屏障的破壞使抗體浸滲到腦內)，再次打開。1周後，通過尼氏染色，對神經細胞死亡進行研究。以對缺血敏感性高、BDNF的表達強的海馬CA1區域的神經細胞的脫落為指標，對該抗體的影響進行研究。
[0238](結果)
[0239]確認通過抗IE62抗體改善CA1區域的細胞死亡。
[0240]實施例16
[0241]大鼠大腦皮質神經細胞的BDNF和Arc基因的持續性表達的研究
[0242](目的)
[0243]有報告指出，腦源性神經營養因子(BDNF)對神經細胞的存活、可塑性的維持是重要的，Arc (Activity-regulated cytoskeleton-associated protein)與突觸可塑性相關。對於對大鼠給予抗IE62單克隆抗體(IE62B)後的BDNF以及Arc基因的持續性表達控制系統進行研究。
[0244](方法)
[0245]E17大鼠大腦皮質原代培養神經細胞用2.5X106個細胞/ 35mm皿進行培養。在培養第6天添加BDNF，3小時後更換培養基(BDNF清除(washout))。通過定量的RT-PCR測定BDNF和Arc mRNA表達量。
[0246](結果、考察)
[0247]在原代培養神經細胞中，BDNF和Arc mRNA表達量，從BDNF清除後48小時後顯著增加。具體研究的結果可知，BDNF mRNA表達的持續性主要依賴於神經活動。
[0248]另一方面，暗示了 Arc mRNA表達的持續性依賴於BDNF信號。進一步地，BDNF增加與突觸密度存在相關性的細胞內鈣變動的頻率。由以上結果認為，BDNF基因的神經活動依賴且持續性的表達控制機構，通過對Arc基因表達附加持續性，在維持突觸機能上發揮基本的作用。
[0249]實施例17
[0250]大鼠大腦皮質神經細胞的BDNF的自主、持續性的表達控制系統的研究
[0251](目的)
[0252]為了明確給予抗IE62單克隆抗體後的BDNF的mRNA表達量持續性增加，進一步地，對於報告與突觸可塑性相關的Arc的mRNA表達量進行分析，與BDNF mRNA表達的情況進行比較。
[0253](方法)[0254]將E17大鼠大腦皮質原代培養神經細胞在聚亞乙基亞胺塗布的35mm皿上、以
2.5X106個細胞/ 2mL進行培養。在培養第6天添加BDNF(lOOng / mL)，3小時後更換3次培養基(清除BDNF)。通過定量RT-PCR法測定BDNF mRNA和Arc mRNA表達量。
[0255](結果、考察)
[0256]在原代培養神經細胞中，BDNF添加組、BDNF清除組的BDNFmRNA表達量在24小時~72小時與對照組相比都持續性增加約2倍。此時，Arc mRNA表達量與對照組相比24小時增加約20倍，在48小時、72小時維持約2倍的表達量。這些mRNA增加在TrkB抑制劑K252a的存在下被抑制。此外，若使用BDNF中和抗體，則BDNF mRNA表達量不變化，但是Arc mRNA表達量顯著減少。
[0257]進一步地，使用各種抑制劑的結果是，得到表現出實現BDNF mRNA和Arc mRNA的持續性表達的信號傳遞不同的結果。
[0258]由以上結果暗示通過利用BDNF的自主性基因表達而合成、分泌的BDNF活化通過TrkB的多個信號傳遞路徑，由此持續地活化BDNF和Arc基因表達。
[0259]以神經細胞中具有的BDNF為中心的自主性、持續性表達控制機理，發揮在維持神經可塑性時發揮基本作用。
[0260]實施例18
[0261 ] 本發明的抗體在 導入有人APP基因的轉基因小鼠中的作用
[0262]若對強力表達人型APP基因、隨著年齡的增加產生腦的老年斑的Η)-ΑΡΡ小鼠(Tg2576小鼠)給予抗IE62單克隆抗體，則預防老年斑的形成。
[0263]給予抗IE62單克隆抗體(IE62B、KSG1~13)的小鼠的學習機能恢復。
[0264]對Tg2576小鼠一次給予抗IE62單克隆抗體(IE62B、KSG1~13)。接種小鼠中老年斑澱粉樣蛋白的沉積顯著減少，看不到腦炎等副作用。該方法期待可以作為阿爾茨海默病的預防、治療方法應用於人。
[0265]對上述Tg2576小鼠注射本發明的抗體(與BDNF交叉反應的抗IE62抗體)，通過記憶水池的淺位置的「水迷宮」的實驗對1個月後的記憶力進行研究。
[0266]給予本發明抗體的小鼠，在給藥前未能記憶淺灘的位置的記憶力恢復至與野生型小鼠相似的水平。
[0267]工業實用性
[0268]根據本發明的神經突的延長促進劑、神經性疾病的預防或治療劑，可以使迄今為止無有效技術方案的神經損傷後的神經再生。此外，根據本發明的神經突的延長抑制劑，期待對迄今為止無有效技術方案的帶狀皰疹後神經痛或慢性疼痛等發揮效果。進一步地，根據本發明的預防或治療劑，期待改善經驗依賴性社會厭惡、壓力等伴隨有神經過敏的疾病。
[0269]本申請以在日本申請的日本特願2006-312236(申請日:2006年11月17日)為基礎，其內容全部包含在本說明書中。
【權利要求】
1.神經突的延長促進劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒IE62蛋白質、識別具有序列號2的414-429位的胺基酸序列的肽且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。
2.如權利要求1所述的促進劑，其中，所述腦源性神經營養因子為二聚物。
3.神經性疾病的預防或治療劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒IE62蛋白質、識別具有序列號2的414-429位的胺基酸序列的肽且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體作為有效成分。
4.如權利要求3所述的預防或治療劑，其中，所述腦源性神經營養因子為二聚物。
5.如權利要求3或4所述的預防或治療劑，其中，所述神經性疾病為伴隨有由於選自腦卒中、缺氧症、窒息、身體損傷、暴露於毒素、惡性新生物、痴呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側索硬化症中的狀態引起的損傷的神經細胞的疾病。
6.商業包裝，包括權利要求1或2所述的神經突的延長促進劑、以及記載該促進劑可以或應當用於神經突的延長的關於該促進劑的記載物。
7.商業包裝，包括權利要求3~5中任意一項所述的神經性疾病的預防或治療劑、以及記載該預防或治療劑可以或應該用於神經性疾病的關於該預防或治療劑的記載物。
8.神經突的延長抑制劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒IE62蛋白質、識別具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽、且與腦源性神經營養因子交叉反應並抑制腦源性神經營養因子的抗體作為有效成分。
9.伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的預防或治療劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒IE62蛋白質、識別具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽、且與腦源性神經營養因子交叉反應並抑制腦源性神經營養因子的抗體作為有效成分。
10.商業包裝，包括權利要求8所述的神經突的延長抑制劑、以及記載該抑制劑可以或應該用於抑制神經突的延長的關於該抑制劑的記載物。
11.商業包裝，包括權利要求9所述的預防或治療劑、以及記載該預防或治療劑可以或應該用於伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的關於該預防或治療劑的記載物。
12.製備權利要求1~5中任意一項所述的抗體的方法，包括使用具有選自序列號2的414-429位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述抗體文庫為人抗體文庫。
14.製備權利要求8或9所述的抗體的方法，包括使用具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述抗體文庫為人抗體文庫。
16.識別水痘-帶狀皰疹病毒IE62蛋白質、識別具有序列號2的414-429位的胺基酸序列的肽且與腦源性神經營養因子交叉反應的抗體在製備用於預防或治療神經性疾病的藥物中的應用。
17.如權利要求16所述的應用，其中，所述腦源性神經營養因子為二聚物。
18.如權利要求16所述的應用，其中，所述神經性疾病為伴隨有由於選自腦卒中、缺氧症、窒息、身體損傷、暴露於毒素、惡性新生物、痴呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側索硬化症中的狀態引起的損傷的神經細胞的疾病。
19.識別水痘-帶狀皰疹病毒IE62蛋白質、識別具有選自序列號2的268-341位的胺基酸序列中的至少7個連續胺基酸的肽、且與腦源性神經營養因子交叉反應並抑制腦源性神經營養因子的抗體在製備用於預防或治療伴隨有由於選自帶狀皰疹後神經痛、慢性疼痛、經驗依賴性社會厭惡和 壓力中的狀態引起的神經過敏的疾病的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/10GK103638521SQ201310552994
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2007年11月16日 優先權日:2006年11月17日
【發明者】白木公康, 浜結香, 吉田與志博, 津田正明, 津本忠治, 遠藤俊郎, 高橋理明 申請人:財團法人阪大微生物病研究會