肺炎支原體檢測試劑及其用途的製作方法

2023-10-31 11:23:07

本發明涉及一種肺炎支原體檢測試劑及其用途(免疫層析法試驗設備、肺炎支原體感染檢查法)等。本申請基於2014年7月30日所申請的日本國專利申請第2014-155388號主張優先權，該專利申請的全部內容通過參照而被引用。
背景技術：
：與細菌性的典型肺炎不同，在胸部X射線照片中呈現肺浸潤像的非細菌性肺炎的30～40％的原因為肺炎支原體。從人體分離的支原體中，病原性明顯的物質為肺炎支原體。支原體肺炎多見於幼兒、學童。潛伏期間平均為14天。有多種多樣的併發症的報導，在小兒中，腦炎、格林巴利症候群、皮疹等的皮膚炎等的併發症多。細菌性肺炎雖急劇減少，但肺炎整體中支原體肺炎的比率升高。肺炎支原體作為社區獲得性肺炎的原因菌，其數量僅次於肺炎球菌。支原體為可自增殖的最小的微生物，難以用光學顯微鏡進行觀察。與其它細菌不同的是其不具有細胞壁，因此，在青黴素及頭孢烯類抗生素中不顯示感受性，在治療中通常使用四環素系或大環內酯類的抗生素。為了診斷肺炎支原體感染，可利用如下的各種方法。來自咽拭子、咳痰的分離培養法用於確定診斷，但由於需要特殊的培養基及長的天數(2～4周)，因此不能應用於迅速診斷。在由肺炎支原體感染所產生的抗體的檢測法中，例如利用粒子凝集法(PA)、紅細胞凝集反應(IHA)等檢測血清抗體。但是，均不能應用於急性期的診斷。在利用了咽拭子、咳痰等檢體中的肺炎支原體核酸的基因擴增技術的檢測法中，聚合酶連鎖反應(PCR)引起的判斷與作為確定診斷的分離培養法的結果非常相關。另外，作為與PCR相比簡便的手段，也報導有LAMP(Loop-MediatedIsothermalAmplification)法的利用。但是，均需要複雜的操作，在測定中需要很多的勞動力，不能應用於迅速的診斷。在支原體肺炎中，由於有效的抗生素受到限制，因此，在醫療現場高度需要在感染初期即判定肺炎支原體感染的有無。一般而言，如果可得到特異性抗體，則可以利用ELISA法等酶免疫測定法(EIA)。另外，可以應用於化學發光法、色素法、螢光法等各種測定法。但是，任一種方法都需要各自專用的測定裝置，在這點上不能說抓住醫療現場的需求。另一方面，免疫層析法(以下，稱為免疫層析法)的操作簡便，不需要特別的裝置，進而可以在短時間(例如10～20分鐘)內測定。但是，可用EIA法檢測的抗體不一定可以應用於免疫層析法，大多需要更高的特異性及高靈敏度的抗體。關於肺炎支原體感染，目前，市售有抗P1蛋白質單克隆抗體(專利文獻1)或使用了抗RibosomalProteinL7/L12蛋白質特異性抗體的免疫層析用試劑(專利文獻2)並應用於診斷，但不能說靈敏度高，難以說顯示與臨床現場中的需求相應的充分的性能。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特開2013-72663號公報專利文獻2：日本特開2012-6968號公報非專利文獻非專利文獻1：VarshneyAKetal.,ClinVaccineImmunol.Feb2008；15(2):215-220.技術實現要素：發明所要解決的課題因此，本發明的課題在於，提供一種可適用於利用免疫層析法的肺炎支原體感染的檢測的特異性抗體及使用其的檢測試劑等。用於解決課題的技術方案在為了解決上述課題而進行的研究中，本發明人等關注於作為與P1蛋白質相比能夠以高靈敏度檢測肺炎支原體感染的目標蛋白質的P30蛋白質。P30為富含脯氨酸(20.7％)的分子量29,743的粘接蛋白質。迄今為止，P30分子已被鑑定，也取得針對P30的抗體。另外，作為利用了該抗體的測定法，有ELISA法的報導(非專利文獻1)，但沒有報導該抗體的向免疫層析法的應用。這次，重新嘗試了適於免疫層析法的抗體的製作，結果可得到顯示優異的性能的抗體。使用該抗體的免疫層析法與使用針對P1蛋白質的抗體的情況相比，可進行明顯地高靈敏度的檢測。以下的發明基於上述的成果。[1]一種肺炎支原體檢測試劑，其含有針對肺炎支原體的P30蛋白質的特異性抗體。[2]根據[1]所述的檢測試劑，其用於免疫層析法。[3]根據[1]或[2]所述的檢測試劑，其中，所述特異性抗體為單克隆抗體。[4]根據[3]所述的檢測試劑，其中，所述單克隆抗體為由保藏號NITEBP-01880的雜交瘤或保藏號NITEBP-01881的雜交瘤所產生的抗體。[5]根據[1]～[4]中任一項所述的檢測試劑，其中，所述特異性抗體為將除去了從N末端至95號胺基酸的重組P30蛋白質作為抗原所製備的抗體。[6]根據[5]所述的檢測試劑，其中，所述重組P30蛋白質由序列號2的胺基酸序列構成。[7]根據[1]～[6]中任一項所述的檢測試劑，其中，所述特異性抗體用著色合成高分子粒子或金屬膠體粒子進行標記。[8]根據[7]所述的檢測試劑，其中，所述金屬膠體粒子為金膠體粒子。[9]一種肺炎支原體檢測試劑盒，其含有[1]～[8]中任一項所述的檢測試劑。[10]一種免疫層析試驗設備，其具備針對肺炎支原體的P30蛋白質的第1特異性抗體、針對肺炎支原體的P30蛋白質的第2特異性抗體及膜載體，其中所述第1特異性抗體固定化於所述膜載體而構成檢測部，所述第2特異性抗體被標記物質所標記，且擔載於離開所述檢測部的位置。[11]根據[10]所述的試驗設備，其中，所述第1特異性抗體為由保藏號NITEBP-01881的雜交瘤所產生的抗體，所述2特異性抗體為由保藏號NITEBP-01880的雜交瘤所產生的抗體。[12]根據[10]或[11]所述的試驗設備，其中，所述標記物質為著色合成高分子粒子或金屬膠體粒子。[13]根據[12]所述的試驗設備，其中，所述金屬膠體粒子為金膠體粒子。[14]一種肺炎支原體感染檢查法，其使用了[10]～[13]中任一項所述的免疫層析試驗設備。[15]根據[14]所述的檢查法，其中，將源自生物體的材料用於檢體。[16]根據[15]所述的檢查法，其中，所述生物體材料為咽拭子或鼻腔抽吸液。[17]一種針對肺炎支原體的P30蛋白質的特異性單克隆抗體，其是由保藏號為NITEBP-01880或NITEBP-01881的雜交瘤產生的。[18]一種標記化抗體，其是用金屬膠體粒子標記[17]所述的特異性單克隆抗體而得到的。[19]根據[18]所述的標記化抗體，其中，所述金屬膠體粒子為金膠體粒子。[20]一種保藏號為NITEBP-01880或NITEBP-01881的雜交瘤。附圖說明圖1是測試條的構成的一例。具體實施方式本發明提供一種對肺炎支原體的檢測有用的試劑(肺炎支原體檢測試劑)及試劑盒。本發明的肺炎支原體檢測試劑的特徵在於，也可適用於免疫層析法(並不妨礙適用於EIA法或蛋白質印跡法等)。即，本發明的試劑可以進行利用了免疫層析法的高靈敏度的肺炎支原體感染的檢測。本發明的試劑盒含有本發明的試劑作為主要構成要素。可以將在實施檢測法時使用的其它的試劑(展開用溶劑、緩衝液等)和/或裝置或器具(容器、反應裝置等)包含在試劑盒中。另外，也可以將抗原(P30蛋白質或其一部分)包含在試劑盒中。另外，通常，在本發明的試劑盒中付加操作說明書。本發明的試劑的有效成分為針對肺炎支原體的P30蛋白質的特異性抗體。構成本發明的試劑的抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體的任一種，從靈敏度的方面考慮，特別優選為單克隆抗體。針對P30蛋白質為特異性的多克隆抗體可以按照常規方法製作。例如，將根據需要與適當的佐劑混合的P30蛋白質給藥於適當的哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔)的皮下或腹腔內。初次免疫後，在第2～3周按照常規方法進行追加免疫時，可得到效價高的抗血清。例如在最終免疫1周後採取血液並將血清分離，通過與利用硫酸銨的鹽析、離子色譜等通常的抗體的精製同樣的方法取得免疫球蛋白分離。另一方面，P30蛋白質單克隆抗體如果參考本說明書的信息，則可以由按照常規方法製作的雜交瘤得到。例如，用根據需要與適當的佐劑混合的P30蛋白質將適當的哺乳動物(例如小鼠、大鼠等)進行免疫。而且，通過使該動物的脾臟細胞、B淋巴細胞等抗體產生細胞與源自適當的動物(例如小鼠、大鼠等)的骨髄瘤細胞融合，可以得到雜交瘤。細胞融合例如可以通過以下方法來進行：在適當的培養基中使抗體產生細胞和骨髄瘤細胞在聚乙二醇等存在下融合的聚乙二醇(PEG)法等。細胞融合後，利用HAT培養基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸甙的培養基)等選擇培養基選別雜交瘤，對於產生辨識P30蛋白質的抗體的雜交瘤的能力，按照常規方法(例如EIA法)進行篩選。接著，將產生所期望的抗體的雜交瘤按照常規方法(例如有限稀釋法)進行克隆，選擇產生單克隆抗體的雜交瘤。抗體製作時用於免疫的P30蛋白質(抗原)可以通過基因重組由大腸桿菌大量生產。P30為由274個胺基酸構成的蛋白質，但在從N末端至第95號的序列中存在2個疏水性的跨膜區。因此，由大腸桿菌生產P30蛋白質全長時，溶解性差且難以處理。因此，優選使將第95號之前的胺基酸序列除去的重組P30蛋白質(將胺基酸序列示於序列號2。)表達而製備，作為抗原蛋白質利用。如後述的實施例所示，本發明人等成功取得特異性地辨識P30蛋白質的多個單克隆抗體。為了識別，對這些抗體賦予#1～#19的克隆號。產生這些抗體中在免疫層析法中顯示高的靈敏度的抗體#3的雜交瘤克隆#3、及產生抗體#9的雜交瘤克隆#9如下所述，被保藏於所規定的保藏機構。＜雜交瘤克隆#3＞保藏機構：日本國家技術評價研究所專利微生物保藏中心(郵編292-0818)日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室保藏日：2014年6月23日保藏號：NITEBP-01880＜雜交瘤克隆#9＞保藏機關：日本國家技術評價研究所專利微生物保藏中心(郵編292-0818)日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室保藏日：2014年6月23日保藏號：NITEBP-01881抗P30蛋白質抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)根據需要進行標記化。標記化按照常規方法進行即可。作為用於標記化的標記物質，優選不溶性粒狀物質。作為不溶性粒狀物質，可列舉將膠乳、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等合成高分子利用色素分子標記而得到的著色合成高分子粒子、金屬膠體粒子(金、銀、銅、鐵、鉑、鈀、它們的混合物(例如金和鉑的混合物、金和銀的混合物、鈀和鉑的混合物)的膠體粒子)、紅細胞等。優選可以通過目視簡便且迅速地觀察變化的粒子，採用著色合成高分子粒子或金屬膠體粒子即可。粒子的粒徑例如為15～100nm，優選為30～80nm。金屬膠體粒子既可以使用市售品，也可以利用常規方法製備。金屬膠體粒子中，從容易利用等理由出發，優選金膠體粒子。以金屬膠體粒子的情況為例對標記化的方法進行說明時，相對於金屬膠體粒子溶液(通常540nm中的吸光度約為2.0)1L，通常添加0.1～100mg、優選0.5～20mg的抗P30蛋白質抗體，在冷藏或室溫下攪拌5分鐘～24小時。接著，用牛血清白蛋白(BSA)(通常為0.01～10g，優選0.1～2g)等封閉，作為離心分離後的沉澱，可以得到用金屬膠體粒子標記的抗P30蛋白質抗體。作為緩衝液，可以使用通常用於免疫學的試驗的緩衝液，例如Tris緩衝液、磷酸緩衝液等。緩衝液的pH通常為4.5～9.5，優選為5.5～8.5的範圍。可以使用抗P30蛋白質抗體構建肺炎支原體感染檢測用的試驗器具(免疫層析試驗設備)。即，本發明也提供一種使用抗P30蛋白質抗體的免疫層析試驗設備。在本發明的設備中，具備針對肺炎支原體的P30蛋白質的第1特異性抗體(第1抗P30蛋白質抗體)及針對肺炎支原體的P30蛋白質的第2特異性抗體(第2抗P30蛋白質抗體)及膜載體。因此，第1抗P30蛋白質抗體固定化於膜載體而構成檢測部。另一方面，第2特異性抗體被標記物質所標記，擔載於離開檢測部的位置。本說明書中，「固定」是指以抗體不移動的方式配置於膜等載體。「擔載」是指在載體中或表面可移動地配置。以下，一邊參照圖1(作為具體例的測試條)，一邊說明試驗設備的構成。第1特異性抗體和第2特異性抗體均對於P30蛋白質為特異性。第1特異性抗體和第2特異性抗體優選對於P30蛋白質為特異性不同的抗體，例如獨立的抗P30蛋白質抗體。第1特異性抗體為捕捉抗體，其固定於載體而構成檢測部。「檢測部」是指捕捉通過抗原抗體反應而形成的檢體中的抗原和第1特異性抗體的複合體，從而檢測抗原的存在的部位。載體可使用能夠通過靜電作用或疏水相互作用等物理的作用而結合蛋白質、且能夠展開檢體中的成分、抗原-第1特異性抗體複合體、對照用標記物質等的材質的物質。作為膜載體的材質，可以列舉硝基纖維素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、醋酸纖維素。優選載體為膜狀(膜載體)。除檢測部之外，優選載體具備用於確認檢體是否適當地被展開的對照部。對照部中，固定有可與對照用標準物質結合的物質。優選檢測部和對照部在將展開方向橫斷的方向以線狀設置在載體上(也分別稱為「測試線」及「對照線」)。載體上的檢測部及對照部的位置關係沒有限定，但通常在比檢測部更靠下遊側形成對照部。補充抗體及可與對照用標記物質結合的物質的固定方法可以根據載體的種類，按照常規方法進行。例如，可以通過使用市售的抗體塗布機將適當稀釋的抗體溶液塗布並進行乾燥而固定。固定於檢測部位的捕捉抗體的量優選為0.05～10μg，更優選為0.1～3μg。第2特異性抗體為用標記物質標記的抗體，即「標記抗體」，在離開檢測部位的位置擔載於膜等載體。典型而言，擔載標記抗體的載體為與將捕捉抗體固定化的載體不同的部件。但是，可以使標記抗體擔載於將捕捉抗體固定化的載體。擔載第2特異性抗體(標記抗體)的標記抗體擔載部件配置於比檢測部更靠上遊側。標記抗體擔載部件在乾燥狀態下擔載標記抗體，在液體中浸潤時釋放標記抗體。作為標記抗體擔載部件的材質，可列舉玻璃纖維、纖維素纖維、塑料纖維等。通過在含有標記抗體的適當的緩衝液中含浸標記抗體擔載部件、或將含有標記抗體的適當的緩衝液添加於標記抗體擔載部件並進行乾燥，可以使標記抗體擔載於標記抗體擔載部件。擔載於標記抗體擔載部件的標記抗體的量優選為0.01～1μg，更優選為0.03～0.3μg。檢體添加部件配置於標記抗體擔載部件的上遊側，優選檢體添加部件中的至少下遊側區域的下面與標記抗體擔載部件中的上遊側的區域的上面接觸。優選標記抗體擔載部件的一部分夾入檢體擔載部件的下面和載體的上遊側的區域的上面之間。優選具備配置於載體的下遊的吸收部件。吸收部件以其上遊側區域的下面與存在於比載體的檢測部更靠下遊側的區域的上面接觸的方式被配置。在本發明的試驗設備中，將根據需要進行了前處理的液體狀的檢體滴加於檢體添加部件時，檢體浸潤於標記抗體擔載部件，檢體和標記抗體的混合物在載體(典型而言為膜載體)上移動，在載體中向著檢測部位展開。在檢體中含有P30蛋白質(抗原)的情況(即肺炎支原體感染病例的情況)下，該抗原和標記抗體形成免疫複合體。而且，在檢測部通過抗原抗體反應，該複合體被捕捉抗體捕捉，從而聚集並顯色。因此，可以通過目視觀察檢測部中的呈色的程度，來判定檢體中的抗原的有無。在載體具備對照部的情況下，從標記抗體擔載部件釋放的對照用標記物質被對照部的可與對照用標記物質結合的物質捕捉，從而聚集並顯色。在將標記抗體也用作對照用標記物質的情況下，不與檢體中的抗原形成複合體而殘留的標記抗體穿過檢測部位，被固定於下遊的對照部的可與標記抗體結合的物質捕捉，從而聚集並顯色。供至本發明的試驗設備的檢體為有可能含有肺炎支原體的檢體。作為可用作檢體的源自生物體的材料，可列舉咽拭子、鼻拭子、鼻腔抽吸液、鼻腔清洗液、咳痰、肺胞清洗液等，但並不限定於這些。作為檢體的前處理，可列舉將從疑似感染了肺炎支原體的被檢體中採取的源自生物體的材料溶解於前處理試劑，製備用於滴加於試驗設備的液體。這種前處理為了可以展開檢體、或者為了可以進行檢體的良好的展開而進行。前處理試劑可以使用各種緩衝液。作為緩衝液，可以使用通常用於免疫學試驗的緩衝液，例如Tris緩衝液、磷酸緩衝液、Good’s緩衝液等。也可以為了使非特異性結合反應降低而在前處理試劑中含有表面活性劑。作為表面活性劑，可以使用TritonX-100(商品名，聚乙二醇單-對-異辛基苯基醚)、Tween20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯)、Tween80(聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯)、CHAPS(3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基胺基]丙磺酸)、SDS(十二烷基硫酸鈉)等。也可以並用2種以上的表面活性劑。以下，利用實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不由實施例所限定。實施例1.對肺炎支原體P30蛋白質特異性的單克隆抗體的製作1-1.抗原蛋白質的製備在P30蛋白質(序列號1)中，從N末端至第95號的序列中存在2個疏水性的跨膜區。使除去了從N末端至95號胺基酸的重組P30蛋白質(將胺基酸序列示於序列號2。)由大腸桿菌表達，作為抗原蛋白質利用。以下，示出製備抗原蛋白質的步驟的概要。首先，以肺炎支原體(M.Pneumoniae)M129株的基因組DNA為模板，通過PCR法將P30基因的片段進行擴增。作為PCR的引物序列，使用AGGCATATGGGACTGCCAATTGTGAAGCG(序列號3)和CAGGTCGACTTAGCGTTTTGGTGGAAAAC(序列號4)(劃線部分別為通過限制酶NdeI和SalI切斷的部位)。將進行了擴增的P30基因片段嵌入於TaKaRaBio社的pcoldProS2表達載體的NdeI-SalI部位，製成重組P30表達載體。將P30表達載體導入大腸桿菌BL21株，通過添加1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)並在15℃下低溫培養，使重組P30蛋白質表達。將由大腸桿菌表達的重組P30蛋白質通過His-tag精製柱和凝膠過濾進行精製。將精製的重組P30蛋白質進行定量，將適當的量作為免疫用抗原使用。1-2.免疫及抗體的精製用以下的方法嘗試取得對於抗原蛋白質為特異性的單克隆抗體。＜材料＞(1)抗原重組P30精製蛋白質(2)免疫動物BALB/cA小鼠6周齡雌性(日本クレア株式會社)3隻(3)佐劑TiterMaxGold(G-3フナコシ)(4)小鼠骨髓瘤細胞P3U1(5)培養基、器材、試劑RPMI-1640培養基(11875-119GIBCO)丙酮酸鈉溶液(11360-070GIBCO)青黴素-鏈黴素-穀氨醯胺溶液(10378-016GIBCO)HAT添加劑(21060-017GIBCO)HT添加劑(11067-030GIBCO)FBS(S1560BWT社)PEG1500(783641ロッシュ)DMS0(D2650SIGMA)96孔培養板(92696TPP)24孔培養板(92424TPP)滅菌培養皿(34153ニプロ)凍結用管(MS-4503住友ベークライト)(6)抗體篩選器材、試劑ELISA微板(442404nunc)抗小鼠IgG標記抗體(1030-04コスモバイオ)單克隆抗體分型試劑盒(1493027ロッシュ)(7)小鼠腹水化、抗體精製BALB/cA小鼠退役雌性(日本クレア株式會社)姥鮫烷(42-002コスモバイオ)HiTrapProteinG(17-0404-03GEヘルスケア)＜方法＞(1)對小鼠的免疫敏化將調整為1.6mg/ml的P30蛋白質和TiterMaxGold進行等量混合，使用玻璃注射器製備乳液。相隔2周分2次向BALB/cA小鼠的皮下給藥相當於100μg的抗原，在其1～2周後皮下給藥僅P30抗原溶液40μg，3天後，在麻醉下進行全採血，採取脾臟及各種淋巴節。(2)骨髓瘤細胞的培養對於小鼠骨髓瘤細胞(P3U1)，在於RPMI1640培養基中添加了丙酮酸和穀氨酸以及青黴素-鏈黴素的培養基(RPMI培養基)中加入FBS使其成為10％並進行繼代培養。細胞融合使用對數增殖期的形態穩定的物質。(3)細胞融合將從被敏化的小鼠中採取的各淋巴組織在#200網眼上細切，用安裝有矽栓的玻璃棒輕輕地按壓，一邊加入培養基，一邊過濾、採取淋巴細胞。通過1200rpm10分鐘的離心處理清洗細胞，計數細胞數。將骨髓瘤細胞移至50ml錐形管，計數細胞數，通過1000rpm5分鐘的離心處理進行清洗。其後，以淋巴細胞和骨髓瘤細胞的比率成為5:1～10:1的範圍的方式調整細胞數並混合，通過進行離心(1200rpm10分鐘)而得到細胞沉澱。就細胞融合而言，用1分鐘將1ml的PEG液一邊緩慢地混合一邊加入到細胞沉澱，其後一邊攪拌2分鐘，一邊使其反應。其後，用1分鐘加入RPMI1640液1ml，進行3次同樣的操作，進一步用3分鐘添加12ml的RPMI1640液。在37℃的培養箱中靜置10分鐘後，通過1000rpm5分鐘的離心而採集細胞，並使其懸浮於添加了HAT添加劑的含有15％FBS的RPMI培養基，並接種於10張96孔培養板。此時，作為飼養細胞，使用小鼠胸腺細胞。在CO2培養箱中培養1周，使雜交瘤選擇增殖。(4)抗體篩選向ELISA用96孔微板中放入用PBS稀釋至1μ/ml的P30蛋白質50μl，在室溫下反應2小時或在冷藏下反應一夜，其後，加入0.5％的脫脂牛奶100μl，進行封閉，製成抗原結合板。在細胞融合後的第1周，從各自的培養板無菌地採取培養上清液大約50μl，放入於抗原結合板，在室溫下反應1小時。其後，用生理食鹽水進行3次的板清洗，接著，使由0.5％脫脂牛奶稀釋為2500倍的酶標記抗小鼠IgG抗體在室溫下反應1小時。同樣地在進行清洗之後，在酶基質液中顯色，選擇與抗原結合的單克隆抗體陽性孔。(5)克隆對於以ELISA選擇的雜交瘤利用有限稀釋法進行克隆。即，以每1孔具有1個雜交瘤細胞的方式製備細胞懸浮液並接種於預先接種有飼養細胞的96孔培養板。1周後確認增殖的菌落，進行同樣的抗體篩選。進行2次克隆，確認完全為單一的細胞。另外，培養基使用加入有15％FBS和HT添加劑的RPMI培養基。(6)克隆建立、細胞凍結對成為單一細胞的雜交瘤進行從24孔培養板至培養皿的擴大培養，以2～5×108個/管進行凍結保存。凍結培養基使用在含有15％FBS和HT添加劑的RPMI培養基中以成為10％的方式加入DMSO的培養基，將其包入紙巾並保管於-85℃的超低溫冷庫。(7)亞類測定亞類的測定使用充分地進行了克隆的培養上清液、通過市售的免疫層析法如手冊那樣進行。(8)小鼠腹水化、抗體精製向在1周以上前腹腔內給藥有姥鮫烷0.5ml的BALB/cA退役小鼠的腹腔接種0.5～1×107個的雜交瘤細胞，在大約7～10天後得到貯存的腹水。使腹水充分地凝固，通過3000rpm15分鐘的離心處理使固體物沉澱，分離上清液。在上清液中作為防腐劑以0.1％添加疊氮化鈉，在冷藏下保存至精製。在來自腹水的抗體精製中，使用HiTrapProteinG柱，在向蛋白質G柱的抗體結合和清洗中使用PBS，在清洗後的抗體溶出中使用0.1M甘氨酸鹽酸BufferpH2.8，在溶出的IgG的中和中使用1MTris。溶出的抗體用50％飽和硫酸銨進行濃縮並在PBS中充分地透析，加入0.05％疊氮化鈉並進行冷藏保存。在精製抗體的純度檢定中進行醋酸纖維素膜電泳，確認γ區域為單一的帶。＜結果＞使用3隻小鼠進行了細胞融合實驗。其結果，從No.1小鼠中通過1次篩選選擇14克隆，從No.2小鼠中通過1次篩選選擇1克隆，從No.3小鼠中通過1次篩選選擇14克隆。其後，研究非特異性反應或菌落增殖，對合計19克隆進行克隆，建立單克隆抗體產生雜交瘤(克隆#1～#19)。對於所建立的雜交瘤，進行小鼠腹水化，得到2～7ml的腹水。關於得到的腹水，通過醋酸纖維素膜電泳確認抗體含量，其後用HiTrapProteinG精製為IgG。各精製抗體用免疫層析法進行評價。在19克隆中，通過克隆#3和#9的組合可得到良好的結果，可以用於測定體系。就亞類而言，#3、#9均為IgG1κ。雜交瘤克隆#3及#9如以下那樣保藏。＜雜交瘤克隆#3＞保藏機構：日本國家技術評價研究所專利微生物保藏中心(郵編292-0818)日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室保藏日：2014年6月23日保藏號：NITEBP-01880＜雜交瘤克隆#9＞保藏機關：日本國家技術評價研究所專利微生物保藏中心(郵編292-0818)日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室保藏日：2014年6月23日保藏號：NITEBP-018812.免疫層析試驗設備的製作2-1.標記抗體擔載部件的製備鑑於以上的結果，將雜交瘤克隆#3產生的抗P30單克隆抗體(P30-3)用於標記抗體。將抗P30單克隆抗體(P30-3)用5mM磷酸緩衝液(pH7.4)稀釋為0.05mg/ml的濃度。在金膠體懸浮液(BBI：平均粒子60nm)0.5ml中加入0.1ml的50mM磷酸緩衝液(pH7.4)並混合之後，進一步加入上述稀釋的抗P30單克隆抗體溶液0.1ml，在室溫下放置10分鐘。在靜置後的溶液中加入用10mM磷酸緩衝液進行了稀釋的10質量％的牛血清白蛋白(BSA)溶液0.1ml，充分攪拌之後，以8,000xg離心分離15分鐘。再次除去上清液，在殘渣中加入pH7.4的10mM磷酸緩衝液，用超聲波破碎機充分地分散，製成標記抗體溶液。將該標記抗體溶液均勻地添加於寬度16mm×長度100mm的玻璃纖維制墊(ミリポア社制：GFCP203000)之後，用真空乾燥機進行乾燥，得到標記抗體擔載部件。2-2.具備檢測部及對照部的硝基纖維素膜載體的製備將與上述2-1的標記抗體不同的抗P30單克隆抗體(雜交瘤克隆#9產生的單克隆抗體P30-9)用含有5質量％的異丙醇的磷酸緩衝液(pH7.4)稀釋為1.3mg/ml的濃度，製備為檢測部固定用抗體(捕捉抗體)溶液。在距離長度25cm×寬度2.5cm的硝基纖維素膜(ミリポア社制：HF120)的長軸側的一端(將該端設為展開方向的上遊側端，將相反側設為下遊側端)1cm的位置使用抗體塗布機(BioDot社制)以1μl/cm的塗布量以線狀塗布該檢測部固定用抗體溶液。進而，在距離硝基纖維素膜的上遊側端1.5cm的位置以1mg/ml的塗布量以線狀塗布抗小鼠IgG抗體。塗布後，在42℃下乾燥60分鐘，得到具備檢測部及對照部的硝基纖維素膜載體。2-3.免疫層析試驗設備的製作在上述2-2的硝基纖維素膜載體的抗體塗布面(將該面設為上面)的相反側(將該面設為下面)上粘接塑料制底板。接著，將上述2-1的標記抗體擔載部件以硝基纖維素膜的上遊側端重疊2mm的方式配置並貼附在硝基纖維素膜載體的上面，進一步將寬度5mm×長度23mm的玻璃纖維制樣品墊(ポール社制：8000006801)以在標記抗體擔載部件的上面重疊2mm的方式配置而貼附。另一方面，將寬度5mm×長度25mm的吸收墊(ポール社制)在硝基纖維素膜載體的上面以硝基纖維素膜載體的下遊側端重疊15mm的方式貼附。最後，沿長軸方向每5mm切斷，得到免疫層析試驗設備。3.肺炎支原體檢測靈敏度的比較使用Chanock培養基將肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia)FH株(ATCC)在37℃下培養7天。將該培養液用作檢體，將使用抗P30單克隆抗體的免疫層析法(使用上述免疫層析試驗設備)和使用抗P1單克隆抗體的免疫層析法的靈敏度進行比較。使用的單克隆抗體如下所述。另外，後者的方法中使用的試驗設備使用抗P1單克隆抗體(P1-4及P1-115：富山研究所)並按照上述的方法製作。＜P30免疫層析法＞標記抗體(金膠體敏化用)：P30-3捕捉抗體(隔膜敏化用)：P30-9＜P1免疫層析法＞標記抗體(金膠體敏化用)：P1-4捕捉抗體(隔膜敏化用)：P1-115將實驗結果示於以下的表。[表1]培養稀釋倍數P30免疫層析法P1免疫層析法1∶100++++1∶200+++-1∶400++-1∶800+-1∶1600--對照（培養基）--如表所示，使用抗P30單克隆抗體的免疫層析法的檢測靈敏度遠遠地超過使用抗P1單克隆抗體的免疫層析法的檢測靈敏度。如上所述，可成功取得具有優異的特性的抗P30單克隆抗體，可以實現與現存的方法相比能夠以相當高的靈敏度檢測肺炎支原體的免疫層析法。工業實用性本發明提供一種可適用於免疫層析法的抗P30單克隆抗體。根據使用該單克隆抗體的免疫層析法，可以進行肺炎支原體感染的簡便、迅速且高靈敏度的檢測。該發明並不受上述發明的實施方式及實施例的說明任何限定。不脫離專利權利要求的記載，在本領域技術人員可以容易地想到的範圍內各種變形方式也包含在該發明中。在本說明書中明示的論文、公開專利公報及專利公報等內容通過援用而引用其全部的內容。序列表田中貴金屬工業株式會社肺炎支原體檢測試劑及其用途TY14001PJP2014-1553882014-07-304PatentInversion3.51274PRT肺炎支原體1MetLysLeuProProArgArgLysLeuLysLeuPheLeuLeuAlaTrp151015MetLeuValLeuPheSerAlaLeuIleValLeuAlaThrLeuIleLeu202530ValGlnHisAsnAsnThrGluLeuThrGluValLysSerGluLeuSer354045ProLeuAsnValValLeuHisAlaGluGluAspThrValGlnIleGln505560GlyLysProIleThrGluGlnAlaTrpPheIleProThrValAlaGly65707580CysPheGlyPheSerAlaLeuAlaIleIleLeuGlyLeuAlaIleGly859095LeuProIleValLysArgLysGluLysArgLeuLeuGluGluLysGlu100105110ArgGlnGluGlnLeuAlaGluGlnLeuGlnArgIleSerAlaGlnGln115120125GluGluGlnGlnAlaLeuGluGlnGlnAlaAlaAlaGluAlaHisAla130135140GluAlaGluValGluProAlaProGlnProValProValProProGln145150155160ProGlnValGlnIleAsnPheGlyProArgThrGlyPheProProGln165170175ProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMetAla180185190ProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgProGly195200205MetProProHisProGlyMetAlaProArgProGlyPheProProGln210215220ProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMetAla225230235240ProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgProGly245250255MetGlnProProArgProGlyMetProProGlnProGlyPheProPro260265270LysArg2179PRT肺炎支原體2GlyLeuProIleValLysArgLysGluLysArgLeuLeuGluGluLys151015GluArgGlnGluGlnLeuAlaGluGlnLeuGlnArgIleSerAlaGln202530GlnGluGluGlnGlnAlaLeuGluGlnGlnAlaAlaAlaGluAlaHis354045AlaGluAlaGluValGluProAlaProGlnProValProValProPro505560GlnProGlnValGlnIleAsnPheGlyProArgThrGlyPheProPro65707580GlnProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMet859095AlaProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgPro100105110GlyMetProProHisProGlyMetAlaProArgProGlyPheProPro115120125GlnProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMet130135140AlaProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgPro145150155160GlyMetGlnProProArgProGlyMetProProGlnProGlyPhePro165170175ProLysArg329DNA人工序列引物3aggcatatgggactgccaattgtgaagcg29429DNA人工序列引物4caggtcgacttagcgttttggtggaaaac29當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp