抗生素6270及其鹽類作為一種抗球蟲病劑和飼料添加劑的應用的製作方法

2023-10-31 07:33:02 1

專利名稱：抗生素6270及其鹽類作為一種抗球蟲病劑和飼料添加劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明是一種新的抗生素6270及其製備方法，以及它作為一種抗球蟲病劑或作為一種加速家畜或家禽生長的飼料添加劑的應用。
為了尋找新的抗生素和研究那些由所分離的微生物產生的抗生素起見，本發明者已經從各種土壤中分離了許多微生物。因此，他們已經發現一個合適的培養基中從日本北海道，網走市(Abashiri)採集的土壤中分離出的屬於擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)屬的微生物時，在培養基中就積累了一種對革蘭氏陽性細菌具有高度抗菌活性的抗生素。該抗生素得到了分離且理化性質及生物學特性得到了檢驗，從而已作為一種新的抗生素得到進一步證實被命名為抗生素6270。
本發明是以這個發現為基礎的，並提供這種新的抗生素6270及其製備方法，該方法包括培養屬於擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)屬的產生抗生素6270的微生物和從培養物中分離抗生素6270。
此外，本發明提供一種含有作為活性成分的抗生素6270的抗球蟲病劑，和一種防治家畜和家禽球蟲病的方法，該方法包括給家畜和家禽吃有效的抗生素6270。
另外，本發明提供一種家畜和家禽的生長加速和飼料功效增強劑，其含有作為活性成分的抗生素6270，並提供一種加速家畜和家禽生長及增強其飼料功效的方法，該方法包括給家畜和家禽吃有效數量的抗生素6270。因此，本發明提供一種家畜和家禽的飼料，這種飼料含有有效數量的抗生素6270。在這方面的有效數量通常是從0.5到200ppm，從1到100ppm則更好。
現在，將詳細敘述本發明並給出最佳實施例。
在附圖中，

圖1是用溴化鉀壓片法測定的抗生素6270的紅外吸收光譜。
圖2是在重質氯仿中通過用四甲基矽烷作為內標準所測定的抗生素6270的1H-核磁共振光譜。
圖3是在重質氯仿中通過用四甲基矽烷作為內標準所測定的抗生素6270的13C-核磁共振波譜。
可用來生產抗生素6270的微生物可能是屬於諾卡氏菌(Nocardiopsis)屬的任何微生物，只要它能夠產生抗生素6270。不過，最好選用由本發明者重新分離的擬諾卡氏放線菌(Nocardiopsis)種的6270品系(作為FERMBP-717被存放在日本的發酵研究所裡)。該微生物已於1985年4月1日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCCNo.0021。
在本發明中所用的擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)種的6270品系具有分支的菌絲體，並在空氣中延伸的氣生菌絲被分裂而形成長的孢子鏈。從整個細胞的水解產物中，內消旋-二氨基庚二酸(mcsodiaminopimericacid)和作為糖成分的半乳糖和核糖被發現了。然而，阿拉伯糖和madurose未被發現。此外，也沒發現黴菌酸。維生素K2類合成物含有作為主要成分的MK-9(H6)和(H3)並且發現了作為痕量成分的MK-9(H4)。基內菌絲的寬度約為0.5微米。根據前述的特性，確定6270菌株是一種屬於放線菌中擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)屬的菌株。
擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)種6270菌株具有下列微生物學特性。
Ⅰ.形態學特徵基內菌絲充分生長並分裂，從而每個菌絲的寬度約為0.4微米。在某些培養基，例如蔗糖-硝酸鹽瓊脂培養基(Difco.Czapeck溶液瓊脂)，澱粉瓊脂培養基(ISP-4Difco-無機鹽澱粉瓊脂)燕麥片瓊脂培養基(ISP-8)或葡萄糖一天冬醯胺瓊脂培養基中，氣生菌絲充分地生長。氣生菌絲或直或彎，並且作為一個整體來看，它們構成網狀。成熟時，氣生菌絲的寬度從0.4到0.6微米。從培養開始到結束的10天中，氣生菌絲經過分裂並形成許多長的孢子鏈，每一孢子鏈至少含有10個孢子。孢子鏈不是螺旋形的，孢子的表面是光滑的且形狀是圓筒形的。其大小約為0.4×1.2微米。未觀察到孢子囊，菌核或菌絲束。
Ⅱ.培養特點按照E.B.Shirling等人所報導的試驗方法(系統細菌學國際雜誌，16，313-340(1966)進行了試驗。另外，使用了已知的培養基和試驗方法。
使用顏色調和手冊，第4版(1958)作為顏色標準在氙燈的標準光源下測定了顏色。當看到相應的顏色標記時，它首先通過普通的名稱顯示出來，然後在圓括號中顯示出顏色標記的代號。當同樣的顏色重複出現時，就只顯示出顏色標記的代號。
除另有規定外，下列資料表示在一個瓊脂平板基上，在280℃下培養三個星期的生長狀況。(a)項表示生長;(b)項表示氣生菌絲的狀態;(c)項表示一種可溶色素;(d)項表示其他特性。
(1)蔗糖-硝酸鹽培養基(Difco-Czapeck溶液瓊脂)a良好，接近灰色(2ba)b白色，粉狀的c無(2)葡萄糖-天冬醯胺培養基a良好，淡琥珀色(3ic)到米色(3ge)b接近灰色(3ba)c無(3)甘油-天冬醯胺培養基a不好，2bab細長形c無(4)澱粉瓊脂培養基a極好，3ic到貢巖(3ca)b粉狀的，白色c無
d澱粉的水解，陰性(5)酪氨酸瓊脂培養基a不好，3geb無c無(6)營養瓊脂培養基(Difco.Bacto營養瓊脂)a不好，淡白色(2ea)b無c無(7)酵母-麥芽提取物瓊脂培養基a極好，裂縫，黃玉色(3ne)b白色c無(8)燕麥片培養基a良好，剝落的(2ca)b2bac無Ⅲ.生理學特點(1)生長溫度範圍(斜面澱粉瓊脂培養基，溫度梯度細菌培養器)6.5-38℃(在5℃以下或39.5℃以上未觀察到生長)最適溫度27℃-38℃。
(2)葡萄糖-蛋白腖-明膠的液化穿刺培養陽性。
(3)澱粉的水解物陰性(4)凝固蛋白腖化脫脂乳沒有凝固和顯著的蛋白腖化(37℃)。
(5)黑色素的形成ISP-酪氨酸瓊脂培養基陰性。
ISP-triptone-酵母提取物肉湯培養基陰性。
ISP-蛋白腖-酵母-鐵瓊脂培養基陰性。
(6)氯化鈉耐受性在4%或更高的濃度下不生長。
(7)黃嘌呤次黃嘌呤，腺嘌呤的溶解度陰性。
Ⅵ.碳源利用(Pridham和Gettlieb基礎培養基)陽性D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，水楊苷。
弱陽性D-果糖，蔗糖。
陰性肌醇，L-鼠李糖，棉子糖，D-甘露醇。
已經鑑定6270菌株是屬於放線菌中(Noeardiopsis)Meyer1076的一種菌株，因為在上述的各種特點中，它在氣生菌絲上形成長的孢子鏈，並且整個細胞的水解產物含有內消旋-二氨基庚二酸(meso-diamiaepimericaeid)和半乳糖，但不含阿拉伯糖和madurose，此外未發現黴菌酸。
在實現本發明的過程中，產生抗生性6270的微生物可按照培養已知放線菌的常規方法進行培養。然而，從工業觀點看，使用通氣-攪動的培養方法是有利的。作為生產用的培養基，可使用通常用於放線菌培養的物質。即，各種碳源，氮源和有機或無機鹽，如果必要的話還有消沫劑，可用適宜的合成形式。例如，作為碳源，可使用葡萄糖，澱粉，甘油，糊精，蔗糖以及動物或植物油。作為氮源，可使用黃豆粉，玉米漿、麥芽，和氨。此外，若有必要，可加入象碳酸鈣，氯化鈉，氯化鉀，和磷酸鹽這樣的無機鹽。也可加入那些具有促進微生物生長，從而促進抗生菌6270產生的有機或無機鹽。培養溫度通常在25到30℃範圍內，最好在30℃左右。培養時間依條件的不同而不同。然而，所產生的抗菌素6270，通常在72到148小時之內到到最大積累值。
抗生素6270可以從培養基中分離，並利用其理化特性，通過常規的方法，如利用雜質溶解度不同的方法，利用對離子交換樹脂或各種吸收劑的吸收作用不同的方法，用一種與水不相溶的有機溶劑萃取的方法或象沉澱、雜質的去除、透析、乾燥和重結晶等各種方法的適當結合加以提純。
例如，培養基裡的抗生素6270可以按下述方法回收。當加入助濾劑如硅藻土或Radiolite700後，肉汁培養基被過波，濾液和微生物細胞分別被適當的溶劑，如乙酸乙脂和丙酮所萃取。然後將細胞萃取物與濾液萃取物合併。將溶劑從該萃取溶液中蒸餾出來，藉此得到抗生素6270的粗晶體。為了從粗晶體中分離出抗生素6270，舉例來說，粗晶體應用色層析分離法處理。洗脫液減壓濃縮，殘渣溶於適當的諸如乙酸乙脂溶劑，流後用稀鹽酸處理。濃縮溶劑層，抗生素6270以游離酸狀態(形式)結晶出來。
為了得到它的鈉鹽，上述用稀鹽酸處理過的溶劑層用稀的碳酸鈉溶液處理，然後濃縮溶劑層，由此可得到鈉鹽形式的抗生素6270。這樣獲得的游離酸型或鈉鹽型抗生素6270可從一適當的溶劑如正-己烷-乙酸乙酯中重結晶而獲得純晶體。這樣得到的游離酸型抗生素6270具有下列特性。
(1)無色針狀結晶，酸性物質。
(2)熔點115-118℃(3)元素分析(以%表示)c(碳)62.72%，H(氫)9.49%O(氧)27.78%(4)所旋光度〔a〕20D-11.5°(厚度1.0，甲醇)(5)紫外吸收光譜於甲醇溶液中測得，最大吸收波段不高於210nm(納米)(6)紅外吸收光譜中的特異吸收(釐米-1)(用溴化鉀壓片法)3470，2980，2945，2890，1735，11460，1380，1315，1165，1102，1075，987，980，(吸收光譜示於圖1)(7)溶解性溶於甲醇、乙醇，乙酸乙脂，氯仿，醚，丙酮，以及苯等不溶於水。
(8)顏色反應硫酸香草醛反應及Dragenderff反應為陽性;茚三酮反應陰性，與碘蒸汽反應顯色。
(9)薄層層析(用矽膠GF245，Merck公司製造)溶劑系統RF值氯仿-甲醇(20∶1)0.49溶劑系統RF值正-己烷-乙酸乙脂(1∶1)0.08
苯-乙酸乙脂(1∶1)0.04苯-丙酮(1∶1)0.53氯仿-丙酮(2∶1)0.36正-己烷-乙酸乙酯(1∶3)0.13乙酸乙酯0.22(10)1H-核磁共振波譜在δppm3.39(3H)，3.49(6H)處觀測到三個甲氧基的存在，在重質氯仿中用甲基矽烷做內標準於100MHz處測得。
(波譜示於圖2)(11)13C-核磁共振波譜在重質氯仿中用四甲基矽烷做內標準於25MHz處測得的結果示於圖3。按照這個結果，碳原子的全部數量為44個。
(12)抗菌譜示於表1(見下頁)。
注a營養瓊脂培養基。
b甘油瓊脂培養基c土豆-蔗糖瓊脂培養基表1試驗微生物最低抑制濃度培養基mcg/ml夜後草桿菌(Bacillus cereus 1.56 aIMA－1729)球狀桿菌(Bacilluscircu-lans 1.56 aPCI 3329)枯草桿菌(Bacillus subtilis 6.25 aPCI219)黃微球菌 (Micrococcus flavus1.56 aIFO3242)藤黃八疊球菌(NIHJ)3.13a金黃色葡萄球菌(Staphylococcus6.25 aaureus FDA 209 PJC-1)金黃色葡萄球菌(Staphglococcus6.25 aaureus)(抗青黴素鏈黴素，氯黴素，四環素及卡那黴素)大腸桿菌(Eseherichiacoli100aNIHJ JC-2)大腸桿菌(Eseherichiacoli )100a(抗鏈黴素，卡那黴素，氯黴素和四環素)肺炎桿菌(Klebsiclla pneu-moniae 100 aPCI602)
表1(續)試驗微生物 最低抑制濃度培養基(mcg/ml)普通變形桿菌(Proteusvul-gasis100aOX-19)綠膿桿菌(Pseudomonas ae-ruginosa 100 aIFO-3756)包皮垢分支桿菌(Mycoba-cterium1.56 bsmegmatisATGG 607鳥型結核分支桿菌(Mycobacte-rium1.56 bauiumIFO 3153)草分支桿菌(Mycobacterium phlei 3.13 bNIHJ)產黃青黴(Penicillium chry-sogenum 100 cQ－176)黃麴黴(Aspergillusflavus) 100 cATG G 9643)(Gochliobolus miyab-eanus)12.5c(Alternaria mari)50 c白色念珠菌(Gandida albic-ans100 cYU 1200
表1(續)試驗微生物 最低抑制濃度培養基(mcg/ml)啤酒酵母(Sacehasomycescerevisiae100 Cstrain 77)
按照上述理化和生物學特徵，這種抗生素已被確定屬於一類叫做聚醚的抗生素。
由1H-核磁共振波譜已知，該抗生素在一個分子中有三個甲氧基團。作為已知的在一分子中有三個甲氧基的抗生素，在聚醚類抗生素中被提到有C2012(日本未審查專利公告53919號，1983)，A-204B(微生物手冊，410，第三卷，CRC出版)，T-42082(日本未審查專利公告79730號，1976)，T-40517(日本未審查專利公告10581號，1975)，38295(日本未審查專利公告125793號，1976)，6016號(日本未審查專利公告84576號，1979)，X-14868C(日本未審查專利公告120696號，1981)CP-47433(日本未審查專利公告154108號，1982)，47434(日本未審查專利公告154187號，1982)，以及LL-C23024β(日本未審查專利公告78598號，1983)。
然而，抗生素6270在熔點，比旋光度，元素分析值或紅外吸收光譜上與已知抗生素不同，顯然是一種新的抗生素。
抗生素6270對革蘭氏陽性菌有極強的抗性，可作為抗菌劑使用。
此外，作為一種治療家畜腹瀉，增強飼料功率以及促進家畜和家禽生長的藥劑，在低濃度下它具有抗球蟲病殺蟎及抗病毒等活性，並作為家禽和家畜的抗球蟲病劑用於雞、鵪鶉、鴨、鵝和火雞，以及牛、豬、兔、水牛、山羊和綿羊等。
現在，本發明將根據實施例進一步描述其細節。但應該理解本發明決不僅限於這些具體實例。
例1擬諾卡氏菌(Nocardiepsis)6270菌株(FERMBP-717)接種於一升含有6.0%的葡萄糖，2.0%黃豆粉，1.0%串珠酵母，0.5%碳酸鈣的培養基中(PH6.0)，於30℃培養48小時。該培養液接種在一個具有200升容量的罐中的100升含有同上組份的培養基中，在攪拌、通風下於30℃培養96小時，通風率為每分鐘100升，攪拌轉速為每分鐘250轉。加入助濾劑(Radielite700，註冊商標)後，該培養液被過濾分離為濾液和細胞。然後，濾液用40升乙酸乙脂萃取，細胞用30升丙酮萃取。細胞的丙酮萃取液，用減壓濃縮除去丙酮，並用20升乙酸乙脂萃取。該萃取液與濾液萃取液合併，混合液減壓濃縮。殘液在750克用氯仿填充的矽酸(Wako膠C-200，商品名)層析柱上吸附，並用氯仿和甲醇(100∶1)的混合液洗脫。活性組分在負壓下被濃縮乾燥，由此獲得油狀殘液。此後，將殘液溶於少量丙酮，吸附於一用丙酮填充的SephadexLH-20層析柱上，用丙酮洗脫。這樣獲得的活性組份濃縮即可得到抗生素6270的粗結晶體。該晶體溶於乙酸乙酯，與稀鹽酸一起振搖。乙酸乙脂層在負壓下濃縮。這樣形成的晶體從正-己烷-乙酸乙脂中重結晶，可獲得無色針狀抗生素6270游離酸晶體23.4克。這樣獲得的抗生素6270游離酸表現出上述理化和生物學特徵。
試驗例1抗球蟲病活性試驗藥劑和飼料
抗生素6270與雞的完全混合飼料(東方酵母公司製造，QrientakYeastCo.)混勻以獲得預定的比例。從卵囊接種前兩天到試驗結束(感染後八天)讓雞自由取食這樣得到的飼料。
作為已知的抗球蟲病劑，Monensin被用於作為對照藥劑。
試驗用雞本試驗用雞為健康產卵雞(SheverStarcro-ss)，這些雞為七日齡(接種時為九日齡)並為在完全禁絕球蟲病染的情況下孵出。每一組為五隻。
卵囊接種及接種量感染用卵囊為對禽艾美球蟲(Eimeria Tenolla)敏感的種類把完全成熟的卵囊(3×104)注射進每一隻雞的素囊，用金屬探針口注。結果的判斷藥劑效果用抗球蟲病指數(ACI)決定，其計算公式如下ACI＝(相關體重的淨增+存活率)-(卵囊值+致病值)小於120作為抗球蟲病劑無效。
小於160作為抗球蟲病劑有效。
160-180作為抗球蟲病劑效果較好。
180以上作為抗球蟲病劑效果極好。
(1)相關體重的淨增試驗結束時，測量每一試驗組體重的淨增(即試驗結束時體重-感染時體重)，並在對照組(100)體重的基礎上計算出相關體重的淨增對照組亦用含有抗球蟲病劑的飼料餵養但不接種。
(2)卵囊指數盲腸中卵囊數量在接種八天後用勻化腸道的方法計數。卵囊指數表示如下腸道中發現的卵囊數卵囊指數0.0-0.1×10600.1-1.0×10611.0-5.0×106105.0-11.0×10620＞11.0×10640(3)腸道致病指數試驗用雞在試驗結束時(感染八天後)解剖，腸道用肉眼檢查以確定致病指數。致病指數表示如下，致病值定義為致病指數值的十倍。
0.(-)盲腸完全正常。如果發現血點，(一)改為(+)。
1.(+)盲腸形狀正常。內含物為少量流質，淡黃色。部分盲腸黏膜發現輕微腫脹變白。
2.(++)盲腸形狀一般不正常。整個黏膜表面可見腫脹。腸內可見無血。粘液稍黃且量少。在黏膜上可發現少量白色點狀壞死或出血點。
3.(+++)盲腸明顯萎縮變形，比直腸稍長。腸道完全變形，並充滿凝血塊或灰白色，奶酪狀變性物質。盲腸完全腫脹、易破裂，有時仍有點出血。病變達到盲腸的主要部分，但未到直腸。
(4)(++++)盲腸顯著變形萎縮。盲腸的形狀看上去象一根臘腸並不再直腸長。病變幾乎達到直腸的三分之一或四分之一。
(1)組到(3)組從卵囊接種前兩天起就飼以含有預定比例抗生素6270的飼料。(4)組餵以含有作為對照的抗生素Mononsin飼料。(5)組是卵囊接種感染未處理對照組，並餵以無抗球蟲病劑的基本飼料。(6)組為未感染、未處理對照組。
從這些試驗結果中，顯然抗生素6270具抗球蟲病活性。
試驗例2豬的飼養效果試驗試驗用豬Landrace種(蘭德瑞斯種)基本飼料a)從試驗開始到四周後60%穀物(玉米、小麥、大麥)，15%黃豆餅，15%動物性飼料(脫脂乳粉，魚粉)，以及10%其他(酶，碳酸鈣，磷酸鉀)氯化鈉等)。
b)4-12周78%穀物(玉米，miro，小麥)，13%黃豆餅，50%魚粉及4%其它(碳酸鈣，磷酸鈣，氯化鈉等)。
方法15隻平均5日齡仔豬分為3組，每組5隻，使平均體重在實際上相等。抗生素6270分別以百萬分之零，125和25的量加入於基本飼料。然後3組豬分別用該飼料餵養12周。測出體重和飼料消耗。
此外，統計從試驗開始的頭四周內豬患腹瀉的總天數。結果列於表3。
飼料需求指數通過飼餵含有抗生素6270的飼料而從5%增加到8%體重的淨增(率)從5%增加到11%。而且觀察到豬的腹瀉實際上緩和。
試驗例3反芻動物的飼養效果試驗用牛Helstein種(哈爾斯蒂恩)高效飼料
71.5%穀物(玉米，mire，大麥)，11.5%穀殼和糖(麩質玉米飼料)麥麩，米糠油餅)，55%植物油餅(黃豆餅，亞麻子油餅)，以及11.5%其它(alphalpha餅粉，糖
漿，磷酸鈣，氯化鈉)。
方法15隻八月齡閹牛分成3組，每組5隻，實際平均體重應相等。抗生素6270分別以百分之一0，7.5和15的濃度加入於基本高效飼料中。3組閹牛分別用該飼料餵養。此外，每隻牛餵以1公斤幹稻草作為粗飼料，結果列於表4。
高效飼料需求指數通過飼以含有抗生素6270的飼料而從7%增加到10%，體重淨增(率)從9%增加到11%。
權利要求
1.一種抗球蟲消劑，其特徵在於含有抗生素6270或其鹽類作為一種有效成分，抗生素6270具有以下理化性質(1)無色針狀結晶；酸性物質(2)熔點115-118℃(3)元素分析(發現物%)C62.72%；H9.49%；O27.78%(4)比旋度[a]20D-11.5°(濃度1.0，甲醇)(5)紫外吸收光譜最大吸收帶在210nm或更遠處沒有觀察到，這是在甲醇溶液中測定的。(6)在紅外吸收光譜中的特徵吸收(Cm-1)(用溴化鉀壓片法進行)3470，2980，2945，2890，1735，1460，1380，1315，1165，1102，1075，987，980(7)溶解度溶於甲醇，乙醇，乙酸乙酯，氯仿，乙醚，丙酮和苯，不溶於水。(8)顏色反應在香草醛-硫酸反應中和Drage-ndorff反應中呈陽性；在茚三酮反應中呈陰性；帶最I2氣體的顏色。(9)薄層層析(使用Merch公司製造的矽酸GF254′)溶劑系統，Rf值氯仿-甲醇(20∶1) 0.49正已烷-乙酸乙酯(1∶1) 0.08苯-乙酸乙酯(1∶1) 0.04苯-丙酮(1∶1) 0.53氯仿-丙酮(2∶1)0.36正已烷-乙酸乙酯(1∶23) 0.13乙酸乙酯 0.22(10)1H-核磁夫振波譜在δppm3.39(3H)，3.49(6H)下觀察到三個甲氧基的存在，這是在重質氯仿中在100MHz下用四甲基矽烷作為內標準測定的。
2.一種防治家禽和家畜球蟲病的方法，其特徵在於，給家禽和家畜吃有效數量的，如權項1所限定的抗生素6270或其鹽類
3.一種家禽和家畜的生長加速和飲料功效增強劑，其特徵在於，含有如權項1所述的抗生素6270或其鹽類作為活性組分。
4.一種加速家畜和家禽生長並提高飼料功效的方法，其特徵在於給家畜和家禽吃含有有效數量的如權項1所述的抗生素6270或其鹽類。
5.一種家畜及及家禽的飼料，其特徵在於，含有如權項1所述的對家禽和家畜的球蟲病有效量的抗生素6270或其鹽類。
6.根據權項7所述的飼料，其特徵在於含有大約0.5到200ppm濃度的抗生素6270或其鹽類。
7.一種家禽和家畜的飼料，其特徵在於，含有如權項1所述的抗生素6270或其鹽類。對加速家畜或家禽的生長及提高飼料功效而言，其含量為有效量。
8.根據權項9所述的飼料，其特徵在於，所含抗生素6270或其鹽類的濃度大約0.5至200ppm。
全文摘要
一種新的抗生素6270的用途，它可用作一種抗球蟲病劑或作為非加速家畜或家禽生長的飼料添加劑。
文檔編號C12P1/06GK1041880SQ8910298
公開日1990年5月9日 申請日期1985年4月1日 優先權日1985年4月1日
發明者日下部洋子, 高橋信子, 清野昭雄, 巖谷康男 申請人:科研製藥株式會社