生產在無血清的培養基懸浮培養中穩定的a549細胞系的方法

2023-10-05 00:10:44 5

專利名稱:生產在無血清的培養基懸浮培養中穩定的a549細胞系的方法
發明領域本發明涉及在培養物中生長細胞和使用所述細胞生產病毒的方法。
發明背景在開發用於生產病毒載體的懸浮方法中有兩個主要障礙。一個障礙是在保持細胞接種物的長期培養中的困難。第二個障礙是一旦將生產細胞保持在懸浮環境中，病毒生產力傾向於顯著減小。
使A549細胞適應於靜止培養中的無血清培養基的方法是本領域已知的。例如，在Siegfried等人，(Siegfried，等人，(1994)J.Biol.Chem.269(11)8596-8603)中，使A549細胞系適應於靜止培養中的無血清培養基。在該方法中，首先在一個月的時間段內使A549細胞適應含有1％胎牛血清的基本Eagle氏培養基。接近匯合時，將這些A549細胞單層用鹽水洗滌並置於無血清的培養基(稱作R0培養基)中，該培養基是補加硒(30nM)和穀氨醯胺(2mM)的RPMI1640無酚紅培養基。在適應R0培養基期間(花費約1個月)，出現沒有血清時存活的集落，並且其最終形成貼壁細胞和成簇漂浮的細胞的混合物。將適應無血清和生長因子的培養基的細胞稱作A549-R0。A549-R0細胞在不存在任何血清或加入的生長因子情況下繁殖2年以上。A549-R0細胞保持在高細胞密度(5×105個細胞/ml)並且每14天以1∶2進行傳代培養。A549-R0細胞具有8到10天的倍增時間，且親代A549細胞具有30小時的倍增時間。A549-R0細胞以比親代A549細胞低得多的速率生長，作為貼壁細胞和以大細胞團或者簇漂浮的細胞的混合物存在，以靜止培養生長並且對於最佳生長需要高細胞密度。
A549細胞系在歷史上已經作為貼壁培養物或者靜止培養物繁殖以用以生產病毒載體。本發明提供了在A549懸浮培養中生產病毒載體的新方法。
發明概述本發明提供了在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的適應的A549細胞系。在本發明的一個實施方案中，所述適應的A549細胞系具有鑑定為美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號PTA-5708的細胞系的特徵。在本發明的另一實施方案中，所述適應的A549細胞系是鑑定為美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號PTA-5708的細胞系。
本發明還提供了使A549細胞適應無血清且無動物材料的培養基懸浮培養的方法，其包括步驟(a)在貼壁培養中使細胞從含有血清的培養基斷奶(weaning)到最終血清濃度為2.5％到低於1.25％(例如，1.25％到0％)的培養基；(b)將細胞引入懸浮培養；(c)監控細胞聚集(例如，每個團塊的細胞數；細胞聚集的程度；細胞團塊大小的分布)；(d)除去細胞團塊；和(e)繼續使懸浮培養中的細胞斷奶到沒有血清和/或任何動物來源的其他組分的培養基。用於該適應方法的A549細胞(即，親代細胞)可以是ATCC株系CCL-185。
本發明包括生產在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的適應的A549細胞系的方法，其包括步驟(a)在貼壁培養中使細胞從含有血清的培養基斷奶到最終血清濃度為2.5％到低於1.25％(例如，1.25％到0％)的培養基；(b)將細胞引入懸浮培養；(c)監控細胞聚集(例如，每個團塊的細胞數；細胞聚集的程度；細胞團塊大小的分布)；(d)除去細胞團塊；(e)繼續使懸浮培養中的細胞斷奶到沒有血清的培養基；和(f)以無血清和無動物材料的培養基懸浮培養來培養細胞。此外，本發明可以包括步驟(e)或步驟(f)後冷藏細胞。在再一個實施方案中，冷藏的細胞系在無血清且無動物材料的培養基條件下或者含有血清的培養基條件下冷凍。該方法還可以包括在0℃或者更低溫度保存細胞。
本發明提供了生產病毒的方法，其包括步驟(a)培養在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的適應的A549細胞系的A549細胞；(b)用病毒(例如，腺病毒，如CRAV)接種細胞；和(c)溫育所接種的細胞。該方法還可以包括步驟(a)後且在步驟(b)前將所述培養基與新鮮培養基交換的步驟。該方法還可以包括在步驟(b)後向培養基加入氯化鈣和/或將培養基與加入或不加入氯化鈣的新鮮培養基交換(例如，通過灌注)的步驟。該方法還可以包括步驟(c)後冷凍細胞的步驟。此外，該方法可以包括步驟(c)後收穫病毒的步驟。該方法可以包括從細胞和培養基收穫病毒。
在本發明的一個實施方案中，適應的A549細胞系在無血清且無動物材料的懸浮培養中顯示出至少137代的持續生長和穩定的病毒生產力。在本發明的另一實施方案中，適應的A549細胞系在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中顯示出至少6個月的持續生長和穩定的病毒生產力。
在本發明的一個實施方案中，病毒是腺病毒。在另一實施方案中，腺病毒是條件複製的腺病毒。在再一個實施方案中，病毒是重組病毒。在另一實施方案中，所述重組病毒攜帶異源基因。
在本發明的一個實施方案中，在無血清且無動物材料的懸浮培養中穩定的所適應的A549細胞系在接種腺病毒時的A549細胞濃度為1.8×106個細胞/ml到2.4×106個細胞/ml。在另一實施方案中，在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的所適應的A549細胞系的A549細胞在接種腺病毒時來自晚期指數生長期中的培養物。在另一實施方案中，接種的腺病毒的量為1×108個病毒顆粒/ml培養物。在本發明的再一個實施方案中，接種時腺病毒顆粒與A549細胞的比率為(40到60)∶1。
在本發明的一個實施方案中，對於生產病毒的方法，在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的所適應的A549細胞系的A549細胞來自冷藏的細胞系。在再一個實施方案中，冷藏的細胞系在無血清且無動物材料的培養基條件下或者在含有血清的培養基條件下冷凍。
本發明的範圍還提供了生產腺病毒的方法，其包括步驟(a)在貼壁培養中使細胞系中的A549細胞從含有血清的培養基(例如，含有10％血清(例如，胎牛血清))斷奶到最終血清濃度為2.5％到低於1.25％(例如，1.25％到0％)的培養基；(b)將細胞引入懸浮培養；(c)監控培養物中的細胞聚集(例如，每個團塊的細胞數；團塊的大小；細胞聚集的程度；細胞團塊大小的分布)；(d)除去細胞團塊；(e)繼續使懸浮培養中的細胞斷奶到沒有血清和/或任何動物來源的組分的培養基；(f)濃縮細胞；(g)將培養基與補加冷凍保護劑的培養基交換；(h)冷凍細胞(例如，冷藏細胞)；(i)將細胞保存在0℃或者更低的溫度下；(j)將細胞重構到無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養；(k)增殖細胞到晚期指數生長期；(l)將培養基與新鮮培養基(例如，無血清並且無動物材料的培養基)交換；(m)用腺病毒接種細胞；(n)向培養物加入氯化鈣；(o)溫育接種的細胞；(p)將培養基與新鮮培養基(例如，無血清並且無動物材料的培養基)交換；(q)向培養物加入氯化鈣；(r)溫育細胞；和(s)收穫腺病毒。步驟(f)-(j)、(l)、(n)、(p)、(q)和(s)是任選的。
發明詳述本發明提供了生產腺病毒(例如，在懸浮A549細胞中)的經濟且容易的方法，其沒有在血清或者動物來源的其他培養基組分的存在下與受感染細胞生長相關的問題。
產生適應的A549細胞系本發明包括使A549細胞系適應在不存在血清或者來自動物來源的組分的物質時生長以產生細胞系的方法，所述產生的細胞系當用腺病毒感染時顯示出懸浮培養中的持續生長和穩定的病毒生產率。通常，通過如下步驟來使A549細胞適應，(a)在貼壁培養或者靜止培養中，使細胞從含有血清的培養基(例如，含有10％血清的培養基)逐漸斷奶到血清終濃度為2.5％到1.25％，或者2.5％到0.6％，或者2.5％到0.5％，或2.5％到0.4％，或2.5％到0.3％，或2.5％到0.2％，或2.5％到0.1％，或2.5％到0.05％，或2.5％到0的培養基；(b)將細胞置于振蕩、搖動、攪動或者攪拌的容器中進行懸浮培養；(c)測量細胞聚集或者監控培養物中細胞聚集的程度；(d)除去細胞團塊(通過本領域已知的任意方法)；和(e)繼續使懸浮培養中的細胞斷奶到沒有血清或者任何動物來源的其他培養基組分的培養基。優選地，在步驟(b)、(c)和(e)中不斷振蕩、搖動、攪動或攪拌細胞。通常，完成適應過程需要3到6周。
通常，所適應的細胞在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定至少137代或6個月(即，細胞在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中表現出持續生長和穩定的病毒生產率)。同樣，所適應的細胞在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中的倍增時間為親代A549細胞在含有血清的培養基中靜止培養的倍增時間的0.8到2.9倍。例如，通常，適應的A549細胞在無血清並且無動物材料的培養基中的倍增時間為24到88小時，而親代A549細胞在含有血清的培養基中並且靜止培養的倍增時間為30小時。在適應的A549細胞系無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中，總的細胞群體是懸浮的。在一個實施方案中，99％以上的適應的A549細胞是懸浮的(例如，100％的細胞是懸浮的，100％的細胞不附著到表面，100％的細胞懸浮在液體培養基中)。
在本發明一個實施方案中，適應的A549細胞系具有鑑定為美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號PTA-5708的細胞系的特徵，PTA-5708細胞系也稱作A549S細胞系。A549S細胞系的細胞在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定至少137代或者6個月(即，細胞在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中表現出持續生長和穩定的病毒生產率)。A549S細胞系的細胞在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中的倍增時間為約24到88小時。在A549S細胞系無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中，總A549S細胞群體是懸浮的。在一個實施方案中，99％以上的A549S細胞是懸浮的(例如，100％的細胞是懸浮的，100％的細胞不附著到表面，100％的細胞懸浮在液體培養基中)。
在本發明的一個實施方案中，適應的A549細胞系是鑑定為美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號PTA-5708的細胞系，其也稱作A549S細胞系。
「A549」是本領域公知的肺癌細胞系。在一個實施方案中，用於適應方法的A549親代細胞系是ATCC株系CCL-185。
本文所用的術語「匯合的」指細胞已經在生長表面形成了粘附層，在粘附層上所有細胞都與其他細胞接觸，從而使用了實際上所有可利用的表面。例如，已經將「匯合的」定義(R.I.Freshney，Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Techniques，Second Edition，Wiley-Liss，Inc.New York，N.Y.，1987，p.363)為這樣的情況，其中「所有細胞都在所有它們的外周與其他細胞接觸並且沒有可以利用的基質沒有被覆蓋」。對於本發明的目的，術語「基本上匯合的」表示細胞通常在表面上接觸，儘管可以剩餘間隙，從而70％以上，優選90％以上的可利用的表面被使用。這裡，「可利用的表面」指容納細胞的足夠表面區域。從而，相鄰細胞之間不能容納額外細胞的小間隙不構成「可利用的表面」。
可以通過使細胞逐漸從血清斷奶或者通過直接適應來使哺乳動物細胞從在血清條件中生長適應到無血清的條件。逐漸斷奶方法對於培養的脅迫較低並且可以導致較小的生長滯後。直接適應方法更快，但是相對苛刻並且最初的細胞密度和生活力通常下降。
許多細胞系可以從含有血清的培養基直接傳代培養到無血清的培養基中。例如，當血清存在下生長的培養物為具有至少90％生活力的處於對數生長期中期的培養物時，可以將它以1∶2或1∶3的比率稀釋到無血清的培養基中。每周重複該過程兩次直到得到連貫生長。由於當直接從補加血清的培養基接種到無血清的培養基時細胞大量喪失，所以，起初，通常以比正常用於傳代培養更高的接種密度接種培養物。在細胞生長速率返回到對補加血清的培養基中的細胞觀察到的速率之前，無血清培養基中前幾次傳代的細胞生長速率通常較低。如果該方法不成功，那麼應該使用連續的或者斷奶方法。
使細胞從含有血清和血清蛋白質的培養基「斷奶」或者「連續適應」到無血清和動物材料的培養基指逐漸、逐步減小培養基的血清濃度。可以通過本領域公知的方法進行逐漸減小。例如，在含有高濃度血清的第一培養基中的細胞可以用於接種含有稍少血清的第二培養基。一旦第二培養基中的細胞生長到給定細胞密度，就可以將它們又用於接種含有更少血清的第三培養基。可以重複該方法直到細胞在含有所希望量的血清的培養基中生長。
在斷奶細胞的另一實例中，細胞生長在補加10％血清的基礎培養基中直到細胞達到線性對數生長期的峰。然後，將細胞在補加5％血清的無血清培養基基質中傳代培養。達到飽和密度後，將細胞在補加1％血清的無血清培養基基質中傳代培養。隨後，在每次傳代培養，將血清減少50％直到血清濃度低於0.06％。然後，在無血清的培養基中保持和培養細胞。如果在適應期間任何點細胞生長下降，就將血清濃度恢復到促進細胞生長的點。在進行血清減少方案前允許細胞生長到在那一血清濃度穩定。一旦細胞適應了無血清的條件，則繼續進行培養基蛋白質減少方案，如在每次傳代培養時，加入等同體積的無血清並且無動物材料的培養基直到培養物在無血清並且無動物材料的培養基條件下繁殖。在該方法的變通方案中，可以將細胞直接適應到無血清並且無動物材料的培養基條件，其中不使用中間的無血清培養基步驟。
斷奶細胞的另一個實例是在含有血清的培養基，如含有5-10％血清的基礎培養基中繁殖細胞到90％飽和密度。使用50％的含有血清的培養基和50％的不含血清的培養基以1∶1比率進行傳代培養。第二天，以相同方式傳代培養細胞。在某點，細胞倍增將減小並且細胞培養之間的時間間隔將增加。根據需要，繼續1∶1傳代培養細胞，直到每天傳代培養細胞。一旦細胞適應了無血清的條件，就繼續培養基血清蛋白質減少方案，如在每次使用50％無血清培養基和50％無血清並且無動物材料的培養基的1∶1傳代培養中，直到每天傳代培養細胞。在該點，可以將細胞調節到分離比(split ratio)大於1∶1的傳代培養程序。在該方法的變通方案中，可以將細胞直接適應到無血清並且無動物材料的培養基條件，其中不使用中間的無血清培養基步驟。
在斷奶細胞的另一實例中，在每次傳代時，將培養物稀釋到含有血清的培養基和無血清的培養基的混合物中。最初可以使用含有血清的培養基和無血清的培養基的1∶1比率。對於每次隨後的傳代，增加無血清的培養基的相對量直到實現完全獨立於血清。在每次傳代時，培養物應在對數生長期中期並且向培養基的稀釋應該大約在1∶2到1∶3的比率。細胞應該每周傳代培養兩次。在每次傳代時，如果新培養基條件不成功，則應該用已知足夠保持細胞生活力的血清濃度接種備份瓶。
對於在血清存在下貼壁的細胞系，如A549，對無血清的培養基或者無血清並且無動物材料的培養基的適應將常常導致培養物變得鬆弛地貼壁，可能形成團，和具有大的細胞團塊。
可以通過本領域公知的方法將細胞引入懸浮培養。例如，可以使用細胞刮棒將貼壁培養的細胞從它們的生長表面取下並再置於容器，如搖瓶或者旋轉瓶中，在瓶中持續攪動培養物。在另一實例中，可以通過胰蛋白酶消化從生長表面取下培養物的細胞，然後滅活胰蛋白酶，或者通過洗滌細胞除去胰蛋白酶，然後將細胞置於容器中的懸浮培養中。備選地，貼壁培養的細胞可以通過非酶方法，如通過輕微拍打培養容器或者通過用含有二價離子螯合劑的溶液處理從基質取出。例如，可以使用二價離子螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-二((3-氨基乙基醚)-N，N，N』，N』-四乙酸(EGTA)。可以振蕩、搖動、攪動或者攪拌懸浮培養物以保持細胞懸浮。
許多細胞類型傾向於在懸浮培養中以細胞團生長，特別是最初來自附著或者貼壁細胞系的培養物。具有可變水平細胞聚集的培養物可以顯示出不同的生長動力學。團塊大小的控制是重要的問題。在團塊內可能發生細胞死亡和壞死。嚴重的聚集由於空間和代謝擴散的限制可以導致很差的細胞生長。此外，如果細胞是用於病毒生產方法的宿主細胞，那麼極度的細胞聚集可以通過防止團塊的內部細胞感染並從而減小所得的總體病毒效價而不利地影響感染效率。生物量測量和聚集定量在確定聚集的懸浮培養中細胞生長和行為中都是重要的。評估懸浮培養中的細胞聚集的程度對於監控懸浮過程是重要的。
可以通過本領域已知的任意方法確定培養中細胞團塊或團的存在。例如，可以通過顯微鏡或者使用細胞篩分裝置，如COULTERCOUNTER(Beckman Coulter，Inc.，Particle Characterization，1950West 8th Avenue，Hialeah，FL，33010，美國)或者AccuSizer 780/SPOSSingle Particle Optical Sizer(Particle Sizing Systems，668Woodbourne Road，Suite 104，Langhorne，PA，19047，美國)觀察團塊的存在。定量細胞聚集的其他自動化方法是本領域公知的(Neelamegham等人，Ann.Biomed.Eng.25(1)180-9(1997)；Tsao等人，Biotechnol.Prog.16809-814(2000))。在本發明的一個實施方案中，Tsao等人(Biotech.Prog.16809-814(2000))的方法可以用於定量地監控細胞聚集和細胞生物量。
適應的A549細胞是在無血清和懸浮培養中生長的懸浮感受態細胞，其為單個懸浮細胞與小團塊的混合物，即單分散的細胞和直徑400微米到直徑20微米的團塊中的細胞。已經通過將貼壁-依賴性的細胞逐漸適應到那些條件使得適應的A549細胞對在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中的生長是感受態的。通過向培養物中加入液體混合物也可以減小形成細胞團的量。加入化學成分確定的液體混合物可以避免向培養物中引入動物產物。
在A549細胞的懸浮適應過程中，可以選擇性保留不與大的細胞團結合的細胞。可以通過本領域公知的方法進行不與大的細胞團結合的細胞的選擇性保留。例如，停止攪動懸浮培養物1到2分鐘，從而允許細胞團塊沉降到培養容器的底部。取出含有單個細胞和小團塊中的細胞的培養物的90％體積並在新的容器中傳代培養。丟棄最初培養物的10％體積的含有大細胞團塊的剩餘培養物體積。在另一實例中，停止攪動懸浮培養物1到2分鐘，從而允許細胞團塊沉降到培養容器的底部。用移液器從容器的底部取出含有大細胞團塊的10％體積的培養物並丟棄。將佔90％最初培養物體積的含有單個細胞和小細胞團塊的剩餘培養物體積進行傳代培養。250ml、500ml和1L大小的搖瓶的培養容器優選分別有30到40ml、100ml和240ml的培養體積。
以這種方式，從培養物，即細胞群體除去由幾百個細胞或更多細胞組成的團塊。可以通過多輪選擇，例如，通過重複該方法富集所希望的細胞群體。所得細胞將比相同懸浮培養基中非適應的細胞顯示出較少的團形成或者較低程度的細胞聚集。
培養期間培養物形成團或聚集的程度可以通過顆粒，即細胞團塊，大小測量，其中使用AccuSizer 780/SPOS單顆粒光學篩分器(Single Particle Optical Sizer)來監控。在該儀器中，單個顆粒被雷射束穿過並測量每個顆粒阻斷的光的量。被阻斷的光的量對應於顆粒的橫截面面積並從而對應於細胞團或細胞團塊大小。以表格形式或者柱狀圖報告單個細胞和細胞團的分布圖。該光學篩分器能夠檢測直徑為例如10到15微米的單個細胞到直徑最高達400微米的細胞團塊的顆粒大小。例如，該儀器使用的優選的探針檢測大小為直徑0.5微米到400微米的顆粒。
在一個實施方案中，通過Tsao等人(Biotechnol.Prog.16809-814(2000))中公開的方法進行細胞聚集或者細胞聚集程度的監控。
適應的A549細胞系的細胞可以作為單個細胞與小細胞團塊的混合物存在於無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中。這部分通過選擇性消除大細胞團或大細胞團塊實現。認為在適應過程中已經除去形成更大團塊的細胞群體。所除去的細胞團塊或細胞團可以直徑大於400微米。剩餘並且培養的細胞團塊優選為小的團塊，其大小為100微米到20微米。單個細胞大小為直徑10到15微米的範圍。
在無血清且無動物材料的懸浮培養中培養穩定的適應的A549(也稱作A549S)中存在的細胞團塊或細胞團可以直徑小於400微米，例如，350微米，通常小於至少300微米，例如，250微米，小於至少200微米，例如，150微米，小於至少100微米，例如，90、80、70、60微米，小於至少50微米，例如，40、30微米，和直徑小於至少25微米。單個細胞的直徑範圍為10到15微米。
顆粒大小的分布和累積細胞體積同時提供了關於培養物的聚集狀態的信息。通過下面的方法描述使用AccuSizer 780/SPOS單顆粒光學篩分器對聚集狀態的定量。一種方法是柱狀圖，其概述所有顆粒，即細胞和細胞團塊的累積體積的分布。形成細胞團的程度可以通過累積聚集圖，例如，累積細胞體積分布圖代表。聚集的程度還可以以數字方式表示。選擇累積曲線穿過柱狀圖或圖表上25％、50％和75％標記時的百分數點。結果的數字表示，如50％標記，提供了樣品之間聚集程度的方便且一致的比較。
所適應的A549細胞系根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)在2003年12月23日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA，20110-2209，美國)，保藏名和編號如下保藏名「A549S」；ATCC編號PTA-5708。當專利授權後對使用保藏在ATCC的細胞系的所有限制都將取消。
「懸浮培養」指細胞培養，其中培養容器中的主要或者所有細胞都懸浮存在，例如，不附著到任何基質或者表面、容器表面或者容器內的另一表面。可以振蕩、搖動、攪動、轉動或者攪拌懸浮培養物以保持細胞懸浮。
「含有血清的培養基」包括含有來自任何生物的血清的任何生長培養基。例如，含有血清的培養基包括含有胎牛血清、新生牛血清、牛血清、人血清、馬血清、雞血清、山羊血清、豬血清、兔血清和/或綿羊血清的培養基。血清可以經熱失活、透析、γ-輻射、去脂或者去纖維蛋白。血清還可以補加例如鐵或者生長因子。
「無血清的培養基」包括缺少血清的任意培養基。在本領域中，無血清的培養基可以描述不需要補加血清來支持細胞生長的一類培養基。無血清的培養基可以含有不連續的蛋白質或者大批蛋白質級分。蛋白質可以是動物來源的。優選的通過商業途徑可獲得的無血清的培養基製劑的實例是來自JRH Biosciences，Inc.，13804W.107thStreet，Lenexa，Kansas，66215，美國的EX-CELLTM520和EX-CELLTM301。
「無血清且無動物材料的」培養基指不含有動物來源的組分的培養基。在本領域中，細胞培養基生產商對無血清的和無血清且無動物材料的培養基的定義可以不同。無血清的或無血清且無動物材料的培養基也可以描述為無血清的、化學成分確定的培養基。這些培養基是不含有未知組成的組分的無血清培養基的亞類。這些培養基沒有動物來源的組分並且所有組分都有已知的化學結構。無蛋白質的培養基是無血清培養基的亞類，它們沒有所有蛋白質，但是可以含有植物或者酵母水解產物。
「無血清且無動物材料的培養基懸浮培養物」或者「無血清且無動物材料的懸浮培養物」指在無血清且無動物材料的培養基中繁殖的懸浮培養物。無血清且無動物材料的培養基懸浮培養物包含細胞和培養基。培養物含有由在培養基中生長或培養的細胞分泌、衍生或者生產的蛋白質。如果病毒繁殖，那麼培養物包含細胞、病毒和培養基。生產病毒的培養物含有來自細胞和病毒的蛋白質。
通過商業途徑可獲得的無動物材料的合成細胞培養基可以用作無血清且無動物材料的培養基。優選的無血清且無動物材料的培養基的實例包括來自Irvine Scientific，2511 Daimler Street，Santa Ana，CA，92705，美國的IS 293-VTM。
可以篩選通過商業途徑可獲得的無血清的培養基作為無血清培養基的適宜性。例如，可以篩選通過商業途徑可獲得的培養基支持A549細胞在搖瓶中生長的能力。例如，可以使用目的培養基將來自貼壁培養的細胞轉移成懸浮的。在另一實例中，來自已經建立的懸浮培養的細胞可以從它們的當前培養基轉換到目的培養基中。通過血細胞計數器計數監控細胞生長。通過顯微鏡檢查評估形成細胞團的程度。例如，來自該篩選方法的結果發現來自JRH Biosciences，Inc.，(13804W.107thStreet，Lenexa，Kansas，66215，美國)的培養基EX-CELLTM520和EX-CELLTM301支持A549細胞生長而無大的團塊。這些培養基可以作為無血清的培養基進一步開發。來自篩選方法的額外結果發現例如，在Condon等人，(Biotechnol.Prog.19137-143(2003))中公開的用於懸浮培養HEK293細胞的補加0.1％PLURONIC F-68(GIBCO)、10mM Tris*HCl(pH 7.4，Biowhittaker)、1X痕量元素(Trace Elements)A、B和C(Mediatech)和13.4mg/L葡糖酸亞鐵(Fluka))的無血清且無動物材料的培養基，例如，IS 293-V(Irvine Scientific)支持A549細胞生長而無大的團塊。可以將該培養基進一步開發為無血清且無動物材料的培養基。
同樣，例如，下面的通過商業途徑可獲得的培養基在篩選方法中不支持A549細胞生長CD 293(GIBCO，Invitrogen)；AIM-V(GIBCO，Invitrogen，Inc.，)；RPMI 1640(GIBCO，Invitrogen，Inc.，)；293SFM II(GIBCO，Invitrogen，Inc.，)；用於腺病毒生產的基因治療培養基3(Gene Therapy Medium 3for AdenovirusProduction)(Sigma-Aldrich，P.O.Box 14508，St.Louis，MO，63178，美國)；和用於懸浮培養的無CHO蛋白培養基，無動物組分培養基(CHO Protein-free Medium，Animal Component-free Medium forSuspension Culture)(PF-ACF-CHO)(Sigma-Aldrich)。不進一步開發這些培養基。此外，例如，培養的A549細胞在下面通過商業途徑可獲得的培養基中形成大的團塊ULTRACHOTM(Biowhittaker，Cambrex Corp.，One Meadowland Plaza，EastRutherford，NJ，07073，美國)；ULTRACULTURETMCulture(Biowhittaker，Cambrex Corp.)；和IS-CHO-VTM(IrvineScientific)。不進一步開發這些培養基。
無血清且無動物材料的培養基補加鐵補充物，該鐵補充物經設計用來替換用於鐵轉運的轉鐵蛋白。通過商業途徑可獲得的鐵補充物的實例是來自Sigma-Aldrich，P.O.Box 14508，St.Louis，MO，63178，美國的化學成分確定的鐵補充物(Chemically-Defined IronSupplement)，產品號為I3153，它含有222-334ppm鐵和鐵結合的合成的轉運分子。該複合物被轉運到細胞中，在細胞中鐵被釋放並可以為細胞利用。Sigma-Aldrich的化學成分確定的鐵補充物以1ml/l培養基的稀度使用。通過商業途徑可獲得的鐵補充物的優選實例是Irvine Scientific(Irvine Scientific，2511 Daimler Street，Santa Ana，CA，92705，美國)的鐵螯合物(Iron Chelate)，產品號為9343，它以1ml到3ml/l培養基，優選3ml/l培養基的稀度使用。通過商業途徑可獲得的鐵補充物的另一優選實例是葡糖酸亞鐵，其以13mg/l培養基的濃度使用。
培養基補充脂類或者脂類前體，如膽鹼、油酸、亞油酸、乙醇胺或者磷酸乙醇胺以促進細胞的生長。有通過商業途徑可獲得的濃縮的脂類混合物用於補充培養基。通過商業途徑可獲得的脂類混合物濃縮物的一個實例是Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich，P.O.Box 14508，St.Louis，MO，63178，美國)的脂類培養基補充物(Lipid MediumSupplement)(100X)，產品號為L2273，以10ml/l培養基的稀度使用。Sigma-Aldrich的脂類培養基補充物(100X)的配方如下100ml/L Sigma-Aldrich的脂類混合物(Lipid Mixture)，產品號為L5146，和100g/L PLURONIC F-28，產品號為P 1300。用於製備脂類培養基補充物(100X)的Sigma-Aldrich的脂類混合物，產品號為L5146的配方如下膽固醇(4.5g/L)；鱈魚肝油脂肪酸甲酯(10g/L)；聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(25g/L)；和D-α-生育酚乙酸酯(2g/L)。通過商業途徑可獲得的脂類混合物濃縮物的優選實例是GIBCO，Invitrogen Corporation(Invitrogen Corporation，1600Faraday Avenue，Carlsbad，California，92008，美國)的化學成分確定的脂類濃縮物，產品號為11905-031，以1ml到10ml/升培養基，例如，0.1％v/v到1％v/v，優選1ml/l培養基，例如，0.1％v/v，更優選4ml/升培養基，例如，0.4％v/v，甚至更優選10ml/升培養基，例如，1％v/v的稀度使用。GIBCO，Invitrogen Corporation的化學成分確定的脂類濃縮物，產品號為11905-031的配方如下PLURONIC F-68(100,000mg/L)；乙醇(100,000mg/L)；膽固醇(220mg/L)；Tween 80(也稱作聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)(2,200mg/L)；DL-α-生育酚乙酸酯(70mg/L)；硬脂酸(10mg/L)；肉豆蔻酸(10mg/L)；油酸(10mg/L)；亞油酸(10mg/L)；棕櫚酸(10mg/L)；棕櫚油酸(10mg/L)；花生四烯酸(2mg/L)；和亞麻酸(10mg/L)。
無血清並且無動物材料的培養基補加非離子表面活性劑，例如，PLURONIC F68。PLURONICS是一系列非離子表面活性劑，它們具有一般結構HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2OH)b(CH2CH2O)cH，其中b為至少15並且(CH2CH2O)a+c按重量計為20％到90％。也已知PLURONICS是例如泊洛沙姆；甲基環氧乙烷聚合物，與環氧乙烷的聚合物；和聚乙二醇-聚丙二醇，聚合物。特別優選的非離子表面活性劑是PLURONIC F68。培養基中所用的非離子表面活性劑，例如，PLURONIC F68的量可以為0.05％到0.4％，特別優選為0.1％到0.05％，更尤其優選0.1％。該試劑通常用於保護細胞免於攪動和通氣的不利影響(Murhammer和Goochee，1990，Biotechnol.Prog.6142-148；Papoutsakis，1991，Trends Biotechnol.9316-324)。
此外，對培養基補充無機痕量元素以增強細胞的生長，如硒、穀氨醯胺、硫酸銅、檸檬酸鐵、亞硒酸鈉、硫酸鋅、鉬酸銨、釩酸銨、硫酸錳、硫酸鎳、矽酸鈉、氯化亞錫、氯化鋁、乙酸鋇、氯化鎘、氯化鉻、二氯化鈷、二氧化鍺、溴化鉀、硝酸銀、氟化鈉和二氯氧化鋯。
存在可以通過商業途徑獲得的痕量元素的濃縮混合物，例如Mediatech的痕量元素A1,000X溶液，產品號為99-182-CI；Mediatech的痕量元素B1,000X溶液，產品號為99-175-CI；和Mediatech的痕量元素C1,000X溶液，產品號為99-176-CI(Mediatech，Inc.，13884 Park Center Road，Herndon，VA，20171，美國)。Mediatech的痕量元素A、痕量元素B和痕量元素C溶液的每一種都以1ml/l培養基的稀度使用。Mediatech的痕量元素A1,000X溶液，產品號為99-182-CI的配方如下CuSO4*5H2O(1.6mg/L)；ZnSO4*7H2O(863mg/L)；亞硒酸鈉(17.3mg/L)；和檸檬酸鐵(1155.1mg/L)。Mediatech的痕量元素B1,000X溶液，產品號為99-175-CI的配方如下MnSO4*H2O(0.17mg/L)；Na2SiO3*9H2O(140mg/L)；鉬酸，銨鹽(1.24mg/L)；NH4VO3(0.65mg/L)；NiSO4*6H2O(0.13mg/L)；和SnCl2(無水的)(0.12mg/L)。Mediatech的痕量元素C1,000X溶液，產品號為99-176-CI的配方如下AlCl3*6H2O(1.2mg/L)；AgNO3(0.17mg/L)；Ba(C2H3O2)2(2.55mg/L)；KBr(0.12mg/L)；CdCl2(2.28mg/L)；CoCl2*6H2O(2.38mg/L)；CrCl3(無水的)(0.32mg/L)；NaF(4.2mg/L)；GeO2(0.53mg/L)；KI(0.17mg/L)；RbCl(1.21mg/L)；和ZrOCl2*8H2O(3.22mg/L)。
此外，對無血清並且無動物材料的培養基補加緩衝劑以幫助控制細胞培養的pH水平。例如，緩衝劑包括碳酸氫鈉、一元和二元磷酸鹽、HEPES((N-2-羥乙基哌嗪-N』-(2-乙磺酸)；4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸)；和其鹽))，和Tris((三(羥甲基)氨基甲烷；三(2-氨基乙基)胺；和其鹽))。
此外，對無血清並且無動物材料的培養基補加胺基酸L-穀氨醯胺，其在培養基中的濃度為2mM到20mM，優選至少2mM，例如，1mM或3mM，更優選至少4mM，例如，5mM、6mM或7mM，更優選至少8mM，例如，9mM或者10mM。
任選地，對無血清並且無動物材料的培養基補加糖，如D-葡萄糖，糖的濃度為0.1-10g/l培養基，至少2g/l培養基。
在一個實施方案中，無血清並且無動物材料的培養基是IrvineScientific的IS 293-VTM(Irvine Scientific，2511 Daimler Street，SantaAna，CA，92705，美國)，其補加0.1％PLURONIC F68(InvitrogenCorporation，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，California，92008，美國)，Irvine Scientific的鐵螯合物(3ml/l培養基)、15mM TRIS緩衝液、Mediatech(Mediatech，Inc.，13884 Park Center Road，Herndon，VA，20171，美國)的痕量元素A(1ml/l培養基)、Mediatech的痕量元素B(1ml/l培養基)和Mediatech的痕量元素C(1ml/l培養基)、8mM L-穀氨醯胺和GIBCO，Invitrogen的化學成分確定的脂類濃縮物(1％v/v)(Invitrogen Corporation)。
在另一實施方案中，無血清並且無動物材料的培養基是IrvineScientific的IS 293-VTM(Irvine Scientific，Santa Ana，California，美國)，其補加0.1％PLURONIC F68(Invitrogen Corporation)、葡糖酸亞鐵(13mg/l培養基)、15mM TRIS緩衝液、Mediatech的痕量元素A(1ml/l培養基)、Mediatech的痕量元素B(1ml/l培養基)和Mediatech的痕量元素C(1ml/l培養基)、8mM L-穀氨醯胺和GIBCO，Invitrogen的化學成分確定的脂類濃縮物(1％v/v)(Invitrogen Corporation)。
細胞培養和病毒生產可以通過將細胞培養在適宜的培養基，如無血清並且無動物材料的培養基，優選以懸浮培養簡單地增殖本發明的適應的A549細胞系。
一旦細胞已經適應，就可以將它們冷藏並保存備用。優選地，通過如下步驟冷藏細胞，將適應的A549細胞增殖到晚期指數生長期；濃縮細胞；將生長培養基交換為例如補加冷凍保護劑和穩定劑的無血清且無動物材料的培養基或者含血清的培養基的培養基；冷凍細胞；並在0℃或更低溫度下保存細胞。
優選地，細胞保存在-70℃或以下，例如，-80℃，或者在液氮中或者在液氮的蒸汽相中。
可以通過本領域公知的任意方法濃縮細胞。例如，可以通過離心、沉降、用灌注裝置(例如，篩網)濃縮或通過過濾濃縮。優選地，將細胞濃縮到至少1×107個細胞/ml。
細胞可以保存在本領域已知的任意冷凍保護劑中。例如，冷凍保護劑可以是二甲基亞碸(DMSO)或者甘油。細胞可以保存在本領域已知的任意穩定劑中。例如，穩定劑可以是甲基纖維素或者血清。
冷凍前，可以將濃縮的細胞分配於幾個單獨的容器中以產生細胞庫。細胞可以保存在例如玻璃或者塑料瓶或者管或者細胞培養袋中。當需要細胞備用時，可以從細胞庫選擇一部分冷藏的細胞(從一個容器)，解凍並且不進行適應而用於無血清並且無動物材料培養基懸浮培養中。
可以通過本領域已知的用於哺乳動物細胞懸浮培養的任意方法增殖或生長適應的A549細胞。適應的A549細胞可以不進一步適應就生長在無血清並且無動物材料的懸浮培養中。可以通過一步或多步方法進行增殖。在一步增殖方法中，從貯藏中取出適應的A549細胞並直接接種到培養容器中，在該培養容器中發生病毒的生產。在多步增殖方法中，從貯藏中取出適應的A549細胞並通過許多培養容器進行增殖，所述容器逐漸增加大小直到得到最終培養容器，在該培養容器中進行病毒的生產。在增殖步驟期間，細胞在最優化生長的條件下生長。培養條件，如溫度、pH、溶解氧水平等等是已知對特定細胞系最優化的條件並且將是本領域技術人員顯而易見的(見，例如，Animal Cell cultureA Practical Approach第二版，Rickwood，D.和Hames，B.D.eds.，Oxford University Press，New York(1992))。
當增殖適應的A549細胞，或者在細胞中生產病毒，例如腺病毒的適應的A549細胞時，來自最初瓶的細胞可以在無血清或者無血清並且無動物材料的培養基中生長到生物量。具有高細胞密度的生物量可以在病毒增殖和生產過程中保持在無血清或者無血清並且無動物材料的培養基中。
可以在本領域已知的任意適宜的容器中生長適應的A549細胞和培養生產病毒的適應的A549細胞。例如，細胞可以生長在並且受感染的細胞可以培養在生物產生器(biogenerator)或生物反應器中。通常「生物產生器」或「生物反應器」指培養罐，其通常由不鏽鋼或玻璃製造，體積為0.5升或更大，包含攪動系統，用於注射CO2氣體流的裝置和充氧裝置。通常，它裝備用於測量生物產生器的內部參數的探針，所述內部參數為諸如pH、溶解氧、溫度、罐壓力或者培養的某些理化參數(例如，葡萄糖或者穀氨醯胺的消耗或者乳酸和銨離子的產生)。將pH、氧和溫度探針連接到生物處理器，其永久調節這些參數。在其他實施方案中，容器是旋轉瓶、滾動瓶、搖瓶或者具有提供機械攪動的攪拌棒的瓶。在另一實施方案中，容器是WAVE生物反應器(WAVE Biotech，Bridgewater，NJ，美國)。可以振蕩、搖動、攪動、滾動或者攪拌懸浮培養物以保持細胞懸浮。
可以通過本領域已知的任意方法測定適應的A549培養物的細胞密度。例如，可以通過顯微鏡術，例如用血細胞計數器，或者通過電子細胞計數裝置(例如，COULTER COUNTER；AccuSizer 780/SPOS單顆粒光學篩分器)測定細胞密度。
術語「世代數」指細胞培養物已經經歷的群體倍增的數目。群體倍增的計算是本領域公知的(見，例如，Patterson，Methods inEnzymology，編著，Jakoby and Pastan，Academic，New York，58150-151(1979))。在一個實施方案中，按照公式ln(細胞質量增加倍數)/ln2通過計算培養期間細胞分裂次數，來確定培養物的體外細胞年齡或世代數。在一個實施方案中，通過Tsao等人(Biotechnol.Prog.16809-814(2000))中公開的方法測量細胞質量的增加。
術語「重組體」指通過常規重組DNA技術修飾的基因組。
本文所用的術語「病毒」不僅包括天然存在的病毒，而且包括重組病毒、減毒病毒、疫苗株系等等。重組病毒包括，但不限於，包含異源基因的病毒載體。術語重組病毒包括嵌合(或者甚至多聚體的)病毒，即使用來自一種以上病毒亞型的互補編碼序列構建的載體。見，例如，Feng等人Nature Biotechnology 15866-870(1997)。在一些實施方案中，由宿主細胞、輔助病毒或者輔助質粒提供病毒複製的輔助功能。代表性載體包括，但不限於，將感染哺乳動物細胞，特別是人細胞，並且可以來自諸如逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和禽痘病毒的那些載體。
任何病毒都可以在本發明的細胞培養物中增殖。在一個實施方案中，病毒是腺病毒。術語「腺病毒」與術語「腺病毒載體」同義，並且指腺病毒科屬的病毒。術語腺病毒科共同指哺乳動物腺病毒屬的動物腺病毒，包括但不限於人、牛、羊、馬、狗、豬、鼠和猿腺病毒亞屬的動物腺病毒。具體地，人腺病毒包括A-F亞屬以及其個體血清型。例如，可以在本發明的細胞培養物中生產任意腺病毒類型1、2、3、4、4a、5、6、7、7a、7d、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91。在本發明的優選實踐中，腺病毒為或者來自人腺病毒血清型2或5。
在本發明的一個實施方案中，腺病毒包含野生型、未突變的基因組。在另一實施方案中，病毒包含突變的基因組；例如，突變的基因組可以缺少片段或者可以包括一個或多個額外的異源基因。在另一實施方案中，病毒是選擇性複製的重組病毒或者條件複製病毒，即在正常細胞中減毒但是在腫瘤細胞中保持病毒複製的病毒。見，例如，Kirn，D.等人，Nat.Med.7781-787(2001)；Alemany，R.等人NatureBiotechnology 18723-727(2000)；Ramachandra，M.等人，ReplicatingAdenoviral Vectors for Cancer Therapy in Pharmaceutical DeliverySystems，Marcel Dekker Inc New York，pp.321-343(2003)。
在本發明的一個實施方案中，選擇性複製的重組病毒是選擇性複製的重組腺病毒或者腺病毒載體，如公開的國際申請號WO 00/22136和WO 00/22137；Ramachandra，M.等人，Nature Biotechnol.191035-1041(2001)；Howe等人，Mol.Ther.2(5)485-95(2000)；和Demers，G.等人Cancer Research 634003-4008(2003)中所速的那些腺病毒或腺病毒載體。
選擇性複製的重組腺病毒也可以描述為，但不限於「溶瘤腺病毒」、「溶瘤複製性腺病毒」、「複製性腺病毒載體」、「條件複製腺病毒載體」或者「CRAV」。
在本發明的另一實施方案中，腺病毒是01/PEME，也稱作cK9TB或K9TB，其通過在E1a基因和E3區中缺失、插入驅動E2F拮抗劑E2F-Rb的p53應答啟動子和插入主要晚期啟動子調節的E3-11.6K基因而修飾為在正常細胞中減弱複製，並且描述於例如Ramachandra，M.等人，Nature Biotechnol.191035-1041(2001)；美國專利申請公開號US2002/0150557；和Demers，G.等人Cancer Research634003-4008(2003)。
術語「感染」指在一定條件下將病毒暴露於適應的A549細胞以促進細胞被病毒感染。在其中已經受到多個拷貝給定病毒感染的細胞中，病毒複製和病毒體包裝所需的活性是協同的。從而，優選調節所述條件，從而使得存在適應的A549細胞受到病毒多重感染的很大可能性。增強適應的A549細胞中病毒生產的條件的一個實例是與感染期中細胞濃度相比增加的病毒濃度。然而，可能每個細胞感染的總數可能太高，從而導致對細胞的毒性效應。因此，優選保持病毒顆粒與A549細胞的比率在感染時為(40到60)∶1。
術語「在一定條件下培養以允許病毒基因組複製」指對受感染的A549細胞保持所述條件以便允許病毒增殖。含有病毒的細胞包括受到病毒感染的細胞和正生產病毒的細胞。希望控制培養條件從而使每個細胞生產的病毒顆粒數最大化。希望監控和控制培養條件，如溫度、溶解氧、pH、攪動和本領域技術人員已知的其他條件。通過商業途徑可獲得的生物反應器，如BIOSTAT系列的生物反應器(B.Braun Biotech，Inc.，Allentown，PA，美國)有監控和保持此類參數的設備。然而，感染和培養條件的最優化將有點可變，可以由本領域技術人員通過考慮例如細胞系的已知性質、病毒的性質和生物反應器的類型來實現病毒的有效複製和生產的條件。
病毒，如腺病毒可以在本發明的適應的A549細胞或者懸浮A549細胞中生產。可以通過如下步驟生產病毒，培養適應的A549細胞；任選向細胞加入新鮮生長培養基；用病毒接種細胞；任選用氯化鈣(CaCl2)補充細胞培養物；溫育接種的細胞(任意時間段)；任選向接種的細胞加入新鮮生長培養基；任選用氯化鈣補充細胞培養物；和任選從細胞和培養基收穫病毒。通常，當病毒顆粒的濃度開始出現平臺時，如通過如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)中描述的常規方法，如高效液相層析使用Resource Q柱測定的，進行收穫。
通常，受感染的、適應的A549細胞能夠在培養中保持以36×109到144×109vp/ml的範圍生產CRAV腺病毒至少137代或者至少6個月。
可以在病毒接種之前和/或之後對細胞提供新鮮培養基。例如，可以通過灌注加入新鮮培養基。培養基交換增加了適應的A549細胞或者適應的A549培養物中病毒生產的水平。在本發明的一個實施方案中，對受感染的適應的A549細胞的培養基進行兩次連續交換，一次交換在感染後，另一次交換在感染後1天。可以對細胞提供有或者沒有額外的鈣的新鮮培養基。
可以在病毒接種後對適應的A549細胞提供鈣。將鈣以可溶形式，例如，作為氯化鈣或者硫酸鈣加入培養物。鈣加入增加了適應的A549細胞或適應的A549培養物中病毒生產的水平。在本發明的一個實施方案中，病毒感染後向培養物加入氯化鈣。在另一實施方案中，病毒接種後2小時加入氯化鈣。在另一實施方案中，病毒感染後2到8小時向培養物加入氯化鈣。在另一實施方案中，感染後20到24小時加入氯化鈣。用於新鮮培養基或者細胞培養物中的額外的氯化鈣濃度範圍為0.2mM到1.6mM。在本發明的一個實施方案中，使受感染的適應的A549細胞或者受感染的適應的A549培養物進行與補加額外的1.6mM氯化鈣的新鮮培養基的兩次連續交換，一次交換在感染後，另一交換在感染後1天。
用於生產病毒的適應的A549細胞可以來自在無血清且無動物材料的培養基條件下冷凍的細胞系或者來自在含有血清的培養基條件下冷凍的細胞系，例如，來自冷凍的細胞庫。
用於鑑定培養物中病毒的存在，即，證明培養物中存在病毒蛋白質的適宜方法包括免疫螢光檢測，其可以使用針對一種病毒蛋白質的單克隆抗體或者多克隆抗體(Von Bülow等人，in Diseases ofPoultry，10th edition，Iowa State University Press)、聚合酶鏈反應(PCR)或嵌套式PCR(Seiné等人，Avian Diseases 37467-476(1993))、ELISA(Von Bülow等人，in Diseases of Poultry，10thedition，Iowa State University Press))、通過流式細胞術分析的六鄰體表達(Musco等人Cytometry 33290-296(1998)、病毒中和或者用於鑑定特定病毒蛋白質的任意常規組織化學方法。
可以通過本領域已知的技術，如Villegas等人，「Titration ofBiological Suspensions，」InA Laboratory Manual for the Isolationand Identification of Avian Pathogens，3rd Ed.，Purchase等人，Eds.，Kendall/Hunt Publishing Co.，Dubuque，Iowa(1989)中描述的方法進行培養物中病毒的量的滴定。在特定實施方案中，如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)描述的，通過ResourceQ測定法測定病毒顆粒的濃度。本文所用的術語「裂解」指破裂含有病毒的細胞。可以通過本領域公知的多種方法實現裂解。例如，可以在低壓(100-200psi差壓)條件下、通過勻漿、通過微流化(microfluidization)或者通過常規的凍融方法裂解哺乳動物細胞。
可以冷凍含有病毒的細胞。可以從含有病毒的細胞和培養基收穫病毒。在一個實施方案中，同時從含有病毒的細胞和培養基收穫病毒。在特定實施方案中，將生產病毒的細胞和培養基在同時裂解含有病毒的細胞和澄清將幹擾病毒純化的細胞碎片的培養基的條件下，如美國專利號6,146,891描述的，進行交叉流微量過濾。
可以分別從含有病毒的細胞和培養基收穫病毒。可以通過常規方法，如差速離心單獨從培養基回收含有病毒的細胞。收穫的細胞可以冷凍保存或進一步通過裂解處理以釋放病毒。可以通過層析方法從培養基收穫病毒。可以用DNA酶/RNA酶，如BENZONASE(AmericanInternational Chemicals，Inc.)降解除去無Exogenase的DNA/RNA。
可以通過諸如美國專利號6,146,891和6,544,769中描述的超濾或者切向流過濾的方法進一步處理病毒收穫物以濃縮病毒。
可以通過本領域公知的任意方法分離和純化本發明的細胞培養物中生產的病毒顆粒。例如，可以通過氯化銫梯度純化、柱層析或分批層析、二乙氨乙基(DEAE)層析(Haruna等人Virology 13264-267(1961)；Klemperer等人，Virology 9536-545(1959)；PhilipsonVirology 10459-465(1960))、羥基磷灰石層析(美國專利申請公開號US2002/0064860)和使用其他樹脂的層析法純化病毒顆粒，所述其他樹脂為諸如均勻交聯的多糖，其包括軟凝膠(例如，瓊脂糖)，基於合成聚合物的大孔聚合物，其包括具有大「直通孔(throughpore)」的灌注層析樹脂，「觸手」吸著劑，其具有設計用於與蛋白質更快相互作用的觸手(例如，fractogel)，和基於剛性殼中軟凝膠的材料，其利用軟凝膠的高容量和複合材料的剛性(例如，Ceramic HyperDF)(Boschetti，Chromatogr.658207(1994)；Rodriguez，J.Chromatogr.69947-61(1997))。在特定實施方案中，通過柱層析，如Huyghe等人Human Gene Therapy 61403-1416(1995)；美國專利號5,837,520；和美國專利號6,261,823中描述的純化病毒。
蛋白質純化也可以分離和純化在本發明的適應的A549細胞中生長的腺病毒(優選包含編碼目的多肽的異源基因的腺病毒)生產的蛋白質。
可以通過標準方法純化本發明的蛋白質、多肽和抗原片段，所述方法包括但不限於鹽或者醇沉澱、親和、製備型圓盤凝膠電泳、等電聚焦、高壓液相層析(HPLC)、反相HPLC、凝膠過濾、陽離子和陰離子交換和分配層析和反流分布法。此類純化方法是本領域公知的並且公開在例如「Guide to Protein Purification」，Methods inEnzymology，Vol.182，M.Deutscher，Ed.，1990，Academic Press，New York，NY。
實施例提供下面的實施例以更清楚地描述本發明，並且不應將這些實施例理解為以任何方式限制本發明的範圍。
表1列出了用於實施例中的多種培養基。
表1培養基
實施例1貼壁A549細胞向無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養的適應按照通過胰蛋白酶消化培養貼壁細胞的標準方案，將A549細胞解凍並在T-75培養瓶中的培養基1(表1)中傳代。適應過程花費3-6周來完成。為啟動懸浮適應過程，通過將細胞通過含有逐步降低水平血清的培養基連續傳代使貼壁細胞逐漸斷奶。這通過在每次細胞培養傳代時用增加體積的無血清並且無動物材料的懸浮培養基培養基2(見表1)稀釋培養基1(見表1)來進行。結果，血清水平逐步降低，在每次傳代時從最初的10％胎牛血清(FBS)水平降低50％，直到最終FBS濃度低於0.3％。每次傳代花3到5天。傳代細胞直到一些細胞變得不貼壁(例如，不附著到培養容器的表面)。
在含有0.3％FBS的培養基中傳代一次後，從T75瓶胰蛋白酶消化細胞，將其再接種到250ml搖瓶(40ml培養體積)中含有相同的0.3％FBS的培養基中，並在37℃在振蕩培養箱中生長，培養箱中具有5％CO2的氣氛並且以85rpm進行振蕩。
轉移到懸浮培養後，用無血清並且無動物材料的培養基培養基2(見表1)進行所有隨後的傳代培養，以完成從血清的斷奶。允許細胞生長到約2×106到2.5×106個細胞/ml。然後將培養物用培養基2(見表1)以1∶2分離到500ml搖瓶(100ml培養體積)中。允許細胞再次生長到約2×106到2.5×106個細胞/ml後以1∶2分離到1L搖瓶(240ml培養體積)中。如通過用錐蟲藍染色確定的，培養物生活力保持高於90％。
用顆粒篩分器AccuSizer780/SPOS單顆粒光學篩分器每天監控細胞生長和聚集。對於培養物的聚集分布圖，小於或等於100個細胞/團的50％讀數給出最佳生長速率。使用錐蟲藍染料排阻和血細胞計數器測量培養物生活力。監控細胞團塊大小允許確定培養條件，如培養基修飾和攪動速率的影響，以通過控制細胞聚集來最優化細胞生長。製備一式兩份培養物並且改變一式兩份培養物之一的培養條件的一個參數(如攪動速度)，並使用顆粒篩分器隨時間推移監控聚集程度。此外，連續進行顆粒大小測量以確定傳代培養時間表。顆粒篩分器給出等於細胞密度的細胞質量讀數和所希望的參數內的聚集保持。用細胞質量讀數確定何時分離培養物以及分離比。對於聚集分布圖，小於或等於100個細胞/團的50％讀數的保持給出了最佳生長速率。
對於在1L瓶中的培養物連續增殖，使用顆粒篩分器連續監控細胞並如上述對細胞傳代培養。顆粒篩分器分析表明A549細胞傾向於在懸浮培養中的前幾次傳代中形成大團塊。通過傳代前停止攪動1到2分鐘允許大團塊沉降到搖瓶底部，從而可以通過移液從群體除去團塊。以該方式傳代培養物直到將聚集降低到希望的水平。希望的水平是如下水平，其中在1-2分鐘後沒有大團沉降到培養瓶的底部並且使用顆粒篩分器的50％細胞讀數小於或等於100個細胞/團。保持培養物生長速率。觀察到的生長速率為至少0.3天-1。適應在無血清並且無動物材料的培養基懸浮生長的細胞可以稱作「懸浮A549細胞」或者「適應的A549細胞」或者「A549S」或者「ATCC編號PTA-5708」。
表2A549細胞對無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養的適應細節
表3.適應的A549細胞系的按比例放大以製備適應的A549細胞系懸浮細胞庫#1的細節
實施例2比較來自懸浮培養的不同細胞系的A549細胞的細胞聚集的量在A549細胞的無血清且無動物材料的培養基懸浮適應以生產適應的A549懸浮細胞系期間，選擇性保留不結合大細胞團的細胞。選擇不附著到表面的細胞或細胞系的亞群並在無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中增殖。通過多輪選擇富集所希望的細胞群體，所述選擇通過停止培養物的攪動並允許大細胞團塊沉降到瓶的底部並傳代培養保持懸浮的細胞來進行。適應的A549細胞系的所得細胞比在相同懸浮培養基(見，例如，表3)中未適應的A549細胞聚集程度較低。
將A549貼壁細胞用胰蛋白酶消化，用培養基1(見表1)洗滌一次，然後接種到125ml搖瓶中20ml體積的培養基1或2(見表1)。細胞在振蕩培養箱中生長6天，培養箱具有5％CO2氣氛，溫度為37℃，攪動速度為85rpm。
表3來自不同A549細胞系的培養物的比較
實施例3通過無血清且無動物材料的培養基懸浮培養的A549S細胞生產CRAV在定軌搖床上的錐形瓶中和在攪拌的罐式生物反應器中進行A549S細胞的病毒生產。在兩種情況中，通過用病毒接種物感染培養物進行生產。
對於搖瓶中的病毒生產，通過將搖床置於組織培養培養箱中來維持溫度(37℃)、CO2水平(5％)和溼度。懸浮A549細胞在感染前在無血清且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)中以分批模式生長到約1.8×106到2.4×106個細胞/ml的密度。病毒接種前，通過離心，用無血清且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)進行約90％最初培養物體積的培養基交換。以1×108個病毒顆粒/ml的終濃度接種病毒，等價於病毒顆粒與細胞的比為約(40到50)∶1。病毒接種後2小時，向培養物加入氯化鈣以對培養物提供額外的1.6mM氯化鈣。感染後約20小時，通過離心進行與補加了額外1.6mM CaCl2的無血清且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)的另一90％培養基交換。在感染後24小時、48小時和72小時從每個培養物收集3ml培養物樣品用於定量所生產的病毒的量。所生產的病毒的量為100×109到150×109vp/ml或者3×104到4×104vp/細胞。
對於在生物反應器中生產，攪拌的罐式反應器裝備有內部旋轉過濾器並裝備有節距刀片葉輪。用加熱毯使培養溫度保持在37℃。溶解氧保持在40％的空氣飽和。頂部空間中空氣流速保持在0.1L/分鐘。用來自搖瓶的細胞接種生物反應器罐，最初接種密度為在無血清且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)中0.5×106個細胞/ml。在整個實驗中攪動速率保持在120rpm。當細胞密度達到約1.8×106到2.4×106個細胞/ml時，進行用3.8L無血清且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)的灌注。然後在灌注後立即以1×108個病毒顆粒/ml的終濃度接種病毒。如使用搖瓶的情況一樣，感染後2小時向罐中的培養物加入額外的CaCl2(1.6mM)。感染後約20小時，進行用3.8L無血清且無動物材料的培養基培養基2(見表1)的另一次灌注。感染後用5％Na2CO3溶液保持pH高於6.9。如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)描述的用Resource Q柱測量病毒效價。
實施例4.無血清且無動物材料的培養基懸浮培養中適應的A549細胞系的穩定性在試驗期間對A549S細胞連續傳代6個月，並以預定時間間隔感染培養物等分試樣以評估CRAV生產力。在培養物的整個生命中以相同方式重複進行這些感染實驗。對體外培養物年齡評估生產力，所述體外培養物年齡表達為細胞世代數。
通常，生產宿主細胞系應該穩定足夠的世代數以確保可按比例放大的過程，例如，穩定至少60代。首先，細胞培養物必須能夠在所選的培養環境中長時間段地保持其生長。其次，在確定的培養物年齡結束時生產水平不應該顯著變化。第三，在不同培養物年齡產生的生產質量應該是相當的。為了評估適應的A549細胞系的穩定性，監控生長速率和病毒生產速率的改變。通過將發生的世代(或者細胞分裂)數除以發生生長的天數可以得到生長速率(見表4)。這還可以表達為ln(細胞質量增加倍數)/(培養結束時時間-培養開始時時間(天數))。
數據表明適應的A549細胞在從冷凍的原種復甦到無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中時易於立即生長，如生長曲線的第一個數據點所示。這翻譯成40％細胞生長/天。接著是生長速率的逐漸增加，直到在約60世代時達到表觀平臺。在培養物從冷藏的條件啟動時，生長速率的最初增加在許多細胞系中是常見的。
對於A549S細胞，表4數據中平均生長速率的範圍為0.19到0.69(天-1)，22個數據點的平均值為0.42(天-1)。這對應於24到88小時的倍增時間(小時)的範圍，其從平均生長速率(天-1)以公式(0.693×24)/平均生長速率計算，且平均倍增時間為40小時。
在繼續培養以測量它的生長速率時，分離衛星培養物並用腺病毒載體感染以評估病毒生產。對於衛星培養物，允許A549S細胞在感染前生長到約1.8×106到2.4×106個細胞/ml。在病毒接種前，用新鮮培養基(培養基2，見表1)進行約90％的最初培養體積的培養基交換。以終濃度1×108vp/ml接種病毒。感染後約2小時，向培養物加入氯化鈣(800μM)。感染後約20小時，進行用補加了800μM氯化鈣的生長培養基(培養基2，見表1)的另一次90％培養基交換。在感染後24、48和72小時收集感染的培養物樣品以用於定量生產的病毒。如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)中描述的用Resource Q柱測量病毒效價。在所有情況中感染後約48小時實現最大病毒效價。病毒生產力以表4中的體積生產力(volumetric productivity)給出。表4中的體積病毒生產力的範圍為3.63×1010到1.44×1011(vp/ml)。表4中21個數據點的平均體積病毒生產力為8.21×1010(vp/ml)。
表4來自適應的A549細胞系的A549S培養物的穩定性結果
實施例5A549懸浮細胞的冷藏用含有血清的培養基(培養基5，見表1)和無動物材料的冷凍培養基(培養基4，見表1)進行A549懸浮細胞庫的冷藏。如實施例1中描述的培養細胞。按照「Culture of Animal Cells」，R.I.Freshney，Wiley Sons Inc.，NY，2000，PP.297-308中描述的標準方案製備冷凍細胞庫。對於無動物材料的庫，冷凍培養基使用培養基4(見表1)。對於含有血清的庫，使用培養基5(見表1)。
來自兩個庫的解凍細胞容易地懸浮生長而不必再次適應。解凍後兩個庫的生長速率非常相當(見，例如，表5)。兩個庫的隨後病毒生產力也沒有受到無血清的冷藏的影響(見，例如，表6)。來自細胞庫的瓶在37℃水浴中解凍，通過離心用培養基2(見表1)洗滌1次，然後使用20ml培養基2(見表1)接種到125ml搖瓶。如實施例4中給出的計算生長速率。如實施例4中關於衛星培養物描述的進行感染。
表5來自冷藏的A549S細胞系的A549S培養物的細胞生長
表6來自冷藏的A549S細胞系的A549S培養物的病毒生產
實施例6A549細胞的懸浮適應之前和之後CRAV生產的比較在相同條件下，在含有血清的培養基(培養基1，見表1)和在靜止培養皿中，使用適應的A549細胞系(A549S)的A549細胞或者來自貼壁培養的A549細胞進行感染。以一式兩份進行感染培養。
將來自生長在培養基2(見表1)的無血清且無動物材料的培養基懸浮培養的適應的A549細胞以80％到100％匯合接種在幾個T-25培養瓶中的培養基1(見表1)中並允許附著到瓶表面24小時。將完全作為貼壁培養(非適應的)生長的A549細胞在感染前接種在幾個T-25瓶中4天並允許在培養基1(見表1)中生長到80％到100％匯合。感染時，將來自兩種細胞系的培養物用培養基1(見表1)進行交換並用CRAV以1×108或4×108vp/ml感染。感染後24小時，除去病毒接種物並用新鮮培養基1(見表1)替換。此外，在感染後24小時對每種細胞系取一個代表性瓶，用胰蛋白酶消化，並通過血細胞計數器計數和錐蟲藍染色測定每個瓶的細胞數。在感染後第2和第3天，來自每個細胞系的瓶在-80℃冷凍並處理用於Resource Q HPLC分析。將培養物生產的病毒的總量除以感染後24小時存在的細胞數以確定兩種細胞系的比生產力。使用含有10％FBS的DMEM(見表1，培養基1)在靜止培養皿中對懸浮適應的細胞A549S進行感染，所述DMEM是用於貼壁培養的製劑。基於每個細胞，與未適應的對照A549細胞相比，A549S細胞沒有顯示出病毒生產水平的降低(見，例如，表7)。
表7使用靜止培養的感染條件用含有血清的培養基，對未適應的貼壁A549細胞與A549S細胞的比病毒生產力的比較
實施例7.氯化鈣加入對無血清並且無動物材料的懸浮培養的A549S細胞中CRAV生產的影響在搖瓶中評估氯化鈣加入對CRAV生產的影響。對於搖瓶中的病毒生產，通過將搖床置於組織培養箱中來維持溫度(37℃)、CO2水平(5％)和溼度水平。懸浮A549S細胞在感染前在無血清並且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)中以分批模式生長到約1.8×106到2.4×106個細胞/ml的密度。病毒接種前，用無血清並且無動物材料的培養基(培養基2，見表1)通過離心進行約90％的最初培養物體積的培養基交換。病毒以終濃度1×108個病毒顆粒/ml接種，相當於病毒顆粒與細胞的約(40到50)∶1比。
病毒接種後(感染後)約2小時，向培養物加入氯化鈣溶液以實現靶氯化鈣(除了培養基中已經含有的鈣量之外)濃度為200μM到1600μM，具體地是下面的氯化鈣濃度200μM、400μM、800μM和1600μM。其次，用含有與感染後2小時進行的氯化鈣加入相同的量的額外氯化鈣的新鮮培養基2在感染後約20小時通過離心進行培養基灌注。包括對照培養物，其中在感染後2小時不加入氯化鈣或者在感染後20小時用新鮮培養基2(見表1)灌注。對於每種培養物在感染後48小時收集3ml培養物樣品以定量所生產的病毒。如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)中描述的通過Resource Q HPLC測量生產的病毒的量。結果在表8中顯示。
表8氯化鈣加入對在無血清並且無動物材料的懸浮培養中培養的A549S細胞中CRAV生產的影響
實施例8.病毒接種物濃度對CRAV生產的影響在搖瓶中用A549S細胞檢查病毒接種物濃度對CRAV生產的影響。使來自冷凍庫的A549S細胞解凍並在培養基2(見表1)中傳代直到它們顯示出穩定生長。兩個1升搖瓶培養物生長到約2.7×106個細胞/ml的濃度並合併培養物。通過離心對約85％的最初培養物體積進行培養基交換，並將細胞重懸浮到約3.6×106個細胞/ml的最終細胞密度並等分試樣到14個125ml搖瓶中。然後將細胞用濃度為0.125×108vp/ml到8×108vp/ml的CRAV病毒接種(見表9)；對每種濃度進行一式兩份的感染。接種的細胞在37℃，5％CO2和高溼度下生長在組織培養箱中。在感染後2小時，向每個培養物加入氯化鈣以向培養物提供額外的1.6mM氯化鈣(CaCl2)。感染後約20小時，用補加了1.6mM CaCl2的培養基2(見表1)進行另外85％培養基交換。在感染後24、48、72和96小時從每個培養物收集3ml樣品用於定量所生產的CRAV病毒。表9顯示，到感染後第3或4天，在來自以0.5×108vp/ml到8×108vp/ml感染的培養物的病毒效價中有很小差異。
表9在不同病毒接種物濃度下A549S培養物的CRAV病毒生產；值是一式兩份樣品的平均值。
本發明的範圍不應受到本文描述的特定實施方案的限制。實際上，除了本發明描述的之外，根據前面的描述，本發明的多種修改將對於本領域技術人員是顯而易見的。此類修改落入所附權利要求
的範圍內。
在本申請全文引用專利、專利申請、出版物、產品說明書和規程，它們的公開內容在此完整引入作為參考。
權利要求
1.在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的適應的A549細胞系。
2.權利要求
1的細胞系，其中所述適應的A549細胞系是鑑定為ATCC編號PTA-5708的細胞系。
3.使A549細胞適應無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養的方法，其包括步驟(a)在貼壁培養中使細胞從含有血清的培養基斷奶到最終血清濃度為2.5％到低於1.25％的培養基；(b)將細胞引入懸浮培養；(c)監控細胞聚集；(d)除去細胞團塊；和(e)繼續使懸浮培養中的細胞斷奶到沒有血清的培養基。
4.權利要求
3的方法，其中所述A549細胞是ATCC株系CCL-185。
5.生產在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中穩定的適應的A549細胞系的方法，其包括步驟(a)通過根據權利要求
3的方法適應A549細胞；和(b)在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中培養所述細胞。
6.權利要求
5的方法，其還包括在0℃或更低溫度下保存細胞。
7.權利要求
5的方法，其還包括冷藏細胞。
8.生產病毒的方法，其包括步驟(a)在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中培養權利要求
1的適應的A549細胞系的A549細胞；(b)用病毒接種細胞；和(c)溫育接種的細胞。
9.權利要求
8的方法，其還包括在步驟(c)後冷凍細胞。
10.權利要求
8的方法，其還包括在步驟(c)後收穫病毒。
11.權利要求
10的方法，其中從細胞和培養基收穫病毒。
12.權利要求
8的方法，其中所述病毒是腺病毒。
13.權利要求
8的方法，其中所述病毒是重組病毒。
14.權利要求
8的方法，其中所述病毒攜帶異源基因。
15.權利要求
12的方法，其中所述腺病毒是條件複製的腺病毒。
16.權利要求
8的方法，其還包括在步驟(b)後向培養物加入氯化鈣。
17.權利要求
8的方法，其中在病毒接種時A549細胞濃度為1.8×106個細胞/ml到2.4×106個細胞/ml。
18.權利要求
12的方法，其中所述接種的腺病毒的量為1×108個病毒顆粒/ml培養基。
19.權利要求
12的方法，其中接種時病毒顆粒與細胞的比率為(40到60)∶1。
20.權利要求
8的方法，其還包括在步驟(a)後和步驟(b)前將所述培養基與新鮮培養基交換。
21.權利要求
8的方法，其還包括在步驟(c)後，步驟(d)將所述培養基與新鮮培養基交換；和(e)溫育所述細胞。
22.權利要求
8的方法，其還包括在步驟(a)後和步驟(b)前；和步驟(c)後將所述培養基與新鮮培養基交換。
23.權利要求
8的方法，其中所述A549細胞來自冷藏的細胞系。
24.權利要求
8的方法，其中所述A549細胞來自適應於無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養的細胞系。
25.生產腺病毒的方法，其包括步驟(a)在貼壁培養中使A549細胞從含有血清的培養基斷奶到最終血清濃度為2.5％到低於1.25％的培養基；(b)將細胞引入懸浮培養；(c)監控細胞聚集；(d)除去細胞團塊；(e)繼續使懸浮培養中的細胞斷奶到沒有血清的培養基；(f)增殖細胞到晚期指數生長期；(g)將所述培養基與新鮮培養基交換；(h)用腺病毒接種所述細胞；(i)向培養物加入氯化鈣；(j)溫育接種的細胞；(k)將所述培養基與新鮮培養基交換；(l)溫育細胞；(m)向培養物加入氯化鈣；(n)溫育細胞；和(o)收穫腺病毒。
26.權利要求
25的方法，其在步驟(e)後但是在步驟(f)前還包括步驟(i)濃縮細胞；(ii)將所述培養基與補加冷凍保護劑的培養基交換；(iii)冷凍細胞；(iv)將細胞保存在0℃或更低的溫度下；和(v)將細胞重構到無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中。
專利摘要
本發明提供了使細胞，如A549細胞適應在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中生長的方法。本發明提供了從適應在無血清並且無動物材料的培養基懸浮培養中生長的A549細胞製備病毒，如腺病毒的方法。
文檔編號C12N15/861GKCN1898379SQ200480038524
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月21日
發明者Z·劉, R·L·小龍利, M·P·桑託洛, M·沃洛奇 申請人:先靈公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan